WO1993005157A1 - Structure ribozymique derivee de l'arn genomique du virus de l'hepatite delta - Google Patents

Structure ribozymique derivee de l'arn genomique du virus de l'hepatite delta Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a new ⁇ bozymic structure capable of cutting in trans a target molecule of DNA or RNA.
  • this new ⁇ bozymic structure is an RNA molecule derived from the genomic RNA of the human hepatitis virus
  • the genomic RNA of the human hepatitis delta virus exhibits autocatalytic activities. From reduced RNA fragments retaining an autocatalytic cleavage activity, derived from genomic viral RNA, it has been possible according to the invention to separate a catalytic part and a substrate part, as will be explained. below.
  • a cleavage can be obtained during a binary reaction by mixing the ribozymic structure having catalytic activity with a heterologous RNA or DNA substrate.
  • This characterization of a fragment with catalytic cleavage activity allows, according to the invention, to use these ribozymic structures of the genomic RNA of the hepatitis delta virus as a ribozymic structure of the "human" type for cleavage.
  • target RNA in vitro or in vivo, for experimental, therapeutic or prophylactic purposes.
  • Ribozymes are RNA molecules which are naturally capable of exerting catalytic activities, and particularly RNAsic activities.
  • ribozymes have sought, from such natural ribozymes, to determine artificial ribozyme structures capable of exerting enzymatic cleavages on specific target RNAs.
  • Such ribozymes therefore provide therapeutic tools which can be used in the context of "antisense" oligonucleotide type approaches, in particular for specifically degrading target RNAs of pathogenic type.
  • Ribozymic activities appear to be widespread, and catalytic RNAs have been described in bacteria, protozoa, plants, and animal systems. The first ribozymic activities were first demonstrated in the splicing systems of class I neutrons, then in RNase P. More recently, it has been discovered that the genomes of many RNA viruses, plants or even mammals 35 also carried ribozymic activities which intervened during the cycle of viral multiplication. Finally, certain RNAs transcribed from regions of satellite DNA in the newt also also exhibit natural ribozymic activity ⁇ used to cut the concateremic transcripts.
  • a second class of ribozymes also derived from a plant virus, has a "hairpin” catalytic structure, or an "L” structure.
  • ribozyme work in vitro, but the cleavage efficiencies in vivo, in animal or human cells, are still not very effective. This relative ineffectiveness is probably due, at least in part, to the fact that all these ribozymes are derived from plant viruses and not from animal or even human viruses.
  • the hepatitis delta is a human RNA viruses that r is found consistently associated with hepatitis B.
  • the genomic RNA, and also anti-genomic RNA of the virus both have an activity autocatalytic cleavage.
  • the sequence of the minimum length RNA fragment exhibiting ribozymic activity does not bear any resemblance to the already known catalytic motifs of the "T" or "L” type.
  • the hepatitis delta virus replicates in human hepatocytes and its ribozymic activity works perfectly in these cells. Its ribozymic activity was naturally selected to function in human liver cells and we therefore have with this model a perfect example of what an active ribozyme could be in humans.
  • the genomic RNA of the hepatitis delta virus 1,700 nucleotides in length, indeed contains a region capable of exerting an autocatalytic cleavage.
  • This autocatalytic cleavage can be carried out by a subfragment with a length of 89 nucleotides, the secondary structure of which can be shown diagrammatically in the form represented in FIG. .
  • the autocatalytic cleavage takes place at the level of the phos ' phodiester bond indicated by the arrow in FIG. 1. From this ribozymic fragment with autocatalytic activity, ribozymic structures comprising catalytic activity capable of s exercise in trans, during a binary reaction, on a second target RNA molecule.
  • This invention provides new ribozymic molecules capable of efficiently cleaving target DNA or RNA molecules, in particular of pathological nature, for therapeutic or prophylactic purposes, in human, animal or even plant cells.
  • RNA subfragments corresponding to different regions of the molecule shown in Figure 1, were prepared. These different fragments were then tested in reconstruction experiments in order to differentiate the substrate fragments from the catalytic fragments.
  • the subject of the present invention is therefore a ribozymic structure derived from the genomic RNA of the hepatitis delta virus consisting of one or more fragments of said genomic RNA of the hepatitis delta virus, and capable of exerting catalytic cleavage activity in trans on another molecule comprising a specific RNA nucleic acid sequence.
  • the ribozymic structure consists of one or two fragment (s) derived from the sequence of 74 nucleotides comprising the nucleotides from 16 to 89 shown in FIG. 2.
