WO1992012251A1

WO1992012251A1 - Procede de production d'acide (r)-malique, hydratase de maleate microbienne et procede de production de cette hydratase

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Publication number: WO1992012251A1
Application number: PCT/JP1991/000025
Authority: WO
Inventors: Kiyoshi Nakayama; Yukie Kobayashi
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Priority date: 1991-01-14
Filing date: 1991-01-14
Publication date: 1992-07-23
Anticipated expiration: 1993-07-14
Also published as: EP0567642A4; US5270190A; EP0567642A1

Description

明細書

(R) — リンゴ酸の製造法、微生物マレイン酸ヒドラタ一ゼ、および微生物マレイン酸ヒドラタ一ゼの製造法

技術分野

本発明は、マレイン酸の水和反応による（R) — リンゴ酸の製造法に関するものである。本発明はまたマレイン酸から水和反応により（R) — リンゴ酸を生成する反応を触媒する酵素、および、該酵素を製造する方法に関するものである。

(R) 一リンゴ酸は、光学活性ィソセリン、光学活性パントラクトン、光学活性な S—ラクタム合成中間体、フェロモンなどの有用物質合成の前駆体として有用な化合物である。

背景技術

(R) ーリンゴ酸は非天然型リンゴ酸であり、光学活性のィソセリン、パントラクトン、 β—ラウタ、フェロモンなど種々の有用な化合物合成の前駆体として有用である。

(R) 一リン酸の光学対称体であり、天然型のリンゴ酸である（ S ) — リンゴ酸は、現在酵素法によりフマール酸から製造されている。フマール酸またはマレイン酸無水物の化学的水和では、（R, S ) — リンゴ酸（ラセミ型リンゴ酸）が生成し、光学活性のリンゴ酸はえられない。合成法による（R) — リンゴ酸またはその誘導体のいくつかの方法が知られている。ワインベリおよびスターリング〔Wynbery, H . , S taring, E . G . J . ： J . A me . C hem. S oc. , 104, 166 (1982)3 は、キニジンにより触媒される不斉シクロ附加反応の応用により、（R) — リンゴ酸を 79%の全収率で合成した。ヘンローら ί H enrot, S . L archeveque, M. , Petit, Y .： J

C hem. S oc. , Perkin . Trans. 1 , Synth. C ommun

(16) 183 ( 1 9 8 6 ) 〕は（R) —ァスパラギン酸から 3段階で（R) — リンゴ酸を全収率 68%で合成した。ゼーバッハら

C H ungerbiihler, E. , Seebach, D . ： Helv. Chem. Acta, 64, 1467 (1981) 〕およびアルベジア二とハネシアン [Albegini, M. および Hanessian, S. ： J_. 0 rg. C h em. , 52,

278 (1987)3 は、（R, R) —酒石酸ジメチルエステルから

(R) — リンゴ酸ジメチルエステルの合成を記載した。（R) 一リンゴ酸はまた（R， S ) —リンゴ酸の分割によっても調製された〔西独国特許出願公開第 2,933, 895 号明細書；特開昭 57-5 6439号公報；特開昭 60- 204741 号公報；欧州特許出願公開第 14 9, 885 号明細書； S ynthesis, 1985 (2)， 214; 米国特許第 4, 912， 042 号明細書（1990)〕。高速液体ク口マトグラフィ一による（R, S)—リンゴ酸の分割も報告された〔B enecke, I . ： J . C hromatog. , 29L_155 (1984) 〕。分極エレクトレットを用いる不斉合成も記載されている〔Rom 67,279 (1979) ― C hem, Abstr. 93 : , 238846 a (1980) 〕。しかしこれらの方法は、出発原料または分割剤が高価で操作が複雑であるため工業的観点からは不利である。（S) — リンゴ酸のフマール酸からの酵素法による製法は知られている〔例えば、 Kitahara, K. , Fukui, S . , Μ isawa , Μ. ： J . G en. A p 1 .

Microbiol. ， 6^ 108 (I960)〕。（ S )—リンゴ酸はまたマレイン酸から、マレイン酸からフマール酸生成を触媒するシス一トランスイソメラーゼをもつ細菌を用いてフマール酸を経て生産される〔O tsuka, K . ： A gric. B io , C hem.， 25， 726 (1961)〕

サックスおよびェンセン [S acks, W. , J ensen, C O. ： J . B iol. C hem. , 192^_ 231 ( 1 9 5 1 ) 〕は、トウモロコシの芯からのヒドラターゼを用いてマレイン酸からリンゴ酸の生成を観察したが、生成したリンゴ酸の立体異性については明らかにしていない。マレイン酸からの（R) — リンゴ酸の生成は、ほ乳動物のじん臓の抽出液を用いて認められた〔Taggart, J . V. , A ngielski, S . , M ore 11, H . ： B iochem.

B iophys. Acta. 58, 141 (1962)〕が、陰イオンによる活性化の他は酵素の性質は明らかにされていない〔B ritten, J . S . , Morel 1, Η . , Taggart, J. ， B iochem. B iophys.

