WO1993017343A1 - Verfahren zur immunologischen erkennung maligner tumore und kit zur durchführung dieses verfahrens - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a method for the detection of malignant tumors or for the determination of their tumor mass on the basis of properties of the patient's serum immunoglobulin G (IgG).
  • IgG serum immunoglobulin G
  • the aim of the present invention is therefore to obtain reproducible information about a possible presence as well as about the extent and development of a malignant tumor in a patient over a reasonable period of at least one day.
  • the patient's fresh blood or serum samples are stabilized with radical scavengers, preferably with superoxide dismutase (SOD) and in the serum of the samples the shift of the ratio of at least one of the IgG subclasses to the sum of the IgG subclasses in comparison to the normal ratio is determined.
  • radical scavengers preferably with superoxide dismutase (SOD)
  • SOD superoxide dismutase
  • the shift in the ratio of the subclass IgG1 and / or the subclass IgG2 to the sum of the IgG subclasses in relation to the normal ratio is preferably determined in the serum of the stabilized samples.
  • Samples with a high IgGl value generally show a greater decrease in the value, but according to previous findings, other factors may also have an influence.
  • the change in the ratio of the IgG subclasses to one another in the blood serum could surprisingly be associated with the occurrence of malignant tumors and even with the amount and spread of the tumor mass present in the body, so that not only a qualitative, but also a quantitative statement about the malignant tumor is possible.
  • the method according to the invention is therefore preferably used for the extra-corporal monitoring of the tumor occurrence in a patient. Such a procedure is of great interest to the attending physician (monitoring), especially during or after therapy.
  • the method according to the invention can also be used successfully for examining healthy people, it being possible to obtain a first indication of a possible tumor in a simple manner.
  • the procedure does not place any strain on the patient and, based on previous experience, is more reliable than the procedures currently available. Of these, the tumor marker method is currently the most frequently used.
  • liquid adsorption chromatography was also used, it being possible to achieve an exceptional degree of selectivity of the individual components by adapting the working conditions.
  • the fractograms obtained can be evaluated qualitatively and quantitatively.
  • the determination of the als S value can also be used as a measured variable, the value which is decisive for the sulfhydryl disulfide ratio in immunoglobulin G. Due to the knowledge that this ratio is related to the ratio of the IgG subclasses to one another, this measured value also represents a tool for carrying out the method according to the invention.
  • the cause of the instability of the IgGl level is assumed to be the formation of non-covalently cross-linked aggregates, which e.g. cannot be detected with RID.
  • the serum was obtained from the whole blood of healthy donors by standing until the precipitate completely coagulated and centrifuged, and this was tested for IgGl either with or without SOD immediately or after 36 hours.
  • kits for carrying out the method according to the invention is also made available according to the present invention, which is characterized by the stabilizing reagent SOD and an arrangement for determining the ratio of the subclass IgG1 to the other IgG subclasses.
  • the following examples are intended to explain the process according to the invention, without restricting it in any way.
  • Agarose gel for RID plates 5 ml of 1% agarose solution, 0.5 ml of RID buffer, 0.5 ml of anti-IgGl serum (Bindi ⁇ g Site, PE006).
  • Four dilutions of the reference serum (Binding Site, BP062) are applied to the same plate: dilutions 1:10, 1:15, 1:25 and 1:50.
  • the samples "36-" and “36+” after dilution with RID buffer 1:50 are also placed on the plate. The areas of the precipitate rings of "0-" and "0+” and the dilutions of the reference serum are then measured, two days later that of the 36 hour samples.
  • IgGl (mg / ml serum)
  • Time series were set for each serum sample (0.1 ml), in which the level of IgGl and IgG2 was measured without and after the addition of SOD (5 ul with 350 iU) with RID.
  • the evaluation was carried out in such a way that the measured values obtained after the different times were expressed as a percentage of the initial value. This resulted in a time-related course for IgGl or IgG2, as is shown in FIGS. 2 of the connected drawings emerges.
  • IgG2 measured with RID. The values obtained are summarized in Table 4 below:
  • the IgGl levels of cancer sera are on average 23 to 24% lower than in normal sera, see that the absolute necessary. efficient inhibition becomes evident.
