WO1992010761A1 - Verfahren und reagenzien zur bestimmung der enzymatischen aktivität von transglutaminasen (ec 2.3.2.13) - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a new method for determining the activity of the enzymes of the enzyme commission number EC 2.3.2.13, in particular the activity of the blood coagulation factor XIII (plasma transglutaminase), and a reagent kit for carrying out the determination.
  • the enzymes of the enzyme commission number EC 2.3.2.13 in particular the activity of the blood coagulation factor XIII (plasma transglutaminase), and a reagent kit for carrying out the determination.
  • Blood coagulation is a complex, multi-phase process that can be triggered by various physiological and pathological processes and is mainly used to stop bleeding in vivo.
  • Various so-called coagulation factors are involved in blood coagulation.
  • Most of these are proteases that activate them by means of highly specific proteolytic effects on other coagulation factors, or cofactors of these reactions.
  • the aim of these reactions is to convert the fibrinogen into polymeric fibrin.
  • Both fibrinogen and factor XIII experience a proteolytic cleavage of polypeptides through the enzyme thrombin, which arises from prothrombin in the course of blood coagulation. After these polypeptides have been split off, fibrinogen is formed from fibrin monomer, which polymerizes spontaneously.
  • Cleavage of the polypeptide from the catalytic unit of factor XIII causes the activation of the enzyme.
  • the catalytically inactive proenzyme factor XIII is found in blood plasma and in platelets. Active factor XIII catalyzes the formation of covalent bonds between the polymerized fibrin molecules and thus an increase in the mechanical resistance of the fibrin.
  • pathophysiologically important molecules such as fibronectin and alpha-2-antiplasmin are covalently coupled to the fibrin clot. The coupling of fibronectin enables cells to grow into the fibrin clot, the coupling of alpha-2-antiplasmin leads to an increase in the resistance of the fibrin to proteases such as plasmin.
  • Transglutaminases are also found in numerous tissues and cells, such as erythrocytes, leucocytes, endothelial cells, liver cells, various tumor cells, etc. These intracellular transglutaminases show similar specificities to factor XHI, but their activity is not dependent on thrombin. The known detection methods for measuring the transglutaminase activity have been developed on the basis of the protein transglutaminase activity of factor XIII.
  • the activity of factor XIII and other transglutaminases can be determined by gel electrophoresis on agarose gel plates and subsequent reaction with strongly colored or fluorescent cadaverine derivatives, casein and thrombin.
  • the excess cadaverine has to be removed from the gel plate by relatively cumbersome fixation and washing. The measurement is carried out by densitometric evaluation of the gel plates (Lorand et al. (Anal. Biochem. 131, pages 419-425 (1983)).
  • the adsorbed galactosidase activity is determined by the release of p-nitrophenol from p-nitrophenyl- ⁇ -D-galactopyranoside and forms a measure of the concentration of factor XIII. This method is also still very complex and inaccurate due to the different transmission steps.
  • the object was therefore to find a simple analytical method for determining the blood coagulation factor XIII (plasma transglutaminase and thrombocyte transglutaminase) and other transglutaminases of the enzyme group EC 2.3.2.13, using as few reagents and reaction and washing steps as possible can be automated as far as possible and can be carried out by untrained specialists.
  • blood coagulation factor XIII plasma transglutaminase and thrombocyte transglutaminase
  • other transglutaminases of the enzyme group EC 2.3.2.13 using as few reagents and reaction and washing steps as possible can be automated as far as possible and can be carried out by untrained specialists.
  • microtiter plates are initially coated with the protein or polypeptide, preferably with casein, this can be used in optimum concentration, so that all active sites on the microtiter plate to which such proteins or polypeptides can attach are blocked. This saves the step necessary in the method of 'Velasco' and 'Lee' to initially block free active centers of the microplate with milk proteins between the accumulation of the casein and the reaction with the antibodies.
  • the surface is such that proteins and peptides are sufficiently non-covalently bound.
  • those made of other plastics such as polyethylene, polycarbonate or polypropylene, can also be used as reaction vessels. If these do not sufficiently adsorb the required proteins and peptides, the surface can additionally be activated by glutaraldehyde, cyanogen bromide or other activators.
  • the shape of the reaction and measuring vessels is of course completely variable, for example plastic test tubes or centrifuge tubes or photometer cuvettes of various shapes can be used.
  • the simplest and cheapest is to carry out the tests with commercially available microtiter plates, for example with 96 wells, each with a volume of 300-400 ⁇ l, or microtiter strips with 8, 12 or 16 wells, also with a volume of 300-400 ⁇ l, since these are suitable for the test of series trials are particularly suitable.
  • Casein in particular is used as the protein, since both factor XIII and tissue and cell transglutaminases react with this substrate.
  • substrates containing glutamine can also be used in the same way.
  • natural factor XIII or transglutaminase substrates such as fibrinogen, collagen, fibronectin, thrombospondin, etc., as well as derivatives and fragments of these proteins as well as natural and synthetic peptides which contain the glutamine necessary for the reaction can be used.
  • the prerequisite is that the substances are absolutely free of transglutamines, which is not always guaranteed with native fibrinogen and fibronectin. Since the substrates containing glutamine differ in their reactivity with the transglutaminases and in their ability to bind to the plastic surfaces of the reaction vessels, it is necessary to carry out control samples with known activity when measuring the transglutaminase activity.