  • the strutures preferred ribozymics that is to say the most effective in terms of cleavage activity, comprise a single fragment.
  • the ribozymic structure according to the invention can consist in the fragment of 7 nucleotides comprising the nucleotides of 16 to 89 or this same fragment 16-89 in which only part of the nucleotides 50 to 77 have been deleted. When the entire sequence 50-77 has been deleted, the fragment loses its cleavage catalytic activity.
  • the ribozymic structure according to the invention will comprise a sequence of at least 12 nucleotides.
  • said nucleic acid sequence of said other molecule corresponds to a fragment of the genomic RNA of the hepatitis delta virus substrate of said trans-cleavage catalytic activity.
  • said nucleic acid sequence of said other molecule may comprise the fragment of 8 nucleotides ranging from nucleotides 5 to 12 shown in FIG. 2.
  • the catalytic cleavage activity takes place in the presence of divalent metal ions, in particular magnesium.
  • the ribozymic structure according to the invention is inserted into said other molecule and is capable of exerting an autocatalytic activity of cleavage on this other molecule in which it is inserted.
  • the ribozymic structure according to the invention will exert a ⁇ bonucléasique activity, in particular endoribonucléasique on another molecule comprising a polyribonucleotide of specific sequence.
  • the ribozymic structure according to the invention can be used for therapeutic or prophylactic purposes in prokaryotic or eukaryotic cells, animal or plant, said other molecule therefore being able to be a heterologous molecule of animal or plant cells.
  • the viral particle of hepatitis delta may be used as an packaging system or any other vector for the intra-cellular delivery of ribozymic structures according to the invention, whether in bacteria, eukaryotic, animal or plant cells.
  • FIG. 1 shows the potential secondary structure in "pseudo-node" of an autocatalytic fragment of the genomic RNA of the hepatitis delta virus.
  • FIG. 2 shows the potential structure of the binary trans cleavage complex by a ribozyme derived from the genomic strand of the hepatitis delta virus.
  • FIG. 3 shows the autoradiography of a 20% polyacrylamide gel on which the products of the incubations of a ribozymic structure according to the invention with its substrate have been migrated, after variable times.
  • FIG. 4 shows an analysis on 10% polyacrylamide gel / 7 M urea of the products of an autocatalytic cleavage kinetics of a ribozymic structure of 71 nucleotides in length comprising a deletion in the self-paired structure 50-77.
  • Example 1
  • This matrix was obtained by chemically synthesizing the DNA sequences, by hybridizing them, then by amplifying the product obtained by a PCR reaction.
  • This PCR reaction makes it possible, using the appropriate primers, to add the promotion sequences of the transcription allowing the functioning of the polymerase 17.
  • Figure 2 illustrates the ribozymic structure of 74 nucleotides and its substrate of 13 nucleotides.
  • FIG. 3 represents the autoradiography of a 20% polyacrylamide gel onto which the products of the incubations of the ribozyme with its substrate have been migrated after variable times.
  • the substrate was labeled in 5 ′ with gamma-ATP 32 P by T4 polynuciéotide kmase and purified on polyacrylamide gel before use.
  • nucleotides 53 to 61 and 66 to 74 were deleted. These deletions were carried out by synthesizing a DNA fragment comprising the desired sequence, then by amplifying this fragment by PCR as described previously for the ribozyme of 74 nucleotides. After amplification with the appropriate primers and transcription by T7 RNA polymerase, a ribozymic structure of 71 nucleotides is obtained, retaining its autocatalytic activity and operating at 37 ° C and 60 ° C ( Figure 4).
  • the ribozyme was labeled 5 ′ with gamma-ATP 32 P by T4 polynucleotide kinase and purified on polyacrylamide gel before use. It is denatured at 95 ° C for 1 minute in the presence of 1 mM EDTA, then it is rapidly cooled to 0 ° C on ice (snap-cool). The reaction medium is then adjusted by adding 40 mM Tris pH 8.0 and 10 mM MgC, then incubated at 37 ° C (2 to 7) or at 60 ° C (8 to 13).
  • the native ribozyme (89 nucleotides long) cuts its RNA with a t 1/2 of 15 seconds, while the deleted ribozyme has a t 1 2 of 3 minutes. Therefore, the deletion changes the general structure of the ribozyme, which changes the kinetics of the reaction, but it does not directly affect the catalytic site.

