WO1993023754A1 - Verfahren zur pränataldiagnostik genetischer anomalien - Google Patents

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WO1993023754A1
WO1993023754A1 PCT/DE1993/000427 DE9300427W WO9323754A1 WO 1993023754 A1 WO1993023754 A1 WO 1993023754A1 DE 9300427 W DE9300427 W DE 9300427W WO 9323754 A1 WO9323754 A1 WO 9323754A1
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Dorothee Ahlert
Wolfgang Holzgreve
Hendrikus Stephanus Paulus Garritsen
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/80—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood groups or blood types or red blood cells

Definitions

  • the invention relates to a method for prenatal diagnosis of genetic anomalies.
  • Spontaneous abortion increases by about 1% due to the intervention (Holzgreve W., Miny P: Genetic aspects of fetal disease. Semin Perinatal 13: 260, 1989). Therefore, an examination for a spontaneously occurring so-called child trisomy (surplus chromosome) is currently only carried out in mothers with an increased risk, e.g. B. carried out increased maternal age. An invasive intervention is only carried out in Germany for pregnant women from the age of 36 because the risk of intervention in younger pregnant women is usually higher than that
  • the invention has for its object genetic Evidence of anomalies prenatally.
  • the solution to the problem consists of a combination of the following steps: a) Pre-enrichment of child cells from maternal whole blood by means of a multi-density gradient. b) Marking the child's cells with a
  • the fetal cells can be concentrated either by enriching them or by depleting the maternal cells.
  • the child's cells can advantageously be labeled with a monoclonal antibody against the transferrin receptor.
  • Nucleated erythrocytes are preferably enriched as child cells and an "anti - CD71" is used as monoclonal antibody.
  • trophoblasts can also be enriched or according to a further suggestion of the invention lymphocytes.
  • Anomalies are preferably detected as evidence of childhood chromosomal disorders by fluorescence in situ hybridization with chromosome-specific DNA probes.
  • Child cells from maternal whole blood can be pre-enriched by a triple-Ficol 1 gradient, with which good results have been achieved.
  • a triple-Ficol 1 gradient e.g. B. the use of a triple Percol 1 gradient.
  • Enriching the labeled fetal cells with a magnetically activated cell sorter has given good results and is inexpensive.
  • it can alternatively also be carried out, for example, with the aid of so-called “Dynabeads”, in which work is carried out with an open test tube and a magnet attached outside the test tube.
  • Examination of the cell composition of fetal blood shows that nucleated erythrocytes in early development (up to the 20th week of pregnancy) make up the predominant proportion of nucleated cells in the fetal circulation.
  • the number of white blood cells (lymphocytes) increases only later in pregnancy. This is based on the special ontogenesis of fetal blood formation, which takes place in different organs during the course of pregnancy in different development phases. Since prenatal diagnosis should be carried out as early as possible because of a possible termination of pregnancy, the isolation of nucleated erythrocytes seems to be the most promising for the development of a prenatal diagnostic method.
  • erythrocytes so that nucleated erythrocytes are specific for fetal blood
  • the transferrin receptor is a membrane protein that is responsible for iron transport into the cell; it can be detected using a specific monoclonal antibody (anti-CD 71).
  • a conventional method for enriching antibody-labeled cells from a cell mixture is to use a
  • Fluorescence activated fourth cell sorter In addition to antibody labeling, the cells are labeled with a fluorescent dye.
  • the FACS device can distinguish and separate the fluorescent cells from the unlabelled cells.
  • fetal cells from maternal blood have recently been successfully enriched (Bianchi DW, Flint AR, Pizzimenti MF et al: Isolation of fetal DNA from nucleated erythrocytes in maternal blood. PNAS 87: 3279. 1990; Price JO, Elias S, Wachtel SS: Prenatal diagnosis with fetal cells isolated from maternal blood by multi parameter flow cytometry. Am J Obstet Gynecol 165: 1731. 1991).
