WO1992012171A1 - Nuevos peptidos sinteticos con actividad inmunomoduladora y su preparacion - Google Patents

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WO1992012171A1
WO1992012171A1 PCT/ES1991/000087 ES9100087W WO9212171A1 WO 1992012171 A1 WO1992012171 A1 WO 1992012171A1 ES 9100087 W ES9100087 W ES 9100087W WO 9212171 A1 WO9212171 A1 WO 9212171A1
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María Luisa SUBIRA BADOS
Antonio Brugarolas Masllorens
Natalia Lopez Moratalla
María Jesús LOPEZ ZABALZA
Salvador Martin Algarra
Francisco Borras Cuesta
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Instituto Cientifico y Tecnologico de Navarra SA
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    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Definitions

  • the present invention refers to a series of new active peptides as modulators of the immune system. These peptides are useful in adoptive immunotherapy and as reagents for assessing cell-mediated immunity. These new molecules, due to their ability to induce toxic cyto activity, find therapeutic application in diseases originated or accompanied by alterations in the immune system, as in some types of cancer, infections and degenerative or congenital pathologies. They may also be useful in the prophylaxis of immune system dysfunctions.
  • Proteins and peptides, as well as other compounds derived from amino acids or other chemical structures, are already used as immunomodulators in clinical practice.
  • proteins or peptides are Interferon-gamma (The Merck Index 11 ed. NQ 4894), Interleukin-2 (The Merck Index 11 ed. NQ 4896) and Thymomodulin (The Merck Index 11 ed. NQ 9338).
  • the immunomodulators derived from amino acids a few compounds may be mentioned: Bucillamine (The Merck Index 11 ed. NQ 1447) and Ubinimex (The Merck Index 11 ed. NQ 9750).
  • Another group of immunomodulators is related to mono- or poly-saccharides. Representatives of this group are Amiprilose (The Merck Index 11 ed. N Q 499) and Lentian (The Merck Index 11 ed. NQ 5322).
  • Other immunostimulators have a heterocyclic or mixed structure. They belong to this group Muroctasin (The Merck Index 11 ed. NQ 6217), Platonin (The Merck Index 11 ed. NQ 7504), Procodazole (The Merck Index 11 ed. NQ 7769) and Tetramisole (The Merck Index 11 ed. NQ 9161 ).
  • the general characteristics of the peptides object of the present invention are defined by: i) the position of the Pro (located between aa 5 and aa 6 ) in relation to residues aa 2 and aa u , each representing them the amino acid residues indicated above; and ii) the length of the peptide chains represented by R x and R 2 , which may be the same or different; therefore the peptides object of the invention can have 15 to 35 amino acids.
  • the sarcosine functionalized polyamide gel resin is treated with diethylene diamine for about 10 hours and washed with abundant dimethylformamide (DMF).
  • the resin is then reacted with an activated arm (linkage agent in the Anglo-Saxon literature), the penta-fluorophenyl ester of 4-hydroxy-methyl-phenoxyacetic acid. Once this arm has been added, the Kaiser ninhydrin test is performed to ascertain the absence of free amino groups and, therefore, should be negative.
  • the symmetric anhydride of the first amino acid is prepared with the amino group protected with the fluorenemethyl oxycarbonyl group (Fmoc). Any other group present in the amino acid side chain must also be protected. with a group compatible with Fmoc modification technology.
  • the symmetric anhydride is allowed to react with the resin for 80 to 100 minutes, using dimethyl-amino-pyridine as the catalyst.
  • the resin is then washed with abundant dimethyl formamide (DMF) and the Fmo group is removed with 20% piperidine in DMF.
  • DMF dimethyl formamide
  • Symmetric anhydrides are prepared from the corresponding amino acids by activating them with dicyclohexylcarbodiimide in dichloromethane.
  • the insoluble dichlorohexyl urea that is formed as a byproduct is removed by filtration;
  • the dichloromethane is removed in a rotary instant evaporator and the symmetric anhydride present in the residue is dissolved in DMF and added to the resin.
  • the reaction is allowed to continue for 60-90 minutes, and if the ninhydrin test is negative, it shows the absence of free amino groups (Kaiser E, Colescott RL, Bossinger CD, Cook PI, Anal Biochem (1970) 34: 595). If the ninhydrin test is positive, this step is repeated. In the case of using active esters, the procedure is much simpler. The active ester (3 to 6 molar excess with respect to the resin) is dissolved directly in DMF containing a molar amount of 1-hydroxy-benzotriazole equivalent to that of the active ester, and added to the reaction mixture.
  • the Fmoc protecting group is removed with 20% piperidine in DMF. The cycle is repeated with the rest of the amino acids so that the polypeptide chain is grown from the C-terminal amino acid to the N-terminal amino acid.
