WO1992013886A1 - Composition d'anticorps diriges contre le recepteur de l'interleukine-2 humaine ou animale - Google Patents

Composition d'anticorps diriges contre le recepteur de l'interleukine-2 humaine ou animale Download PDF

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WO1992013886A1
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Yannick Jacques
Jean-Paul Soulillou
Marie Audrain
Christine FRANÇOIS-BENDAHOU
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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
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    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • composition of antibodies directed against the human or animal interleukin-2 receptor Composition of antibodies directed against the human or animal interleukin-2 receptor.
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising at least two antibodies directed against the human or animal interleukin-2 receptor for ensuring the inhibition of interleukin-2 binding
  • Interleukin-2 plays a vital role in regulating the immune system. We know that two membrane glycoproteins are involved in the binding of IL-2. It is the p55 chain ( ⁇ chain of
  • a number of monoclonal antibodies have already been made against the p55 chain in humans and animals. Some of these antibodies have been used in the treatment of diseases associated with lymphocyte activation, such as experimental autoimmune diseases (12, 13), T cell leukemia (14) and, most importantly, organ transplants ( 15): The efficacy of a monoclonal anti-p55 antibody, 33B3.1, has been demonstrated in the prevention of early rejection of kidney allografts in humans (16 to 18).
  • a number of anti-p75 monoclonal antibodies are also known, notably TU27 (19), Mik ⁇ 1 and Mik ⁇ 2
  • anti-p75 monoclonal antibodies in particular the TU27 antibody
  • the applicant found that the antibody did not affect not proliferation of cells when the IL-2 concentration covered the saturation level of the high affinity receptors, which suggests a level of inhibition weak or zero in vivo in the presence of IL-2.
  • anti-p55 antibodies such as 33B3.1 only induce complete inhibition of IL-2 binding at high concentration (> 100 nM).
  • the present invention therefore aims to provide an antibody composition, preferably monoclonal, inducing at low concentration an effective inhibition of the binding of IL-2 and of the proliferation induced by IL-2.
  • the Applicant has surprisingly found that the combined use of two anti-p55 and anti-p75 monoclonal antibodies respectively has a synergistic effect which results in a very strong inhibition of cell proliferation at much higher antibody concentrations. weak than what was used in the prior art for lower results.
  • the inhibitory effect of 33B3.1 on the proliferation induced by IL-2 is greatly facilitated in the presence of Tic-1, TU27 or A41, the inhibition of 50% of the proliferation being then obtained at 33B3.1 concentrations 10 to 25,000 times lower.
  • the subject of the invention is therefore a composition comprising at least two antibodies directed against the IL-2 receptor, characterized in that it comprises an anti-p55 antibody and an anti-p75 antibody ensuring the inhibition of the binding IL-2 to its receptor and cell proliferation.
  • antibody in the sense of the invention means both the antibodies themselves and antibody fragments such as Fab, FCab ') 2 and F v . These fragments can in particular be obtained by chemical or genetic means.
  • the anti-p55 antibody and / or the anti-p75 antibody are preferably monoclonal antibodies.
  • IL-2 receptor in the sense of the invention is meant both the high affinity receptor constituted by all of the chains p55 and p75, than the said chains alone, in particular the chain p75 'which has an intermediate affinity allowing the binding of IL, -2.
  • anti-p55 antibodies in particular 33B3.1
  • anti-p75 antibodies in particular TU27, Tic-1 and A41.
  • the invention also applies to combinations of anti-p55 and anti-p75 antibodies which have been modified chemically or by genetic recombination, including “humanized” chimeric antibodies, for example by the method described in the application for Patent FR-A-2,641,468, as well as to bispecific antibodies which can be derived from anti-p55 and anti-p75 antibodies, by known chemical or genetic methods.
  • the relative proportions of anti-p55 and anti-p75 antibodies can vary quite widely.
  • the ratio can range from 99/1 to 1/99, the optimal ratio being estimated at 63 + 20/37 + 20.
  • the proportions for other combinations can be determined by in vitro tests or calculated from the optimal ratios of the combination 33B3.1 / TU27, in proportion to the respective affinities for the IL-2 receptor.
  • the optimal ratio is estimated at 20 ⁇ 10/80 ⁇ 10; in combination 33B3.1 / A41, the optimal ratio is estimated at 80 ⁇ 10/20 ⁇ 10.
  • composition according to the invention can be used in particular as an active agent against rejection of organs and marrow transplants, against leukemias and lymphomas
  • CD25-positive as well as against autoimmune pathologies such as type 1 diabetes, rheumatoid arthritis, ankylosing spondyloarthritis, multiple sclerosis and myas thenia gravis.
  • a subject of the invention is therefore also a process for the treatment of these diseases in which the composition which is the subject of the invention is administered parenterally, in particular intravenously, preferably between 1 and 50 mg per day in an isotonic vehicle containing the appropriate excipients.
  • FIGS. 1A, 1B show the effect of TU27 and 33R3.1 on the high affinity binding of IL-2 to 4AS cells.
