WO1992014814A1 - Support pour la culture de cellules et procede de preparation d'un tel support - Google Patents

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WO1992014814A1
WO1992014814A1 PCT/BE1991/000012 BE9100012W WO9214814A1 WO 1992014814 A1 WO1992014814 A1 WO 1992014814A1 BE 9100012 W BE9100012 W BE 9100012W WO 9214814 A1 WO9214814 A1 WO 9214814A1
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microcarriers
cells
support according
support
faces
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PCT/BE1991/000012
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English (en)
Inventor
Guy De Hollain
Dominique Masquelier
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4C Biotech SA
Original Assignee
Computer Cell Culture Center SA
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C12N5/0075—General culture methods using substrates using microcarriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/06—Plates; Walls; Drawers; Multilayer plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers

Definitions

  • the present invention relates to a support for the culture of anchor-dependent cells (CAD), in the form of microcarriers made of a biocompatible material. It also relates to a process for the preparation of such a support.
  • CAD anchor-dependent cells
  • Mammalian cells used as such, for the production of human and veterinary vaccines, for obtaining molecules with very high added value or other similar productions, are generally CAD: they require a support to grow. In the absence of it, these cells, in suspension, degenerate and die.
  • Mass culture is best carried out industrially as the surface offered for attachment is large compared to the total volume of the support used.
  • this ratio can vary between 1.25 and 150.0 for some current microcarriers
  • microcarriers with spherical geometry are easier to form: microbeads. This is the reason why the user today has the choice of a very wide variety of this type of microcarrier (see among others, A. SHAHAR et al., Nerve and Muscle Cells on Microcarriers in Culture, in: Advances ...., op.cit., Pages 33 et seq., Volume 3, 1987).
  • these discs allow only a culture of cells attached ad vitam to their support, for example for the secretion of a given substance which is received.
  • the cell supports are not in suspension.
  • the aim of the present invention is to solve the problems posed by the supports according to the prior art, while notably improving the surface / volume ratio of the support. of culture.
  • the invention should preferably allow easy detachment of the cells from their support, without treatment damaging the cells, as well as a suspension culture. It is necessary that the supports according to the invention are biocompatibies. It is preferable that they allow an easy analysis of the cells during their growth, and that their density allows a culture in suspension in the culture medium. It is advantageous to achieve that the supports withstand the sterilization conditions.
  • the invention has provided a support for the culture of CAD, in the form of microcarriers in a biocompatible material, in which the microcarriers have a two-dimensional geometry and have two anchoring faces affixed to each of which the cells can cling and develop, without possible penetration of cells between these two faces.
  • the microcarriers have a thickness preferably less than or equal to 25 microns.
  • the microcarriers have a discoid shape, and in particular a shape of discs or spindles.
  • discoid designates, in the context of the present invention, the family of particles obtained by the orthogonal (disc) or oblique (spindle) intersection of two parallel planes separated from each other by a distance of 35 microns maximum, with a full cylinder.
  • the microcarriers, in the culture medium have a density between 0.90 and 1.10 g / cm 3 , preferably between
  • the density of the microcarriers is particularly suitable so that, in the fluid serving as a cooking medium, the turbulence generated to keep them in suspension does not trau ⁇ mat the hanging cells and does not alter their viability. Too light, the microcarriers float, too heavy, they sediment at the bottom of the bioreactor. Maintaining them in suspension therefore requires conditions of agitation speed of the culture medium such that the shearing forces thus generated do not detach the cells, inflicting multiple traumas on them.
  • the microcarriers are made of a material resistant to sterilization. This makes it possible to prevent contaminants (bacteria, mycoplasmas, yeasts, viruses, etc.) adhering to the microcarriers from developing in the culture of cells to the detriment of the latter.
  • the microcarriers are transparent for waves between the microcarriers
  • the microcarriers are made of a polymer material.
  • a polymer material a polymer having many aromatic groups, and in particular polystyrene.
  • the micro ⁇ carriers are biocompatible.