  • the C-terminal amino acid is released from the resin under conditions in which the peptide is stable.
  • the reagent used is 95% trifluoroacetic acid, containing phenol, and ethanedithiol in proportions that depend on the amino acids present in the sample.
  • the side chain protecting groups of the amino acid are also cut with this reagent.
  • the obtained peptide is purified by high pressure liquid chromatography (HPLC) using a reversed phase C18 column equilibrated with 0.1% w / v tri-fluoroacetic acid in water, which constitutes the starting solvent. .
  • HPLC high pressure liquid chromatography
  • a linear gradient was established with the second solvent (acetonitrile containing 0.1% (w / v) trifluoroacetic acid) until 70% of the latter was reached.
  • Synthesized peptides have been tested for the cytotoxic activity they induce in lymphomononuclear cells from peripheral blood from healthy donors. Incubation is performed in the presence of different concentrations.
  • the most active peptides are those that carry proline between aa 5 and aa 7 , and together with aa 2 and aa n , adopting the values indicated above.
  • lymphomononuclear cells obtained from peripheral blood increases their cytotoxic activity against cells of the K562 and Daudi lines used as tumor target cells.
  • Control experiments using recognized immunomodulators, such as recombinant human interleukin-2, have shown similar activity, in the annihilation of K562 target cells and cells.
  • Daudi to that obtained with the peptides object of this invention, proliferation of lymphomononuclear cells is induced together with an increase in the number and proportion of CD14 +, CD56 + and CDllb + cells.
  • these peptides Due to their small size, when compared with proteins and other complex molecules, these peptides are presumably less toxic and immunogenic, and therefore are suitable as therapeutic agents in clinical disorders that occur with immune system disorders, as occurred in cancer, viral infections and immunodeficiencies. It could also be used in high-risk situations in elderly patients and children.
  • sarcosine-functionalized polyamide gel resin (0.3 mEq / g) is treated with 7 ml of ethylenediamine for 10 hours in a reactor with continuous stirring, and 10 washes are washed with enough dimethylformamide. The resin is then reacted with an active arm or binding agent.
  • 125.4 mg of this 4-hydroxy-methyl-phenoxyacetic acid (HMPA) penta-fluorophenyl (HMPA) and 48.64 mg of hydroxybenzotriaol (HOBT), both dissolved in DMF, are added and allowed to react for 90 minutes
  • 10 DMF washes are performed and the Kaiser ninhydrin test is performed, to make sure the absence of free amino groups.
  • the symmetric valine anhydride is prepared with its amino group protected by the fluoren-methyl-oxycarbyl group (Fmoc). To this end, 244.4 mg of amino acid is allowed to react with 74.28 mg of dicloexylcarbodiimide (DCC), both dissolved in dichloromethane. The symmetric anhydride, dissolved in DMF, is allowed to react with the resin for 80 to 10 minutes using 4.4 mg of dimethyl-amino-pyridine as a catalytic agent. The resin is then washed with abundant dimethyl formamide (DMF) and the 20% Fmoc co piperidine group in DMF is removed. The amino group is now ready to react with the carboxyl group of a new amino acid.
  • DCC dicloexylcarbodiimide
  • Symmetric anhydrides are prepared from the corresponding amino acids by activating them with dicyclohexylcarbodiimide in dichloromethane. The coupling reaction is allowed to continue for 90 minutes. If the ninhydrin test is negative, the protective group is removed Fmoc with 20% piperidine in DMF. The cycle is repeated with the rest of the amino acids in such a way that the polypeptide chain grows from the C-terminal amino acid to the N-terminal amino acid. To this end, the penta-fluorine-phenylene esters of glutamine were used
  • the bond linking the valine with the resin is broken, as well as protecting the side chain protecting groups of the amino acids from the sequence. This is done by adding 9 ml of the cutting mixture (95% trifluoroacetic acid, 2.5% phenol and 2.5% ethanedithiol) and letting it react overnight. The peptide is precipitated by the addition of ether, and several washes are made with this solvent. The precipitate is recovered after complete evaporation of the solvent.
  • the remaining amino acids are those specified in this example.
  • the remaining amino acids are those specified in this example.
  • R x Asn-Gly-Phe-Ile-Gln
  • R 2 Ala-Lys-Val
  • aa 2 Leu
  • aa u Glu.
  • the remaining amino acids are those specified in this example.
  • Mononuclear cells were obtained by leukapheresis of peripheral blood from healthy donors, processing 5 to 10 liters of whole blood and using a Fenwall CS-3000 continuous flow cell separator (Fenwall Laboratories, Deerfield, Illinois, USA). Access to the vascular system was obtained with a double-lumen central venous catheter.