  • the 4AS cells were incubated at 37oC for 30 min with increasing concentrations of IL-2 labeled with iodine 125, alone ( ⁇ ) or in the presence of TU27 (40 nM) ( ⁇ ), 33B3.1 (20 nM ) ( ⁇ ), or in the presence of TU27 and 33B3.1 in the same concentrations ( ⁇ ).
  • Nonspecific binding was measured in the presence of an excess (100 times) of unlabeled IL-2 (+).
  • Graph A represents the bond curves.
  • Graph B represents the Scatchard analysis after subtraction of the non-specific bond.
  • FIG. 2 shows the inhibition of the binding of TU27 labeled with iodine 125 to 4AS cells, by IL-2.
  • the 4AS cells were incubated at 37 ° C. for 45 min with 2 nM of labeled TU27 and with increasing concentrations of IL-2, in the absence ( ⁇ ) and in the presence ( ⁇ ) of 20 nM of 33B3.1 .
  • FIG. 3 shows the effect of TU27 and 33B3.1 on IL-2-dependent cell proliferation.
  • the 4AS cells were distributed in 96-well plates with irradiated DAB cells and increasing concentrations of IL-2, in the absence ( ⁇ ) or in the presence of 70 nM of TU27 ( ⁇ ) or 660 nM of 33B3.1 ( ⁇ ).
  • FIGS. 4A, 4B show the synergistic effect of TU27 and 33B3.1 on the inhibition of IL-2-dependent cell proliferation.
  • the 4AS cells were distributed in 96-well plates with irradiated DAB cells, 250 ⁇ M of IL-2 and (graph A) increasing concentrations of 33B3.1 in the absence ( ⁇ . Or in the presence ( ⁇ ) of 70 nM of TU27 or (Chart B) increasing concentrations of TU27 in the absence ( ⁇ ) or in the presence ( ⁇ of 25 nM of 33B3.1.
  • FIGS. 5A, 5B compare the effects of energy of 33B3.1 and different anti-p75 on IL-2 proliferation dependent on 4AS cells.
  • the cells were distributed in 96-well plates with irradiated DAB cells, 250 ⁇ M of IL2 and the following amounts of antibody: (graph A) increasing concentrations of 33B3.1 in the absence ( ⁇ ) or in the presence of 20 nM Tic-1 ( ⁇ ), 20 nM TU27 (A) or 20 nM A41 (o); (graph B) 10 nM of 33B3.1 in the presence of increasing concentrations of Tic-1 ( ⁇ ), TU27 (O) or A41 ( ⁇ );
  • FIG. 6 compares the synergistic effects of 33B3.1 and A41 on different cellular models of IL-2-dependent proliferation.
  • the 4AS cells ( ⁇ , ⁇ ) or the PBLs stimulated by PHA (o, ⁇ ) or OKT3 ( ⁇ , ⁇ ) are distributed in 96-well plates in the presence of 250 pM of IL2 and increasing amounts of 33B3.1 in the absence ( ⁇ , o, ⁇ ) or in the presence ( ⁇ , ⁇ , ⁇ ) of 20 nM of A41.
  • the 4AS clone comes from a series of clones produced by limiting dilutions from a rejected kidney allograft (22, 23). It was grown in RPMI 1640 medium (GIBCO, Glasgow, Scotland) supplemented with 10% human serum (CTS, France) and 1 nM of rIL-2 (Roussel Uclaf) and was stimulated for one week in the presence of B cells transformed by EBV and irradiated. These B cells were isolated from splenocytes from the kidney graft donor and are available from the same authors. This cell line (called DAB cell line) was cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum (SEBAK, Paris, France).
  • PBL Peripheral blood lymphocytes
  • the monoclonal antibody TU27 is a mouse IgG1 directed against the p75 chain of human rIL-2 (19). It was purified from ascites liquid (supplied by K.Sugamura, Tohoku Univers ity, Japan) by affinity chromatography on a protein A column (Bio-Rad, Richmond, USA), dialyzed against PBS, then the samples were stored at -20oC.
  • the TU27 antibody was deposited under the reference FERM P 10509, FERM BP 2510 with the Japanese collection: Fermentation Research Institute (FRI), 1-3, Higashi 1-chome, Yatabe-machi, Tsukuba-gun, Ibaraki-ken 305 Japan.
  • the monoclonal antibody 33B3.1 is a rat IgG2a directed against the p55 chain of human rIL-2 (24, 25) and is marketed by IMMUNOTECH (France) under the name IOT 14a (Deposit no 1-1002 with the CNCM ).
  • the Tic-1 antibody is a mouse IgG directed against the p75 chain of human rIL2. It is sold in purified form reference M-100A by Endogen laboratories (Boston, MA, USA).
  • the A41 antibody is a mouse IgG1 directed against the p75 chain of human rIL2. It was supplied in purified form by U. Weidle from Boehringer Laboratories (Penzberg, Germany).
  • the IL-2 used is a highly purified recombinant molecule produced in Escherichia coli and was supplied by Laboratoires Roussel Uclaf, Romainville, France.
  • IL-2 coupled to iodine 125 comes from New England Nuclear (Boston, Massachusetts, USA). Its specific radioactivity is between 300 and 1000 cpm / fmol. Tic-1, TU27, A41 and 33B3.1 were labeled with iodine 125 by the iodogen method (26). The specific radioactivity was between 1500 and 2500 cpm / fmol.