  • biocompatibility it should be understood, in the sense of the present invention, that the CAD are capable of catching on the faces of the microcarriers according to the invention and of multiplying therein. It is advantageously provided for this purpose to coat the two faces of the microcarriers according to the invention with a thin metallic deposit. This deposit is advantageously based on titanium. We can also consider platinum for example.
  • the microcarriers according to the invention offer a series of significant advantages compared to the three-dimensional microcarriers used today.
  • the reduction in the diameter of the micro-disks up to, for example, 80 microns makes it possible to use the nozzles developed in flow cytometry for achieving hydrodynamic focusing.
  • the scrolling in single file in the beam of the interrogating laser can be further improved by reducing the degrees of freedom of the microdisks following their shaping into spindle-shaped supports.
  • Such an approach would make it possible to apply the analysis and sorting techniques developed in flow cytometry to the cells anchored on the support, without it being necessary detach them beforehand with trypsin or ethylenedi mine tetraacetate (EDTA). In situ analysis becomes easy and cell damage resulting from trypsin or EDTA treatment is avoided.
  • micro-carriers preferably from 1 to 25 microns, or ultra-thin microcarriers, that is to say with a thickness of less than 1 micron.
  • the microdisks according to the invention having a diameter of less than 500 microns have the enormous advantage of being able to be transferred by pipetting and they can be used in cultures in suspension, without problem.
  • the present invention also relates to a method of manufacturing a support for the culture of CAD, in the form of microcarriers in a biocompatible material, this method being characterized in that it comprises cutting a thin or ultra-thin film into microcarriers having a two-dimensional geometry and comprising two affixed anchoring faces, on each of which the cells can hang and develop, without possible penetration of the cells between these two faces, as well as possibly prior treatment of the film to make it biocompatibie.
  • the thin or ultra-thin film can be cut in any suitable manner, depending on the nature of the film.
  • Polystyrene films for example, have many aromatic groups and are suitable for photoablation by excimer laser.
  • a method of vaporizing a thin layer of titanium on the internal surface of a petri dish is described in particular in patent LU-A-86337.
  • Other application methods can be envisaged, in particular by projection of titanium plasma using a magnet.
  • Tests intended to evaluate the adhesion capacity of CAD were carried out on discs of 8 mm in diameter, cut out with a punch in films of polystyrene and cellophane.
  • the cells used for these tests are Vero cells, available on the market, which were cultivated in Roux dishes with a surface area of 200 cm 2 in a humid incubator (37 ° C, 95% air / 5% CO in medium 199 (Gibco) enriched with 5% fetal calf serum (Gibco) and containing 100 U of penicillin and 0.1 mg of streptomycin / ml.
  • the bottom of the dishes containing the cells is rinsed with a PBS solution and the cells are detached by trypsinization (0.5% Gibco 1/250 trypsin solution containing 0.2% EDTA). This enzymatic digestion of the matrix is carried out until the cells can be seen hanging up with the naked eye. At this time, the activity of the enzyme is stopped by the addition of complete medium.
  • the cells are centrifuged (1000 rpm-ECCO centrifuge type H 6.5) for 10 minutes. The supernatant removed, the cells are resuspended in a determined volume of medium in order to determine their concentration, using for this purpose the Burker counting cell.
  • FIGS. 1 to 3 represent photos taken under the microscope of three control discs produced from films of cellophane of quality A, cellophane of quality B and polystyrene respectively, and subjected to the tests described above.
  • Figures 7 to 9 show similar photos of three discs made from the same films as for Figures 1 to 3, but after vaporization of titanium on both sides.
  • the cut film is made of a biocompatible material per se, which may be the case for certain types of cellophane for example, the application of a thin layer of titanium becomes superfluous.

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Abstract

Support pour la culture de cellules ancrage-dépendantes (CAD), en forme de microporteurs en un matériau biocompatible, les microporteurs présentant une géométrie bidimensionnelle et comportant deux faces d'ancrage apposées sur chacune desquelles les cellules peuvent s'accrocher et se développer, sans pénétration possible des cellules entre ces deux faces, et leur procédé de fabrication.