  • the glutamine-containing substrate can be bound to the reaction vessel (di microtiter plate) either shortly before the determinations are actually carried out, but the coated plates can also be manufactured and stored under sterile conditions.
  • Particularly suitable for the reactive primary amine of the formula I are those which have a linear methylene chain with 4 to 8 carbon atoms, with 5 to 6 carbon atoms being particularly preferred. With shorter chains, a reaction is obviously no longer possible for steric reasons; with longer chains, the reaction rate drops sharply. Practically all groups which do not interfere with the transglutaminase reaction, but which enter into an antibody reaction, are suitable as substituents -X- of formula (I). Larger, optionally substituted carbocyclic groups are particularly suitable, although a certain hydrophobicity seems to increase the reactivity of the nucleophiolic primary amino group.
  • the substrates known from the literature dinitrophenylcadaver, biotinamido-pentylamine and dansylcadaverine, are therefore suitable, for example.
  • polyclonal antibodies can also be used, provided they are sufficiently specific for the above substrates and are available in a sufficiently pure form so that coupling with an indicator enzyme is possible.
  • polyclonal antisera can be purified by affinity chromatography or ion exchange chromatography.
  • a control reaction with factor XIII-free plasma or trans glutaminase-free sample can be checked that such polyclonal antibodies have no reactivity with the normal plasma or sample components or components of the coating solutions de reaction vessels.
  • An enzyme is preferably used as a label for the antibodies used, in order to increase the sensitivity accordingly.
  • the markings commonly used in technology with alkaline phosphatase, peroxidase or urease can also be used advantageously for this test.
  • Corresponding detection reagents are known, for example p-nitrophenylphosphate for alkaline phosphatase, 2,2'-azino-bis- (3-ethylbenzthiazolin-6-sulphonic acid) or o-phenylenediamine for peroxidase and bromcresol purple for urease.
  • markings with chromophoric, in particular fluorescent groups can also be used, as a result of which the additional detection reactions remain and the reaction can be monitored directly photometrically.
  • Radioactive markings are in many laboratories because of the associated safety precautions and the outlay on equipment not “desired, but of course the method according to the invention can also be carried out by radioactive labeling of either the primary amine used or the antibody used. In the former case, the step of antibody labeling of the reaction product can already be omitted, in the second case only afterwards a radioactivity measurement of the bound substrates is carried out at this marker and the washout via excess antibody.
  • the method according to the invention has been worked out in particular for the detection of the blood coagulation factor XIII (plasma transglutaminase), but the other enzymes of the number EC 2.3.2.13 can also be determined in this way.
  • microtiter plates with 96 wells of 400 ⁇ l of polystyrene are incubated at 37 ° C. with a solution of casein in 0.1 M phosphate buffer pH 8.0 or 0.05 M tris (hydroxymethyl) aminomethane and 0.1 M NaCl, pH 8.5.
  • the optimal concentration of casein is between 3 and 6 ⁇ g / ml solution, the incubation time at 37 ° C. should be at least 2 hours and at most 24 hours.
  • the microtiter plates are then emptied and rinsed with a buffer solution, for example with a buffered NaCl solution.
  • Figures 1 and 2 The effect of casein concentration in the casein solution on the sensitivity of the test for two types of polystyrene microtiter plates with and without glutaraldehyde activation is shown in Figures 1 and 2.
  • Optimal sensitivity is achieved in a concentration range of 1-10, preferably 3-6, ⁇ g casein per ml buffer solution.
  • Figure 3 shows comparative experiments with casein and the proteolytic fibrinogen fragment D as coating material. Both Ca and fibrinogen fragment D show a sensitive reaction proportional to the transglutaminase activity of factor XIII.
  • the measurements for FIGS. 1, 2 and 3 were carried out according to Examples 2 and 3 with standardized samples of known factor XHI activity.
  • a buffer solution is made from:
  • the samples used are diluted with the sample dilution buffer, a dilution between 1:15 and 1:40, in particular 1:20, being used to measure the factor XIII activity in human blood plasma. Different dilution factors result for other samples.
  • a buffer stock solution is made from:
  • the active amine substrate solution is made from:
  • DNPC dinitrophenylcadaverine
  • a microtiter plate (96 wells) according to Example 1 is rinsed with solution b).
  • 100 ⁇ l of diluted sample, 100 ⁇ l of substrate solution c) and 100 ⁇ l of thrombin solution are poured into each well (2 to 3 parallel tests per sample and control with standard plasma with a known transglutaminase concentration and factor X ⁇ i-deficient plasma).
  • the reagent supernatant is rinsed out with solution b).
  • Microtiter plates according to the above example are then connected to the substrate reaction with 250 ⁇ l / well of an anti-dinitrophenyl-antibody conjugate solution from 25 ⁇ l antibody conjugate (phosphatase marked) and 25 ml of solution b) and incubated for 60 minutes at room temperature.
  • the antibody-enzyme conjugate is produced by glutaraldehyde coupling from commercially available antibody (Sigma, Deisenhofen) and commercially available enzyme alkaline phosphatase (Boehringer, Mannheim) according to a method described by Harlow and Lane (Harlow E, Lane D, Antibodies: A laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA (1988) Other methods for coupling antibodies and enzymes can also be used in the described method.
