CH630465A5 - Verfahren zum nachweis oder zur bestimmung eines antikoerper/antigen-komplexes in einer fluidprobe. - Google Patents

Verfahren zum nachweis oder zur bestimmung eines antikoerper/antigen-komplexes in einer fluidprobe. Download PDF

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung eines Ak: Ag-Komplexes in einer Fluidprobe, beispielsweise von Harn oder Serum.
Der Einfachheit halber werden im folgenden die Symbole «Ak», «Ag» und «Ak:Ag» für «Antikörper», «Antigen» bzw. «Antikörper: Antigen-Komplex» benutzt.
Bekanntlich ist es wichtig, dass man biologische Fluide auf Ak, Ag und Ak: Ag-Komplexe analysiert. So sind beispielsweise viele Krankheiten durch die Anwesenheit von Ak: Ag-Komple-xen im Kreislauf gekennzeichnet. Bei dem Ag kann es sich um eine grosse Vielzahl von Proteinen handeln, und zwar einschliesslich solcher Proteine, die auf die Gegenwart von Bakterien oder Viren zurückzuführen sind, oder solcher, die von menschlichen Geweben oder Krebszellen freigesetzt werden. Die Ak sind natürlich für das besondere Ag spezifisch, und es handelt sich vorwiegend um Immunglobuline der Klasse IgG, die durch das Lymphsystem des Lebewesens synthetisiert werden. Der Nachweis von Ak: Ag-Komplexen im Blut sowie ihre Abtrennung und Charakterisierung liefern wertvolle Informationen, die beispielsweise zur Diagnose von Krankheiten verwendet werden können.
Zur Feststellung und quantitativen Bestimmung von Ag, Ak und Ak:Ag-Komplexen sind zahlreiche Verfahren bekannt. Dies trifft insbesondere auch für die Bestimmung der Natur und
Menge des vorhandenen Ag zu. Diese quantitativen Bestimmungsverfahren werden «Immunoassays» genannt.
Es ist seit einiger Zeit bekannt, dass die natürlich vorkommende Substanz Clq die Eigenschaft besitzt, sich mit Ak: Ag-5 Komplexen zu vereinigen, jedoch nicht mit einem freien Ag oder einem freien Ak. Obwohl es bereits vorgeschlagen wurden (Agnello et al, J. Exp. Med., 134,228, (1971)), diese Eigenschaft in einer besonderen Weise zur Feststellung, jedoch nicht zur quantitativen Analyse oder absoluten Bestimmung von io Ak: Ag-Komplexen auszunützen, hat man bisher nicht erkannt, dass Clq potentiell ein ausserordentlich nützliches Reagenz zur Analyse von Ak, Ag und Ak: Ag-Komplexen ist.
Es wurde nun ein Immunoassay-Verfahren unter Verwendung von Clq gefunden.
15 Gegenstand der Erfindung ist das in Anspruch 1 angegebene Verfahren. Vorteilhafte Ausgestaltungen dieses Verfahrens sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
Clq ist ein natürlich umlaufendes Protein, und Verfahren zu seiner Abtrennung und Reinigung sind bekannt. Man gewinnt 20 es im allgemeinen aus dem Serum des Menschen, Kaninchens oder Rindes, und zwar durch ein Verfahren, das als Euglobulin-ausfällung bekannt und beispielsweise in J. Immunol. 106,304-413 (1971) beschrieben ist.
Der zu analysierende Ak: Ag-Komplex kann dadurch gebil-25 det werden, dass man ein Fluid, das ein Ak oder ein Ag enthält, das entsprechende Ag bzw. den entsprechenden Ak zusetzt. Auf diese Weise ist es möglich, die Menge an Ak oder Ag in einem Fluid zu bestimmen.
Bei dem erfindungsgemässen Verfahren kann das Material, 30 das agglutinieren gelassen wird, in weiten Grenzen variieren. So verursacht beispielsweise Clq die Agglutinierung von roten Blutkörperchen. Ferner verursacht es die Agglutination von Stoffen, die beispielsweise einen Überzug oder eine äussere Oberfläche aus Immunglobulinen besitzen, wie beispielsweise 35 Polystyrolteilchen, die mit Immunglobulin überzogen sind. Derartige Überzüge können durch immunologische Reaktionen zwischen Ak und Membran-Antigenen, durch physikalische Adsorption oder durch chemische Reaktion gebildet werden. Mit Immunglobulin überzogene Polystyrolteilchen sind han-40 delsüblich, können aber auch sehr leicht selbst hergestellt werden.
Wenn diese überzogenen Teilchen oder roten Blutkörperchen mit Clq in Berührung kommen, beginnt das Auftreten der 45 Agglutination. Wenn allerdings in der Lösung auch ein Ak: Ag-Komplex vorhanden ist, reagiert dieser mit Clq verhältnismässig schneller, so dass das Clq an den in der Lösung befindlichen Ak: Ag-Komplex gebunden wird und als Folge davon keine Agglutination der überzogenen Teilchen (oder roten Blutkörper-50 chen) auftritt. Das Vorhandensein von Ak: Ag-Komplexen im Serum kann man somit beispielsweise dadurch nachweisen, dass das Serum mit Clq sowie mit Teilchen in Berührung gebracht wird, die mit Immunglobulin überzogen sind. Wenn eine Agglutination beobachtet wird, enthält das Serum keine Ak: Ag-Kom-55 plexe.