  • lymphomononuclear cells were washed and counted and resuspended at a concentration of 2 x 10 6 per me in RPMI-1640 medium containing 10 penicillin units per ml, 200 mg gentamicin per ml, 2 mM glutamine per mi and 2.5% autologous serum in a PL-732 culture bag (Fenwall Laboratories, Deerfield, Illinois, USA).
  • the incubation medium contained 200 micrograms of the peptide under study.
  • Peptide number 1 (Peptide of Example 1).
  • Peptide number 2 (Peptide of Example 2).
  • Peptide number 3 (Peptide of Example 3).
  • Peptide number 4 (Peptide of Example 4).
  • Control peptide (Ala-Asp-Ala-Gln-Gln-Asn-Lys-Phe-Asn-Lys- Asp-Gln-Gln-Ser-Val. In this pentadecaptide peptide is lacking Proli ⁇ na.
  • the cells are cultured for 4 days in a Badora incu ⁇ 37QC moist air, 5% C0 2 and 21% 0 2.
  • a sample of one mi is extracted daily for microbiological studies. Changes in the cytotoxic capacity of lymphomononuclear cells before and after activation of the peptide are measured with the 51 Cr release assay, using target cells of the K562 and Daudi lines (Table I). Phenotypic changes of lympho-mononuclear cells are also evaluated, before and after activation of the peptide, with fluorescein-labeled mononuclear antibodies and with automated flow cytometry (Table II).
  • lymphomononuclear cells are very heterogeneous, because of the presence of surface markers (CD) allows the description of their phenotypes (Weissman IL, Fathman CG, J Exp Me (1973) 137: 504; Small M, Herzenberg CA, Weissman IL , Cel Immunol (1975) 15: 109).
  • CD surface markers
  • Table I Cytolytic activity induced by peptides against K562 and Daudi target cells. Nonuclear lymphoma cells have been obtained from three different healthy donors. (Standard value ⁇ standard error).

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Abstract

Se describen nuevos péptidos inmunomoduladores de fórmula general R1-aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-Pro-aa7-aa8-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-R2 en la cual R1 representa H, R2 representa OH, o bien R1 y R2 representan cada uno un resto de aminoácido o cadenas peptídicas, iguales o diferentes, que contienen 2 a 10 restos de aminoácidos, de tal modo que cuando R1=H y R2=OH, la fórmula representa un pentadecapéptido cuyos aminoácidos N-terminal y C-terminal son respectivamente aa1 y aa15; aa2 es un resto de Val, Leu, Ile, Ala, Lys o Gly; aa11 es un resto de Glu o Asp; y los otros restos de aminoácidos aan distintos de aa2 y aa11 pueden ser cualquiera de los 20 aminoácidos naturales. La incubación de estos péptidos con células linfomononucleares de sangre periférica aumenta su actividad citotóxica frente a células K562 y Daudi utilizadas como células diana de tumores. Se induce proliferación de las células linfomononucleares junto con un aumento en el número y proporción de células CD14+, CD56+ y CD11b+. Estos péptidos son útiles en bioterapia de cáncer y también como reactivos para evaluar la capacidad de respuesta celular del sistema inmune.

Description

NUEVOS PEPTIDOS SINTÉTICOS CON ACTIVIDAD INMUNOMODULADORA SU PREPARACIÓN
El presente invento' se refiere a una serie de nuevo péptidos activos como modulares del sistema inmune. Esto péptidos son útiles en inmunoterapia adoptiva y como reacti vos para evaluar la inmunidad mediada por células. Estas nu vas moléculas, por su capacidad para inducir actividad cito tóxica, encuentran aplicación terapéutica en enfermedade originadas o acompañadas por alteraciones en el sistema inmu ne, como ocurre en algunos tipos de cáncer, infecciones y pa tologías degenerativas o congénitas. Pueden ser útiles tam bién en la profilaxis de disfunciones del sistema inmune.