  • microtiter plate is washed with solution b) and mixed with 250 ⁇ l phosphatase substrate solution per well.
  • phosphate substrate solution To prepare the phosphate substrate solution, mix: 5 ml of 1 M diethanolamine, 0.01 M magnesium chloride, pH 9.5 15 mg of p-nitrophenyl phosphate (substrate tablet, e.g. from Sigma, Deisen ⁇ ofen), 20 ml of distilled water.
  • substrate tablet e.g. from Sigma, Deisen ⁇ ofen
  • the absorption is then measured photometrically at 405 nm.
  • the measurement can be carried out kinetically by measurements after defined incubation times, preferably after 10, 20, 30, 40, 50 and 60 minutes, or by end point measurement after adding a stop reagent, preferably 50 ⁇ l per well of a 3 M NaOH solution.
  • the factor XIII activity is calculated by comparison with the absorption of the controls. A corresponding calibration curve is shown in Figure 4.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Blutgerinnungsfaktors XIII (Plasma-Transglutaminase und Thrombocyten-Transglutaminase) und anderer Transglutaminasen der Enzymgruppe EC 2.3.2.13, wobei a) Microtiterplatten aus Kunststoffen oberflächlich mit Proteinen oder Peptiden beschichtet werden, welche Glutamin enthalten; b) Calciumchlorid, eine als Reduktionsmittel wirkende Thioverbindung, eine Verbindung mit einer primären Aminogruppe der allgemeinen Formel (I): NH2-(CH2)n-X, in welcher n eine ganze Zahl von 4-8 und X eine inerte, mit spezifischen Antikörpern koppelnde Gruppe bedeutet, sowie eine Transglutaminase-haltige Probe auf der beschichteten Microtiterplatte zur Reaktion gebracht werden, wobei gegebenenfalls Thrombin zur proteolytischen Aktivierung der Transglutaminase zugefügt wird; c) die durch Transglutaminase an die Platte gebundenen Amine mit einem markierten Antikörper gegen die Gruppe X umgesetzt; d) die Menge des gebundenen Amins bzw. des Antikörpers mittels eines geeigneten Nachweisreagenzes bestimmt; e) und jeweils zwischen den einzelnen Schritten gelöste Reagenzreste ausgewaschen werden sowie ein Reagenzkit zur Durchführung des Verfahrens.

Description

Verfahren und Reagenzien zur Bestimmung der enzvmatischen Aktivität von Transglutaminasen (EC 2.3.2.13)
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine neue Methode zur Bestimmung der Aktivität der Enzyme der Enzymkommisions-Nummer EC 2.3.2.13, insbesondere der Aktivität des Blutgerinnungsfaktors XIII (Plasma-Transglutaminase), sowie ein Reagenzkit zur Durchführung der Bestimπrnnεr.
Die Blutgerinnung ist ein komplexer, in mehreren Phasen ablaufender Vorgang, der durch verschiedene physiologische und pathologische Prozesse ausgelöst werden kann und in vivo vor allem der Blutstillung dient. An der Blutgerinnung sind verschiedene, sogenannte Gerinnungs¬ faktoren beteiligt. Meist handelt es sich hierbei um Proteasen, die durch hochspezifische proteolytische Wirkung auf andere Gerinnungsfaktoren diese aktivieren, oder um Cofaktoren dieser Reaktionen. Ziel dieser Reak¬ tionen ist die Überführung des Fibrinogens in polymeres Fibrin. Sowohl Fibrinogen wie auch Faktor XIII erfahren durch das Enzym Thrombin, welches im Verlauf der Blutgerinnung aus Prothrombin entsteht, eine proteolytische Abspaltung von Polypeptiden. Nach Abspaltung dieser Polypeptide entsteht aus Fibrinogen Fibrinmonomer, welches spontan polymerisiert. Abspaltung des Polypeptids von der katalytischen Einheit des Faktor XIII bewirkt die Aktivierung des Enzyms. Das katalytisch inaktive Proenzym Faktor XIII findet sich im Blutplasma, sowie in Thrombocyten. Aktiver Faktor XIII katalysiert die Bildung von kovalenten Bindungen zwischen den polymerisierten Fibrinmolekülen und damit eine Erhöhung der mechanischen Resistenz des Fibrins. Zusätzlich wer¬ den pathophysiologisch wichtige Moleküle wie Fibronectin und Alpha-2- Antiplasmin kovalent an das Fibringerinnsel gekoppelt. Die Kopplung von Fibronectin ermöglicht das Einwachsen von Zellen in Fibrin¬ gerinnsel, die Kopplung von Alpha-2-Antiplasmin führt zu einer Er¬ höhung der Resistenz des Fibrins gegenüber Proteasen wie Plasmin. V
Transglutaminasen finden sich auch in zahlreichen Geweben und Zellen, wie Erythrocyten, Leucocyten, Endothelzellen, Leberzellen, ver¬ schiedenen Tumorzellen, etc. Diese intrazellulären Transglutaminasen zeigen ähnliche Spezifität wie Faktor XHI, sind in ihrer Aktivität jedoch nicht thrombinabhängig. Die bekannten Nachweisverfahren zur Mes¬ sung der Transglutaminaseaktivität sind anhand der Proteintransglu- taminaseaktivität des Faktors XIII entwickelt worden.