Description

Support pour la culture de cellules et procédé de préparation d'un tel support
La présente invention est relative à un support pour la culture de cellules ancrage-dépendantes (CAD), en forme de microporteurs en un matériau biocompatible. Elle concerne égale¬ ment un procédé de préparation d'un tel support.
Les cellules de mammifères, utilisées en tant que telles, pour la production de vaccins humains et vétérinaires, pour l'obtention de molécules à très haute valeur ajoutée ou d'autres productions analogues, sont généralement des CAD : elles nécessitent un support pour croître. En l'absence de celui-ci, ces cellules, en suspension, dégénèrent et meurent.
La culture en masse est d'autant mieux réalisée industriellement que la surface offerte à l'accrochage est grande par rapport au volume total du support utilisé. En calculant le rapport surface/volume de différents supports, on constate que ce rapport peut varier entre 1,25 et 150,0 pour certains microporteurs actuels
(voir M. BUTLER, Growth Limitations in Microcarrier Cultures, in : Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, pages 57 et suivantes, volume 34, Springer Verlag, 1987).
Industriellement, il est plus facile de façonner des microporteurs à géométrie sphérique : les microbilles. C'est la raison pour laquelle l'utilisateur a le choix aujourd'hui d'une très grande variété de ce type de microporteur (voir entre autres, A. SHAHAR et cons., Nerve and Muscle Cells on Microcarriers in Culture, in : Advances...., op.cit., pages 33 et suivantes, volume 3 , 1987).
Malgré toutes leurs potentialités, il n'existe que peu d'exemples au monde où les CAD soient cultivées en masse sur des microporteurs. Les boîtes de Roux, les flacons rotatifs et autres "usines à cellules" restent les moyens les plus généralement utilisés. Les raisons qui sous-tendent cette situation ainsi que les moyens à mettre en oeuvre, nécessaires pour y mettre fin, ont fait l'objet d'une étude détaillée (voir A.O.A. MILLER et cons., Microbeads and Anchorage-Dependent Eukaryotic Cells : The Beginning of a New Era in Biotechnology, in : Advances...., op.cit., pages 73 et suivantes, volume 39, 1989).
Récemment, dans le but essentiellement de diminuer les coûts de production des substances produites par les CAD, il a été fait usage de spirales en polystyrène, et de disques de 1,5 mm d'épaisseur et de 6 mm de diamètre formés d'un treillis de poly- propylène enrobé d'un film de polyester (voir A. KADOURI et cons., Polystyrène substratum for bulk culture of anchorage dépendent cells, in Cytotechnology, 1 : 301-307, 1988 ; M. NEEMAN et cons., Adaptation of Culture Methods for NMR Studies of Anchorage- Dépendent Cells, in Magnetic Résonance in Médecine, 7, 236-242,
1988 ; A. KADOURI et cons., Production of Anti-Leukemic Factor from Stroma Cells in a Stationary Bed Reactor on a New Cell Support, in 9th ESACT Meeting, Belgium, pages 327 et suivantes, Butteworths, 1989). Tous les supports précités se caractérisent par une géométrie tridimensionnelle. Pour beaucoup d'entre eux, même en ce qui concerne les microbilles et les disques épais en matière tissée, le rapport surface/volume du support reste peu favorable. Ces disques épais en treillis de matière tissée présentent d'ailleurs l'inconvénient de permettre la pénétration et l'accrochage de cellules à l'intérieur des disques. Ces cellules ne peuvent plus ou très diffici¬ lement être alors séparées de leur support, ce qui représente un grand inconvénient et une perte sèche lorsqu'on cultive les cellules pour elles-mêmes. En fait, ces disques permettent uniquement une culture de cellules accrochées ad vitam à leur support, par exemple en vue de la sécrétion d'une substance donnée que l'on récoite. Dans ce type de culture, les supports de cellules ne sont pas en suspension. La présente invention a pour but de résoudre les problèmes posés par les supports selon la technique antérieure, tout en améliorant notablement le rapport surface/volume du support de culture. L'invention doit permettre de préférence un détachement aisé des cellules à partir de leur support, sans traitement endom¬ mageant les cellules, ainsi qu'une culture en suspension. Il est nécessaire que les supports suivant l'invention soient biocompatibies. Il est préférable qu'ils permettent une analyse aisée des cellules au cours de leur croissance, et que leur densité permette une culture en suspen¬ sion dans le milieu de culture. Il est avantageux de parvenir à ce que les supports résistent aux conditions de stérilisation.
