JPH09275991A - Ｄ−リンゴ酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 安価なマレイン酸を原料として、Ｌ−リンゴ
酸の副生なしに選択的にＤ−リンゴ酸を簡便に製造する
方法を提供する。 【解決手段】 エルビニア属、ミコプラナ属、スポロサ
ルシナ属、ビブリオ属、ゲオトリカム属またはトルラス
ポラ属に属し、マレイン酸からＤ−リンゴ酸を生成する
能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した菌
体もしくは該菌体の処理物をマレイン酸に作用させるこ
とにより、Ｄ−リンゴ酸を生成させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はＤ−リンゴ酸の製造
方法に関する。Ｄ−リンゴ酸は種々の医薬品、化成品の
合成原料として有用である。

【０００２】

【従来の技術】従来、Ｄ−リンゴ酸を製造する方法とし
ては、化学合成法によるものが知られているが（A. Ber
nardら、Tetrahedron, Vol.46, p.1987-1998 (199
0)）、反応工程が複雑であり、光学純度も低い。また、
ラセミ体のリンゴ酸をジアステレオマー塩にして光学分
割する方法も知られているが（特開昭57-56439号、特開
昭60-204741号）、キニーネ等の高価な分割剤を必要と
するために経済的方法とはいえない。さらに、ラセミ体
のリンゴ酸に微生物を作用させ、Ｌ−リンゴ酸のみを資
化させて、残存するＤ−リンゴ酸を採取する方法が知ら
れているが（特開平2-242699号）、最大でもラセミ体か
らのモル収率は50%が限度であり、生成Ｄ−リンゴ酸の
光学純度も低い欠点を有する。一方、マレイン酸から直
接微生物によってＤ−リンゴ酸を生成させる方法も知ら
れている（J. Mariet ら、Appl. Environ. Microbiol.,
Vol.58 p.2854-2960(1992)、特開平4-316491号、特開
平7-188号、特開平7-143891号)。しかしながら、いずれ
の方法も生成Ｄ−リンゴ酸の光学純度が低い、高価な誘
導剤を微生物の培養培地に添加しなくてはならない、あ
るいは、Ｄ−リンゴ酸の生成速度が遅く反応に多くの菌
体を用いなければならない等の欠点を有していた。ま
た、アースロバクター属細菌を用いてマレイン酸からＤ
−リンゴ酸を生成する報告がある（特開平5-103680
号）。本報告によれば、生成Ｄ−リンゴ酸の光学純度が
高く、反応収率も高い。しかしながら、この場合活性の
高い微生物は、アースロバクター属細菌のみであり、他
の微生物については効率的にＤ−リンゴ酸を生産する能
力を有するものは見いだされていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、安価
かつ簡便にＤ−リンゴ酸の製造する方法を提供すること
にある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上述の事情
に鑑み検討を重ねた結果、マレイン酸よりきわめて高い
光学純度でＤ−リンゴ酸を効率良く生成させ得る微生物
を見出し、本発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち、本発明は、エルビニア属、ミコ
プラナ属、スポロサルシナ属、ビブリオ属、ゲオトリカ
ム属またはトルラスポラ属に属し、マレイン酸よりＤ−
リンゴ酸を生成する能力を有する微生物の培養物、該培
養物より分離した菌体もしくは該菌体の処理物をマレイ
ン酸に作用せしめ、Ｄ−リンゴ酸を生成させることを特
徴とするＤ−リンゴ酸の製造方法を提供するものであ
る。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明に使用する微生物として
は、エルビニア属、ミコプラナ属、スポロサルシナ属、
ビブリオ属、ゲオトリカム属またはトルラスポラ属に属
し、マレイン酸よりＤ−リンゴ酸を生成する能力を有す
る微生物であればいずれを用いてもよいが、具体的に
は、以下のような菌株を例示することができる。 エルビニア・アミロボラ（Erwinia amylovora）IFO 126
87 ミコプラナ・ジモルファ（Mycoplana dimorpha) ATCC 4
279スホ゜ロサルシナ・ウレアエ (Sporosarcina ureae）IFO 12698 ビブリオ・タイロゲネス（Vibrio tyrogenes）AJ 2807
(FERM P-7060) ゲオトリカム・フラグランス（Geotrichum fragrans）C
BS 152.25 トルラスポラ・デルブルッキー（Torulaspora delbruec
kii）IFO 1083