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Abstract

La présente invention concerne une structure ribozymique dérivée de l'ARN génomique du virus de l'hépatite delta consistant dans un ou plusieurs fragments dudit ARN génomique du virus de l'hépatite delta, et capable d'exercer une activité catalytique de coupure en trans sur une autre molécule comportant une séquence spécifique d'acide nucléique d'ARN.

Description

STRUCTURE RIBOZYMIQUE DERIVEE DE L'ARN GENOMIQUE DU VIRUS DE
ΓΉEPATITE DELTA
La présente invention concerne une nouvelle structure πbozymique pouvant couper en trans une molécule cible d'ADN ou d'ARN.
Précisément, cette nouvelle structure πbozymique est une molécule d'ARN dérivée de l'ARN génomique du virus humain de l'hépatite
5 delta.
L'ARN génomique du virus humain de l'hépatite delta présente des activités autocatalytiques. A partir de fragments d'ARN de taille réduite conservant une activité autbcatalytique de coupure, dérivés de l'ARN viral génomique, on a réussi selon l'invention à séparer de façon 10 distincte une partie catalytique et une partie substrat, comme il sera explicité ci-après.
Dès lors, une coupure peut être obtenue au cours d'une réaction binaire en mélangeant la structure ribozymique ayant l'activité catalytique avec un ARN ou ADN substrat hétérologue. Cette caractérisa¬ i s tion d'un fragment à activité catalytique de coupure permet, selon l'invention, d'utiliser ces structures ribozymiques de l'ARN génomique du virus de l'hépatite delta comme structure ribozymique du type "humain" pour le clivage d'ARN cibles, in vitro ou in vivo, à des fins expérimentales, thérapeutiques ou prophylactiques. 20 Les ribozymes sont des molécules d'ARN qui sont naturellement capables d'exercer des activités catalytiques, et particulièrement des activités RNAsiques. On a cherché, à partir de tels ribozymes naturels, à déterminer des structures ribozymiques artificielles capables d'exercer des coupures enzymatiques sur des ARN cibles spécifiques. 25 De tels ribozymes fournissent donc des outils thérapeutiques pouvant être utilisés dans le cadre d'approches de type oiigonucléotides "antisens", notamment pour dégrader spécifiquement des ARN cibles de type pathogènes.
Les activités ribozymiques semblent largement répandues, et 30 l'on a décrit des ARN catalytiques chez les bactéries, les protozoaires, les plantes, et les systèmes animaux. Les premières activités ribozymiques ont été mises en évidence tout d'abord dans les systèmes d'épissage des .ntrons de classe I, puis dans la RNase P. Plus récemment, on a découvert que les génomes de nombreux virus à ARN, de plantes ou même de mammifères 35 portaient également des activités ribozymiques qui intervenaient au cours du cycle de multiplication virale. Enfin, certains ARN transcrits à partir de régions d'ADN satellite chez le triton présentent également une activité ribozymique naturelle^ servant à couper les transcrits concatémériques.
L'analyse "de la structure des ribozymes génomiques de certains virus de plantes a mis en évidence des séquences réactionnelles communes ainsi que des structures secondaires consensus qui ont permis de construire des ribozymes pouvant agir sur mesure comme agents de clivage de séquences spécifiques d'ARN. L'analyse des régions impliquées dans ces coupures a fait apparaître une structure commune dite en "tête de marteau", ou en "T", nécessaire et suffisante pour effectuer la réaction nucléasique.
Une seconde classe de ribozymes, dérivés également d'un virus de plante présente une structure catalytique en "épingle à cheveux", ou structure en "L".
Ces différents types de ribozyme fonctionnent in vitro, mais les efficacités de coupure in vivo, dans des cellules animales ou humaines, sont encore peu efficaces. Cette inefficacité relative est vraisemblablement due, au moins en partie, au fait que toutes ces ribozymes sont dérivées de virus végétaux et non de virus animaux ou même humains.