Acta , 185, 220 (1969) 〕。土から分離されたシユードモナス属菌株の抽出液によるマレイン酸からの（R) — リンゴ酸の生成が報告されている CRahatekar, H. L . , Maskatl, F . S . ， S ubrammar ian, S . S . , R aghavendra Rao, M. R. ： I ndian. J . B iochem. , 5 , 143 (1968)〕； Hopper, D . J . , Chapman, P. J . , S agney, S . ： B iochem. J_- HQ.. 798 (1968)〕。しかし、関与した酵素の性質については全く明らかにされておらず、（R) — リンゴ酸の供給を効率的に可能とする工業的製法は開発されていない。

発明の開示

本発明の目的は、上記先行技術の不利な点を克服して（R) ーリンゴ酸を生化学的に効率的に製造する方法を提供するにある。他の目的は、（R) — リンゴ酸の生化学的製造に有用な新しい酵素、および該酵素を効率的に製造する方法を提供することにある。

本発明者らは、（R ) —リンゴ酸の有用性に基き、工業的に製造されていて安価に入手しうるマレイン酸から（R ) —リンゴ酸を製造する生化学的方法について強力に研究した。目的に合った菌を菌株コレクションからの微生物のみならず、自然界から新しく菌を分離することにより探索した。その結果、新しい酵素、微生物マレイン酸ヒドラ夕一ゼが本発明において発見され、それがマレイン酸を生化学的に水和して（R ) —リンゴ酸を製造するのに極めて有用であることを見いだした。さらに、この酵素を効率的に製造する方法も本発明において確立された。従って本発明の一つの具体的様式では、反応培地中で、（A ) マレイン酸を水和して（R ) —リンゴ酸を生成しうる微生物マレイン酸ヒドラターゼを、（B ) 該マレイン酸ヒドラタ一ゼをふくむ微生物を、マレイン酸と接触させることにより、マレイン酸を水和して（R ) —リンゴ酸を製造することにある。さらに今一つの具体的様式では、新しく見いだされた微生物マレイン酸ヒドラターゼ、およびある有機物質の存在でマレイン酸ヒドラタ一ゼを生産しうる微生物を培養することにより微生物マレイン酸ヒドラターゼを製造することにある。

本発明に使用する微生物は、マレイン酸を水和して（R ) — リンゴ酸をつくるマレイン酸ヒドラターゼをふくむものである。本発明の方法で用いられる酵素はマレイン酸を水和して（R ) 一リンゴ酸を生成する反応を触媒する酵素であり、マレイン酸ヒドラタ一ゼと呼ばれる。この酵素は、国際生化学連合酵素委員会の酵素分類命名規約に従って〔4, 2, 1, 31 〕のクラスに分類される。

マレイン酸を（R) —リンゴ酸に変換しうる酵素を生産する微生物は、マレイン酸から（R) —リンゴ酸を生産する能力に基づいて選択的に自然界から分離することができるし、また菌株コレクションの微生物に求めることができる。そのような微生物としては、アースロバクタ一 ( A rthrobacte r ) 、ブレビバクテリゥム（ B revibacterium)、コリネバクテリゥム

(Corynebacter ium) 、バチルス (Bacillus)、ァシネトノ 'クタ— (Acinetobacter) およびシュートモナス (Pseudomonas) に属する微生物が例としてあげられる。さらに菌種名、菌株の具体的例をあげると、アースロバクタ一 ' シトレウス（Arthrobacter citreus) AT C C 17775,アースロバクタ一 · ォキシダンス (Arthrobacter oxydans) I F 012138, アースロバクタ一 · ニコチアネー（A rthrobacter nicotianae) AT C C

21279,アースロバクタ一 · ウレァファシエンス（Arthrobacter ureafaciens) A T C C 7562、アースロバクタ一，グロビホルミス（ A rthrobacter globiformis) I F 012137,ブレビバクテリゥム · ヘルボルム（ B revibacterium helvolum) AT C C 11822, ブレビバクテリウム · ケトグルタミクム（Brevibacterium ketoglutamicum) A T C C 15587, コリネバクテリウム * ァセトァシトフイノレム ( C orynebacter ium acetoacidophi lum)

A T C C 13870, コリネバクテリゥム ' カルネ一

( C orynebacterium cal lunae) A T C C 15991,、コリネバクテリゥム · グノレ夕ミクム ( G orynebacter ium glutamicum) A T C C 31808, コリネバクテリゥム · ビタルメン

( C orynebacterium vitarumen ) A T C C 10234 、バチルスアルべィ（Bacillus alvei ) A T C C 6344, バチルス · ブレビス（Bacillus brevis) A T C C 8185、ァシネトバクタ一 - カノレコアセチクス ( A cinetobacter calcoaceticus) A T C C 14987, シユードモナス ' フラギィ ( P seudomonas f ragi) I F 03458, シユードモナス ' プチダ（ P seudomonas putida) I F 03738, シユードモナス ' フルォレスンス（P seudomonas f luorescens) I F 03081, シユードモナス · シユードアルカリゲネス ( P seudomonas pseudoalcal igenes ) A T C C 12815 があげられる。

これらの微生物は、菌株コレクション（AT C C ： American Type Culture Collection, R ockvi 1 le, Maryland, U. S. A. ； I F O : I nstitute For F ermentat ion, Osaka, J apan) から自由に入手できる。これらの微生物は野性株でも突然変異株でも使用できる。また、 D N A組換え法によりえられる、マレイン酸ヒドラターゼをコードする遺伝子をもつ菌株も本発明に使用できる。

微生物マレイン酸ヒドラターゼは、上記微生物から抽出したものでもよいし、また上記微生物の培養液も使用できる。固定化酵素及び酵素をふくむ微生物も、それらがマレイン酸ヒドラターゼ活性を示す限り使用できる。