【０００７】本発明に用いる微生物を培養するための培
地は、その微生物が増殖し得るものであれば特に制限は
ない。例えば、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素
等を含有する通常の液体栄養培地を使用することができ
る。

【０００８】炭素源としては、上記微生物の利用可能な
ものであればいずれも使用でき、具体的には、グルコー
ス、フルクトース、シュクロース、デキストリン等の糖
類、ソルビトール、エタノール、グリセロール等のアル
コール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸等
の有機酸類もしくはその塩類、またはこれらの混合物を
使用することができる。

【０００９】窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム等の無機アンモニウム塩、フマル
酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸アン
モニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の硝酸
塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティー
プリカー等の有機窒素化合物、またはこれらの混合物を
使用することができる。

【００１０】他に無機塩類、微量金属塩、ビタミン類
等、通常の培養に用いられる栄養源を適宜、混合して用
いることができる。また、必要に応じて微生物の増殖を
促進する因子、本発明の目的化合物の生成能力を高める
マレイン酸等の因子、あるいは培地のｐＨ保持に有効な
物質も添加できる。

【００１１】培養方法としては、ｐＨは４ないし９、好
ましくは、６ないし８、培養温度は２０ないし４５℃、
好ましくは２５ないし３７℃で、その微生物の生育に適
した条件下で、５ないし７２時間、好ましくは１２ない
し４８時間程度培養する。

【００１２】上記微生物をマレイン酸に作用せしめる方
法としては、かくして得られる培養物にマレイン酸を添
加して反応させる方法、遠心分離等により培養物から菌
体を分離し、これをそのままもしくは洗浄した後、緩衝
液、水等に再懸濁したものにマレイン酸を添加して反応
させる方法等がある。また、菌体の処理物として、菌体
破砕物、アセトン処理菌体、凍結乾燥菌体、またはポリ
アクリルアミドゲル法、カラギーナン法、アルギン酸ゲ
ル法等の公知の方法で固定化した菌体も用いることもで
きる。さらに、菌体抽出物もしくはこれより反応を触媒
する加水分解酵素を分離精製したものも菌体処理物とし
て使用できる。

【００１３】マレイン酸はそのまま、または水もしくは
緩衝液に溶解させたものを、反応始めから一括してもし
くは反応途中に分割して添加することができる。添加濃
度は特に制限されないが、０．１ないし１０％程度が好
ましい。また、反応液にTriton X-100、Triton N-101、
Tween 20、Tween 60等の界面活性剤を添加することによ
り反応が促進される場合がある。

【００１４】反応はｐＨ６ないし９、好ましくはｐＨ
６．５ないし８．０、温度は１０ないし６０℃、好まし
くは３０ないし４５℃の範囲で、撹拌下あるいは静置下
で行う。かくして１ないし１２０時間程度反応させるこ
とにより反応液中に著量のＤ−リンゴ酸が生成蓄積す
る。

【００１５】反応によって生成したＤ−リンゴ酸の採取
は、反応液から直接あるいは菌体を分離した後、晶析、
カラムクロマトグラフィー等の通常の精製方法を用いれ
ば容易に行うことができる。

【００１６】

【実施例】以下、本発明を実施例にてさらに詳細に説明
する。なお、実施例におけるＤ−リンゴ酸の光学活性並
びに反応収率の測定は、下記の条件により高速液体クロ
マトグラフィーにより行った。 カラム：SUMICHIRAL OA-5000（(株)住友分析センター
製） 溶離液：1mM 酢酸銅＋0.1M 酢酸アンモニウム水溶液／
イソプロパノール（８５／１５） 流量：１．０ｍｌ／分 検出：ＵＶ２５４ｎｍ） 保持時間：Ｄ−リンゴ酸 ７．４分、Ｌ−リンゴ酸
１．８分