Lorand et al. (J. Clin. Invest. 48, Seite 1054 - 1064 (1964) beschreiben einen Test, in dem Faktor XIII mit Thrombin, Glutathion und Calciumchiorid aktiviert und Monodansylcadaverin und gelöstes Casein zugefügt wird. Die Reaktion wird nach 30 Minuten mit Ethanol oder Chloressigsäure abgestoppt, das ausgefallene Protein abzentrifugiert und mehrfach ge¬ waschen, anschließend in einer 8 M Harnstofflösung wieder aufgelöst und die Fluoreszenz des incorporierten Dansyleadaverins gemessen. Die durch die Fällungs- und Waschschritte außerordentlich umständliche Methode wurde später durch Nishida et al. (Thromb. Res. 36, Seite 123 - 131 (1984)) verbessert, indem die Trennung zwischen dem proteingebun¬ denen Dansylcadaverin und dem freien Dansylcadaverin durch Gelfiltra¬ tion durchgeführt wird. Die Reaktion benötigt aber immer noch einige Stunden und einen relativ hohen Aufwand.
Nach einer etwas abgewandelten Methode läßt sich die Aktivität von Fak¬ tor XIII und anderen Transglutaminasen durch Gelelektrophorese auf Agarosegelplatten und anschließender Reaktion mit stark farbigen oder fluoreszierenden Cadaverinderivaten, Casein und Thrombin bestimmen. Auch hier muß durch relativ umständliches Fixieren und Auswaschen das überschüssige Cadaverin aus der Gelplatte entfernt werden. Die Mes¬ sung erfolgt durch densitometrische Auswertung der Gelplatten (Lorand et al. (Anal. Biochem. 131, Seite 419 - 425 (1983)).
Ein anderes Verfahren mit radioaktiv markierten Aminen wird von Lorand et al. in Anal. Biochem. 50, Seite 623 - 631 (1972) beschrieben, wobei die Reaktionsmischung aus Faktor XIII, Thrombin, Calciumchiorid und einem radioaktiv markierten Amin (Putrescin oder Histamin) nach einer Reaktionszeit von etwa 30 Minuten mit Trichloressigsäure gestoppt und das gefällte Protein mit Filterpapier aufgefangen wird. Gründliche Waschen mit Trichloressigsäure, Ethanol und Aceton beseitigt weitge hend die nicht reagierten radioaktiven Amine und erlaubt an der Rest radioaktivität den Gehalt an Faktor XIII zu bestimmen.
Ein anders verlaufendes Verfahren wird von Mousli et al. in Clin. Chem 23/9, Seite 39 - 43 (1977) beschrieben. Das Verfahren nutzt die Tatsach aus, daß bei der durch Transglutaminase, in diesem Falle thrombinak tiviertem Faktor XIII, katalysierten Reaktion zwichen der freien Amino gruppe des proteingebundenen Glutamins und der freien Aminogrupp des Lysins Ammoniak frei wird, welches mit einem Kationenaustausche gebunden und so von der übrigen Lösung getrennt wird, um es an schließend nach Berthelot zu bestimmen. Auch diese Reaktion ist relati umständlich und durch den ungenauen Ammoniaknachweis an Mikromethode nicht sehr geeignet.
Eine wesentliche Verbesserung bringt der von Velasco beschriebene Tes (Biochem. Biophys. Res. Commun. 152, Seite 505 - 511 (1988)). Gemäß dieser Methode wird Dansylcadaverin unter Katalyse von Faktor XIII an N,N'-Dimethylcasein gebunden und die calciumabhängige Reaktion gestoppt, indem eine aliquote Menge des Reaktionsgemisches in eine EDTA-haltige Microtiterplatte überführt wird. Ein Teil des Proteins wird an die Oberfläche der Microtiterplatte adsorbiert und vom Überstand durch Abgießen und Wachen getrennt. Freie Bindungsflächen der Micro¬ titerplatte, welche nicht durch Protein belegt sind, werden anschließend durch Milchproteine blockiert und dann ein monoclonaler Antikörper ge¬ gen die Dansylgruppe zugegeben. Nach Auswaschen überschüssigen An¬ tikörpers wird ein weiterer Antikörper gegen Epitope des ersten Antikör¬ pers hinzugegegen, welcher mit Peroxidase markiert ist. Nach weiteren Waschschritten wird durch Zugage von Peroxidase-Reagenz (Farbstof und Wasserstoffperoxid) die Peroxidaseaktivität gemessen, die letztlich einen Rückschluß auf die Transglutaminaseaktivität der ursprünglichen Probe erlaubt. Nachteilig an diesem Verfahren ist die große Anzahl der Wach- und Umsetzungsschritte. ' •
Ein ähnliches Verfahren wird von Lee et al. (Clin. Chem. 34/5, Seite 906 - 910 (1988)) beschrieben, wobei Citratplasma mit Bentonit inkubiert wird, um Fibrinogen zu entfernen und der Überstand auf eine Microtiterplatte übertragen wird und mit Thrombin inkubiert wird. Danach wird eine Lö¬ sung von Calciumchiorid, N,N'-Dimethylcasein und Biotinamidopentyl- amin zugefügt. Die Reaktion wird mit EDTA gestoppt und zur Insolubili- sierung eine aliquote Menge auf eine andere Microtiterplatte übertragen. Nach dem Waschen wird eine Streptavidin-ß-Galactosidaselösung zuge¬ fügt. Die adsorbierte Galactosidaseaktivität wird durch die Freisetzung von p-Nitrophenol aus p-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid bestimmt und bildet ein Maß für die Konzentration des Faktors XIII. Auch diese Metho¬ de ist noch sehr aufwendig und durch die verschiedenen Übertragungs¬ schritte ungenau.