  • SOD fulfills this condition, but only up to a standing time of around 40 hours, which should be sufficient in most cases.
  • a clearly defined time effect as shown in Fig.l, only occurs with IgGl, while IgG2, the second main component, shows irregular fluctuations in the level, which, however, are also suppressed by SOD (Fig.2).
  • Buffer composition 0.05 M phosphate citrate buffer pH 4.7 0.086 M phosphate citrate buffer pH 4.3 Flow rates varying from 70 ml / h to 10 ml / h.
  • the connected fractograms (FIGS. 3 and 4) were obtained, in which purity levels of the components of up to 96 and 100% were achieved in the relevant peaks B and C, respectively.
  • the blood samples (2-10 ml) were immediately centrifuged at 440 x g for 10 minutes, the serum was pipetted off, diluted 1:50 with RID buffer and applied to the RID plates; after 2 days, the precipitate rings were measured and the IgGl and IgG2 concentration determined using a reference serum (Mancini technique).
  • IgGl and IgG2 were isolated using Protein-A Sepharose 0.3 ml serum was applied to the column (K 9/15) and with 0.16 M phosphate citrate buffer pH 7.0 and a flow rate of 10 ml / h eluted.
  • IgG binds to protein A via the Fc part and the remaining serum proteins are eluted unbound.
  • IgM and IgA are also bound to Protein A.
  • the buffer is changed: first IgG2 is eluted with 0.05 M phosphate citrate buffer pH 4.7 and then IgGl with 0.086 M phosphate citrate buffer pH 4.3.
  • the gel is then cleaned using 0.1 M citrate buffer and then the citrate buffer is exchanged for the start buffer (0.16 M phosphate citrate buffer pH 7.0).
  • Table 6 lists the mean values of the IgGl and IgG2 concentrations of the serum samples (- sem), determined both with RID and with Protein-A. The quotient G1 / G2 can then be formed from these two values.

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Abstract

Verfahren zur Feststellung maligner Tumore bzw. zur Bestimmung ihrer Tumormasse, bei welchem die frischen Blut- oder Serumproben des Patienten stabilisiert und im Serum der Proben die Verschiebung des Verhältnisses mindestens einer der IgG-Subklassen zu der Summe der IgG-Subklassen im Vergleich zum Normalverhältnis bestimmt wird.

Description

Verfahren zur immunologischen Erkennung maligner T more und Kit zur Durchführung dieses Verfahr"e"ns
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Feststellung maligner Tumore bzw. zur Bestimmung ihrer Tumor¬ masse anhand von Eigenschaften des Serum-Immunglobulins G (IgG) des Patienten.
Seit mehreren Jahren ist es bekannt, daß bei Patienten mit malignen Tumoren eine signifikante Veränderung der Mengen der Sulfhydryl- bzw. Disulfidgruppen (gemessen mittels der Dithiα nitrobenzoat-Reak'tixü--) innerhalb des Serum-IgG zu beobach¬ ten ist. Der experimentelle Meßwert für das Verhältnis von Sulfhydryl- zu Disulfidgruppen wird als∑S-Wert bezeichnet, wobei bis vor kurzem die Ursache für die Veränderung des Σ S-Wertes unbekannt war.
Im Laufe der weiteren Untersuchungen auf diesem Gebiet zeigte sich nun, daß die Veränderung des SS-Wertes auf eine Verschie bung des Verhältnisses der Subklasse IgGl zu den anderen Sub¬ klassen (z.B. IgG2) zurückzuführen ist.
Dieser Zusammenhang ist neu und gibt dem Fachmann neben der grundlegenden wissenschaftlichen Erkenntnis eine Möglichkeit der diagnostischen Nutzung dieses Phänomens.
Unabhängig davon hat sich im Zuge der diesbezüglichen For¬ schungsarbeiten immer wieder gezeigt, daß sich die Meßwerte bei frischen Blut- bzw. Serumproben innerhalb kurzer Zeit re¬ lativ stark verändern. Eine Durchführung der verschiedenen Analyseverfahren für IgG an unbehandelten Blut- oder Serum¬ proben führt somit zu keinen reproduzierbaren und auswertba¬ ren Ergebnissen.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, während eines vernünftigen Zeitraums von mindestens einem Tag reproduzier¬ bare Angaben über ein eventuelles Vorhandensein sowie über Ausmaß und Entwicklung eines malignen Tumors in einem Pa¬ tienten zu erhalten.