  • FACS device very expensive (approx. DM 800,000, -) and can only be operated by a specialist who has been trained for many years. Since the use of a FACS device in prenatal di agnosti seeing routine examinations would entail a considerable disadvantage as a result of this considerable financial and personnel expenditure, the antibody-labeled cells are proposed in a more recent manner according to the invention developed magnetically activated cell sorters (Miltenyi A., Müller W., Weiche! A .: High Gradient magnetic cell Separation with MACS - Cytometry
  • the MACS consists of a strong magnet, in the field of which a syringe filled with steel wool is inserted, through which the cell mixture is added after antibody and bead labeling and the negative cells, which are not loaded with magnetic beads, are washed out, while the positive cell fraction is on the steel wool sticks. The syringe is then removed from the magnetic field and the positive fraction containing the labeled cells is rinsed out.
  • the use of the magnetically activated cell sorter has the advantage that it is very easy to use and the cost of
  • FISH Fluorescence-labeled gene probes that are specific for a chromosome can be hybridized on a slide with the DNA of fixed nuclei.
  • the specificity of DNA-DNA hybridization allows a specific detection of the genes in the DNA-containing nuclei.
  • a hybridization can be seen under the fluorescence microscope by a distinct fluorescent signal in the nuclei.
  • a distinct sample of the autosomes contains two distinct sig to recognize nale in the cores.
  • this method can be used to detect 3 signals using a chromosome-specific gene probe.
  • fluorescence in situ hybridization to detect a child
  • Aneuploidy after the accumulation of fetal cells from the blood of pregnant women who have had a fetus with a known chromosomal abnormality is aneuploidy after the accumulation of fetal cells from the blood of pregnant women who have had a fetus with a known chromosomal abnormality.
  • Fig. 2 Differential cell counts. Blood tests
  • the blood should not be older than 12 hours before processing.
  • umbilical cord blood was diluted in a series in adult blood so that the ratio of nucleated cells from 1:10 to
  • 2 ml of heparinized whole blood are mixed with 4 ml of PBS buffer (8.42 g NaCl, 0.2 g KCl. 0.299 g KH 2 PO 4 , 0.92 g NaHPO 4 , ad 1000 ml aqua dest.) Mixed and placed in a 12 ml centrifuge tube.
  • PBS buffer 8.42 g NaCl, 0.2 g KCl. 0.299 g KH 2 PO 4 , 0.92 g NaHPO 4 , ad 1000 ml aqua dest.
  • Density 1110 is mixed from appropriate proportions of densities 1077 and 1119, both of which are available from Sigma (Munich). The gradients are centrifuged at 550 g for 30 min. The following three distinct cell layers can then be seen in the clear Ficoll supernatant:
  • the number of cells in the enriched cells is so low that it is not visible, but their position can be clearly recognized by the transition between the two layers of different colors.
  • the centrifuge tube At the bottom of the centrifuge tube there is a thick red border of coreless erythrocytes. There is a yellowish layer with blood serum over the Ficol 1 layers.
  • the cell number of the middle band was determined according to the triple gradient in a Thomas chamber.
  • the cells were 10 min. Centrifuged at 200 g and the pellet was taken up in 50 ⁇ l PBS buffer containing 10% serum. The serum is removed after the triple gradient and 45 min before use. incubated at 56 ° C. The use of the serum in the antibody incubation prevents the non-specific labeling of monocytes.
  • 50 ⁇ l of “anti-CD71” Becton-Dickenson
  • 50 ⁇ l of “anti-CD71” Becton-Dickenson
  • 20 ⁇ lrat-anti-mouse IgG 2 (a + b) magnetic microbeads (Miltenyi Biotech, Bergisch-Gl adbach) are added and the mixture is further 15 min.
  • the column is then rinsed with PBS / 0.5% BSA and the PBS / BSA mixture is left in the column by closing the tap in time so that the buffer is about 1 cm above the steel wool.
  • This treatment enables the column to be filled with PBS / BSA buffer without air bubbles. Existing air bubbles would prevent the cells from later binding to the steel wool.