  • the 4AS cells are subjected beforehand to a "washing" of the IL-2 by preincubation for two hours at 37 ° C. in a medium free of IL-2. The cells were then centrifuged, washed three times and resuspended in PBS containing 0.5% BSA. 25 ⁇ l samples per well of cell suspension (between 0.5 and 2.10 cells per well as appropriate) were distributed on 96-well plates (NUNC, Roskilde, Denmark), with increasing concentrations of labeled ligand in a final volume of 50 ⁇ l per well.
  • the cells were prepared and distributed as above.
  • the labeled ligand was added in a fixed concentration to increasing concentrations of unlabeled competitors. After incubation at 37oC for 30 min (IL-2) or 45 min (antibody), the bound and non-bound fractions of the cells were determined as described above.
  • the 4AS cells were distributed in 96-well plates in an amount of 10,000 cells per well in 200 ⁇ l of RPMI 1640 medium + 10% human serum. Stimulating cells (20,000 irradiated DAB cells per well) and various concentrations of IL-2 were then added. After 72 h of incubation at 37 ° C in an incubator, the cells were incubated for 16 h in the presence of tritiated thymidine (0.25 ⁇ Ci per well) (Amersham, Les Ulis, France), harvested (PHD harvester, Watertown, Massachusetts, USA) and the incorporation of thymidine was then determined.
  • the PBL stimulated in PHA or OKT3 were distributed in 96-well plates under the same conditions as the 4AS.
  • IL2 was added at 250 pM and optionally anti-rIL2 antibodies at different concentrations.
  • the incorporation of thymidine is carried out as for the 4AS cells.
  • the antibody 33B3.1 which is inactive towards YT.2C2 cells due to the absence of the p55 chain, exhibited an inhibitory effect much superior to TU27 on the binding of IL-2 to 4AS cells.
  • the antibody 33B3.1 induces the complete disappearance of the high affinity component.
  • the number of binding sites with intermediate affinity (2500 sites / cell) was similar to the number of binding sites with high affinity measured in the absence of 33B3.1, suggesting that 33B3.1, by binding to p55, has for effect of transforming high affinity structures by liberation of the intermediate affinity component.
  • the response curves as a function of the doses of antibody showed that 33B3.1 inhibited the proliferation induced by IL-2 of the 4AS cells (FIG. 4A) with a half-maximal effect observed at 7.5 nM.
  • Complete inhibition of proliferation by 33B3.1 was observed only at high concentration (> 100 nM).
  • the dose-response curve of 33B3.1 was widely shifted to the low concentrations. In this case, the semi-maximum inhibition of proliferation was obtained with only 0.2 nM of 33B3.1, that is to say approximately 40 times less antibodies.
  • FIG. 4B Other experiments (FIG. 4B) have shown that, while TU27 alone at significant concentrations of 50 pM at 320 nM, with or without preincubation, had no effect on the proliferation induced by IL-2, this antibody showed an inhibitory effect in the presence of 33B3.1.
  • the antibody 33B3.1 at 25 nM induces an inhibition of approximately 70% of the proliferation and the remaining 30% are completely inhibited by TU27 (half-maximum effect observed at 1 nM).
  • Binding experiments carried out on a cell ul area expressing only the human p75 chain (YT line clone 2C2) (reference 4) have shown that the antibodies Tic-1, TU27 and A41 recognize a common epitope on the p75 chain with respective affinities of the order of 10 nM, 1 nM and 0.1 nM.
  • FIG. 5A shows that the inhibitory effect of 33B3.1 on the proliferation of 4AS cells is all the more effective when it is associated with a high affinity anti-p75.
  • the 33B3.1 used alone partially blocks (30%) proliferation at the highest concentration (167 nM), with an IC50 estimated at 1430 nM.
  • the IC50 of 33B3.1 drops respectively to 102 nM, 2.3 nM or 0.056 nM, i.e. at concentrations respectively 14 times, 620 times or 25,500 times less important than in the absence of the corresponding anti-p57.
  • anti-p75 antibodies cause very little inhibition of the proliferation of 4AS cells in the absence of 33B3.1.

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Abstract

La composition, qui comprend au moins deux anticorps, de préférence monoclonaux, dirigés contre le récepteur de l'interleukine-2, comporte un anticorps anti-p55 et un anticorps anti-p75 assurant l'inhibition de la liaison de l'interleukine-2 à son récepteur. Il s'agit notamment des couples 33B3.1/TU27, 33B3.1/Tic et 33B3.1/A41. La composition est utilisable comme agent actif contre les rejets d'organes et de greffes de moelle, contre les leucémies et lymphomes CD25-positifs ainsi que contre les pathologies auto-immunes telles que le diabète de type 1, la polyarthrite rhumatoïde, la spondylarthrite ankylosante, la sclérose en plaques et la myasthénia gravis.

Description

Composition d'anticorps dirigés contre le récepteur de l'interleukine-2 humaine ou animale.
La présente invention se rapporte à une composition comprenant au moins deux anticorps dirigés contre le récepteur de l'interleukine-2 humaine ou animale pour assurer l'inhibition de la liaison de l'interleukine-2
(IL-2).