Es bestand daher die Aufgabe, eine einfaches, mit möglichst wenigen Reagenzien und Reaktions- und Waschschritten auskommendes ana¬ lytische Verfahren zur Bestimmung des Blutgerinnungsfaktors XIII (Plasma-Transglutaminase und Thrombocyten-Transglutaminase) und anderer Transglutaminasen der Enzymgruppe EC 2.3.2.13 zu finden, das möglichst automatisierbar und von ungeschulten Fachkräften durch¬ führbar ist.
Die Lösung dieser Aufgabe ist in dem Hauptanspruch wiedergegeben. Die Unteransprüche dienen zur Förderung dieses Verfahrens.
Dadurch, daß die Micro titerplatten zunächst mit dem Protein oder Polypeptid, vorzugsweise mit Casein belegt werden, kann dieses in opti¬ maler Konzentration eingesetzt werden, so daß alle aktiven Stellen der Microtiterplatte, an die sich solche Proteine oder Polypeptide anlagern können, blockiert werden. Dadurch wird die im Verfahren von 'Velasco' und 'Lee' notwendige Stufe, zwischen der Anlagerung des Caseins und der Reaktion mit den Antikörpern zunächst freie aktive Zentren der Mi¬ crotiterplatte mit Milchproteinen zu blockieren, eingespart. Auch die in den Verfahren von "Velasco' und 'Lee' notwendige Blockierung der im reaktiven Protein enthaltenen freien Aminogruppen von Lysinresten des Proteins durch Methylierung oder Acetylierung wird überflüssig, da durch die Fixierung des Proteins auf der Oberfläche der Microtiterplatte aus Gründen der fehlenden Mobilität der Proteine zueinander diese freien Aminogruppen nicht mehr in Wechselwirkung mit freien Aminogrup- pen der Glutaminreste des Proteins treten können. So stehen alle freien Aminogruppen der Glutaminreste des Proteins für die Reaktion mit dem löslichen primären Amin der Reaktionsmischung zur Verfügung. Gleichzeitig vergrößert sich zudem die Auswahl der für das Verfahren einsetzbaren Proteine und Peptide.
Bei verschiedenen handelsüblichen Microtiterplatten aus Kunststoff, beispielsweise solchen aus Polystyrol, ist die Oberfläche so beschaffen, daß Proteine und Peptide in ausreichendem Maße nichtkovalent zu binden. Als Reaktionsgefäße können natürlich auch solche aus anderen Kunst¬ stoffen wie Polyethylen, Polycarbonat oder Polypropylen verwendet wer¬ den. Soweit diese die erforderlichen Proteine und Peptide nicht in aus¬ reichendem Maße adsorbieren, kann die Oberfläche zusätzlich durch Glutaraldehyd, Cyanbromid oder andere Aktivatoren aktiviert werden.
Die Form der Reaktions- und Meßgefäße ist natürlich völlig variabel, so können bespielsweise Kunststoffreagenzröhrchen oder Zentrifugen- röhrchen oder Photometerküvetten verschiedenster Form verwendet wer¬ den. Am einfachsten und preiswertesten ist die Durchführung der Teste mit handelsüblichen Microtiterplatten, beispielsweise mit 96 Vertiefun¬ gen von jeweils 300 - 400 μl Volumen, oder Microtiterstrips mit 8, 12 oder 16 Vertiefungen von ebenfalls 300 - 400 μl Volumen, da diese sich für die Durchführung von Reihenversuchen besonders gut eignen.
Als Protein wird insbesondere Casein verwendet, da sowohl Faktor XIII wie auch Gewebe- und Zell-Transglutaminasen mit diesem Substrat reagieren. Jedoch können auch andere glutaminhaltige Substrate in gleicher Weise eingesetzt werden. Neben Caseinfraktionen oder proteo¬ lytischen Caseinderivaten kommen dafür natürliche Faktor XIII- oder Transglutaminasesubstrate wie Fibrinogen, Collagen, Fibronectin, Thrombospondin, etc. sowie Derivate und Fragmente dieser Proteine ebenso in Frage wie natürliche und synthetische Peptide, die das zur Reaktion notwendige Glutamin enthalten. Voraussetzung ist, daß die Substanzen absolut frei von Transglutaminas sind, was bei nativem Fibrinogen und Fibronectin nicht imme gewährleistet ist. Da sich die glutaminhaltigen Substrate in ihrer Reak tionsfähigkeit mit den Transglutaminasen wie auch in ihrer Bindungs fähigkeit an die Kunststoffoberflächen der Reaktionsgefäße unterschei den, ist es erforderlich, bei der Messung der Transglutaminaseaktivitä Kontrollproben mit bekannter Aktivität mitzuführen.