マレイン酸ヒドラターゼを生産する微生物を培養することによりマレイン酸ヒドラターゼをふくむ培養液をえるには、通常の培養方法、すなわち、炭素源としての有機化合物、窒素源としての有機および Zまたは無機化合物、および種々の無機塩をふくむ栄養培地中で、 pH4〜10、温度 10〜40°Cで培養すればよい。マレイン酸、シトラコン酸のうち、少くも 1 つを培地成分として加えることが望ましい。それは、このような化合物を培地に加えることにより高いマレイン酸ヒドラターゼ活性をもつ培養物がえられるからである。培地に加えるこれらの化合物の濃度は、一般に重童で約 0.1 〜 3 %であり、重量で 0.5 〜2.0 %がより好ましい濃度である。これらの化合物の効果は、後出の実施例 1 および 2 に示される如くで、このような化合物の少なくとも 1つを含む培地で、酵素の収量が顕著に増加する。マレイン酸およびシトラコン酸のマレイン酸ヒドラターゼ生成に対する効果は第 1表に示した実験結果によつても示される。

第 1表

ブレビパクテリゥム · ヘルボルム A T C C 11822 におけるシトラコン酸およびマレイン酸のマレイン酸ヒドラターゼ誘導

* 培地組成：肉エキス 5.0 % : NH ₄ C i 0.1%,

K Η 2 Ρ 04 0.14¾, Ν a 2 Η Ρ 04 · 12Η₂0

0.31 %, Μ g S 04 - 7 Η ₂0 0.025 %

( %は w ν ) * * 50m M トリス一塩酸緩衝液（1, 700 £ ) , 100m Μ、マレイン酸（200 ^ )，粗酵素標品（100 / ^ ) 、全容積 2, 000 ρ Η 7. 2の反応液中で 30°Cで 60分反応したとき生成する（R ) 一リンゴ酸量により決定。

第 1表に示した実験では、シトラコン酸およびマレイン酸は蘭の生育も増加した。

本発明では固体培地、液体培地の何れもが使用できる。酵素生産微生物の他の培養条件は、この分野の技術者の常識によつて使用菌がよく生育できるように選択される。

長時間の培養または遊離剤の添加により、通常、微生物細胞から酵素が遊離される。この場合培養終了後、細胞および不溶物を培養液から遠心分離または濾過により除いて粗酵素液としてえることができる。細胞中のマレイン酸ヒドラタ一ゼは、細胞を破碎、超音波処理などにより破壞して酵素を抽出することにより粗酵素液としてえられる。勿論細胞自体を酵素標品として用いることもできる。

精製マレイン酸ヒドラターゼは、粗酵素液から有機溶媒分画法、硫安分別沈でん法、透析、等電点沈でん法およびカラムク口マトグラフィ一などの通常の酵素精製法を単独または組合せて応用することによりえることができる。固形培地を菌の培養に用いた場合は、微生物細胞を含む固形培地に水を加えて混合してから細胞を集めて、上記の超音波処理などの処理にかけて粗酵素をえることができる。

基質であるマレイン酸は勿論、生理的に受容しうる塩の形、例えばナトリウム塩、カリウム塩の形で使用でき、またえられる（ R ) — リンゴ酸も塩の形でえることもできる。

マレイン酸ヒドラターゼを含む微生物細胞または、それから由来する酵素標品は基質を含む溶液中に加えて反応が進行するまで培養する。また、微生物が生育した培養液に基質を加えて、反応のために更に培養することにより基質と接触させる。酵素は精製処理を加えた酵素標品の形、または菌の培養液から分離された細胞の形、物理化学的または生化学的に処理した細胞の形、例えば洗浄菌体、凍結乾燥菌体、ァセトン乾燥菌体、抽出液、固定化標品その他の形で基質と接触反応させることもできる。

基質の濃度は、バッチ法か連続法かによつて異なる。バッチ法では一般に約 0.1 〜30%、好ましくは約 0.5 〜10% (重量）で、連続法ではや、低い濃度、すなわち、 0.05〜20% (重量）が好ましい。反応は通常約 5〜50°C、好ましくは 20〜45°C、 p H約 4〜10、好ましくは 6〜 9で行われる。反応時間は、静置、かく拌、固定化酵素をふくむカラムでの流下その他の反応様式の差によって、また酵素の形により異なるが、通常 1〜100 時間である。連続法ではより長時間の反応が連続して行われることは勿論である。

反応のプロセスは、リンゴ酸の生成を薄層クロマトグラフィ一を用いて分析することにより追跡できる。反応液中のリンゴ酸濃度はまた、反応液を硫酸および 2, 7 —ナフタレンジオールと反応させるグッドバンおよびスタークの方法（Goodban, A. E . , S tark, J . B . ： Anal . C hem. , 29, 283 (1957)〕により分析できる。反応液中の（R) — リンゴ酸は、クレプスおよびエグルストン（Krebs, H . A. , E gglestone, L . V. ： B iochem. J . , 37- ³³⁴ (1943)〕の方法により分析して決定できる。これらの値（リンゴ酸および（R) — リンゴ酸）から反応液中の（R) —リンゴ酸の光学純度を推定できる。このようにして得た光学純度の値は、分離した（R) —リンゴ酸について決定した値より不正確ではあるが、反応を追跡するために便利である。反応液から分離した（R) —リンゴ酸の光学純度は、（R, S ) 一リンゴ酸を（R) — リンゴ酸と（S) — リンゴ酸に分離できる薄層ク口マトグラフィ一により決定できる。分離した（R) —リンゴ酸の比旋光度の決定によっても光学純度は決定できる。

反応液からの（R) —リンゴ酸の分離回収は、（ S ) — リンゴ酸について公知の方法、すなわちイオン交換樹脂処理、濃縮、結晶化のプロセスを、反応液から遠心分離により細胞その他の固形物を除いた液に適用することにより行われる。