  • the PBS / BSA mixture must 30 min. remain in the column so that it is saturated with BSA to prevent non-specific binding.
  • the column is attached to the magnet and, by opening the three-way valve, the buffer is removed so far that the liquid level is just above the steel wool.
  • the 500 ⁇ l cell suspension is pipetted onto the column and the tap is opened until the upper edge of the liquid level has almost reached the steel wool again. Then 6 fractions of 500 ⁇ l PBS / 0.5% BSA are added and the column is washed with it. This
  • Negative fraction is eluted with a 24 G needle and collected in a centrifuge tube. Then the three-way valve is closed and the column is removed from the magnet. A syringe with PBS / 0.5% BSA is attached to the side of the tap. After opening the tap, the buffer is pressed into the column with the syringe until the cell suspension reaches the top of the column. After closing the three-way valve, it is reattached in the magnet and a 22 G needle is attached at the bottom. The column is then again eluted 6 times with 500 ⁇ L PBS / 0.5% BSA, this
  • Fraction is collected as a wash fraction. After closing the three-way valve, the column is removed from the magnet, filled to the top with PBS / 0.5% BSA buffer and a syringe, also filled with 3 ml PBS / BSA buffer, is placed on top. After removing the needle, the "positive fraction" is rinsed out by pressing the syringe.
  • the positive fraction of the magnetic cell separation was used to isolate the interphase nuclei
  • the effectiveness of the triple gradient is significantly higher than in the case of enrichment from umbilical cord blood.
  • Table 1 shows the number of nucleated erythrocytes that could be isolated from the blood of nine pregnant women by combining the two separation methods.

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Abstract

Sowohl in Nabelschnurblutproben als auch nach der Separation von Schwangerenblut konnte klar nachgewiesen werden, daß die Kombination des Dreifachgradienten und MACS mit anti-CD71 markierten Zellen eine sehr effektive Methode zur Anreicherung von nukleierten Erythrocyten ist. Im Nabelschnurblut lag der Anteil nukleierten Erythrocyten nach den beiden Anreicherungstechniken zwischen 72- und 89 %. Bei schwangeren Frauen verschiedener Gestationsalter konnten nukleierte Erythrocyten in der Positivfraktion nach Dreifachgradient und MACS in allen Fällen nachgewiesen werden. Die Variation in der Anzahl angereicherter nukleierter Erythrocyten in verschiedenen Schwangerschaften reflektiert höchstwahrscheinlich individuelle Unterschiede des feto-maternalen Zellverhältnisses in verschiedenen Gestationsaltern. Mit der hier beschriebenen Technik konnten im normalen männlichen Blut und Blut nichtschwangerer Frauen keine nukleierten Erythrocyten nachgewiesen werden im Gegensatz zu Schwangeren verschiedener Gestationsalter. Die Methode ist also gut reproduzierbar und geeignet für die klinische Diagnostik. Mit der Fluoreszenz in situ Hybridisierung gelang ein Nachweis einer fetalen Trisomie in allen drei untersuchten Fällen. Die Anreicherung nukleierter Erythrocyten ist also stark genug, um einen diagnostischen Nachweis kindlicher Aneuploidien mit Hilfe der Fluoreszenz In Situ Hybridisierung zu führen. Es ist daher naheliegen, daß man mit dieser wenig invasiven und relativ einfach und kostengünstig durchzuführenden Methode eine Screeninguntersuchung auf die drei wichtigsten Trisomien (13, 18 und 21) sowie Einzelgenerkrankungen (mit Hilfe der PCR) anbieten könnte, die praktisch keine Gefahr für die Patientin und das Kind bedeutet.

Description

"Verfahren zur Pränatal di agnosti k genetischer
Anomalien"
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Pränataldiagnostik genetischer Anomalien.
Aus der FR 2 657 167 ist ein nichtdiagnostisches Screening-Verfahren bekannt, bei dem für die
Screeninguntersuchungen nur mütterliches Serum verwendet wird. Auf diese Weise kann ein altersbedingtes Risiko für Morbus Down rechnerisch modifiziert werden, wobei durch diese Untersuchungen jedoch nur ein relatives Risiko für das Down Syndrom geschätzt werden kann.