Fundamentos del invento
La participación de mecanismos inmunológicos en l patogenia y desarrollo de diversas enfermedades como cáncer, infecciones y patologías congénitas o degenerativas es bie conocida. Se sabe también que la modulación de las alteracio¬ nes inmunológicas, mediante la administración de moléculas me diadoras de citotoxicidad, puede modificar la evolución natu¬ ral de estas enfermedades, retrasando la aparición de compli¬ caciones o incluso induciendo la curación (Rosenberg SA, Mulé JJ, Spies PJ, Reichert CM, Schwaítz SL, J Exp Med (1985) 161:1169-1188). También es bien conocida la participación de péptidos y proteínas en algunos de los mecanismos que regulan la respuesta inmunológica. Investigaciones recientes han con¬ ducido a importantes descubrimientos en este campo que han permitido la identificación de moléculas implicadas en el fun cionamiento normal o anormal del sistema inmune (Young RA, Elliott TJ, Cell (1989) 59:5-8; Marx J, Science (1990) 249: 246-248); han conducido también a la síntesis de nuevas molé¬ culas con la intención de potenciar, modular o modificar los efectos obtenidos con productos naturales. La generación "in vitro" de células con actividad antitumoral a partir de célu¬ las linfomononucleares presentes en sangre periférica, o a partir de células linfomononucleares extraídas de tumores re- seccionados, ha puesto de manifiesto que es posible modular "ex vivo" el sistema inmune de tal manera que se abra la puer ta a nuevos abordajes terapéuticos en enfermedades resisten- tes hasta ahora a los tratamientos convencionales (Rosenberg SA. In De Vita VT, Hellman S, Rosenberg SA eds. Important advances in oncology. Philadelphia: JB Lippincott, 1986:55- -91; Topalian SL, Rosenberg SA eds. Important advances in oncology. Philadelphia: JB Lippincott, 1990:19-41). Las proteínas y los péptidos, así como otros com¬ puestos derivados de aminoácidos u otras estructuras quími¬ cas, se utilizan ya como inmunomoduladores en la práctica clínica. Entre las proteínas o péptidos cabe citar Interfe- ron- -gamma (The Merck Index 11 ed. NQ 4894), Interleukin-2 (The Merck Index 11 ed. NQ 4896) y Thymomodulin (The Merck Index 11 ed. NQ 9338).
Entre los inmunomoduladores derivados de aminoácidos pueden mencionarse unos cuantos compuestos: Bucillamine (The Merck Index 11 ed. NQ 1447) y Ubinimex (The Merck Index 11 ed. NQ 9750). Otro grupo de los inmunomoduladores está rela¬ cionado con mono- o poli-sacáridos. Representativos de este grupo son Amiprilose (The Merck Index 11 ed. NQ 499) y Lenti- nan (The Merck Index 11 ed. NQ 5322). Otros inmunoestimulado- res poseen una estructura heterocíclica o mixta. Pertenecen a este grupo Muroctasin (The Merck Index 11 ed. NQ 6217), Platonin (The Merck Index 11 ed. NQ 7504), Procodazole (The Merck Index 11 ed. NQ 7769) y Tetramisole (The Merck Index 11 ed. NQ 9161).
No obstante, este tipo de tratamiento está sujeto a controversia debido a la gravedad de algunos de los efectos secundarios (Osband ME, Ross S, Immunology Today (1990) 13: 193-195). Por esta razón, esta terapia queda reservada a cen¬ tros especializados en los que puedan evaluarse adecuadamente los factores inmunológicos que han de considerarse para su correcto manejo.
í HOJA SUSTITU I DAMM" 1 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Basándonos en los datos existentes en la bibliogra fía sobre la existencia de péptidos que se unen específica mente a los receptores implicados en la estimulación del si tema inmunitario (Bjorkman PJ, Saper MA, Samraoni B, Bennet WS, Strominger JL, Wiley DC, Nature (1987) 329:506; hite J, Hermán A, Pullen AM, Kubo R, Kappler J , Marrack P. Cel (1989) 56:27; Born W, Hall L, Dallas A, Boymel J, Schinnic T, Young D, Brennan P, O'Brien R, Science (1990) 249:67; Sette A, Buus S, Colon S, Smith JA, Miles C, Pierce SK, Pro Nati Acad Sci USA (1987) 84:1659), hemos realizado la sínte¬ sis de los péptidos objeto del invento. Estos péptidos indu¬ cen actividad citotóxica mediada por células linfo ononuclea- res. Los péptidos objeto del presente invento responden a la fórmula general
Rl~aal~aa2~aa3~aa4~aa5~Pro~aa7"aa8~aa9~aa10~ aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-R2 en la cual Rx representa H, R2 representa OH, o bien Rx y R2 representan cada uno de ellos un resto de aminoácido o cade¬ nas peptídicas, iguales o diferentes, que contienen 2 a 10 restos de aminoácidos, de tal modo que cuando RX=H y R2=0H, la fórmula representa un pentadecapéptido cuyos aminoácidos N-terminal y C-terminal son respectivamente aax y aa15; aa2 es un resto de Val, Leu, lie, Ala, Lys o Gly; aan es un resto de Glu o Asp; y los otros restos de aminoácidos aan distintos de aa2 y aa^ pueden ser cualquiera de los 20 aminoácidos natura- les con configuración L.