以下、本発明の微生物マレイン酸ヒドラターゼの酵素的性質を述べる。

( 1 ) 作用および特異性：

本酵素は、マレイン酸に水和して（R) —リンゴ酸を生成する反応を触媒する。フマール酸には作用しない。

( 2 ) 最適 p Hおよび p H安定性：

本酵素は P H6.0 〜9.0 で活性であり、 P H7.0 〜8.0 でもつとも活性である。本酵素は、一般に P H6.0 〜9.0 で安定で特に p H7.0 〜8.0 でもつとも安定である。

( 3 ) 最適温度および温度安定性：本酵素は 20〜50°Cでよく作用し、その最適温度は約 40°Cである。本酵素は 35C以下で安定であり、 45°Cまたはそれ以上で急速に活性が低下する。

( 4 ) 分子量：

ゲル濾過法（セファロース 4 Bを用いる）によりえられた分子量の値は約 13.5x 10⁴ である。

( 5 ) 阻害剤：

I mMで P CMB (p - chloromercur ibenzoic acid)力 100 %活性を阻害したが、 E D TAおよび PMS F

(phenylmethylsulfonyl fluoride) は阻害しなかった。インドール酢酸と N a I 0₄ はそれぞれ 12%および 17%の阻害を示した。 N—ェチルマレイミドは 10mMで 33%の阻害を示した。これらの阻害のデータから本酵素は活性部位に S H基をふくむ可能性が考えられる。

発明を実施するための最良の形態

以下本発明を実施例によつて詳細に説明するが、実施例は勿論本発明を限定するものではない。実施例でパーセントは特に言及しない限り重量パーセントである。

実施例 1

培地 1 ^あたりグルコース 10 g、ペプトン 5 g ：肉エキス 3 g、酵母エキス 3 g、塩化ナトリウム 2. 5 g他水をふくむ p H 7. 0の組成の種培地に 26°Cで毎分 195 回転で 24時間振とう培養したアースロバクタ一 · グロビホルミス（ A rthrobacter globiformis) I F 0 12137の培養 1. 5 m£をの滅菌生育培地をふくむ 300 の三角フラスコに接種して、 26°C、毎分 220 回転で 24時間振とう培養してえた培養液分の菌体を集菌し、遠心分離、 50mMリン酸緩衝液（p H7. 0 ) 洗浄の操作を 2回くり返して後、マレイン酸 1. 0 %、 N a C ^ 0. 1 %をふくむ lOOmMリン酸緩衝液をふくむ太型試験管にけん濁して、 26。Cで毎分 195 回転で振とうしながら反応させた。生育培地の組成は、基本培地としてグルコース 1 %、 NH₄ C i 0.1%、 K H ₂ P 04 0.14%、 N a ₂ H P 0₄ · 12Η ₂ 0 0.31%、

M g S 04 · 7 H ₂ 0 0.025 %, 肉ェ丰ス 0.5%、 p H 7.0 であり、これに第 2表に示した濩度にシトラコン酸を加えたものも使用した。反応時間 19.5〜48時間で経時的に分析したリンゴ酸生成濃度、その（R) —リンゴ酸光学純度（ e . e . ) を、生育培地のシトラコン酸濃度の区分に応じて示したのが第 2表である。

表に見られる如く、生育培地中にシトラコン酸を加えない場合でも反応 48時間になると、 4.7g/iの（R) — リンゴ酸（ e . e . 73%) を生成したが、シトラコン酸を生育培地に加えた場合は反応時間 19.5時間で既に 5 gZ ^以上の（R) — リンゴ酸を生成した。

第 2表

リンゴ酸生成濃度（ gZ ^ ) および（R) —リンゴ酸の光学純度（ e . e . %)

反応液中のリンゴ酸の光学純度〔（R) —体の e . e . % はクレプスら（H. A . Krebsら、 B iochemical J ournal 37卷、 334 頁、 1943年）に従い、モリブデン酸アンモニゥムを培養液上清に加えて旋光度を測定する方法によった。なお、リンゴ酸濃度の低い場合は本法は誤差が大きくなるので測定しなかった。

実施例 2

使用微生物として、シユードモナス · フラギ一（ P seudomonas fragi) I F 0 3458、シユードモナス · プチダ（ P seudomonas putida) I F 03738およびアースロバクタ一 · ォキシダンス ( Arthrobacter oxydans) I F 012138 を用いる他は実施例 1 と同様に実施した場合、第 3表に示す結果がえられた。これらの菌株でも生育培地にシトラコン酸を加えると（R) — リンゴ酸の生成を速くした。

第 3表

リンゴ酸生成濃度（gZ^ ) および（R) —リンゴ酸の光学純度（ e . e . %)

生育培地に加えたシトラコン酸濃度実施例 3

使用菌株としてブレビパクテリゥム ' ヘルボルム

( B revibacterium_ helvolum) A T C C 11822を用い生育培地にシトラコン酸 1 %を加えた他実施例 1の方法によって実施した場合、反応 48時間で 4.4 g Z のリンゴ酸が生成し、その (R) — リンゴ酸光学純度は 100 % ( e . e . ) であった。反応液から遠心分離により菌体を除いた液を強酸性陽イオン交換樹脂（D o w e x 50) (H型）に通してから強塩基性陰イオン交換樹脂（D o w e x— 1X8 ) (蟻酸型）に通じ、樹脂を水洗後、蟻酸を用いて濃度勾配溶出を行い、リンゴ酸区分を濃縮乾固して再結し、（R) — リンゴ酸を単離した。このものの収量は反応液 1 ·βより 2.5gで光学純度（ e . e . )は 100 %であった。