Im übrigen ist es seit ca. 20 Jahren möglich, vorgeburtlich genetische Anomalien zu diagnostizieren. Die zur Zeit zur Verfügung stehenden Techniken zur Aspiration kindlichen Gewebes während der Schwangerschaft sind die Fruchtwasserpunktion (Amniozentese) und die sog. Chorionzottenbi opsi e. Die Chorioπzottenbiopsie kann bereits ab der 8., die Amniozentese ab der 14. Schwangerschaftswoche durchgeführt werden. Die Invasivität dieser konventionellen Methoden bedingt jedoch, daß Eingriffsrisiken für den Feten (z. B. Fehlgeburt oder Verletzung) aber auch für die Mutter (z. B. Entzündungen in der Gebärmutter) bestehen. Eine randomisierte Kontrollstudie wies nach, daß sogar durch eine Amniozentese, die von vielen als die sicherere Aspirationstechnik angesehen wird, das Risiko eines
Spontanabortes eingriffsbedingt um ca. 1 % steigt (Holzgreve W.,Miny P : Genetic aspects of fetal disease. Semin Perinatal 13: 260, 1989). Deshalb wird zur Zeit eine Untersuchung auf eine spontan auftretende sogenannte kindliche Trisomie (überzähliges Chromosom) nur bei Müttern mit erhöhtem Risiko, z. B. erhöhtem mütterlichen Alter durchgeführt. Ein invasiver Eingriff wird in Deutschland erst bei Schwangeren ab dem 36. Lebensjahr durchgeführt, weil das Eingriffsrisiko bei jüngeren Schwangeren im Normalfall höher ist, als die
Wahrscheinlichkeit des Auftretens einer kindlichen Trisomie. Deshalb besteht seit vielen Jahren eine starke Motivation zur Entwicklung einer weniger invasiven Technik zur Pränataldiagnosti k. Obwohl eine Vielzahl von Versuchen in der Vergangenheit unternommen wurde, diese Hoffnung zu verwirklichen, war keine der bisher versuchten Techniken erfolgreich.
Vermutlich gelangen im Laufe einer Schwangerschaft einige wenige kindliche Zellen, als Folge feto- maternaler Transfusion, in den mütterlichen Kreislauf. Das Verhältnis kindlicher zu mütterlichen kernhaltigen Zellen im Blut einer Schwangeren ist aber extrem niedrig und wird zur Zeit auf ca. 1 in 109 bis 1 in 1011 Zellen geschätzt (Holzgreve W,
Gänshirt-Ahlert D, Burschky M et al.: Detection of fetal DNA in matemal blood by PCR. Lancet 335:
1220, 1990). Wegen dieser hohen Verdünnung kindlicher Zellen ist es ohne vorherige Anreicherung bisher noch nicht gelungen, das genetische Material des Feten aus mütterlichem Blut reproduzierbar nachzuweisen (Holzgreve W, Garritsen HSK, Gänshi rtAhlert D: Fetal cells in maternal circulation.
J Reprod Med 37 (5): 410, 1992, nicht vorveröffentlicht)
Wenn es möglich wäre, diese fetalen Zellen aus der mütterlichen Zirkulation zu isolieren, wäre durch eine einfache Blutentnahme der Zugang zu einer
Pränatal di agnosti k möglich. Hierdurch würde das durch den konventionellen Eingriff bedingte Risiko für Mutter und Kind entfallen. Zusätzlich würde eine Blutentnahme gegenüber der heute üblichen Amniozentese bzw. Chori onzottenbi opsie eine erhebliche
Kostensenkung bedeuten. Amniozentesen werden nur von besonders dafür ausgebildeten Frauenärzten durchgeführt und die neuere Chorionzottenbiopsie wird zur Zeit in Deutschland nur in wenigen speziell dafür eingerichteten Zentren angeboten. Da alle kernhaltigen Zellen die gesamte genetische Information enthalten, können aus kindlichen Blutzellen nach erfolgreicher Isolation aus mütterlichem Blut dieselben genetischen Aberrationen nachgewiesen werden, wie nach konventioneller Aspiration fetaler Zellen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, genetische Anomalien pränatal nachzuweisen.