Pour résoudre ces problèmes, on a prévu suivant l'invention un support pour la culture des CAD, en forme de microporteurs en un matériau biocompatible, dans lequel les microporteurs présentent une géométrie bidimensionnelle et comportent deux faces d'ancrage apposées sur chacune desquelles les cellules peuvent s'accrocher et se développer, sans pénétration possible des cellules entre ces deux faces.
Par géométrie bidimensionnelle, il faut entendre que l'épaisseur de ces microporteurs tant à devenir infime et négligeable par rapport aux dimensions des CAD. Cette réduction d'épaisseur est telle qu'il n'y a aucune possibilité de croissance de cellules au sein du support, mais uniquement sur ses deux faces d'ancrage.
Suivant une forme de réalisation de l'invention les microporteurs ont une épaisseur de préférence inférieure ou égale à 25 microns.
Suivant une forme préférée de réalisation de l'in- vention, les microporteurs ont une forme discoïdale, et en particulier une forme de disques ou de fuseaux. Le terme discoîdal désigne, dans le cadre de la présente invention, la famille de particules obtenues par l'intersection orthogonale (disques) ou oblique (fuseaux) de deux plans parallèles séparés l'un de l'autre d'une distance de 35 microns au maximum, avec un cylindre plein.
Suivant une forme avantageuse de réalisation de l'invention, les microporteurs ont, dans le milieu de culture, une densité comprise entre 0,90 et 1,10 g/cm3, de préférence entre
1,03 et 1,05 g/cm3. La densité des microporteurs est appropriée en particulier pour que, dans le fluide servant de milieu de cuiture, les turbulences engendrées pour les maintenir en suspension ne trau¬ matisent pas les cellules accrochées et n'altèrent pas leur viabilité. Trop légers, les microporteurs flottent, trop lourds, ils sédimentent au fond du bioréacteur. Leur maintien en suspension nécessite donc des conditions de vitesses d'agitation du milieu de culture telles que les forces de cisaillement ainsi engendrées ne décrochent pas les cellules, en leur infligeant de multiples traumatismes.
Suivant une forme de réalisation particulière de l'invention, les microporteurs sont en un matériau résistant à la stérilisation. Cela permet d'éviter que des contaminants (bactéries, mycoplasmes, levures, virus, etc..) adhérant aux microporteurs ne se développent dans la culture de cellules au détriment de ces dernières.
Suivant une autre forme de réalisation de l'invention, les microporteurs sont transparents pour des ondes comprises entre
400 nm et 1000 nm. Par transparence, on entend que, dans ce domaine de longueurs d'ondes, la lumière traverse les microporteurs sans atténuation importante de l'intensité du faisceau lumineux émer¬ geant par rapport à l'intensité du faisceau de lumière incident. Une absorption inférieure à 1% est considérée comme tout à fait avan¬ tageuse.
Suivant une forme de réalisation de l'invention, les microporteurs sont en une matière polymère. On peut par exemple envisager, comme matière polymère, un polymère présentant de nombreux groupes aromatiques, et en particulier du polystyrène.
D'autres matières ne sont bien entendu pas à exclure et par exemple des disques en matière hydrophile, comme de la cellophane ou du poly-D-hydroxybutyrate, sont concevables. Ils présentent cependant l'inconvénient de gonfler à l'eau, ce qui risque de leur faire perdre leur géométrie bidimensionnelle.