Dies wird erfindungsgemäß dadurch erreicht, daß die frischen Blut- oder Serumproben des Patienten mit Radikalfängern, vor¬ zugsweise mit Superoxiddismutase (SOD) , stabilisiert werden und im Serum der Proben die Verschiebung des Verhältnisses mindestens einer der IgG-Subklassen zu der Summe der IgG- Subklassen im Vergleich zum Normalverhältnis bestimmt wird.
Vorzugsweise wird im Serum der stabilisierten Proben die Ver¬ schiebung des Verhältnisses der Subklasse IgGl und bzw. oder der Subklasse IgG2 zu der Summe der IgG-Subklassen im Ver¬ gleich zum Normalverhältnis bestimmt.
Die hinsichtlich der Stabilität der IgGl-Werte durchgeführten Untersuchungen unbehandelter Proben zeigten bei Anwendung des Radialimmundiffusionsverfahrens (RID) nach Mancini eine star¬ ke Abnahme der Serum-IgGl-Spiegel beim Stehen der Serumproben an der Luft. Dieser Effekt setzt praktisch sofort nach der Blutabnahme ein und beträgt nach sieben Stunden durchschnitt¬ lich 20 %_ nach 36 Stunden mindestens 25 % , wobei die Be¬ stimmungen an Blutproben gesunder Spender beiderlei Ge¬ schlechts durchgeführt werden.
Das Ausmaß des Effektes hängt unter anderem von der Höhe des Ausgangswertes ab:
Proben mit hohem IgGl-Wert zeigen in der Regel ein stärkeres Absinken des Wertes, allerdings dürften nach bisherigen Vor¬ befunden auch noch weitere Faktoren von Einfluß sein.
Ergibt sich schon aus dem bisher Gesagten, daß ohne wirksame Stabilisierung eine exakte Bestimmung des IgGl-Spiegels im Blutserum in der klinischen Praxis nicht möglich ist, so wird die Stabilisierung ein absolutes Erfordernis, • wenn die Ver¬ schiebung des Verhältnisses der IgG-Subklassen zueinander im Blut Krebskranker als Tumormarker im Sinne des erfinduπgsge- mäßen Verfahrens ausgewertet werden soll.
Die Stabilisierung mit Radikalfäπgern erscheinen erfolgver¬ sprechend, die besten Ergebnisse wurden jedoch eindeutig bis¬ her durch Zusatz von SOD erreicht. Diese, kann den frischen Vollblutproben oder den Serumprobeπ nach Abtrennung des Blut¬ zellmaterials zugegeben werden.
Sehr günstige Stabilisierungsergebnisse werden erreicht, wenn die Stabilisierung des Serums mit SOD in einem Mengenverhält¬ nis von 100 - 1000, vorzugsweise 300 - 400 iU SOD/ml, Serum vorgenommen wird.
Günstig ist es dabei, die SOD in Form einer Lösung mit der Konzentration 5000 - 10000 iU SOD/ml zu den Serumproben zuzu¬ geben. Die derart stabilisierten Proben werden anschließend hinsichtlich der Verschiebung des Verhältnisses der Subklasse IgGl zu der Summe der IgG-Subklassen im Vergleich zum Normal¬ verhältnis geprüft.
Die Veränderung des Verhältnisses der IgG-Subklassen zuein¬ ander im Blutserum konnte überraschenderweise mit dem Auftre¬ ten maligner Tumore und sogar mit der Menge und der Ausbrei¬ tung der im Körper vorhandenen Tumormasse in Zusammenhang ge¬ bracht werden, sodaß nicht nur eine qualitative, sondern auch eine quantitative Aussage über den malignen Tumor möglich ist.
Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren daher zur extra- corporalen Überwachung des Tumorgeschehens in einem Patienten eingesetzt. Ein solches Verfahren ist vor allem während oder im Anschluß an eine Therapie für den behandelnden Arzt von großem Interesse (Monitoring) . Aber auch zur Gesundenunter- suchung kann das erfindungsgemäße Verfahren erfolgreich ein¬ gesetzt werden, wobei in einfacher Weise ein erster Hinweis auf ein eventuelles Tumorgeschehen erhalten werden kann.