Die Lösung der Aufgabe besteht aus einer Kombination folgender Schritte: a) Voranreicherung kindlicher Zellen aus mütterlichem Vollblut durch einen MehrfachDichte-Gradienten. b) Markierung der kindlichen Zellen mit einem
monoklonalen Antikörper und/oder Markierung mütterlicher Zellen mit entsprechenden
spezifischen Antikörpern mit magnetischen Beads und Anreicherung der markierten fetalen Zellen bzw. Depletion der mütterlichen Zellen durch magnetische Separation. c) Nachweis kindlicher genetisch bedingter
Anomalien durch molekulargenetische Nachweismethoden.
Die Konzentration der fetalen Zellen kann also entweder durch deren Anreicherung erfolgen oder über die Depletion der mütterlichen Zellen.
Vorteilhaft können die kindlichen Zellen mit einem monoklonalen Antikörper gegen den Transferrinrezeptor markiert werden. Vorzugsweise werden als kindliche Zellen nukleierte Erythrocyten angereichert und als monoklonaler Antikörper wird ein "anti - CD71" eingesetzt.
Als kindliche Zellen können auch Trophobl asten angereichert werden oder gemäß einem weiteren Vorschlag der Erfindung Lymphocyten.
Der Nachweis kindlicher genetisch bedingter
Anomalien erfolgt vorzugsweise als Nachweis kindlicher Chromosomenstörungen durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung mit Chromosomen-spezifischen DNA Sonden.
Die Voranreicherung kindlicher Zellen aus mütterlichem Vollblut kann durch einen Dreifach-Ficol 1- Gradienten erfolgen, mit dem gute Ergebnisse erzielt wurden. Die Verwendung anderer Dreifach- oder Vielfach-Gradienten ist jedoch denkbar, z. B. die Verwendung eines Dreifach-Percol 1-Gradienten.
Die Anreicherung der markierten fetalen Zellen durch einen magnetisch aktivierten Zellsorter (MACS) hat gute Ergebnisse erbracht und ist preisgünstig. Sie kann jedoch alternativ beispielsweise auch mit Hilfe sogenannter "Dynabeads" erfolgen, bei denen mit einem offenen Reagenzgefäß und einem außerhalb des Reagenzgefäßes angebrachten Magneten gearbeitet wi rd. Die Untersuchung der Zellzusammensetzung fetalen Blutes zeigt, daß nukleierte Erythrocyten in der frühen Entwicklung (bis zur 20. Schwangerschaftswoche) den überwiegenden Anteil der kernhaltigen Zellen in der fetalen Zirkulation ausmachen. Erst im späteren Verlauf der Schwangerschaft nimmt die Anzahl der weißen Blutkörperchen (Lymphocyten) zu. Dies beruht auf der speziellen Ontogenese der fetalen Blutbildung, die im Laufe der Schwangerschaft in verschiedenen Entwicklungsphasen in unterschiedlichen Organen stattfindet. Da die Pränatal diagnostik wegen eines in Frage kommenden Abbruchs der Schwangerschaft so früh wie möglich erfolgen sollte, erscheint die Isolierung nukleierter Erythrocyten zur Entwicklung einer pränataldi agnostischen Methode am viel versprechensten.
Es ist auch bekannt, daß das Blut normaler Erwachsener keine kernhal tigen, sondern nur kernlose
Erythrocyten enthält, so daß kernhaltige Erythrocyten spezifisch für das fetale Blut sind
(Holzgreve W, Garritsen HSK, Gänshirt-Ahlert D:
Fetal cells in maternal circulation. J. Reprod
Med 37: 410, 1992).