実施例 4

使用菌株として第 4表に示した菌株を用いる他は実施例 3の如く実施した場合、反応時間、 24時間または 48時間で反応液中に生成したリンゴ酸の濃度、その（R) — リンゴ酸光学純度は第 4表に示したとおりであった。

第 4表

]'酸の光学糸度使用菌株 (R)i

/ ί ) e. e . % 48時間 24時間 48時間

Pseudomonas f 1 uorescens

2.8 89 IFO 3081

Pseudomonas pseudo -

3.2 4.8 83 81 alcal igenes ATCC 12815

Corynebacter i um acetoac i -

2.3 93 dophilum ATCC 13870

Corynebacter ium ca 1 lunae

2.7 90 ATCC 15991

Corynebacter ium

2.0 83 glutamicm ATCC 31808

Corynebacter ium

5.9 85

vitarumen ATCC 10234 第 4表一つづき

実施例 5

使用菌株としてアースロバクタ一 · グロビホルミス I F O 12137 を用いて実施例 1の生育培地でシトラコン酸添加濃度 0. 5 %の培地を使用すること、および反応を静置で行なうこと以外は実施例 1 の如く実施した場合、反応 24時間で（R) —リンゴ酸が 6, 3 gZ の濃度に生成し、 e. e.は 99%、 48時間で 9. 1 g ^の濃度に生成し、 e. e.は 91%であった。

実施例 6

実施例 3および実施例 4 に記載した微生物菌株、生育培地培養法を使用して生育した菌体を、反応に使用する前に超音波処理により菌体をこわしてえた抽出液を菌体の代りに用いる他は実施例 3および実施例 4の如く実施したとき、何れの菌株でも 1 g / i の濃度に（R) — リンゴ酸が生成した。

実施例 7

グルコース 3 %, K 2 H P 04 0. 5 % , K H 2 P 0₄ 0.5 %, M g S 0₄ · 7 Η ₂ 0 0.025 %, F e S 0₄ · 7 H ₂ 0 0.001 %, M n S 04 · 4 H ₂ 0 0.001 % , 肉エキス 0. 5 酵母エキス 0. 3 %, ペプトン 0. 5 %、シトラコン酸 0. 5 %の組成の滅菌培地（ p H7. 0 ) 3 0 をふくむ 300 三角フラスコに、ブレビバクテリウム · ヘルボルム A T C C 11822を植菌して 26°Cで 24時間振とう培養した後、菌体を集菌して、マレイン酸 4 %の水溶液（N a O Hで p H7. 0 にす）に添加して、 35°Cで静置して 72時間反応させたとき、反応液中に（R) — リンゴ酸が 4.44%の濃度に生成し、その光学純度は e. e. 98. 0 % であった。

実施例 8

グルコース 2 %, N H ₄ C 0. 5 %, K 2 Η Ρ 04 0. 5 %, Κ Η 2 Ρ 04 0.5%, Μ g S 04 · 7 Η 2 0 0.025 %, F e S 04 · 7 Η 2 0 0.001%, Μ η S 04 · 4 Η ₂ 0 0.001 %, 肉エキス 0. 5 %, 酵母エキス 0.3 %、ペプトン 0. 5 %の組成の滅菌培地 30τ ^を含む 300 三角フラスコに、ブレビバクテリウム . ヘルボルム A T C C 11822 を植菌して 24時間 26°Cで振とう培養した後、菌体を集めてアセトン処理したもの（ァセトン菌体）を、生育培養の菌濃度（すなわち集菌前の培養液の菌濃度）と同じ濃度になるように 4 %のマレイン酸を含む水溶液（ p H7. 0 とす）に加えて 72時間静置反応させたとき、 3-03% の濃度にと（R) —リンゴ酸が生成し、その光学純度は e.e. 87.1%であった。

実施例 9

グルコース 1 %, NH₄C 0. 1 %, KH₂ P 04 0.14%, N a 2 H P 04 · 12H ₂ 0 0.3 %, Mg S 0₄ - 7 H₂ 0 0.025 %, 肉エキス 0. 5 %, シトラコン酸 1 %の組成の滅菌培地（p H7. 0 ) をふくむ 300 三角フラスコにブレビバクテリゥム · ケ卜グノレタミクム（Brevibacterium ketoglutamicum AT C C 15587 を植菌して 26°Cで 24時間振とう培養後、遠心分離により集菌して菌体をえた。マレイン酸 1 %をふくむ p H 7. 0の 5 の 100 mM燐酸緩衝液を入れた太型試験管に菌体を加えて 26°Cで 48時間振とうして反応させたとき反応液中に（R) 一リンゴ酸が 1.09gZ^の濃度に生成し、その光学純度は e.e. 85 %であった。

実施例 10

実施例 5 と同様に実施してえた、アースロバクタ一 ' グロビホルミス I F 0 12137の菌体を 1 %マレイン酸溶液に 20時間反応させてえた反応液（リンゴ酸 4.3g/^、（R) —リンゴ酸の e. e.79.8%) の遠沈上清 255 を p H4.5に調製して 100 でで 10分加熱した後遠心分離により沈でんを除いた。この液を強酸性陽ィォン交換樹脂（ダイヤィォン S K— 1 B ) (20〜50メッシュ， H⁺ 型）のカラムと、強塩基性陰イオン交換樹脂（ダウエックス 1 X 8 (50〜100 メッシュ， H C O O— 型）のカラムをこの順に上から連結したものに通じた。それぞれのカラムの樹脂量はづっであつた。その後 2カラム分の蒸留水でカラムを洗浄後、上のカラム（ダイヤイオン S K— 1 B ) により脱塩され、下のカラム（ダウエックス 1 X 8 ) に吸着されたリンゴ酸を溶出するため、上のカラムをとりはずし、下のカラムを 1 N蟻酸で溶出し、溶出液のリンゴ酸をふくむ区分を集めてシラップ状に減圧濃縮し、冷却後析出した結晶を濾別して少量の冷ァセトニトリルで洗浄後乾燥して 0.276gの（R) — リンゴ酸の結晶をえた。