Die Bindung des glutaminhaltigen Substrates an das Reaktionsgefäß (di Microtiterplatte) kann entweder kurz vor der eigentlichen Durchführun der Bestimmungen erfolgen, es können aber auch die beschichteten Plat¬ ten unter sterilen Bedingungen gefertigt und gelagert werden.
Für das reaktive primäre Amin der Formel I sind solche besonders geeignet, welche eine lineare Methylenkette mit 4 - 8 C-Atomen besitzen, wobei soche mit 5 - 6 C-Atomen besonders bevorzugt sind. Bei kürzeren Ketten ist aus sterischen Gründen offensichtlich eine Reaktion nicht mehr möglich, bei längeren Ketten nimmt die Reaktionsgeschwindigkeit stark ab. Als Substituenten -X- der Formel (I) kommen praktisch alle Gruppen in Frage, welche die Transglutaminasereaktion nicht stören, jedoch eine Antikörperreaktion eingehen. Größere, gegebenenfalls substi¬ tuierte carbozyklische Gruppen sind besonders geeignet, wobei eine gewisse Hydrophobizität die Reaktionsfähigkeit der nucleophiolen primären Aminogruppe zu erhöhen scheint.
Die aus der Literatur bekannten Substrate Dinitrophenylcadaverm, Biotinamido-pentylamin und Dansylcadaverin sind daher beispielsweise geeignet.
Neben monoclonalen Antikörpern können auch polyclonale Antikörper verwendet werden, sofern diese für die vorstehenden Substrate genügend spezifisch sind und in ausreichend reiner Form verfügbar sind, so daß eine Kopplung mit einem Indikatorenzym möglich ist. Eine Reinigung derartiger polyclonaler Antiseren kann durch Affinitätschromatographie oder Ionenaustauschchromatographie erfolgen. In jedem Fall muß durch eine Kontrollreaktion mit Faktor Xlll-freiem Plasma bzw. trans- glutaminasefreier Probe geprüft werden, daß bei solchen polyclonale Antikörpern keine Reaktivität mit den normalen Plasma- ode Probenkomponenten oder Komponenten der Beschichtungslösungen de Reaktionsgefaße besteht.
Als Markierung für die verwendeten Antikörper kommt vorzugsweise ei Enzym in Frage, um dadurch die Analysenempfindlichkeit entsprechen zu steigern. Die in der Technik gebräuchlichen Markierungen mit alka lischer Phosphatase, Peroxidase oder Urease können auch für diese Test mit Vorteil eingesetzt werden. Entsprechende Nachweisreagenzien sin bekannt, beispielsweise seien für die alkalische Phosphatase p-Nitro phenylphosphat, für Peroxidase 2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenzthiazolin-6-sul fonsäure) oder o-Phenylendiamin und für Urease Bromcresolpurpur ge nannt.
Soweit es für die Nachweisempfindlichkeit ausreicht, können auc Markierungen mit chromophoren, insbesondere fluoreszierenden Grup pen verwendet werden, wodurch die zusätzlichen Nachweisreaktione verbleiben und die Reaktion direkt photometrisch verfolgt werden kann Radioaktive Markierungen sind wegen der damit verbundenen Sicher heitsvorkehrungen und des apparativen Aufwandes in vielen Laborato rien nicht" erwünscht, jedoch läßt sich selbstverständlich das erfindungs gemäße Verfahren auch durch eine radioaktive Markierung entwede des eingesetzten primären Amins, oder des verwendeten Antikörper durchführen. Im ersteren Falle kann bereits die Stufe der Antikörper markierung des Reaktionsproduktes entfallen, in dem zweiten Fall kan erst anschließend an diese Markierung und die Auswaschung über schüssiger Antikörper eine Radioaktivitätsmessung der gebundenen Sub strate erfolgen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere auf den Nachweis de Blutgerinnungsfaktors XIII (Plasmatransglutaminase) ausgearbeite worden, jedoch können auch die anderen Enzyme der Nummer EC 2.3.2.13 auf diese Weise bestimmt werden.
In den folgenden Beispielen ist die Erfindung näher beschrieben, ohne daß dadurch eine Beschränkung beabsichtigt ist. S
Beispiel 1
Belegen einer Microtiterplatte mit Casein
a) Nichtkovalente Bindung durch hydrophobe Interaktion
Gereinigte Microtiterplatten mit 96 Vertiefungen ä 400 μl aus Polystyrol werden mit einer Lösung aus Casein in 0.1 M Phosphat¬ puffer pH 8.0, oder 0.05 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan und 0.1 M NaCl, pH 8.5 bei 37°C inkubiert. Die optimale Konzentration des Caseins liegt zwischen 3 und 6 μg/ml Lösung, die Inkubations¬ zeit bei 37°C sollte mindenstens 2 Stunden und höchstens 24 Stunden betragen. Die Microtiterplatten werden anschließend entleert und mit einer Pufferlösung, beispielsweise mit gepufferter NaCl-Lösung gespült.