Por consiguiente, los péptidos del invento pueden tener desde 15 aminoácidos (caso de R1=H y R2=0H) hasta 35 aminoácidos, cuando el péptido de 15 aminoácidos es prolonga¬ do por ambos extremos, representando así cada uno de Rx y R2 desde ninguno hasta 10 restos de aminoácidos. La estructura preferida es aquélla en la que RX=H y R2=0H, y es fácilmente soluble en agua. Debe quedar claro que las características generales de los péptidos objeto del presente invento vienen definidas por: i) la posición de la Pro (situada entre aa5 y aa6) en relación con los restos aa2 y aau, representando cada uno de ellos los restos de aminoácidos anteriormente indicados; y ii) la longitud de las cadenas peptídicas represen¬ tadas por Rx y R2, que pueden ser iguales o diferentes; por tanto los péptidos objeto del invento pueden tener de 15 a 35 aminoácidos.
La síntesis química de estos péptidos se ha realiza¬ do mediante el método en fase sólida de Merriefield (Merrie- field RB; J Am Chem Soc (1963), 85:2149) con la modificación Fmoc (Atherton E, Logan JC, Sheppard CR, J Chem Soc Perkin Trans (1981), 1:538).
De acuerdo con esta técnica, la síntesis de los pép¬ tidos se realiza de la siguiente manera:
1. Preparación de la resina
La resina de gel de poliamida funcionalizada con sarcosina se trata con dietilendiamina durante unas 10 horas y de lava con abundante dimetilformamida (DMF). La resina se hace reaccionar luego con un brazo activado (linkage agent en la literatura anglosajona), el éster penta-flúor-fenílico del ácido 4-hidroxi-metil-fenoxiacético. Una vez que se ha agre¬ gado este brazo, se realiza el ensayo de la ninhidrina de Kaiser para cerciorarse de la ausencia de grupos aminos li¬ bres y que, por tanto, debe resultar negativo.
2. Unión del primer aminoácido al brazo activado de la resi¬ na:
Se prepara el anhídrido simétrico del primer aminoá- cido con el grupo amino protegido con el grupo fluorenmetil- oxicarbonilo (Fmoc). Cualquier otro grupo presente en la cadena lateral del aminoácido deberá ser igualmente protegido con un grupo compatible con la tecnología de modificació Fmoc. Se deja que el anhídrido simétrico reaccione con la re¬ sina entre 80 y 100 minutos, utilizando dimetil-amino-piri- dina como catalizador. Se lava luego la resina con abundant dimetil-formamida (DMF) y se procede a retirar el grupo Fmo con piperidina al 20% en DMF. El grupo amino está ahora listo para reaccionar con el grupo carboxilo de un nuevo aminoáci¬ do.
3. Etapa de formación del péptido:
El resto de los aminoácidos se incorporan secuen- cialmente utilizando sus anhídridos simétricos o sus esteres activos. Los anhídridos simétricos se preparan a partir de los correspondientes aminoácidos activándolos con diciclohe- xilcarbodiimida en diclorometano. La diclorohexil-urea inso- luble que se forma como subproducto se elimina por filtra¬ ción; el diclorometano se elimina en un evaporador instantá- neo rotatorio y el anhídrido simétrico presente en el residuo se disuelve en DMF y se agrega a la resina. Se deja que la reacción prosiga durante 60-90 minutos, y si el ensayo de la ninhidrina es negativo, ello muestra la ausencia de grupos aminos libres (Kaiser E, Colescott RL, Bossinger CD, Cook PI, Anal Biochem (1970) 34:595). Si el ensayo de la ninhidrina es positivo, se repite esta etapa. En el caso de utilizar este¬ res activos, el procedimiento es mucho más simple. El éster activo (3 a 6 de exceso molar con respecto a la resina) se disuelve directamente en DMF conteniendo una cantidad molar de 1-hidroxi-benzotriazol equivalente a la del éster activo, y se agrega a la mezcla de la reacción.
Si el ensayo de la ninhidrina resulta negativo, se procede a retirar el grupo protector Fmoc con piperidina al 20% en DMF. El ciclo se repite con el resto de los aminoáci- dos de tal manera que se haga crecer la cadena polipeptídica desde el aminoácido C-terminal a aminoácido N-terminal.
H OJA SU ST íTJJf DA 4. Etapa de liberación del péptido:
El aminoácido en posición C-terminal se libera de la resina en condiciones en las que el péptido es estable. El reactivo empleado es ácido trifluoroacético al 95%, conte¬ niendo fenol, y etanoditiol en proporciones que dependen de los aminoácidos presentes en la muestra. Los grupos protecto¬ res de cadenas laterales del aminoácido se cortan también con este reactivo.