L'interleukine-2 joue un rôle primordial dans la régulation du système immunitaire. On sait que deux glycoprotéines membranaires sont impliquées dans la fixation de l'IL-2. Il s'agit de la chaîne p55 (chaîne α de
55 kDa ou antigène Tac) par laquelle l'IL-2 se lie à la cellule avec une faible affinité (Kd = 10 -8 M) (référence bibliographique 1) et de la chaîne p75 (chaîne β de 75 ou 70 kDa) qui présente une affinité intermédiaire pour l'IL-2 (Kd = 10 -9M) (2 à 5). Les deux chaînes se combinent pour former le récepteur de l' interleukine-2 (rIL-2) à haute affinité (Kd = 10-11 M) (2 à 6). L'ADNc codant pour chacune des deux chaînes p55 et p75 a été identifié (6 et 7). Au contraire des cellules n'exprimant que la chaîne p55, les cellules ne présentant que la chaîne p75 répondent à l'IL-2 (8 à 10) et l'internalisent (11). On a déjà réalisé un certain nombre d'anticorps monoclonaux dirigés contre la chaîne p55 chez l'homme et l'animal. Certains de ces anticorps ont été utilisés dans le traitement de maladies associées à une activation lymphocytaire, telles que des maladies auto-immunes expérimentales (12, 13), la leucémie à cellules T (14) et, surtout, aux transplantations d'organes (15): L'efficacité d'un anticorps monoclonal anti-p55, le 33B3.1, a été démontrée dans la prévention du rejet précoce d'allogreffes de reins chez l'homme (16 à 18).
On connaît également un certain nombre d'anticorps monoclonaux anti-p75, notamment TU27 (19), Mikβ1 et Mikβ2
(20), 2-RB (21), Tic-1 (Endogen, Boston, MA, USA) et A 41
(Boehringer).
Outre l'utilisation de certains de ces anticorps monoclonaux pour inhiber la liaison de l'IL-2 à son récepteur, on a aussi décrit dans ce dessein l'emploi d'un mélange de deux anticorps monoclonaux dirigés tous deux contre la chaîne p55 (demande de brevet européen EP-A-0.241.811).
En analysant l'effet d'anticorps monoclonaux anti-p75, en particulier l'anticorps TU27, sur la prolifération cellulaire d'un clone lymphocytaire T humain induite par l'IL-2, la déposante a trouvé que l'anticorps n'affectait pas la prolifération des cellules lorsque la concentration en IL-2 couvrait le niveau de saturation des récepteurs de haute affinité, ce qui laisse présager un niveau d'inhibition faible ou nul in vivo en présence d'IL-2. En outre, la déposante a trouvé que les anticorps anti-p55 tels que 33B3.1 n'induisaient une inhibition complète de la liaison de l'IL-2 qu'à forte concentration(> 100 nM). La présente invention a donc pour objectif de fournir une composition d'anticorps, de préférence monoclonaux, induisant à faible concentration une inhibition efficace de la liaison de l'IL-2 et de la prolifération induite par l'IL-2.
La déposante a trouvé, de façon surprenante, que l'utilisation combinée de deux anticorps monoclonaux respectivement anti-p55 et anti-p75 présente un effet de synergie qui se traduit par une très forte inhibition de la prolifération cellulaire à des concentrations en anticorps beaucoup plus faibles que ce qui était utilisé dans l'art antérieur pour des résultats moindres. Ainsi, l'effet inhibiteur de 33B3.1 sur la prolifération induite par l'IL-2 est fortement facilité en présence de Tic-1, de TU27 ou de A41, l'inhibition de 50 % de la prolifération étant alors obtenue à des concentrations de 33B3.1 10 à 25 000 fois inférieures.
L'invention a donc pour objet une composition comprenant au moins deux anticorps dirigés contre le récepteur de l'IL-2, caractérisée en ce qu'elle comporte un anticorps anti-p55 et un anticorps anti-p75 assurant l'inhibition de la liaison de l' IL-2 à son récepteur et de la prolifération cellulaire.
Par anticorps dans le sens de l'invention, on entend aussi bien les anticorps eux-mêmes que des fragments d'anticorps tels que Fab, FCab')2 et Fv. Ces fragments peuvent être notamment obtenus par voie chimique ou génétique.
L'anticorps anti-p55 et/ou l'anticorps anti-p75 sont de préférence des anticorps monoclonaux.
Par récepteur de l'IL-2 dans le sens de l'invention, on entend aussi bien le récepteur à haute affinité constitué par l'ensemble des chaînes p55 et p75, que Iesdites chaînes seules, notamment la chaîne p75' qui présente une affinité intermédiaire permettant la liaison de l'IL,-2.
Parmi les anticorps monoclonaux utilisables dans la combinaison selon l'invention, on peut citer, pour les anticorps anti-p55, notamment 33B3.1, et, pour les anticorps anti-p75, notamment TU27, Tic-1 et A41.
L'invention s'applique également aux combinaisons d'anticorps anti-p55 et anti-p75 qui ont été modifiés par voie chimique ou par recombinaison génétique, y compris les anticorps chimériques "humanisés", par exemple par le procédé décrit dans la demande de brevet FR-A-2 641 468, ainsi qu'aux anticorps bispécifiques que l'on peut dériver d'anticorps anti-p55 et anti-p75, par des procédés connus chimiques ou génétiques.