Le virus de l'hépatite delta est un virus humain à ARN, que lron trouve systématiquement associé au virus de l'hépatite B. L'ARN génomique, et également l'ARN anti-génomique de ce virus présentent tous deux une activité de clivage autocatalytique. La séquence du fragment d'ARN de longueur minimale présentant une activité ribozymique n'offre aucune ressemblance avec les motifs catalytiques déjà connus de type "T" ou "L". Le virus de l'hépatite delta se réplique dans les hépatocytes humains et son activité ribozymique fonctionne parfaitement dans ces cellules. Son activité ribozymique a été naturellement sélectionnée pour fonctionner dans des cellules humaines de foie et on dispose donc avec ce modèle d'un exemple parfait de ce que pourrait être un ribozyme actif chez l'homme. L'ARN génomique du virus de l'hépatite delta, long de 1700 nucléotides, comporte en effet une région capable d'exercer une coupure autocatalytique. Cette coupure autocatalytique peut être effectuée par un sous-fragment d'une longueur de 89 nucléotides dont la structure secondaire peut se schématiser sous la forme représentée à la figure 1. Cette structure longue de 89 nucléotides comporte une conformation de type "pseudo-noeud". La coupure autocatalytique s'effectue au niveau de la liaison phos'phodiester indiquée par la flèche sur la figure 1. A partir de ce fragment ribozymique à activité autocatalytique on a, selon la présente invention, fourni des structures ribozymiques comportant une activité catalytique pouvant s'exercer en trans, au cours d'une réaction binaire, sur une seconde molécule d'ARN cible. Cette invention fournit de nouvelles molécules ribozymiques pouvant cliver efficacement des molécules d'ADN ou d'ARN cible, notamment de nature pathologique, à des fins thérapeutiques ou prophylactiques, dans des cellules humaines, animales ou même végétales.
Il s'agit là d'une nouvelle activité ribozymique en trans. La molécule responsable de cette coupure en trans présente une structure et Une séquence ne correspondant à aucune autre structure ribozymique agissant en trans précédemment décrite.
En utilisant les techniques de synthèse chimique de l'ARN, des sous-fragments d'ARN correspondant à différentes régions de la molécule, représentée figure 1, ont été préparés. Ces différents fragments ont ensuite été testés dans des expériences de reconstructions afin de différencier les fragments substrats des fragments catalytiques.
La présente invention a donc pour objet une structure ribozymique dérivée de l'ARN génomique du virus de l'hépatite delta consistant dans un ou plusieurs fragments dudit ARN génomique du virus de l'hépatite delta, et capable d'exercer une activité catalytique de coupure en trans sur une autre molécule comportant une séquence spécifique d'acide nucléique ARN.
Par "autre molécule", on entend selon la présente demande que la coupure s'exerce sur une molécule autre que l'ARN génomique du virus de l'hépatite delta. Dans un mode de réalisation particulièrement approprié la structure ribozymique est constituée de un ou deux fragment(s) issu(s) de la séquence de 74 nucléotides comportant les nucléotides de 16 à 89 représentés sur la figure 2. Parmi les structures testées, les strutures ribozymiques préférées, c'est-à-dire les plus efficaces en termes d'activité de coupure, comportent un seul fragment.
En particulier, la structure ribozymique selon l'invention peut consister dans le fragment de 7 nucléotides comportant les nucléotides de 16 à 89 ou ce même fragment 16-89 dans lequel une partie seulement des nucléotides 50 à 77 ont été délétés. Lorsque la totalité de la séquence 50-77 a été délétée, le fragment perd de son activité catalytique de coupure.
De préférence, la structure ribozymique selon l'invention comportera une séquence d'au moins 12 nucléotides.
Selon l'invention, ladite séquence d'acide nucléique de ladite autre molécule correspond à un fragment de l'ARN génomique du virus de l'hépatite delta substrat de ladite activité catalytique de coupure en trans. En particulier, ladite séquence d'acide nucléique de ladite autre molécule substrat de l'activité catalytique pourra comporter la séquence 5rXGGCC3' avec X = C ou U, ladite structure ribozymique étant capable d'exercer l'activité nucléasique ou ribonuciéasique sur la liaison phosphodiester entre X et G.
Dans un mode de réalisation, ladite séquence d'acides nucléiques de ladite autre molécule pourra comporter le fragment de 8 nucléotides allant des nucléotides 5 à 12 représentés sur la figure 2.
De façon appropriée, l'activité catalytique de coupure a lieu en présence d'ions métalliques divalents, notamment le magnésium.
Dans un mode de réalisation de l'invention, la structure ribozymique selon l'invention est insérée dans ladite autre molécule et est capable d'exercer une activité autocatalytique de clivage sur cette autre molécule dans laquelle elle est insérée. Comme on l'a vu, la structure ribozymique selon l'invention exercera une activité πbonucléasique, notamment endoribonucléasique sur une autre molécule comportant un polyribonucléotide de séquence spécifique.
La structure ribozymique selon l'invention peut être utilisée à des fins thérapeutiques ou prophylactiques dans des cellules procaryotes ou eucaryotes, animales ou végétales, ladite autre molécule pouvant donc être une molécule hétérologue de cellules animales ou végétales.