Das Verfahren stellt für den Patienten keinerlei Belastung dar und ist nach bisherigen Erfahrungen zuverlässiger als die derzeit zur Verfügung stehenden Verfahren. Von diesen gilt gegenwärtig das Tumormarker-Verfahreπ als das am häufigsten verwendete.
Bei der Umsetzung des erfindungsgemäßen Verfahrens in die Praxis zeigte sich, daß die Berechnung des genannten Verhält¬ nisses günstigerweise aus den Ergebnissen an sich bekannter Analysenmethoden für IgG, insbesondere chromatographischer bzw. immunologischer Methoden, erfolgt. Die Durchführung von Immunodiffusions-Assays hat sich in diesem Zusammenhang als besonders erfolgreich erwiesen. Auch einfache i munadsorpti- ve Säulenverfahren können angewendet werden.
Weiters wurde auch die Flüssigkeitsadsorptionschromatographie eingesetzt, wobei durch Anpassung der Arbeitsbedingungen eine außerordentliche Trennschärfe der einzelnen Komponenten er¬ zielt werden kann. Die erhaltenen Fraktogramme können quali¬ tativ und quantitativ ausgewertet werden.
Anstelle der chromatographischen Verfahren kann gewüπschten- falls auch die Bestimmung des Σ S-Wertes als Meßgröße heran¬ gezogen werden, jenes Wertes, der für das Sulfhydryl-Disul- fid-Verhältnis im Immunglobulin G maßgebend ist. Durch die Erkenntnis, daß dieses Verhältnis mit dem Verhältnis der IgG-Subklassen untereinander im Zusammenhang steht, stellt dieser Meßwert ebenfalls ein Werkzeug zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens dar.
Bei der Abklärung der Bedingungen der Messung des SS-Wertes im Zusammenhang mit dem erfiπduπgsgemäßen Verfahren wurde die Beobachtung bestätigt, daß mit hoher Treffsicherheit zwi¬ schen malignen und beπignen Geschwulst-Erkrankungen unter¬ schieden werden kann.
Bei Mamma-Carciπomen konnte auch eine Korrelation zu den ein¬ zelnen Stadien hergestellt werden. So zeigte sich beim T.Stadium eine positive Reaktion von fast 65 %, die bis zu T.Stadien auf 91 % stieg. Verglichen mit üblichen Tumormar- kern (z.B. CEA) ist dies eine enorme Steigerung, da diese im T.Stadium eine Auffindungsrate von ca. 5 % besitzen. Es wird diesbezüglich auf die Veröffentlichung M.Smola, W.Estelberger, M.Reiter, K.Schauenstein und E.Schauenstein: CANCER, Vol.68, No.5,1991, p.1026 verwiesen.
Nach chirurgischen Eingriffen normalisierte sich der ∑S-Wert. Je nachdem, ob der chirurgische Eingriff erfolgreich war oder nicht, blieb der Wert normal oder wurde .wieder pathologisch. M.Lahousen, E.Schauenstein, et al. Wiener Klin.Wschr.101,858 (1989). Es wird somit vermutet, daß der SS-Wert ein Maß für den humoralen Immunstatus, d.h. für die Immunabwehr dar¬ stellt. Eine andere Möglichkeit zur Bestimmung des Verhältnisses der IgG-Subklassen zueinander besteht in der Methode der Radial¬ immundiffusion (RID) .
Für alle Methoden gilt jedoch gleichermaßen die Tatsache, daß die Ergebnisse nur dann aussagekräftig sind, wenn vorher eine Stabilisierung der Proben vorgenommen wurde.
Als Ursache für die Instabilität des IgGl-Spiegels wird die Bildung nicht-kovalentvernetzter Aggregate angenommen, die z.B. mit RID nicht detektierbar sind. Die bisherigen Befunde sprachen dafür, daß diese Aggregatbildung durch sauerstoff- haltige Radikale ausgelöst wird und tatsächlich erwiesen sich die Stabilisierungsversuche mit SOD als besonders erfolgreich.