Les proportions relatives d'anticorps anti-p55 et anti-p75 peuvent varier dans d'assez larges proportions. Dans la combinaison 33B3.1/TU27 le rapport peut aller de 99/1 à 1/99, le rapport optimal étant estimé à 63+20/37+20. Les proportions pour d'autres combinaisons peuvent être déterminées par des essais in vitro ou calculées à partir des rapports optimaux de la combinaison 33B3.1/TU27, en proportion des affinités respectives pour le récepteur de l'IL-2. Dans la combinaison 33B3.1/Tic-1, le rapport optimal est estimé à 20 ± 10 / 80 ± 10 ; dans la combinaison 33B3.1 / A41, le rapport optimal est estimé à 80 ± 10 / 20 ± 10.
La composition selon l'invention est utilisable notamment comme agent actif contre les rejets d'organes et de greffes de moelle, contre les leucémies et lymphomes
CD25-positifs ainsi que contre les pathologies auto-immunes telles que le diabète de type 1, la polyarthrite rhumatoide, la spondylarthri te ankylosante, la sclérose en plaques et la myas thénia gravis.
L'invention a donc également pour objet un procédé de traitement de ces maladies dans lequel on administre par voie parentérale, notamment par voie intraveineuse, la composition objet de l'invention, de préférence entre 1 et 50 mg par jour dans un véhicule isotonique contenant les excipients appropriés.
L'invention va être maintenant décrite plus en détail dans la description détaillée suivante, se référant au dessin annexé dans lequel :
- Les figures 1A, 1B montrent l'effet de TU27 et 33R3.1 sur la liaison de haute affinité de l'IL-2 aux cellules 4AS . Les cellules 4AS ont été incubées à 37ºC pendant 30 mn avec des concentrations croissantes d'IL-2 marquée à l'iode 125, seule (■) ou en présence de TU27 (40 nM) (▲), 33B3.1 (20 nM) (Δ), ou en présence de TU27 et 33B3.1 dans les mêmes concentrations (●). La liaison non spécifique a été mesurée en présence d'un excès (100 fois) d'IL-2 non marquée (+). Le graphique A représente les courbes de liaison. Le graphique B représente l'analyse Scatchard après soustraction de la liaison non spécifique.
- La figure 2 montre l'inhibition de la liaison de TU27 marqué à l'iode 125 aux cellules 4AS, par l'IL-2. Les cellules 4AS ont été incubées à 37°C pendant 45 mn avec 2 nM de TU27 marqué et avec des concentrations croissantes d'IL-2, en l'absence (▲) et en présence (■) de 20 nM de 33B3.1.
- La figure 3 montre l'effet de TU27 et 33B3.1 sur la prolifération cellulaire IL-2-dépendante. Les cellules 4AS ont été réparties dans des plaques à 96 puits avec des cellules DAB irradiées et des concentrations croissantes d'IL-2, en l'absence (Δ) ou en présence de 70 nM de TU27 (▲) ou de 660 nM de 33B3.1 (●).
- Les figures 4A, 4B montrent l'effet de synergie de TU27 et 33B3.1 sur l'inhibition de la prolifération cellulaire IL-2-dépendante. Les cellules 4AS ont été réparties dans des plaques à 96 puits avec des cellules DAB irradiées, 250 pM d'IL-2 et (graphique A) des concentrations croissantes de 33B3.1 en l'absence (Δ. ou en présence (▲) de 70 nM de TU27 ou (graphique B) des concentrations croissantes de TU27 en l'absence (■) ou en présence (▲ de 25 nM de 33B3.1.
- Les figures 5A, 5B comparent les effets de svnergie de 33B3.1 et de différents anti-p75 sur la prolifération IL-2 dépendante des celluless 4AS. Les cellules ont été réparties dans des plaques à 96 puits avec des cellules DAB irradiées, 250 pM d'IL2 et les quantités en anticorps suivantes : (graphique A) concentrations croissantes en 33B3.1 en l'absence (●) ou en présence de 20 nM de Tic-1 (Δ), de 20 nM de TU27 (A) ou de 20 nM de A41 (o) ; (graphique B) 10 nM de 33B3.1 en présence de concentration croissantes de Tic-1 (●), de TU27 (O) ou de A41 (▲) ;
- La figure 6 compare les effets synergiques de 33B3.1 et A41 sur différents modèles cellulaires de prolifération IL-2-dépendante. Les cellules 4AS (□ , ■) ou les PBL stimulés par PHA (o , ●) ou OKT3 (Δ , ▲ ) sont répartis dans des plaques 96 puits en présence de 250 pM d'IL2 et des quantités croissantes de 33B3.1 en l'absence (□ , o , Δ) ou en présence (■ , ● , ▲) de 20 nM de A41. MATERIELS ET METHODES
1 - Cellules
Le clone 4AS, disponible chez les auteurs des articles référencés 22 et 23, est issu d'une série de clones produits par dilutions limites à partir d'une allogreffe de rein rejetée (22, 23). Il a été cultivé en milieu RPMI 1640 (GIBCO, Glasgow, Ecosse) supplémenté avec 10 % de sérum humain (CTS, Nantes, France) et 1 nM de rIL-2 (Roussel Uclaf) et a été stimulé pendant une semaine en présence de cellules B transformées par l'EBV et irradiées. Ces cellules B ont été isolées à partir de splénocytes du donneur de greffon rénal et sont disponibles chez les mêmes auteurs. Cette lignée cellulaire (appelée lignée cellulaire DAB) a été cultivée en milieu RPMI 1640 supplémenté avec 10 % de sérum de veau foetal (SEBAK, Paris, France).