Dies ist ein sehr einfacher und zuverlässiger Test, der zum Nachweis von allen Ak: Ag-Komplexen angewandt werden kann. Es folgt ein Beispiel für das Verfahren.
50 jxl Serum werden 50 |xl einer Lösung von löslichem 60 Clq zugesetzt, und das Gemisch wird mit 50 |xl einer Suspension aus Polystyrolteilchen vereinigt, die mit Immunglobulinen überzogen sind. Eine auftretende Agglutination der Teilchen kann sehr leicht festgestellt werden.
Der beschriebene Test kann auch zum Nachweis der An-65 wensenheit eines besonderen Ag oder Ak im Serum angewandt werden. Wenn man beispielsweise eine Überprüfung auf ein besonderes Antigen Ag' vornehmen will, wird dem Serum der geeignete spezifische Antikörper Ak' zugesetzt, und dann wird
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der Test auf das Vorhandensein eines Ak: Ag-Komplexes, nämlich Ak':Ag', durchgeführt. Wenn das Serum ursprünglich andere Ak: Ag-Komplexe enthält, müssen diese zuerst entfernt werden, beispielsweise durch Verwendung von unlöslich gemachtem RF oder Clq, wie es in einer gleichzeitig eingereichten Anmeldung der Anmelderin beschrieben ist, auf die hiermit Bezug genommen wird.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann auch quantitativ durchgeführt werden. Beispielsweise kann die zu analysierende Probe mit einer Lösung aus Clq sowie einer bekannten Menge von mit IgG überzogenen Latexteilchen vermischt werden, wodurch Clq an jeglichen vorhandenen Ak: Ag-Komplex gebunden wird und das restliche Clq eine Agglutinierung der Latexteilchen bewirkt. Die Menge des restlichen Clq kann bestimmt werden, indem man die agglutinierten oder nichtagglutinierten Latexteilchen zählt und die Ergebnisse mit Standardergebnissen vergleicht. Aus dem dabei erhaltenen Ergebnis kann die Menge an Ak: Ag-Komplex bestimmt werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:
Beispiel 1
Bestimmung von IgE
0,1 ml einer Probe mit IgE wurde mit einer Pipette in ein 5-ml-Rohr gegeben, und es wurde 1,0 ml des Kaninchen-Anti-human-IgE-Antiserums (verdünnt 1:128) zugesetzt. Das Gemisch wurde eine Stunde lang bei 37 °C bebrütet und mit 1 ml einer Lösung versetzt, die 60000 Latexteilchen mit einem Durchmesser von 0,8 [im enthielt, die zuvor in einer physiologischen Kochsalzlösung mit 1 mg IgG/ml bebrütet worden war. Das Gemisch wurde geschüttelt und mit 0,1 ml einer Lösung aus 600 Nanogramm Clq versetzt.
Das Gemisch wurde über Nacht bebrütet und dann in einem Teilchenzähler verarbeitet, der Teilchen, die einen Durchmesser von mehr als 1 |im aufweisen, nicht berücksichtigt. Die Konzentration des IgE war dem Teilchenwert umgekehrt proportional und konnte an Hand einer zuvor aufgenommenen Eichkurve ermittelt werden, die man mit Lösungen erhalten 5 hatte, die bekannt der Konzentrationen von IgE enthielten.
Beispiel 2
Automatische Analyse auf a rFetusprotein
Eine zu untersuchende Probe wird mit einem Durchfluss io von 0,1 ml/min. in ein automatisches, nach dem Prinzip des kontinuierlichen Durchflusses arbeitendes Analysengerät gepumpt, und zwar zusammen mit einer denselben Durchfluss aufweisenden Lösung, die 60000 Latexteilchen/ml enthielt. Die Latexteilchen hatten einen Durchmesser von 0,8 |xm, und die 15 Lösung war zuvor mit einem aj-Fetusprotein-Antiserum bebrütet worden, das mit einer physiologischen Kochsalzlösung im Verhältnis 1:64 verdünnt worden war. Die vermischten Ströme wurden mit Luft segmentiert, die mit einem Durchfluss von 0,32 ml/min. in das System gepumpt wurde. Nach der Zufuhr 20 der Luft wurde eine Clq-Lösung mit einem Durchfluss von 0,4 ml/min. eingeführt.
Der luftsegmentierte Strom wurde 10 Minuten lang bei 37 °C wärmebehandelt und anschliessend 2 Minuten auf 63 °C erhitzt, um das Clq zu zerstören und damit alle durch Clq 25 gebundenen Latexteilchen freizugeben. Dies betrifft allerdings nicht diejenigen, die durch Ag: Ak gebunden waren.
Der Strom wurde dann durch einen Teilchenzähler geleitet, der Teilchen unberücksichtigt liess, die einen Durchmesser von mehr als 1 um hatten. Die Konzentration des cq-Fetuspro-30 teins war umgekehrt proportional dem Teilchenzählwert und konnte an Hand von zuvor aufgenommenen Eichkurven ermittelt werden, die mit Lösungen von bekannter Konzentration an «j-Fetusprotein erstellt worden waren.
C