Zur Durchführung dieser Versuche wurde aus dem Vollblut ge¬ sunder Spender durch Stehenlassen bis zur vollständigen Ge¬ rinnung und Abzentrifugieren des Niederschlags das Serum ge¬ wonnen und dieses entweder mit oder ohne SOD sofort oder nach 36 h auf IgGl geprüft.
Bei den ersten Laborversuchen erfolgte diese Prüfung durch. RID. Es zeigte sich, daß bei gleicher Anfangskonzentratioπ an IgGl die mit SOD versetzten Proben nach 36 h noch fast die gleiche Konzentration hatten, während die nicht stabilisier¬ ten Proben bis nahe an die Hälfte des Anfangswertes abgesun¬ ken waren.
Bei der Auftrennuπg des IgG in seine Fraktionen durch Opti¬ mierungsversuche mit Protein-A-Sepharose ergab sich, daß es durch Herabsetzen der Durchflußgeschwindigkeit im Prinzip möglich ist, zu Reinheitsgraden von 96 bis 100 % der Im un- globulin-Bestandteile zu kommen.
Basierend auf diesen Forschungsergebnissen wird gemäß der vorliegenden Erfindung auch ein Kit zur Durchführung des er¬ findungsgemäßen Verfahrens zur Verfügung gestellt, der durch das Stabilisierungsreagens SOD und eine Anordnung zur Be¬ stimmung des Verhältnisses der Subklasse IgGl zu den anderen IgG-Subklassen gekennzeichnet ist. Die folgenden Beispiele sollen zur Erläuterung des erfin¬ dungsgemäßen Verfahrens dienen, ohne dieses in irgendeiner Weise zu beschränken.
Beispiel 1
Protokoll eines Stabilisierungsversuches:
10 ml Vollblut werden aus der Armvene eines gesunden Spenders entnommen. Nach 5 bis 10 Minuten ist die Gerinnung abge¬ schlossen. Es wird 10 Minuten bei 440 x g zentrifugiert. Das Serum wird abpipettiert und in 4 aliquote Anteile zu je 0,1 ml aufgeteilt:
2 Nullzeitproben "0-" und "0+" sowie 2 Proben zur Prüfung nach 36 Stunden "36-" und "36+"! Die Proben "0+" und "36+" werden mit 5 l SOD-Lösung (35 iU) versetzt (SOD Lot 100H9311 von Fa. Sigma über Fa. Biotrade) . Die beiden Nullproben wer¬ den mit RID-Puffer 1 : 50 verdünnt (0,05 M Tris, 0,10 M NaCl, 1 g NaN3/l, verdünnte HC1 ad pH 8,0). Die Proben "36+" und "36-" werden unverdünnt 36 Stunden bei Raumtemperatur im ver¬ schlossenen Zustand bei Tageslicht aufbewahrt. Die Proben "0-" und "0+" werden sofort auf die RID-Platte gebracht, wo¬ bei 3 l/well eingebracht werden. Agarosegel für RID-Platteπ: 5 ml l-%ige Agaroselösung, 0,5 ml RID-Puffer, 0,5 ml anti- IgGl-Seru (Fa. Bindiπg Site, PE006) . Auf die gleiche Platte werden vier Verdünnungen des Referenzserums (Fa. Binding Site, BP062) aufgetragen: Verdünnungen 1:10, 1:15, 1:25 und 1:50. Nach 36 Stunden werden die Proben "36-" und "36+" nach Verdünnung mit RID-Puffer 1:50 ebenfalls auf die Platte ge¬ bracht. Sodann werden die Flächen der Präzipitatringe von "0-" und "0+" sowie der Verdünnungen des Refereπzserums ge¬ messen, zwei Tage später die der 36 Stunden-Proben. Dann wer¬ den die Werte der bei den Verdünnungen des Referenzserums ge¬ messenen Flächen der Präzipitatringe gegen die bekannten IgGl-Konzentrationen der Verdünnungen aufgetragen. In das er¬ haltene Eichdiagramm werden schließlich die Flächen der aus den vier Proben erhaltenen Präzipitatringe eingetragen und daraus die IgGl-Konzentrationen durch Interpolation ermittelt. Tabelle 1
Probe Probe
Spender 0- 0+ 36- 36+
IgGl (mg/ml Serum)
G.R. 10,24 10,00 6,59 9,76
H.P. 8,91 8,99 5,72 8,89
F.T. 7,26 7,26 3,81 7,03
Beispiel 2
Bei einem 7-stündigen Versuch ähnlicher Art wie in Beispiel 1 wurden folgende Ergebnisse erhalten:
Tabelle 2
IgGl (mg/ml Serum) O h 0 h+SOD 7 h 7 h+SOD
Serum 1 6,77 6,97 6,38 6,97
Serum 2 5,45 5,45 4,55 5,45
Durch die gesamten bisherigen Versuche hat sich herausge¬ stellt, daß unter den beschriebenen Bedingungen die Hemmwir¬ kung von SOD mit 36 bis.40 Stunden begrenzt ist, d.h. daß die IgG-Bestimmungen auf jeden Fall innerhalb dieses Zeitraumes durchgeführt werden sollten.