【００１７】実施例１ グリセロール１．０％、マレイン酸０．２％、(ＮＨ₄)₂
ＳＯ₄ ０．５％、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．３％、ＫＨ₂ＰＯ₄
０．１％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０５％、ＦｅＳＯ₄
・７Ｈ₂Ｏ ０．００１％、ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ ０．０
０１％、酵母エキス１．０％及びポリペプトン１．０％
から成る組成の培地（ｐＨ７．０）を５００ｍｌ容坂口
フラスコに５０ｍｌずつ分注し、１２０℃、１５分の条
件で加熱殺菌した（尚、上記表示は、重量／容量％で表
示）。これに予めブイヨン寒天培地にて３０℃、２４時
間培養して得られたエルビニア・アミロボラ IFO 1268
7、ミコプラナ・ジモルファ ATCC 4279、スポロサルシ
ナ・ウレアエIFO 12698及びビブリオ・タイロゲネス FE
RM P-7060の各菌体をそれぞれ一白菌耳量接種し、３０
℃で２４時間振とう培養した。培養終了後、遠心分離に
より菌体を集め、培養液と同量の１００ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、得られた湿菌体と同重
量の１００ｍＭリン酸緩衝液加え菌体懸濁液とした。こ
の菌体懸濁液１ｍｌに、２００ｍｇのマレイン酸及び１
００ｍｇのTriton X-100を溶解した同緩衝液９ｍｌを加
え、３０℃で反応を行った。２０時間後にサンプリング
を行い、反応液中に生成したＤ−リンゴ酸及びＬ−リン
ゴ酸の生成量を測定した。結果を表１に示す。各菌株と
も、良好にＤ−リンゴ酸を生成するが、Ｌ−リンゴ酸は
全く生成しなかった。

【００１８】

【表１】

【００１９】実施例２ グリセロール１．０％、マレイン酸０．２％、(ＮＨ₄)₂
ＳＯ₄ ０．５％、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．３％、ＫＨ₂ＰＯ₄
０．１％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０５％、ＦｅＳＯ₄
・７Ｈ₂Ｏ ０．００１％、ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ ０．０
０１％、酵母エキス０．５％、ポリペプトン１．０％及
びマルツエキス０．５％から成る組成の培地（ｐＨ６．
０）を５００ｍｌ容坂口フラスコに５０ｍｌずつ分注
し、１２０℃、１５分の条件で加熱殺菌した（尚、上記
表示は、重量／容量％で表示）。これに、予めポテトデ
キストロース寒天培地にて３０℃、４８時間培養して得
られたゲオトリカム・フラグランス CBS 152.25及びト
ルラスポラ・デルブルッキー IFO 1083の各菌体をそれ
ぞれ一白菌耳量接種し、３０℃で２４時間振とう培養し
た。培養終了後、遠心分離により菌体を集め、培養液と
同量の１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄し
た後、得られた湿菌体と同重量の１００ｍＭリン酸緩衝
液加え菌体懸濁液とした。この菌体懸濁液１ｍｌに、
０．５ｇの直径０．４ｍｍのガラスビーズを加え、ミニ
ビードビーター（バイオスペック社製）で、２分間処理
することにより菌体破砕を行った。この菌体破砕懸濁液
全量を、２００ｍｇのマレイン酸及び１００ｍｇのTrit
on X-100を溶解した同緩衝液９ｍｌを加え、３０℃で反
応を行った。２０時間後にサンプリングを行い、反応液
中に生成したＤ−リンゴ酸及びＬ−リンゴ酸の生成量を
測定した。結果を表２に示す。各菌株とも、良好にＤ−
リンゴ酸を生成するが、Ｌ−リンゴ酸は全く生成しなか
った。

【００２０】

【表２】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 エルビニア属、ミコプラナ属、スポロサ
   ルシナ属、ビブリオ属、ゲオトリカム属またはトルラス
   ポラ属に属し、マレイン酸よりＤ−リンゴ酸を生成する
   能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した菌
   体もしくは該菌体の処理物をマレイン酸に作用せしめ、
   Ｄ−リンゴ酸を生成させることを特徴とするＤ−リンゴ
   酸の製造方法。