b) Kovalente Bindung nach Aktivierung mit Glutaraldehyd
Gereinigte Microtiterplatten mit 96 Vertiefungen ä 400 μl aus Polystyrol werden mit einer Lösung aus 0.25 % Glutaraldehyd in 0.1 M Phosphatpuffer pH 5.0 für 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Lö¬ sung wird ausgekippt, die Platten mit 0.1 M Phosphatpuffer pH 5.0 gewaschen, mit der Caseinlösung aus 3 - 6 μg/ml Casein in 0.1 M Phosphatpuffer pH 8.0 gefüllt und zwischen 2 und 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Lösung wird anschließend ausgekippt und die Platten 1 Stunde mit einer Lösung aus 0.1 M Glycin oder Ethanolamin in 0.1 M Phosphatpuffer pH 8.0 bei 37°C inkubiert, um freie aktive Gruppen zu blockieren. Die Microtiterplatten werden an¬ schließend entleert und mit einer Pufferlösung, beispielsweise mit gepufferter NaCl-Lösung gespült.
Die Auswirkung der Caseinkonzentration in der Caseinlösung auf die Empfindlichkeit des Tests für zwei Typen von Polystyrol-Microtiterplatten mit und ohne Glutaraldehydaktivierung ist in Abbildungen 1 und 2 gezeigt. Eine optimale Empfindlichkeit wird in einem Konzentrations¬ bereich von 1 - 10, vorzugsweise von 3 - 6 μg Casein pro ml Pufferlösung erzielt. Abbildung 3 zeigt vergleichende Versuche mit Casein und dem proteo lytischen Fibrinogenfragment D als Beschichtungsmaterial. Sowohl Ca sein wie Fibrinogenfragment D zeigen eine der Transglutaminase- aktivität des Faktors XIII proportionale empfindliche Reaktion. Die Mes¬ sungen für die Abbildungen 1, 2 und 3 wurden gemäß Beispiel 2 und 3 mit standardisierten Proben bekannter Faktor XHI-Aktivität durchgeführt.
Beispiel 2
Durchführung der Transglutaminasereaktion zur Messung der Faktor XIII-Aktivität
a) Pufferlösung zur Probenverdünnung
Eine Pufferlösung wird hergestellt aus :
0.05 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan und
0.05 M Natriumchlorid und der pH mit 1 M HC1 auf einen Wert von 7.4 eingestellt.
Die eingesetzten Proben werden mit dem Probenverdünnungspuffer verdünnt, wobei zur Messung der Faktor XIII-Aktivität im menschlichen Blutplasma eine Verdünnung zwischen 1 : 15 und 1 : 40, insbesondere 1 : 20 verwendet wird. Für andere Proben ergeben sich andere Verdünnungsfaktoren.
b) Pufferlösung zum Waschen der Microtiterplatten
Eine Puffer-Stammlösung wird hergestellt aus :
0.2 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, pH 7.4
1.4 M Natriumchlorid
0.003 M Kaliumchlorid
0.5 % Tween 20 (Polyethoxysorbitanlaureat) und vor Gebrauch 1 : 10 mit destilliertem Wasser verdünnt. Λ O
c) Substratlösimg
Die Substratlösung des aktiven Amins wird hergestellt aus:
0.1 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanpuffer, pH 7.4
0.1 M Natriumchlorid
0.06 M Calciumchiorid
0.005 M Dithioerythritol (DTE)
0.001 M Dinitrophenylcadaverin (DNPC)
d) Thrombinlösung
1000 - 1500 NIH U lyophilisiertes Thrombin werden in 10 ml destil¬ liertem Wasser gelöst.
Durchfuhrunςr der Reaktion
Eine Microtiterplatte (96 Vertiefungen) gemäß Beispiel 1 wird mit Lösung b) gespült. Je Vertiefung werden 100 μl verdünnte Probe, 100 μl Sub¬ stratlösung c) und 100 μl Thrombinlösimg eingefüllt (2 bis 3 Parallelver¬ suche pro Probe und Kontrolle mit Standardplasma mit bekannter Trans- glutaminasekonzentration und Faktor Xπi-Mangelplasma). Nach 10 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wird der Reagenzüberstand mit Lösung b) ausgespült.
Beispiel 3
Verstärkung der Meßempfindlichkeit durch das Antikörper-Enzvmkon- iugat
Microtiterplatten gemäß vorstehendem Beispiel werden anschließend an die Substratreaktion mit 250 μl/Vertiefung einer Anti-Dinitrophenyl- Antikörperkonjugat-Lösung aus 25 μl Antikörperkonjugat (Phosphatase- markiert) und 25 ml Lösung b) versetzt und 60 Minuten be Raumtemperatur inkubiert.
Das Antikörper-Enzymkonjugat wird durch Glutaraldehyd-Kopplung au kommerziell erhältlichem Antikörper (Fa. Sigma, Deisenhofen) un kommerziell erhältlichem Enzym alkalische Phosphatase (Fa Boehringer, Mannheim) nach einer von Harlow und Lane beschriebene Methode hergestellt (Harlow E, Lane D, Antibodies: A laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, U.S.A. (1988) Andere Methoden zur Kopplung von Antikörpern und Enzymen könne im beschriebenen Verfahren ebenso eingesetzt werden.