Claims (8)

630 465 PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung eines Ak: Ag-Komplexes in einer Fluidprobe, wobei der Probe eine Lösung von Clq zugesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, dass ausserdem ein Material zugesetzt wird, das bei Kontakt mit Clq zur Agglutinierung veranlasst wird, und dass das Ausmass der Agglutinierung oder Nichtagglutinierung des Materials bestimmt wird.
2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als zuzusetzendes Material ein solches verwendet, das ein Immunglobulin enthält.
3. Verfahren gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als zuzusetzendes Material ein solches verwendet, das aus inerten Trägerteilchen mit einer Immunglobulin-Beschich-tung besteht.
4. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als inerte Trägerteilchen solche aus Polystyrol verwendet.
5. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung quantitativ erfolgt und dass als Material eine bekannte Menge von mit IgG überzogenen Latexteilchen verwendet wird, wodurch Clq an jeglichen vorhandenen Ak: Ag-Komplex gebunden wird und restliches Clq eine Agglutinierung der Latexteilchen bewirkt, und dass die Menge des restlichen Clq (und daraus die Menge an
Ak: Ag-Komplex) bestimmt wird, indem die agglutinierten oder nichtagglutinierten Latexteilchen gezählt werden, und das Ergebnis mit Standardergebnissen verglichen wird.
6. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1,2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die Bestimmung quantitativ durchführt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es nach dem Prinzip des kontinuierlichen Durchflusses durchgeführt wird.
8. Anwendung des Verfahrens gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den Komplex sich dadurch bilden lässt, dass man einem Fluid, das ursprünglich einen Ak oder ein Ag enthält, das entsprechende Ag bzw. den entsprechenden Ak zusetzt und dadurch die Menge des ursprünglich in dem Fluid vorhandenen Ak oder Ag bestimmen kann.
CH918880A 1974-05-20 1980-12-12 Verfahren zum nachweis oder zur bestimmung eines antikoerper/antigen-komplexes in einer fluidprobe. CH630465A5 (de)

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