Beispiel 3
Mit jeder Serumprobe (0,1 ml) wurden Zeitreihen angesetzt, in denen der Spiegel an IgGl und IgG2 ohne und nach Zusatz von SOD (5 Ul mit 350 iU) mit RID gemessen wurde. Die Auswertung erfolgte in der Weise, daß die nach den verschiedenen Zeiten erhaltenen Meßwerte in Prozenten des Ausgangswertes ausge¬ drückt wurden. Dabei ergab sich für IgGl bzw. IgG2 ein zeit.- licher Verlauf, wie er aus den Fig.1.bzw. 2 der angeschlosse¬ nen Zeichnungen hervorgeht.
Diskussion der Fig-, l.bis 4- der angeschlossenen Zeichnungen: 1. Die mit RID meßbare Abnahme des IgGl-Spiegels beträgt nach 48 Stunden Stehzeit (unter Verschluß, aerob, Raumtempe¬ ratur) im Mittel 30 % .
2. Der Effekt setzt offenbar prompt ein und erreicht bereits nach 7 Stunden rund 20 % Abnahme. Die Kinetik läßt hier auf eine Exponentialfunktion schließen und die Experimente haben gezeigt, daß die relative zeitliche Abnahme von IgGl der je¬ weils reagierenden Menge an dieser Subklasse direkt proporti¬ onal ist. Damit konnte eine der Michaelis-Menten-Beziehuπg entsprechende Kinetik ausgeschlossen und die Erkenntnis ab¬ geleitet werden, daß hier eine Reaktion der zweiten Ordnung eintritt, aller Wahrscheinlichkeit nach die primäre Bildung von Dimeren, aus denen im weiteren Verlauf dann höhere Aggre¬ gate entstehen. Die Bildung solcher Aggregate würde es auch verständlich machen, daß diese in der RID nicht detektierbar sind, nachdem gezeigt werden konnte, daß Hitze-Aggregate in der RID keine erkennbaren Präzipitatioπskreise bilden.
3. Ob es im weiteren Verlauf der Reaktion, zwischen 12 und 24 Stunden, zu einer vorübergehenden Selbststabilisierung des Systems kommt oder ob hier eine Streuung der Meßpunkte vor¬ liegt, kann nicht mit Sicherheit entschieden werden. Fest steht nur, daß der Prozeß anschließend kontinuierlich wei¬ terläuft.
4. Die Hemmbarkeit der Reaktion durch SOD läßt darauf schlies- sen, daß es sich um eine durch O-Radikale induzierte Selbst¬ aggregation handeln dürfte. Nach Wickens et al. (Biochi . Biophis. Acta, Vol.742:607-616, 1983) führt Bestrahlung mit kleinen" UV-Dosen zur Selbstaggregation und solche Aggregate, die übrigens auch durch aktivierte Leukozyten induziert wer¬ den, zeigen eine beträchtliche Abschwächung der Präzipitat- linien.
5. Aus Fig.l geht hervor, daß der IgGl-Spiegel im Durch¬ schnitt innerhalb von 24 Stunden um etwa' 15 %, nach 36 Stun¬ den um 22 % abnimmt. Innerhalb dieser Zeitspanne kann die Abnahme durch SOD-Zusatz praktisch vollständig gehemmt wer¬ den. Die Bedeutung dieses Ergebnisses wird offenbar, wenn man berücksichtigt, daß in Fig.l die mittleren prozentuellen Abnahmen dargestellt sind und daß die bei den einzelnen Pro¬ ben gemessenen individuellen Abnahmen unter Umständen erheb¬ lich größer sein können, wie die folgende Tabelle 3 veran¬ schaulicht.