この結晶のリンゴ酸純度は高速液体ク口マトグラフィー（検出 UV 210n m) で 92·2%、 e . e . 98.5%であった。

結晶母液およびァセトニトリル洗浄液を合わせて減圧濃縮し、前の結晶取得と同様の操作により 0.266gの結晶をえた。この結晶のリンゴ酸純度は 89.3%、 e . e . 100 %であった。

実施例 11

シトラコン酸 2 %, 肉エキス 5 %, N H 4 C £ 0. 1 %, K H 2 P 04 0.14 %, N a ₂ H P 0₄ - 12H ₂ 0 0.31%, M g S 04 · 7 H 2 0 0.025% (% ： w/v)の組成の培地

( p H7. 0 ) で生育したブレビパクテリゥム · ヘルボルム ( B revibacterium_ helvolum) A T C C 11822 の菌体を超音波処理により破砕した。硫酸アンモニゥム（43〜60%飽和）で沈でんした蛋白をセファロース 4 Bゲル上のクロマトグラフィ一により更に精製した。これらの操作により細胞破砕抽出液の酵素活性に比較して、マレイン酸ヒドラターゼの比活性は 16 倍に増加した。以上本発明の好ましい具体例について述べたが、種々の改変した方法が用いられうることは当業者には明白であろう。このような改変は以下に述べる特許請求の範囲内で勿論可能なこと tある。

Claims

請求の範囲

1. マレイン酸と、（A) マレイン酸を（R) — リンゴ酸に水和する微生物マレイン酸ヒドラターゼ、または（B ) 該マレイン酸ヒドラターゼをふくむ微生物を、反応液中で接触させることにより（R) —リンゴ酸を生産させることを特徴とする

(R) 一リンゴ酸の製造法。

2. 特許請求の範囲第 1項の方法において、使用する微生物がアースロバクタ一（ A rthrobacter), ブレビパクテリゥム

( B revibacter ium), コリ不ノくクテリゥム ( C orynebacter ium) ,0 バチルス（Bacillus), ァシネトパクター（ A cinetobacter) およびシユードモナス（ P seudomonas) の何れかの属に属する微生物である方法。

3. 特許請求の範囲第 1項の方法において、使用する微生物が次の菌種の何れかである方法：アースロバクタ一 · シトレゥ5 ス ( A rthrobacter citreus), アース <クタ一 · ォキシダンス ( A rthrobacter oxydans), アースクタ一 - ニコチ

( A rthrobacter nicotinae), ース 'クタ一 · ゥレアファシエンス ( A rthrobacter ureaf aciens ) ，アース 'クタ一 · グノレビホノレミス ( A rthrobacter globiformis),0 ブレビノくクテリゥム · へノレボソレム ( B revibacterum helvolum), ブレビバクテリウム · ケトグルタミクム（ B revibacterium ketoglutaraicum) 、コリネノくクテリゥム ' ァセトァシドフィルム C orvnebacter ium acetoacidopni lum) ，コリ不 'クテリウム · カノレネ一 ( C orynebacter ium cal lunae) , コリネバクテリウム ' グノレタミクム ( C orynebacter ium 1 u tami cum) , コリネノクテリゥム · ピ、タノレメン ( C orynebacterium vitarumen), バチルス · アルべィ（Bacillus alvei), バチルス ' ブレビス（Bacillus brevis) 、ァシネトノクタ一 ' カルコァセチクス ( Acinetobacter calcoaceticus;, シユー卜モナス · フラギィ（ P seudomonas f ragi), シユードモナス ' プチダ

( P seudomonas putida) , シユードモナス · フルォレスンス C P seudomonas f luorescens), シュー ^モナス · シユードァノレカリゲネス ( P seudomonas pseudoalcal igenes)₀

4. 特許請求の範囲第 1項の方法において、使用微生物が、 0 次の菌株である方法：

アースロノくクタ一 · シ卜レウス ( A rthrobacter citreus) A T C C 17775, アースロバクタ一 ' ォキシダンス（Arthrobacter oxydans) I F 012138, アースロバクタ一 · ニコチアネー

(Arthrobacter nicotianae) A T C C 12279, アースロバク5 ター，ゥレアファシエンス（A rthrobacter ureafaciens) A T

C C 7562, アースロバクタ一 ' グロビホルミス（ Art robacte r globiformis ) I F 0 12137, ブレビバクチリウム ' へルポルム（Brevibacteriu helvolum) AT C C 11822,

ブレビバクテリゥム · ケトグルタミクム（Brevibacterium

0 ketoglutamlcum) AT C C 15587, コリネパクテリゥム ' ァセ

卜ァシドフイノレム（Corynebacter ium acetoacidophi lum) A T C C 13870, コリネバクテリゥム · カルネ一（Corynebacter ium callunae) AT C C 15991, コリネバクテリゥム ' ダルタミクム（ C orynebacterium glutamicum) A T C C 31808, コリネD ノく'クテリゥム ' ヒタノレメン〔Coryne bacterium vi tarumen ) AT C C 10234, バチルス ' アルべィ（Villus alvei) A T C C 6344, バチルス · ブレビス ( B acillus brevis) A T C C 8185, ァシネトパクター · カルコァセチクス