On pourra utiliser la particule virale de l'hépatite delta comme système d'encapsidation ou tout autre vecteur pour la délivrance intra-cellulaire de structures ribozymiques selon l'invention, que ce soit dans des bactéries, des cellules eucaryotes, animales ou vététales.
D'autres avantages et caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée qui va suivre. Cette description est faite en référence aux figures 1 à 4.
- La figure 1 représente la structure secondaire potentielle en "pseudo-noeud" d'un fragment autocatalytique de l'ARN génomique du virus de l'hépatite delta.
- La figure 2 représente la structure potentielle du complexe binaire de coupure en trans par un ribozyme dérivé du brin génomique du virus de l'hépatite delta.-
- La figure 3 représente i'autoradiographie d'un gel de polyacrylamide 20 % sur lequel on a fait migrer les produits des incubations d'une structure ribozymique selon l'invention avec son substrat, après des temps variables.
- La figure 4 représente une analyse sur gel de polyacrylamide 10 %/7 M urée des produits d'une cinétique de coupure autocatalytique d'une structure ribozymique de 71 nucléotides de long comportant une délétion dans la structure auto-appariée 50-77. Exemple 1
Parmi les combinaisons testées on a découvert, comme on l'a vu, qu'il était possible d'effectuer une coupure en trans en utilisant comme substrat un fragment composé, par exemple, de 13 nucléotides (1 à 13) de la figure 2 et en utilisant comme structure ribozymique une molécule composée soit de deux fragments, comportant respectivement les nucléotides de 16 à 62 et 63 à 89, soit d'un seul fragment de 74 nucléotides de long comportant les nucléotides de 16 à 89. Ce ribozyme de 74 nucléotides a été obtenu par transcription in vitro par la RNA polymérase T7 d'une matrice d'ADN bicaténaire. Cette matrice a été obtenue en synthétisant chimiquement les séquences d'ADN, en les hybndant, puis en amplifiant le produit obtenu par une réaction de PCR. Cette réaction de PCR permet, en utilisant les amorces appropriées, d'ajouter les séquences de promotions de la transcription permettant le fonctionnement de la polymérase 17.
La figure 2 illustre la structure ribozymique de 74 nucléotides et de son substrat de 13 nucléotides.
Ce ribozyme long de 74 nucléotides est capable d'effectuer une coupure rapide du substrat. Si l'on incube le ribozyme en présence du substrat pendant des temps variables de 0 à 60 minutes, dans un tampon contenant 10 mM MgCl^, 50 M Tris pH 8,0 2 m spermidine, on observe (figure 3) qu'une coupure a lieu. La figure 3 représente l'autoradiographie d'un gel de polyacrylamide 20 % sur lequel on a fait migrer les produits des incubations du ribozyme avec son substrat après des temps variables. Le substrat a été marqué en 5' par du gamma-ATP 32P par la T4 polynuciéotide kmase et purifé sur gel de polyacrylamide avant utilisation. On observe qu'une partie importante de ce substrat est clivée dès les premières minutes de l'incubation, clivage matérialisé par une bande marquée longue de 5 nucléotides qui apparaît rapidement dans les conditions de fonctionne¬ ment ribozymique, c'est-à-dire en présence de magnésium. Les témoins effectués en présence d'EDTA sont négatifs, ce qui montre que l'on observe bien une réaction enzymatique dépendant de la présence de magnésium (ou d'autres ions divaients) ce qui est une caractéristique des ribozymes. Exemple 2
Les résultats expérimentaux ci-après montrent que la présence de la structure secondaire appariée située entre les nucléotides 50 et 77 n'est en partie pas indispensable à l'activité catalytique de ce ribozyme. En partant de la structure d'un ribozyme de 89 nucléotides de long comme celui décrit dans la figure 1, on procède à des expériences de délétion de certaines régions, et en particulier des délétions de la structure en épingle à cheveux ("hairpin") comprise entre les nucléotides 50 et 77. En effet, cette "hairpin" est une structure secondaire extrêmement stable, que l'on retrouve dans toutes les configurations potentielles calculées par des programmes de minimalisation d'énergie appliqués à l'analyse de la structure de ce ribozyme et est probablement effectivement présente dans la structure active.
Afin de déterminer si cette structure secondaire appariée jouait un rôle catalytique ou bien structural, on a délété les nucléotides 53 à 61 et 66 à 74. Ces délétions ont été effectuées en synthétisant un fragment d'ADN comportant la séquence désirée, puis en amplifiant ce fragment par PCR comme décrit précédemment pour le ribozyme de 74 nucléotides. Après amplification avec les amorces appropriées et transcrip¬ tion par l'ARN polymérase de T7, on obtient une structure ribozymique longue de 71 nucléotides conservant son activité autocatalytique et fonctionnant à 37°C et à 60°C (figure 4).