Les lymphocytes du sang périphérique (PBL) ont été purifiés à partir de poches d'hemochromatoses sur coussin de Ficoll. Ils sont stimulés pendant 4 jours en présence soit de Phytohémaglutinine à 1 % (PHA, DIFCO, Détroit, MI, USA), soit d'anticorps antiCD3 (OKT3, Ortho, Raritan, NJ, USA) à 1 ug/ml.
2 - Anticorps et IL-2.
L'anticorps monoclonal TU27 est une IgGl de souris dirigée contre la chaîne p75 du rIL-2 humain (19). Il a été purifié à partir de liquide d'ascite (fourni par K.Sugamura, Tohoku Univers ity, Japon) par chromatographie d'affinité sur une colonne de protéine A (Bio-Rad, Richmond, USA), dialysée contre du PBS, puis les échantillons ont été stockés à -20ºC. L'anticorps TU27 a été déposé sous la référence FERM P 10509, FERM BP 2510 auprès de la collection japonaise : Fermentation Research Institute (FRI), 1-3, Higashi 1-chome, Yatabe-machi, Tsukuba-gun, Ibaraki-ken 305 Japon.
L'anticorps monoclonâl 33B3.1 est une IgG2a de rat dirigée contre la chaîne p55 du rIL-2 humain (24, 25) et est commercialisé par IMMUNOTECH (France) sous la dénomination IOT 14a (Dépôt nº 1-1002 auprès de la CNCM). L'anticorps Tic-1 est une IgG de souris dirigée contre la chaîne p75 du rIL2 humain. Il est vendu sous forme purifiée référence M-100A par les laboratoires Endogen (Boston, MA, USA) .
L'anticorps A41 est une IgG1 de souris dirigée contre la chaîne p75 du rIL2 humain. Il a été fourni sous forme purifiée par U. Weidle des laboratoires Boehringer (Penzberg, Allemagne).
L'IL-2 utilisée est une molécule recombinante hautement purifiée produite dans Escherichia coli et a été fournie par les Laboratoires Roussel Uclaf, Romainville, France.
3 - Marquage radioactif de l'IL-2 et des anticorps monoclonaux.
L'IL-2 couplé à l'iode 125 provient de New England Nuclear (Boston, Massachusetts, USA). Sa radioactivité spécifique est comprise entre 300 et 1000 cpm/fmol. Tic-1, TU27, A41 et 33B3.1 ont été marqués à l'iode 125 par la méthode à l'iodogène (26). La radioactivité spécifique se situait entre 1500 et 2500 cpm/fmol.
4 - Essais de liaison.
Les cellules 4AS sont soumises au préalable à un "lavage" de l'IL-2 par préincubation pendant deux heures à 37ºC dans un milieu exempt d'IL-2. Les cellules ont été ensuite centrifugées, lavées trois fois et remises en suspension dans du PBS contenant 0,5 % de BSA. Des échantillons de 25 μl par puits de suspension cellulaire (entre 0,5 et 2.10 cellules par puits selon le cas) ont été répartis sur des plaques à 96 puits (NUNC, Roskilde, Danemark), avec des concentrations croissantes de ligand marqué dans un volume final de 50 μl par puits. Après une incubation de 45 mn (ligand = anticorps) ou de 30 mn (ligand = IL-2) à 37ºC sous agitation, des cellules de chaque puits ont été déposées sur une couche d'huile de paraffine au dibutylphtalate, centrifugées et les fractions radioactives liées ou non liées aux cellules ont été séparées et comptées comme cela est décrit dans la référence 27. Les capacités de liaison maximales (Bmax) des ligands et leurs constantes de dissociation respectives (Kd) ont été déterminées par analyse Scatchard.
5 - Compétition.
Les cellules ont été préparées et réparties comme ci-dessus. Le ligand marqué a été ajouté à concentration fixe à des concentrations croissantes de compétiteurs non marqués. Après incubation à 37ºC pendant 30 mn (IL-2) ou 45 mn (anticorps), les fractions liées et non liées aux cellules ont été déterminées comme cela a été décrit ci-dessus.
6 - Essai de prolifération.
Les cellules 4AS ont été réparties dans des plaques à 96 puits à raison d'une quantité de 10 000 cellules par puits dans 200 μl de milieu RPMI 1640 + 10 % de sérum humain. On a ajouté ensuite des cellules stimulantes (20 000 cellules DAB irradiées par puits) et diverses concentrations d'IL-2. Après 72 h d'incubation à 37ºC en incubateur, les cellules ont été incubées pendant 16 h en présence de thymidine tritiée (0,25 μCi par puits) (Amersham, Les Ulis, France), récoltées (appareil de récolte PHD, Watertown, Massachusetts, USA) et l'incorporation de thymïdine a ensuite été déterminée.