(Acinetobacter calcoacet icus) A T C C 14987, シユードモナス · フラギィ（Pseudomona f ragi) I F 0 3458, シユーモナス · プチダ（Pseudomonas putida) I F 0 3738, シユードモナス · フノレオレスンス (Pseudomonas f 1 uorescens)

I F 0 3081, シユードモナス · シユードアルカリゲネス (Pseudomonas pseudoalcal igenes) A T C C 12815 ₀

5. 特許請求の範囲第 1項の方法において、マレイン酸を水和して（R) — リンゴ酸を生成する反応が温度 5 °Cから 50°C、 p H 4から 10、マレイン酸の'濃度が反応液の重量に対して 0.05 から 30%の範囲で行われることを特徵とする方法。

6. 特許請求の範囲第 1項の方法において、使用するマレイン酸ヒドラタ一ゼが次の性質を有するものを使用する方法：

( 1 ) 作用および特異性：マレイン酸に水和して（R) — リンゴ酸を生成する反応を触媒する。フマール酸には作用しない。

( 2 ) 最適 p Hおよび p H安定性： p H6.0 〜9.0 で活性であり、 ρ Η7·0 〜8.0 でもつとも活性である。一般に p H6.0 〜 9.0 で安定で特に ρ Η 7.0 〜8.0 でもつとも安定である。

( 3 ) 最適温度および温度安定性： 20〜50°Cでよく作用し、その最適温度は約 40°Cである。 35°C以下で安定であり、 45°Cまたはそれ以上で急速に活性が低下する。

( 4 ) 分子量：ゲル濾過法（セファロース 4 Bを用いる）によりえられる分子量値が約 13.5x 10⁴ である。 ( 5 ) 阻害剤： I mMで P CMB ( p - chlromercur ibenzoic acid)が 100 %活性を阻害し、 E D TAおよび PMS F

(phenylmethylsulf onylf luoride) は阻害しない。

7. 次の性質を有する微生物由来のマレイン酸ヒドラタ一ゼ ( 1 ) 作用および特異性：マレイン酸に水和して（R) —リンゴ酸を生成する反応を触媒する。フマール酸には作用しない。 ( 2 ) 最適 p Hおよび p H安定性： p H6.0〜9.0 で活性であり、 p H7.0〜8.0 でもつとも活性である。一般に p H6.0〜 9.0 で安定で特に p H7.0〜8.0 でもつとも安定である。

( 4 ) 分子量：ゲル濾過法（セファロース 4 Bを用いる）によりえられる分子量値が約 13.5X 10⁴ である。

( 5 ) 阻害剤： I mMで PMC B

( - chloromercuribenzoic acid)が 100 %活性を阻害し、 E 0丁八ぉょび？¾^5？ (phenylmethylsulf onylf luoride) は阻害しない。

8. 特許請求の範囲第 7項において微生物が次の属の微生物であるマレイン酸ヒドラターゼ：

アースロバクタ一 ( A rthrobacter), ブレビバクテリゥム (Brevibacterium), コリ不 ^クテリウム ( C orynebacterium), バチルス (Bacillus)一，ァシネ 'クタ一 ( A cinetobacter), シュ一ドモナス ( P seudomonas) ₀

9. 特許請求の範囲第 7項において微生物が次の菌種の微生物であるマレイン酸ヒドラターゼ：

アースクタ一 · シトレウス（Arthrobacter citreus), アースロノく'クタ一 · ォキシダンス（Arthrobacter oxydans), アースロノくクタ一 · ニコチアネー（Arthrobacter nicotianae), アースロバクタ一 · ウレァファシエンス（ A rthrobacter

ureaf aciens), アースロノくクタ一 · グロビホルミス

( A rthrobacter globiformis), ブレビノくクテリゥム · へノレボノレム ( B revibacter ium helvolum) 、ブレビクテリゥム · ケ卜グノレタミクム ( B revibacter ium ketoglutamicum),コリネノくクテリウム · ァセトァシドフイノレム（ C orynebacter ium acetoacidophi lum), コリネノくクテリゥム · カノレネ一

(Corynebacter ium cal lunae),コリネノくクテリゥム · グノレタミクム (Corynebacter ium glutamicunu, コリネノくクテリゥム · ビタノレメン（Corynebacter ium vitarumen), <チノレス · ァノレべィ（B acillus alvei), バチルス ' ブレビス（B acillus b rev is) , ァシネトパクター · カルコァセチクス

(Acinetobacter ca 1 coacet i cus) , シュードモナス · フラギィ ( P seudomonas f ragi), シュードモナス · プチダ

( P seudomonas put ida , シドモナス · フノレオレスンス ( P seudomonas f 1 uorescens) , シユードモナス · シュ一ドァノレカリケ不ス ( P seudomonas pseudoalcal igenes)o

10. 特許請求の範囲第 7項において、微生物が次の菌株であるマレイン酸ヒドラターゼ：

アースロノく、クタ一 · シトレウス（Arthrobacter citreus) A T C C 17775, アースロバクタ一，ォキシダンス (Arthrobacter oxydans)^ I F 0 12138, ースクタ一チアネ一（Arthrobacter nicotiaaae) A T C C 21279, アース口パクター · ゥレアファシエンス (Arthrobacter ureaf aciens) A T C C 7562, アースロバクタ一 ' グロビホルミス（Arthrobacter globiformis) I F 0 12137, ブレビパクテリゥム ' ヘルボルム（ B revibacterium helvolum) AT C C 11822, ブレビパクテリゥム · ケ卜グノレタミクム（Brevi bacterium ketoglutamicum) AT C C 15587, コリネバクテリゥム · ァセトァシドフィルム ( C orynebacterium acetoacidophi lum) AT C C 13870, コリネヾクテリゥム · 力ノレネー ( C orynebacterium cal lunae) AT C C 15991，コリネバクテリゥム ' グルタミクム