Il est nécessaire, suivant l'invention, que les micro¬ porteurs soient biocompatibles. Par biocompatibilité, il faut entendre, dans le sens de la présente invention, que les CAD sont capables de s'accrocher sur les faces des microporteurs suivant l'invention et de s'y multiplier. Il est avantageusement prévu dans ce but de revêtir les deux faces des microporteurs suivant l'invention d'un mince dépôt métallique. Ce dépôt est avantageusement à base de titane. On peut envisager également le platine par exemple. Les microporteurs suivant l'invention offrent une série d'avantages significatifs par rapport aux microporteurs tridimen¬ sionnels utilisés aujourd'hui.
Un calcul simple permet de se rendre compte que la surface totale de deux disques infiniment minces dont le diamètre est égal à celui de la sphère à l'intérieur de laquelle ils s'inscrivent
(disques "equatoriaux") est égale à la surface extérieure de la sphère
(= microbille).
A l'intérieur des deux calottes ainsi aménagées au-dessus et en dessous de ces deux disques equatoriaux, peuvent se disposer d'autres disques dont le diamètre cette fois va en diminuant au fur et à mesure qu'on s'éloigne de l'équateur pour se diriger vers les pôles. Adoptant une épaisseur de 10 microns pour l'ensemble des disques ainsi engendrés et exprimant leur surface en terme de "surface équatoriale équivalente", la surface totale ainsi fournie par les disques est 5 à 7 fois supérieure à la surface extérieure de la sphère.
Bien sûr, en suspension, les mouvements aléatoires de ces microdisques ainsi que l'augmentation d'épaisseur résultant de l'adhésion des CAD concourent à diminuer la surface totale dispo- nible. Néanmoins celie-ci reste supérieure à au moins deux fois la surface externe de la sphère.
Par ailleurs, la réduction du diamètre des micro¬ disques jusqu'à par exemple 80 microns permet d'utiliser les ajutages développés en cytométπe de flux pour réaliser la focalisation hydro- dynamique. Le défilement à la file indienne dans le faisceau du laser interrogateur peut encore être amélioré en diminuant les degrés de liberté des microdisques consécutivement à leur façonnage en supports fusiformes. Une telle approche permettrait d'appliquer aux cellules ancrées sur le support les techniques d'analyse et de tri développées en cytométrie de flux, sans qu'il soit nécessaire de les en détacher au préalable par la trypsine ou le tétraacétate d'éthylènedi mine (EDTA). L'analyse in situ devient aisée et les endommagements cellulaires résultant d'un traitement à la trypsine ou au EDTA sont évités. Selon leur épaisseur on pourra envisager des micro¬ porteurs minces, de préférence de 1 à 25 microns, ou des microporteurs ultra-minces, c'est-à-dire d'une épaisseur inférieure à 1 micron. Les microdisques suivant l'invention présentant un diamètre inférieur à 500 microns présentent l'énorme avantage de pouvoir être transférés par pipettage et ils peuvent être utilisés dans des cultures en suspension, sans problème. Les microdisques, dont le diamètre est d'une dimension supérieure, bien qu'ils puissent également être utilisés en suspension, de par le fait qu'ils ne peuvent être transférés que partransvasement, trouvent leur utilisation plutôt dans les cultures immobilisées.
La présente invention concerne également un procédé de fabrication d'un support pour la culture de CAD, en forme de microporteurs en un matériau biocompatible, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend un découpage d'un film mince ou ultra-mince en microporteurs présentant une géométrie bidimension¬ nelle et comportant deux faces d'ancrage apposées, sur chacune desquelles les cellules peuvent s'accrocher et se développer, sans pénétration possible des cellules entre ces deux faces, ainsi qu'éven¬ tuellement un traitement préalable du film pour le rendre biocompatibie. Le découpage du film mince ou ultra-mince peut être effectué d'une manière quelconque appropriée, selon la nature du film. Les films de polystyrène par exemple présentent de nombreux groupes aromatiques et ils se prêtent à la photoablation par laser excimère. On peut aussi envisager un découpage mécanique, à l'em- porte-pièce, particulièrement avantageux dans le cas de microporteurs de grand diamètre. Malgré la relativement mauvaise qualité de ce type de découpe, il est possible d'envisager une découpe par pyrolyse (laser à argon), par exemple de disques en cellophane préalablement colorée en rouge avec une substance non toxique. D'autres procédés sont bien sûr éventuellement envisageables. Dans le cas où le matériau dont est fait le support suivant l'invention n'est pas en soi biocompatible, ce qui est le cas par exemple du polystyrène, il faut prévoir en outre, avant le découpage, un traitement approprié pour rendre ce matériau biocompatible. Dans ce but, on prévoit, suivant l'invention une application d'un mince dépôt métallique, en particulier à base de titane, sur chacune des surfaces du film mince.