5. Purificación del péptido:
El péptido obtenido se purifica mediante cromatogra¬ fía líquida de alta presión (HPLC) utilizando una columna de C18 de fase inversa equilibrada con 0,1% en p/v de ácido tri¬ fluoroacético en agua, que constituye el disolvente de parti¬ da. Se estableció un gradiente lineal con el segundo disolven te (acetonitrilo conteniendo 0,1% (p/v) de ácido trifluoroacé tico) hasta que se alcanzó el 70% del último.
Características estructurales de los nuevos péptidos objeto del invento
Los péptidos sintetizados se han ensayado con res- pecto a la actividad citotóxica que inducen en células lin¬ fomononucleares procedentes de sangre periférica de donantes sanos. La incubación se realiza en presencia de distintas concentraciones. Los péptidos más activos son los que llevan la prolina entre aa5 y aa7, y junto con aa2 y aan, adoptando los valores indicados anteriormente.
La incubación de los péptidos activos con células linfomononucleares obtenidas de sangre periférica aumenta su actividad citotóxica frente a células de las líneas K562 y Daudi utilizadas como células diana de tumores. Experimentos de control utilizando inmunomoduladores reconocidos, tal como ínterleukin-2 recombinante humana, han mostrado una actividad similar, en la aniquilación de células diana K562 y células Daudi, a la obtenida con los péptidos objeto de este invent Se induce proliferación de las células linfomononuclear junto con un aumento en el número y proporción de célul CD14+, CD56+ y CDllb+. Estos resultados indican que est péptidos pueden ser utilizados en inmunoterapia adoptiva pa el cáncer, y también como reactivos para evaluar la capacid de respuesta celular del sistema inmune.
Debido a su pequeño tamaño, si se comparan con pr teínas y otras moléculas complejas, estos péptidos son pres miblemente menos tóxicos e inmunogénicos, y, por tanto, s adecuados como agentes terapéuticos en desórdenes clínic que cursan con alteraciones del sistema inmune, como ocur en cáncer, infecciones víricas e inmunodeficiencias. Podrí utilizarse también en situaciones de alto riesgo en pacient ancianos y en niños.
El invento se ilustra con algunos ejemplos.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Síntesis del péptido
Asn-Val-Leu-Gly-Ala-Pro-Lys-Lys-Leu-Asn-Glu-Ser-Gln-Ala-Va Este pentadecapéptido responde a la fórmula general anterio cuando
Rχ *= H, R2 - OH, aa2 - Val, aa^ = Glu
y los restantes aminoácidos son los especificados en el ejem plo.
1. Preparación de la resina:
Doscientos mg de resina de gel de poliamida funcio nalizada con sarcosina (0,3 mEq/g) se tratan con 7 mi d etilendiamina durante 10 horas en un reactor con agitació continua, y se hacen 10 lavados con bastante dimetilformami da. Se hace reaccionar luego la resina con un brazo activad o agente de unión. Para ello se añaden 125,4 mg del éste penta-fluor-fenílico del ácido 4-hidroxi-metil-fenoxiacétic (HMPA) y 48,64 mg de hidroxibenzotriaol (HOBT), ambos disuel tos en DMF, y se deja reaccionar durante 90 minutos. A conti nuación se hacen 10 lavados con DMF y se realiza el ensayo d la ninhidrina de Kaiser, para cerciorarse de la ausencia d grupos aminos libres.
2. Unión del primer aminoácido al brazo activado de la resi na:
Se prepara el anhídrido simétrico de la valina co su grupo amino protegido por el grupo fluoren-metil-oxicarbo nilo (Fmoc). A este fin, se deja que reaccionen 244,4 mg de aminoácido con 74,28 mg de dicloexilcarbodiimida (DCC), ambo disueltos en diclorometano. Al anhídrido simétrico, disuelt en DMF, se le deja reaccionar con la resina durante 80 a 10 minutos utilizando 4,4 mg de dimetil-amino-piridina com agente catalítico. A continuación se lava la resina con abun- dante dimetil-formamida (DMF) y se' elimina el grupo Fmoc co piperidina al 20% en DMF. El grupo amino está ahora listo para reaccionar con el grupo carboxilo de un nuevo aminoáci¬ do.
3. Incorporación de los catorce aminoácidos restantes:
Se añaden a la resina 154,65 mg del éster penta- -flúor-fenílico de la alanina disuelto en DMF junto con 43,8 mg de 1-hidroxi-benzotriazol (HOBT). El resto de los amino- ácidos se incorporan secuencialmente utilizando sus anhídri¬ dos simétricos o los esteres activos para conseguir la reac¬ ción.