Le ribozyme a été marqué en 5' par du gamma-ATP 32P par la T4 polynucléotide kinase et purifié sur gel de polyacrylamide avant utilisation. On le dénature à 95°C pendant 1 minute en présence de 1 mM EDTA, puis il est refroidi rapidement à 0°C sur glace (snap-cool). Le milieu de réaction est ensuite ajusté en ajoutant 40 mM Tris pH 8,0 et 10 mM MgC , puis incubé à 37°C (2 à 7) ou à 60°C (8 à 13). Des fractions aliquotes sont prélevées à des temps variables : 1 minute (2 & 8), 2 minutes (3 & 9), 5 minutes (4 à 10), 10 minutes (5 δ 1 1), 20 minutes (6 & 12), et 60 minutes (7 & 13). Dans le contrôle (1), la réaction a été arrêtée au temps t 0 minute avant addition de 1O mM MgCl-,.
Le ribozyme natif (89 nucléotides de long) coupe son ARN avec un t 1/2 de 15 secondes, alors que le ribozyme délété présente un t 1 2 de 3 minutes. Donc, la délétion modifie la structure générale du ribozyme, ce qui modifie la cinétique de la réaction, mais elle n'affecte pas directement le site catalytique.
Il est donc possible de réduire la taille de la structure ribozymique fonctionnelle de la figure 2 en réduisant partiellement la longueur de cette boucle 50-77. LEGENDES RELATIVES A LA FIGURE 3 :
Tl « Substrat seul incubé dans le milieu de réaction pendant 60'
T2 - Substrat incubé dans le milieu de réaction en présence du ribozyme HΔV et de 10 mM EDTA C - Cinétique de coupure - substrat incubé en présence du ribozyme HΔV M - Marqueur de taille indiquant la position de la bande coupée attendue (5nt)

Claims

REVENDICATIONS
1 ) Structure ribozymique dérivée de l'ARN génomique du virus de l'hépatite delta consistant dans un ou plusieurs fragments dudit ARN génomique du virus de l'hépatite delta, et capable d'exercer une activité catalytique de coupure' en trans sur une autre molécule comportant une séquence spécifique d'acide nucléique d'ARN.
2) Structure ribozymique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'un ou deux fragment(s) issu(s) de la séquence de 74 nucléotides comportant les nucléotides de 16 à 89 représentés sur la figure 2.
3) Structure ribozymique selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle consiste dans le fragment de 74 nucléotides comportant les nucléotides de 16 à 89 représentés sur la figure 2.
4) Structure ribozymique selon la revendication 2 caractérisée en ce qu'elle consiste dans un fragment issu du fragment de 74 nucléotides constitué des nucléotides 16 à 89 de la figure 2, fragment dans lequel une partie des nucléotides 50 à 77 ont été délétés.
5) Structure ribozymique selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle comporte une séquence d'au moins 12 nucléotides. 6) Structure ribozymique selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ladite séquence d'acides nucléiques de ladite autre molécule correspond à un fragment de l'ARN génomique du virus de l'hépatite delta substrat de ladite activité catalytique de coupure en trans.
7) Structure ribozymique selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est capable d'exercer une activité catalytique de coupure sur la liaison phosphodiester entre X et G avec X = C ou U d'une séquence d'acide nucléique ARN respectivement comportant la séquence 5'XGGCC3'.
8) Structure ribozymique selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisée en ce qu'elle est capable d'exercer une activité catalytique de coupure sur une séquence d'acides nucléiques de ladite autre molécule comportant le fragment de 8 nucléotides allant des nucléotides 5 à 12 représentés sur la figure 2. 9) Structure ribozymique selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle est insérée dans ladite autre molécule et est capable d'exercer une activité autocatalytique de clivage sur cette autre molécule dans laquelle elle est insérée. 10) Structure ribozymique selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce qu'elle est capable d'exercer une activité ribonucléasique, notamment endoribonucléasique, sur une autre molécule comportant un polyribonucléotide-
I I) Structure ribozymique selon l'une des revendications 1 à 10 utile pour la mise en oeuvre d'une méthode de traitement thérapeutique ou prophylactique dans des cellules procaryotes ou eucaryotes, animales ou végétales.
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