Un procédé de vaporisation d'une mince couche de titane sur la surface interne d'une boîte de Pétri est décrit notam- ment dans le brevet LU-A-86337. On peut envisager d'autres procédés d'application, notamment par projection de plasma de titane à l'aide d'un magné tron.
L'utilisation de disques ou fuseaux minces en poly¬ styrène ou en cellophane revêtus d'une couche de titane sur les deux faces permet d'envisager un décrochage electrolytique des cellules.
Pour rendre biocompatible le film mince ou ultra¬ mince on peut aussi envisager, suivant l'invention, de faire passer une décharge électrique à effet couronne au travers du film. II faut noter que, si le polystyrène ne résiste pas à une stérilisation à l'autoclave, il est possible de le stériliser par irradiation aux rayons gamma. Une stérilisation à l'alcool peut aussi être envisagée.
Des essais destinés à évaluer la capacité d'adhésion de CAD ont été réalisés sur des disques de 8 mm de diamètre, découpés à l 'emporte-pièce dans des films de polystyrène et de cellophane. Les cellules utilisées pour ces essais sont des cellules Véro, disponibles sur le marché, qui ont été cultivées en boîtes de Roux de 200 cm2 de surface dans un incubateur humide (37°C, 95% air/ 5% CO dans du milieu 199 (Gibco) enrichi par 5% de sérum de veau foetal (Gibco) et contenant 100 U de pénicilline et 0, 1 mg de streptomycine/ml.
Le fond des boîtes contenant les cellules est rincé par une solution de PBS et les cellules sont détachées par trypsinisation (solution de trypsine Gibco 1/250 à 0,5% contenant 0,2% de EDTA). Cette digestion enzymatique de la matrice est réalisée jusqu'au moment où l'on peut voir les cellules se décrocher à l'oeil nu. A ce moment, l'activité de l'enzyme est arrêtée par l'addition de milieu complet. Les cellules sont centrifugées (1000 rpm-centrifugeuse ECCO type H 6,5) pendant 10 minutes. Le surnageant éliminé, les cellules sont resuspendues dans un volume déterminé de milieu afin de déterminer leur concentration, en utilisant à cet effet la cellule de comptage de Burker.
L'incubation de 40.000 cellules est ensuite réalisée à la surface des microporteurs suivant l'invention, préalablement recouverts ou non de titane. Ces microporteurs ont été déposés dans une boîte multipuits (24). Au fond des puits, ils sont maintenus plaqués par une goutte de glycérol. Les observations sont réalisées 24 heures après cette inoculation. Les figures 1 à 3 représentent des photos prises au microscope de trois disques témoins réalisés à partir de films respectivement en cellophane de qualité A, cellophane de qualité B et polystyrène, et soumis aux essais décrits ci-dessus.
Les figures 4 à 6 représentent des photos semblables de trois disques réalisés à partir des mêmes films que les figures
1 à 3, mais après projection au magnétron d'un plasma de titane sur leurs deux faces.
Les figures 7 à 9 représentent des photos semblables de trois disques réalisés à partir des mêmes films que pour les figures 1 à 3, mais après vaporisation de titane sur leurs deux faces.
Il ressort de ces figures, que les disques utilisés suivant l'invention connaissent un rendement cellulaire de loin supérieur après application d'une couche de titane sur leurs deux faces.
Il est évident que, si le film découpé est en une matière biocompatible en soi, ce qui peut être le cas de certains types de cellophane par exemple, l'application d'une couche mince de titane devient superflue.