Los anhídridos simétricos se preparan a partir de los correspondientes aminoácidos activándolos con diciclo- hexilcarbodiimida en diclorometano. Se deja que la reacción de copulación prosiga durante 90 minutos. Si el ensayo de la ninhidrina resulta negativo, se elimina el grupo protector Fmoc con piperidina al 20% en DMF. Se repite el ciclo con el resto de los aminoácidos de tal manera que la cadena polipep- tídica crece del aminoácido C-terminal al aminoácido N-termi¬ nal. A este fin, se utilizaron los esteres penta-flúor-fení- lieos de glutamina
(173,16 mg), serina (171,21 mg), ácido glutámico (691,66 mg), asparagina (168,62 mg), leucina (168,33 mg) , usina (205,63 mg), usina (205,63 mg), prolina (163,44 mg), alanina (154,65 mg), glicina (150,12 mg), leucina (168,33 mg), valina (163,33 mg) y asparagina (168,62 mg).
4. Etapa de liberación del péptido:
Después de eliminar el grupo Fmoc del último amino- ácido incorporado, se rompe el enlace que une la valina con la resina, así como se escinden los grupos protectores de las cadenas laterales de los aminoácidos de la secuencia. Esto se realiza mediante adición de 9 mi de la mezcla de corte (ácido trifluoroacético al 95%, fenol al 2,5% y etanoditiol al 2,5%) ya dejándolo reaccionar durante toda una noche. Se precipita el péptido por la adición de éter, y se hacen varios lavados con este disolvente. Se recupera el precipitado después de la evaporación completa del disolvente.
Ejemplo 2
Procediendo del mismo modo que en el Ejemplo 1 se sintetiza el péptido siguiente:
Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Pro-Ser-Val-Ser-Lys-Glu-lie-Leu-Ala-Val
Este pentadecapéptido responde a la fórmula general anterior cuando
R: = H, R2 = OH, aa2 = Leu, aau = Glu
Los restantes aminoácidos son los especificados en este ejemplo.
Ejemplo 3
Procediendo de modo análogo al del Ejemplo 1 se sin tetiza el péptido siguiente:
Glu-Ile-Leu-Asn-Met-Pro-Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Val
Esta pentadecapéptido responde a la fórmula general anterior cuando
Rx = H, R2 = OH, aa2 = lie, aau = Glu
Los restantes aminoácidos son los especificados e este ejemplo.
Ejemplo 4
Asn-Gly-Phe-Ile-Gln-Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Pro-Ser-Val-Ser-Lys- -Glu-Ile-Leu-Ala-Glu-Ala-Lys-Val
Este péptido, que consta de 23 restos de aminoácidos, corres¬ ponde a la fórmula general anterior cuando
Rx = Asn-Gly-Phe-Ile-Gln, R2 = Ala-Lys-Val, aa2 = Leu, aau = Glu.
Los restantes aminoácidos son los especificados en este ejemplo.
ESTUDIO DE LAS PROPIEDADES BIOLÓGICAS DEL PEPTIDO OBJETO DEL INVENTO
Generación de células con actividad citotóxica frente a célu¬ las diana NK sensibles y NK resistentes.
1. Leucaféresis
Se obtuvieron por leucaféresis células mononucleares de sangre periférica de donantes sanos, procesando 5 a 10 litros de sangre entera y empleando un separador celular de flujo continuo Fenwall CS-3000 (Fenwall Laboratories, Deer- field, Illinois, EE.UU.). Se obtuvo acceso al sistema vascu- lar con un catéter venoso central de doble luz.
2. Activación de células mononucleares in vitro
Se lavaron y contaron células linfomononucleares separadas y se las volvió a suspender a una concentración de 2xl06 por mi en un medio de RPMI-1640 que contenía 10 unida¬ des de penicilina por mi, 200 mg de gentamicina por mi, 2mM de glutamina por mi y 2,5% de suero autólogo en una bolsa de cultivo PL-732 (Fenwall Laboratories, Deerfield, Illinois, EE.UU. ). El medio de incubación contenía 200 microgramos del péptido que se está estudiando.
Péptido número 1 (Péptido del Ejemplo 1). Péptido número 2 (Péptido del Ejemplo 2). Péptido número 3 (Péptido del Ejemplo 3). Péptido número 4 (Péptido del Ejemplo 4).
Péptido de control (Ala-Asp-Ala-Gln-Gln-Asn-Lys-Phe-Asn-Lys- Asp-Gln-Gln-Ser-Val. En este pentadecapéptido falta la Proli¬ na. Este péptido de control tiene en común con los péptidos objeto del invento solamente aau=Asp).