Tabelle 3
IgGl IgGl+SOD IgGl IgGl+SOD IgGl IgGl+SOD IgGl IgGl+500 O h 24 h 36 h 48 h
(mg/ml Serum)
Figure imgf000011_0001
Im Rahmen dieses Beispiels wurden 16 Serumproben gesunder
Spender untersucht. Als erstes wurde der Spiegel an IgGl und
IgG2 mit RID gemessen. Die erhaltenen Werte sind in der fol¬ genden Tabelle 4 zusammengefaßt:
Tabelle 4
Figure imgf000011_0002
Zusätzlich konnte noch auf 6 weitere Werte zurückgegriffen werden, die in Tabelle 5 zusammengestellt sind.
Tabelle 5
Figure imgf000012_0001
Mittelt man die erhaltenen Mittelwerte, so resultieren für die 22 Gesund-Seren 8,33 - 0,48 mg IgGl und 3,04 - 0,25 mg IgG2/ml Serum.
Die IgGl-Spiegel von Krebsseren liegen im Mittel um 23 bis 24 % tiefer als in Normalseren, s.odaß die absolute Notwen- . digkeit einer effizienten Hemmung evident wird. SOD erfüllt diese Bedingung, allerdings nur bis zu einer Stehzeit der Probe von rund 40 Stunden, was aber für die meisten Fälle wohl ausreichend sein dürfte. Bemerkenswerterweise tritt ein eindeutig definierter Zeiteffekt, wie er in Fig.l dargestellt ist, nur bei IgGl auf, während IgG2, die zweite Hauptkompo- πeπte, unregelmäßige Schwankungen des Spiegels zeigt, die jedoch durch SOD ebenfalls unterdrückt werden (Fig.2). Da nun SOD das in der RID angezeigte Absinken von IgGl hemmt und nur diese Subklasse eine reaktive Disulfidbrucke SS* im Molekül enthält, wird verständlich, daß SOD auch für die Messung des ΣS-Wertes, der ja zu 85 % aus dem Ter für SS* besteht, als Stabilisator eingesetzt werden kann.
Beispiel 5
Trennung der IgG-Subklassen 1 und 2 an Protein-A-Sepharose-
Säulen.
Pufferzusammensetzung: 0,05 M Phosphat-Citrat-Puffer pH 4,7 0,086 M Phosphat-Citrat-Puffer pH 4,3 Durchflußgeschwindigkeiten variierend von 70 ml/h bis 10 ml/h.
Es wurden die angeschlossenen Fraktogramme (Fig. 3 und 4) er¬ halten, bei denen in den relevanten Peaks B und C Reinheits¬ grade der Komponenten bis zu 96 bzw. 100 % erzielt wurden.
Beispiel 6
Bestimmung der IgGl- und IgG2-Konzentration einerseits durch Affinitätschromatographie mit Protein-A-Sepharose , anderer¬ seits, zur Kontrolle, mit RID
Für den Vergleich der beiden Methoden wurden Seren von 20 ge¬ sunden Probanden sowie Seren von 40 Patientinnen mit Ovari- al-, Cervix- und Collum-Karzinomen verwendet, wofür die Blut¬ proben präoperativ abgenommen wurden.
Die Blutproben (2-10 ml) wurden nach Abnahme sofort bei 440 x g 10 Minuten zentrifugiert, das Serum abpipettiert , 1:50 mit RID-Puffer verdünnt und auf die RID-Platten aufge¬ tragen; nach 2 Tagen wurden die Präzipitatringe vermessen und die IgGl- und IgG2-Konzentration mittels Refereπzserum be¬ stimmt (Mancini-Technik) .