Un essai semblable aux précédents a été réalisé sur des disques découpés dans une feuille de polystyrène traitée par une décharge à effet couronne, pour la rendre biocompatible. Les résultats obtenus sont aussi satisfaisants que ceux illustrés sur les figures 6 et 9.
Des essais analogues aux précédents ont aussi été effectués sur des cellules de keratinocytes humains et sur des fibroblastes diploïdes de rat, avec des résultats identiquement bons.
Il est entendu que d'autres formes que celle des discoïdes pourraient convenir pour les microporteurs. On pourrait envisager des ellipses, des ovales, des carrés, des losanges, d'autres poly¬ gones, etc....

Claims

REVENDICATIONS
I. Support pour la culture de cellules ancrage- dépendantes (CAD), en forme de microporteurs en un matériau biocom¬ patible, caractérisé en ce que les microporteurs présentent une géomé¬ trie bidimensionnelle et comportent deux faces d'ancrage apposées sur chacune desquelles les cellules peuvent s'accrocher et se développer, sans pénétration possible des cellules entre ces deux faces.
2- Support suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les microporteurs ont une épaisseur inférieure ou égale à 25 microns. 3. Support suivant l'une des revendications 1 et
2, caractérisé en ce que les microporteurs ont une forme discoi'dale, et en particulier une forme de disques ou de fuseaux.
-*. Support suivant l'une des revendications I à
3, caractérisé en ce que les microporteurs ont, dans le milieu de culture, une densité comprise entre 0,90 et 1,10 g/cm3, de préférence entre 1,03 et 1,05 g/cm3.
5. Support suivant l'une des revendications 1 à
4, caractérisé en ce que les microporteurs sont en un matériau résis¬ tant à la stérilisation. 6. Support suivant l'une des revendications 1 à
5, caractérisé en ce que les microporteurs sont transparents pour des ondes comprises entre 400 nm et 1000 nm.
7. Support suivant l'une des revendications 1 à
6, caractérisé en ce que les microporteurs sont revêtus sur leurs deux faces d'un mince dépôt métallique.
8. Support suivant la revendication 7, caractérisé en ce que le dépôt métallique est à base de titane.
9. Support suivant l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les microporteurs sont en une matière polymère. 10. Support suivant la revendication 9, caracté¬ risé en ce que la matière polymère est du polystyrène.
11. Support suivant l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les microporteurs sont formés d'un film hydrophile. 12. Support suivant la revendication 1 1, caractérisé en ce que le film hydrophile est en cellophane ou en poly-D-hydro- xybutyrate.
13. Procédé de fabrication d'un support pour la culture de cellules ancrage-dépendantes (CAD), en forme de micro¬ porteurs en un matériau biocompatible, caractérisé en ce qu'il comprend un découpage d'un film mince ou ultra-mince en microporteurs présen¬ tant une géométrie bidimensionnelle et comportant deux faces d'an¬ crage apposées, sur chacune desquelles les cellules peuvent s'accrocher et se développer, sans pénétration possible des cellules entre ces deux faces, ainsi qu'éventuellement un traitement préalable du film pour le rendre biocompatible.
14-. Procédé suivant la revendication 13, caractérisé en ce que le film mince a une épaisseur inférieure ou égale à 25 microns.
15. Procédé suivant l'une des revendications 13 et 14, caractérisé en ce qu'il comprend un découpage à l'aide d'un laser.
16. Procédé suivant l'une des revendications 13 et 14, caractérisé en ce qu'il comprend un découpage mécanique, à l 'emporte-pièce.
17- Procédé suivant l'une des revendications 13 à 16, caractérisé en ce qu'il comprend, comme traitement préalable susdit, une application d'un mince dépôt métallique, en particulier à base de titane, sur chacune des surfaces du film mince, notamment par projection de plasma, ou respectivement par vaporisation.
18. Procédé suivant l'une des revendications 13 à 16, caractérisé en ce qu'il comprend, comme traitement préalable susdit, un passage d'une décharge électrique à effet couronne au travers du film mince ou ultra-mince.
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