Las células se cultivan durante 4 días en una incu¬ badora de aire húmedo a 37QC, 5% de C02 y 21% de 02. Se ex¬ trae diariamente una muestra de un mi para estudios micro- biológicos. Los cambios en la capacidad citotóxica de las célu¬ las linfomononucleares antes y después de la activación del péptido se miden con el ensayo de liberación de 51Cr, utili¬ zando células diana de las líneas K562 y Daudi (Tabla I). Se evalúan también los cambios fenotípicos de las células linfo- mononucleares, antes y después de la activación del péptido, con anticuerpos mononucleares marcados con fluoresceína y con citometría de flujo automatizada (Tabla II). Es bien sabido que las células linfomononucleares son muy heterogéneas, per la presencia de marcadores de superficie (CD) permite la des cripción de sus fenotipos (Weissman IL, Fathman CG, J Exp Me (1973) 137:504; Small M, Herzenberg CA, Weissman IL, Cel Immunol (1975) 15:109).
Tabla I. Actividad citolítica inducida por péptidos frente células diana K562 y Daudi. Se han obtenido células linfomo nonucleares de tres donantes sanos diferentes. (Valor medi ± error estándar).
ACTIVIDAD CITOTOXICA (%)
PEPTIDO DAUD K562
Ninguno Péptido nS 1 Péptido nQ 2 Péptido nQ 3 Péptido nQ 4 Péptido de control
Figure imgf000014_0001
Tabla II. Fenotipos de las células linfomononucleares después de la activación del péptido. Se han obtenido células linfo¬ mononucleares de tres donantes sanos diferentes. (Valor medio ± error estándar).
CÉLULAS QUE EXPRESAN MARCADORES DE SUPER FICIE (%)
PEPTIDO CD3 CD8 CDllb CD14 CD16 CD56 Ninguno 59 ± 3 17 ± 2 14 ± 4 9 ± 1 11 ± 5 6 ± 2 Péptido nQ 1 60 ± 1 17 ± 1 23 ± 5 17 ± 4 22 ± 7 18 ± 6 Péptido nQ 2 58 ± 2 18 ± 2 24 ± 3 18 ± 3 22 ± 6 17 ± 5 Péptido nQ 3 59 ± 3 17 ± 2 23 ± 4 18 ± 3 21 ± 5 18 ± 5 Péptido nQ 4 58 ± 3 18 ± 2 • 21 ± 3 17 ± 4 21 ± 6 17 ± 5 Péptido de control 60 ± 2 17 ± 2 13 ± 4 9 ± 2 12 ± 4 6 ± 2

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Nuevos péptidos activos como inmunomoduladores que responden a la fórmula general
R--aa--aa2-aa2-aa.-aa--Pro-aa--aag-aaQ-a .Q- aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-R2
en la cual R1 representa H, R2 representa OH, o bien R^ y R2 representan cada uno de ellos un resto de aminoácido o cade¬ nas peptídicas, iguales o diferentes, que contienen 2 a 10 restos de aminoácidos, de tal modo que cuando RX=H y R2=0H, la fórmula representa un pentadecapéptido cuyos aminoácidos N-terminal y C-terminal son respectivamente aax y aa15; aa2 es un resto de Val, Leu, lie, Ala, Lys o Gly; aan es un resto de Glu o Asp; y los otros restos de aminoácidos aan distintos de aa2 y aan pueden ser cualquiera de los 20 aminoácidos natura¬ les con configuración L.
2. Síntesis de los péptidos según la reivindicación 1, siguiendo el método de fase sólida para la síntesis quími- ca de los péptidos.
3.- Uso de los péptidos según la reivindicación 1 en el tratamiento del cáncer.
4.- Uso de los péptidos según la reivindicación 1 en el tratamiento de afecciones causadas o acompañadas por inmu- nodepresión.
5.- Uso de los péptidos activos como inmunomodulado¬ res según las reivindicaciones 1 y 2 como reactivos de labo¬ ratorio para el estudio de la inmunidad celular en sujetos sanos y enfermos, y como herramienta para el diagnóstico de cáncer, infecciones y enfermedades que cursen con disfuncio¬ nes del sistema inmunitario.
6.- Uso de los péptidos según la reivindicación 1 en la profilaxis de disfunciones del sistema inmunitario en sujetos sanos y ante situaciones de alto riesgo de pacientes ancianos y niños.
7.- Uso de los péptidos según la reivindicación 1 en el tratamiento de la inmunodeficiencia.
8.- Uso de los péptidos según la reivindicación 1 en el tratamiento de enfermedades autoinmunes y degenerativas.
9.- Uso de los péptidos según la reivindicación 1 para la obtención de células linfomononucleares activadas destinadas a aplicarse en el diagnóstico y tratamiento de estados acompañados o causados por disfunciones inmunológi- cas.
10.- Uso de los péptidos según la reivindicación 1 en inmunoterapia adoptiva.
HOJA SUSTITXJIOA
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