Les PBL stimulés en PHA ou OKT3 ont été répartis dans des plaques à 96 puits dans les mêmes conditions que les 4AS. On a ajouté de l'IL2 à 250 pM et éventuellement les anticorps anti-rIL2 à différentes concentration. L'incorporation de thymidine est effectuée comme pour les cellules 4AS.
INTERACTION DE TU27 ET DE 33B3.1 AVEC LA LIAISON A HAUTE AFFINITE DE L'IL-2.
L'influence de TU27 et de 33B3.1 sur la liaison de l'IL-2 avec les cellules 4AS a été d'abord analysée à 37°C par addition des compétiteurs en même temps que l'IL-2 marquée Çfigures 1A. 1B). Dans le domaine des concentrations étudiées (jusqu'à 2 nM), la liaison de l'IL-2 est caractérisée par une prédominance de la composante à haute affinité (Kd = 60 pM, 2600 sites/cellule) et l'apparition d'une composante à faible affinité. A une concentration (26 nM) induisant une inhibition complète de la liaison de l'IL-2 sur des cellules YT.2C2 (clone dérivé d'une lignée cellulaire du type NK humain ; référence bibliographique 4) qui n'expriment que la chaîne p75, l'anticorps TU27 n'a que faiblement inhibé la liaison de l'IL-2 aux cellules 4AS et le Kd de la liaison à l'IL-2 n'a été que légèrement affecté (Kd = 75 pM) (figure 1B).
L'anticorps 33B3.1, qui est inactif vis-à-vis des cellules YT.2C2 du fait de l'absence de la chaîne p55, a présenté un effet inhibiteur bien supérieur à TU27 sur la liaison de l'IL-2 aux cellules 4AS. Comme cela ressort des analyses Scatchard (figure 1B), l'anticorps 33B3.1 induit la disparition complète de la composante à haute affinité. La liaison de l'IL-2 en présence de 33B3.1 s'est caractérisée par une affinité intermédiaire (Kd = 1,36 nM) . Le nombre de sites de liaison à affinité intermédiaire '2500 sites/cellule) était analogue au nombre de sites de liaison à haute affinité mesuré en l'absence de 33B3.1, suggérant que 33B3.1, en se fixant sur p55, a pour effet de transformer les structures à haute affinité par libération de la composante à affinité intermédiaire. En outre, les composantes à affinité intermédiaire observées en présence de 33B3.1 étaient complètement inhibées par TTJ27 (figures 1A, 1B) avec un effet demi-maximal observé au voisinage de 1 nM, montrant que cette composante correspondait bien à des chaînes p75 isolées.
On considère maintenant l'effet de l'IL-2 sur la liaison de TU27 (figure 2). L'IL-2 inhibe complètement la liaison de TU27 sur les cellules 4AS et cet effet a été observé à des concentrations faibles d'IL-2 (constante d'inhibition Ki = 20 pM) correspondant à sa liaison à haute affinité. Par lui-même, 33B3.1 n'a pas d'effet sur la liaison de TU27 et inversement. Par contre, en présence de 33B3.1, l'IL-2 n'inhibe la liaison de TU27 qu'à des concentrations environ 50 fois supérieures. Dans ce cas, la constante d'inhibition était de Ki = 890 pM.
Ces résultats confortent le schéma selon lequel l'anticorps 33B3.1, en se fixant aux chaînes p55, libère la composante à affinité intermédiaire pour l'IL-2 (p75).
EFFET DE TU27 ET DE 33B3.1 SUR LA PROLIFERATION IL-2-DEPENDANTE DES CELLULES 4AS
Stimulées par un al lo-antigène (lignée cellulaire DAB), les cellules 4AS ont proliféré proportionnellement à la quantité d'IL-2 (figure 3). La prolifération demi-maximale a été observée pour 200 pM d'IL-2, une valeur correspondant à la liaison d'IL-2 au récepteur à haute aff ini té .
L'ajout en excès de 33B3.1 (660 nM) dans le milieu de culture s'est traduit par une inhibition complète de la prolifération. En revanche, TU27 n'a pas eu d'effet significatif sur la prolifération IL-2-dépendante des cellules 4AS, même pour de faibles concentrations, sub-optimales, d'IL-2, que l'anticorps ait été ajouté en même temps que l'IL-2 ou qu'il ait été préincubé pendant 1 h avec les cellules, avant l'addition d'IL-2. Des expériences réalisées sur d'autres clones de cellules T ont donné des résultats similaires.
Les courbes de réponse en fonction des doses d'anticorps ont montré que 33B3.1 inhibait la prolifération induite par IL-2 des cellules 4AS (figure 4A) avec un effet demi-maximal observé à 7,5 nM. Une inhibition complète de la prolifération par 33B3.1 n'était observée qu'à concentration élevée (> 100 nM). Cependant, lorsque TU27 était présent à une concentration de 70 nM, la courbe de réponse en fonction de la dose de 33B3.1 était largement décalée vers les faibles concentrations. Dans ce cas, l'inhibition demi-maximale de la prolifération était obtenue avec seulement 0,2 nM de 33B3.1, c'est-à-dire environ 40 fois moins d'anticorps.