Nach der Inkubation wird die Microtiterplatte mit Lösung b) gewasche und mit 250 μl Phosphatase-Substratlösung pro Vertiefung versetzt.
Zur Herstellung der Phsphatase-Substratlösung werden gemischt: 5 ml 1 M Diethanolamin, 0.01 M Magnesiumchlorid, pH 9.5 15 mg p-Nitrophenylphosphat (Substrattablette, z.B. Fa. Sigma, Deisen¬ hofen) 20 ml destilliertes Wasser.
Anschließend wird die Absorption bei 405 nm photometrisch gemessen. Die Messung kann kinetisch durch Messungen nach festgelegten Inkuba¬ tionszeiten, vorzugsweise nach 10, 20, 30, 40, 50 und 60 Minuten, oder durch Endpunktmessung nach Hinzufügen eines Stopreagenzes, vorzugsweise 50 μl pro Vertiefung einer 3 M NaOH-Lösung, durchgeführt werden.
Durch Vergleich mit der Absorption der Kontrollen wird die Faktor XIII- Aktivität errechnet. Eine entsprechende Eichkurve ist in Abbildung 4 gezeigt.

Claims

Λ V
P a t e n t a n s p r ü c h e
Verfahren zur Bestirnmung des Blutgerinnungsfaktors XIII (Plasma-Transglutaminase und Thrombocyten-Transglutamxnase) und anderer Transglutaminasen der Enzyπigruppe EC 2.3.2.13, wobei
a) Microtiterplatten aus Kunststoffen oberflächlich mit einem Substrat der Transglutaminase beschichtet werden und
b) mit einer Lösung die ein weiteres Substrat der Trans¬ glutaminase, Calciumchiorid, eine als Reduktionsmittel wirkende Thioverbindung sowie eine Transglutaminase- haltige Probe auf der beschichteten Microtiterplatte zur Reaktion gebracht werden, wobei gegebenenfalls Thrombin zur proteolytischen Aktivierung der Transglutaminase zugefügt wird, dadurch gekennzeichnet, daß
c) das auf die Microtiterplatten beschichtete Substrat ein Glutamin enthaltendes Protein oder Peptid ist,
d) das in Lösung befindliche Substrat eine Verbindung mit einer primären Aminogruppe der allgemeinen Formel I
Figure imgf000014_0001
in welcher n eine ganze Zahl, von 4 - 8 und X eine inerte, mit spezifischen Antikörpern koppelnde Gruppe bedeutet, ist.
e) die durch Transglutaminase an die Platte gebundenen
Amine mit einem markierten Antikörper gegen die Gruppe X umgesetzt, f ) die Menge des gebundenen Amins bzw. des Antikörpers mittels eines geeigneten Nachweisreagenzes bestimmt
g ) und jeweils zwischen den einzelnen Schritten gelöste Reagenzreste ausgewaschen werden .
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das primäre Amin der Formel I Dinitrophenylcadaverin ist und mit einem enzymmarkierten Antikörper gegen Dinitrophenylgruppen umgesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper mit alkalischer Phosphatase, Peroxidase oder Urease markiert ist und mit einem Phosphatase-, Peroxidase- bzw. Urease- Reagenz bestimmt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper radioaktiv markiert ist und die Radioaktivität gemessen wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das primäre Amin oder der Antikörper mit einer fluoreszierenden Gruppe markiert ist und die Fluoreszenz gemessen wird.
6. Verfahren nach der Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in gepufferten Lösungen bei pH- Werten von 7.0 bis 8.5, vorzugsweise bei pH 7.4, und Temperaturen von 20 - 40°C, vorzugsweise 20 - 37°C, durchgeführt werden.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Microtiterplatten mit Caseinlösung beschichtet werden.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Thioverbindung Dithioerythritol (DTE, erythro-l,4-Dimer- capto-2,3-butandiol) oder Dithiothreitol (DTT, threo-l,4-Dimercapto- 2,3-butandiol) ist.
9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Thrombin Rinderthrombin oder Humanthrombin ist.
10. Reagenzkit zur Bestimmung des Blutgerinnungsfaktors XII (Plasma-Transglutaminase und Thrombocyten-Transglutaminase und anderer Transglutaminasen der Enzymgruppe EC 2.3.2.13 bestehend aus:
a) Microtiterplatte aus Kunststoff
b) Beschichtungslösung mit Proteinen oder Peptiden, welche Glu- tamin enthalten, in gepufferter Lösung,
oder
Microtiterplatten, welche mit Proteinen oder Peptiden, die Glu- tamin enthalten, vorzugsweise Casein, beschichtet sind
c) einer Reagenzlösung aus Calciumchiorid, einer Thioverbindung und einem primären Amin der Formel I
NH2-(CH2)n-X (I)
d) gegebenenfalls einer Thrombinlösung zum Nachweis throm- binabhängiger Transglutaminasen
e) einer markierten Antikörperlösung gegen die Gruppe X der Amins der Formel I
f) einem Nachweisreageπz für die Markierung des Antikörpers e)
g) Pufferlösungen zum Waschen
h) gegebenenfalls Eichlösungen mit normierter Trans- glutaminase-Aktivität.
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