Für die Isolierung von IgGl und IgG2 mittels Protein-A Sepha- rose wurde 0,3 ml Serum auf die Säule (K 9/15) aufgetragen und mit 0.16 M Phosphat-Citrat-Puffer pH 7.0 und einer Durch- laufgeschwiπdigkeit von 10 ml/h eluiert. Hierbei bindet IgG über den Fc-Teil an das Protein-A und die restlichen Serum¬ proteine werden ungebunden eluiert. Außer IgG wird auch IgM und IgA an Protein-A gebunden. Nach Erreichen der Baseline kommt es zum Pufferwechsel: zunächst wird IgG2 mit 0.05 M Phosphat-Citrat-Puffer pH 4.7 und danach IgGl mit 0.086 M Phosphat-Citrat-Puffer pH 4.3 eluiert. Danach erfolgt die Reinigung des Gels mittels 0.1 M Citrat-Puffer und dann er¬ folgt der Austausch des Citrat-Puffers gegen den Startpuffer (0.16 M Phosphat-Citrat-Puffer pH 7.0). Die Eluate von IgGl und IgG2 werden mit 1 N NaOH auf PH 7.0 titriert und die Proteinkonzentratioπen photometrisch bei 278 nm bestimmt. Der Extinktionskoeffizient von &' = 1.58 ermöglicht dann die Kon¬ zentrationsbestimmung.
Tabelle 6 listet die Mittelwerte der IgGl- und IgG2-Konzen- trationen der Serumproben (— sem) , sowohl mit RID als auch mit Protein-A bestimmt, auf. Aus diesen beiden Werten ,kann dann der Quotient G1/G2 gebildet werden.
Tabelle 6a bestimmt mit RID IgGl IgG2 G1/G2 (mg/ml Serum) n
Ges. Probanden 8.72^0.41 3.66±0.31 2.62-0.21 20 Gyn. Tumore 6.70^0.50 3.69^0.35 2.04-0.14 40
Tabelle 6b bestimmt mit Protein-A
IgGl IgG2 G1/G2
(mg/ml Serum) n
7.27^0.36 3.14^0.25 2.54±0.22 20
5.75^0.37 3.16iθ.29 2.08^0.13 40
Mit RID bestimmt, unterscheiden sich die Mittelwerte der IgGl-Konzentrationen der gesunden Probanden und Tumorpatieπ- ten hochsignifikant (p = 0.005), wobei 27.5 % falsch negative und 25 % falsch positive Resultate erhalten wurden. Ein ähn¬ liches Ergebnis zeigt die Isolierung von IgGl mit Protein-A: p = 0.005 und 30 % falsch negative und 35 % falsch positive Resultate.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur Feststellung maligner Tu ore bzw. zur Be¬ stimmung ihrer Tumormasse anhand von Eigenschaften des Serum- Immuriglobulins G (IgG) des Patienten, dadurch gekennzeichnet, daß die frischen Blut- oder Serumprobeπ des Patienten mit Ra¬ dikalfängern, vorzugsweise mit Superoxiddis utase (SOD), sta¬ bilisiert werden und im Serum der Proben die Verschiebung des Verhältnisses mindestens einer der IgG-Subklassen zu der Summ der IgG-Subklassen im Vergleich zum Normalverhältnis bestimmt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß im Serum der stabilisierten Proben die Verschiebung des Ver¬ hältnisses der .Subklasse IgGl und bzw. oder der Subklasse IgG2 zu der Summe der IgG-Subklassen im Vergleich zum Normal¬ verhältnis bestimmt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Verschiebung des Verhältnisses durch Be¬ stimmung des 2 S-Wertes bestimmt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Verschiebung des Verhältnisses aus den Ergeb¬ nissen an sich bekannter Analysenmethoden für IgG, insbeson¬ dere chromatographischen bzw. immunologischen Methoden, be¬ rechnet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Verschiebung des Verhältnisses durch einen Immun- diffusions-Assay bestimmt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß die Stabilisierung des Serums mit SOD in einem Mengenverhältnis von 100 bis 1000, vorzugsweise 300 bis 400, iU SOD/ml Serum vorgenommen wird.
7. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur extracorporalen Erfassung eines .Tumorgeschehens in einem Patienten.
8. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der An¬ sprüche 1 bis 7, gekennzeichnet durch ein Stabilisieruπgs- reagens, vorzugsweise SOD, und eine Anordnung zur Bestimmung des Verhältnisses mindestens einer IgG-Subklasse zu der Sum¬ me der IgG-Subklassen.
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