D'autres expériences (figure 4B) ont montré que, alors que TU27 seul à des concentrations importantes de 50 pM à 320 nM, avec ou sans préincubâtion, n'avait pas d'effet sur la prolifération induite par IL-2, cet anticorps montrait un effet inhibiteur en présence de 33B3.1. L'anticorps 33B3.1 à 25 nM induit une inhibition de 70 % environ de la prolifération et les 30 % restants sont complètement inhibés par TU27 (effet demi-maximum observé à 1 nM). Des expériences de liaison réalisées sur une lignée cell ul aire n'exprimant que la chaîne p75 humaine (lignée YT clone 2C2) (référence 4) ont montré que les anticorps Tic-1, TU27 et A41 reconnaissent une épitope commun sur la chaîne p75 avec des affinités respectives de l'ordre de 10 nM, 1 nM et 0.1 nM.
La figure 5A montre que l'effet inhibiteur du 33B3.1 sur la prolifération des cellules 4AS est d'autant plus efficace que lui est associé un anti-p75 de forte affinité. Dans cette expérience, le 33B3.1 utilisé seul bloque partiellement (30 %) la prolifération à la plus forte concentration (167 nM), avec un IC50 estimé à 1430 nM. En présence de 20 nM Tic-1, de 20 nM TU27 ou de 20 nM A41, l'IC50 du 33B3.1 chute respectivement à 102 nM, 2,3 nM ou 0,056 nM, c'est-à-dire à des concentrations respectivement 14 fois, 620 fois ou 25500 fois moins importantes qu'en l'absence de l'anti-p57 correspondant.
Inversement (Figure 5B), les anticorps anti-p75 n'entraînent que très peu d'inhibition de la prolifération des cellules 4AS en l'absence de 33B3.1. En présence de 10 nM de 33B3.1, dose à laquelle on n'observe aucune inhibition de la prolifération cellulaire, les anticorps anti-p75 inhibent complètement cette prolifération et les IC50 sont corrélés avec les affinités respectives des anti-p75 : IC50 de Tic-1 = 58 nM ; IC50 de TU27 = 4,5 nM ; IC59 de A41 = 0,85 nM.
Sur la figure 6 sont montrés les effets de synergie entre 33B3.1 et A41 dans différents modèles d'inhibition de la prolifération cellulaire IL2-dépendante. Sont comparés sur cette figure les cellules 4AS stimulées par les cellules DAB (système de stimulation secondaire allogénique d'un clone cellulaire T), des PBL stimulés par OKT3 (stimulation primaire via le complexe TCR/CD3 d'une population polyclonale) et des PBL stimulés par PHA (stimulation primaire par un mitogène d'une population polyclonale). Dans tous les cas, on observe que la dose-réponse d'inhibition par le 33B3.1 est déplacée vers des concentrations beaucoup plus faibles lorsqu'est rajouté l'anticorps A41 (20 nM) qui tout seul n'a que très peu d'effet quel que soit le système cellulaire étudié.
Les résultats présentés dans les figures 5 et 6 suggèrent que la propriété de synergie entre anti-p55 et anti-p75 est général isable au moins à tout couple d'anticorps interagissant avec les épitopes définis respectivement sur les chaînes p55 et p75 par les anticorps 33B3.1 et Tic-l/TU27/A41. Ils montrent également que cette synergie est général isable à tout système de prolifération passant par le système IL2/rIL2 de haute affinité (association p55 et p75).
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27 - Y. JACQUES et al., 1986, J. Immunol. 136:1693.

Claims

REVENDICATIONS.
1. Composition comprenant au moins deux anticorps dirigés contre le récepteur de l'interleukine-2, caractérisée en ce qu'elle comporte un anticorps anti-p55 et un anticorps anti-p75 assurant l'inhibition de la liaison de l'interleukine-2 à son récepteur.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'anticorps anti-p55 et/ou l'anticorps anti-p75 sont des anticorps monoclonaux.
3. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comporte l'anticorps 33B3.1 dirigé contre la chaîne p55 et l'anticorps TU27 ou l'anticorps Tic-1 ou l'anticorps A41 dirigés contre la chaîne p75.
4. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'un au moins des anticorps est un anticorps chimérique.
5. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les deux anticorps sont liés sous forme d'anticorps bispécif ique.
6. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que le rapport de 33B3.1/TU27, le rapport de 33B3.1/Tic-1 ou le rapport de 33B3.1/A41 est compris entre 99/1 et 1/99.
7. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que le rapport de 33B3.1 / TU27 est de 63 ± 20 / 37 ± 20, le rapport 33B3.1/Tic est de 20 ± 10/80 ± 10, le rapport 33B3.1/A41 est de 80 ± 10/20 ± 10.
8. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, comme agent actif contre les rejets d'organes et de greffes de moelle, contre les l eucémies et lymphomes CD25-positifs ainsi que contre les pathologies auto-immunes telles que le diabète de type 1, la polyarthrite rhumatoïde, la spondylarthrite ankylosante, la sclérose en plaques et la myasthenia gravis.
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