C C orynebacterium glutamicum) AT C C 31808, コリネ <クテリウム * ビタノレメン ( C orynebactereium vitarumen) AT C C 10234, バチルス · アルべィ（Bacillus alvei) A T C C 6344, バチルス · ブレブス（ B acillu§_ evi ） AT C C 8185, ァシネトクタ一 ' カルコァセチクス（ A cinetobacter

calcoaceticus ) AT C C 14987, シユードモナス ' フラギィ ( P seudomonas fragi) I F O 3458, シュ一ドモナス ' プチダ ( P seudomonas putida) I F O 3738, シユードモナス ' フルォレスンス ( P seudomonas f luorescens) I F O 3081, シュ一ドモナス · シユードアルカリゲネス（ P seudomonas

pseudoalcal igenes A T C C 12815 ₀

11. マレイン酸の水和反応により（R) —リンゴ酸を生成する反応を触媒するマレイン酸ヒドラターゼを生成する微生物を、マレイン酸とシトラコン酸の何れか 1つまたは両方を含む培地に培養してマレイン酸ヒドラタ一ゼを生産させることを特徴とするマレイン酸ヒドラターゼの製造法。

12. 特許請求の範囲第 11項の方法において、使用する微生物がアースロバクタ一 ( A rthrobacter)、ブレビパクテリゥム

(Brevibacter ium), コリネノくクテリゥム ( C orynebacterium , ノくチノレス (Bacillus), ァシネ卜ノくクタ— ( A cinetobacter) およびシユードモナス（ P seudomonas) の何れからの属に属する微生物である方法。

13. 特許請求の範囲第 11項の方法において、使用する微生物が次の菌種の微生物である方法：

アースロバクタ一 · シ卜レウス（Arthrobacter ci treus) , アースロノ <クタ一♦ ォキシダンス（Arthrobacter oxydans), Γース πιノくク夕一 - 二チ "7ネー（Arthrobacter nicot ianae , アースロノく'クタ一 · ウレァファシエンス（Arthrobacter

ureaf aciens), アースロノくクタ一 · グロビホノレミス（Arthrobacter globiformis), ブレビノくクテリゥム ' へノレホノレム (Brevibacter ium helvolum), ブレビバクテリゥム · ケトグルタミクム

(Brevibacter ium ketoglutamicum),コリ不ノヽクテリゥム · ァセトァシドフイノレム ( C orynebacter ium acetoacidophi Ium), コリネノく'クテリゥム · カノレネ一 (. C orynebacter i um ca 11 unae; , コリネノく'クテリゥム · クノレ夕ミクム C orynebacter i um

glutamicum),コリネノくクテリゥム · ビタルメン ( C orynebacter ium

VI i tarumen) , ノくチノレス · ァノレヘイ Bacillus alvei), バチルス · ブレビス（ B ac i 11 brevis),ァシネトノ <クター力ノレコアセチク ( A cinetobacter calcoacet icus), 8

シユードモナス ' フラギィ (Pseudomonas f ragi), シユードモナス · プチダ（Pseudomonas putida), シュ一ドモナス · フノレ才レスンス (Pseudomonas f luorescens), シユードモナス • シュ一ドアノレカリケネス P seudomonas pseudoalcal igenes)_c

14. 特許請求の範囲第 11項の方法において使用する微生物が次の菌株である方法：

アースクタ一《シ卜レウス ( A rthrobacter citreus) AT C C 17775, アースロバクタ一 ' ォキシダンス

( A rthrobacter oxydans) I F 0 12138, アースロバクター - ニコチアネー ( A rthrobacter nicotianae) AT C C 21279, アースロバクタ一 · ウレァファシエンス

( A rthrobacter ureafaciens) AT C C 7562, アース口 z クタ一 * グロビホノレミス ( A rthrobacter globif ormis) I F 0 12137, ブレビパクテリゥム ' ヘルボルム

( B revibaerium helvolum) AT C C 11822, ブレビパクテリゥム · ケトグルタミクム（B rev i bacterium

ketoglutamicum) A T C C 15587, コリネバクテリウム ' ァセトァシドフィルム ( C orynebacter ium acetoacidophi lum) AT C C 13870, コリネバクテリゥム ' カルネ一

( C orynebacter ium call_unae) A T C C 15991, <クテリゥム * グノレタミクム ( C orynetacter ium glutamicum) A T C C 31808, コリネバクテリゥム ' ビタルメン

( C orynebacterium vitarumen) A T C C 10234, バチルス • アルべィ（Bacillus alvei) AT C C 6344, バチルス • ブレビス（Bacillus brevis) A T C C 8185, ァシネ 9

トノベ'クタ一 ' カルコァセチクス（ A cinetobacter

calcoaceticus) A T C C 14987, シユードモナス · フラギィ ( P seudomonas f ragi) I F 0 3458, シュ一ドモナスプチダ（ P seudomonas putida) I F 0 3738, シユードモナス · シユードアルカリゲネス（ P seudomonas

pseudoal_kaligenes) A T C C 12815, シユードモナス · フルォレスンス ( P seudomonas f luoresceus) I F 0 3081_o