In jüngerer Zeit wurde eine Methode publiziert, die durch Verwendung eines Zwei Stufengradienten aus fetalem Vollblut mononukleäre weiße Blutkörperchen von nukleierten roten Blutkörperchen abtrennen kann (Bhat MM, Bieber M, Teng NNH: One step Separation of human fetal lymphocytes from nucleated red blood cells. J Immun Meth 131 : 147. 1990). In Abwandlung dieser Technik benutzt die Erfindung einen effektiveren Dreifachgradienten, um nukleierte
Erythrocyten aus mütterlichem Blut voranzureichern. Es entstehen dabei nach Zentrifugation von Vollblut über einen Dreifachgradienten aus Ficoll drei distinkte Zellschichten, von denen die mittlere Zellschicht nukleierte Erythrocyten enthält. Wir konnten nachweisen, daß die Anreicherung dieser
Zellen um so effektiver ist, je verdünnter diese im Vollblut vor der Zentrifugation sind.
Untersuchungen an Knoc henmarks zel l en Erwachsener, die kernhaltige Vorläuferzel len der Erythrocyten enthalten, ergaben, daß diese auf den Zellmembranen einen sogenannten Transferri nrezeptor exprimieren (Horton MA: Expression of transferrin receptors during erythroid maturation. Exp Cell Res 144: 361, 1983). Der Transferrinrezeptor ist ein Membranprotein, das für den Eisentransport in die Zelle verantwortlich ist; er kann mit Hilfe eines spezifischen monoklonalen Antikörpers (anti-CD 71) nachgewiesen werden. Eine konventionelle Methode zur Anreicherung antikörper-markierter Zellen aus einem Zellgemisch ist die Verwendung eines
Fl uoreszenz-akti vierten Zellsorters (FACS). Zusätzlich zur Antikörpermarkierung werden hierbei die Zellen mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert. Das FACS-Gerät kann die fluoreszierenden Zellen von den nicht markierten Zellen unterscheiden und voneinander trennen. Mit Hilfe dieser Methode ist es in jüngster Zeit gelungen, fetale Zellen aus mütterlichem Blut anzureichern (Bianchi DW, Flint AR, Pizzimenti MF etal: Isolation of fetal DNA from nucleated erythrocytes in maternal blood. PNAS 87: 3279. 1990; Price JO, Elias S, Wachtel SS: Prenatal diagnosis with fetal cells isolated from maternal blood by mul ti parameter flow cytometry. Am J Obstet Gynecol 165: 1731. 1991). Allerdings ist ein
FACS Gerät sehr kostspielig (ca. DM 800.000,- -) und kann nur von einem dafür spezialisierten langjährig ausgebildeten Mitarbeiter bedient werden. Da durch diesen erheblichen finanziellen und personellen Aufwand der Einsatz eines FACS Gerätes bei pränatal di agnosti sehen Routineuntersuchungen einen erheblichen Nachteil mit sich bringen würde, wird gemäß der Erfindung vorgeschlagen, die antikörpermarkierten Zellen mit Hilfe eines in jüngerer Zeit entwickelten magnetisch-aktivierten Zellsorters (Miltenyi A., Müller W., Weiche! A.: High Gradient magnetic cell Separation with MACS - Cytometry
11:231. 1990.) anzureichern. Bei dieser Technik werden die antikörper-markierten Zellen zusätzlich mit magnetischen Beads beladen. Der MACS besteht aus einem starken Magneten, in dessen Feld eine mit Stahlwolle gefüllte Spritze eingebracht wird, über diese wird das Zellgemisch nach Antikörper- und Beads-Markierung gegeben und die negativen, nicht mit magnetischen Beads beladenen Zellen werden herausgewaschen, während die positive Zellfraktion an der Stahlwolle haften bleibt. Anschließend wird die Spritze aus dem Magnetfeld entfernt und die Positivfraktion, die die markierten Zellen enthält, herausgespült. Die Verwendung des magnetisch aktivierten Zellsorters bietet den Vorteil, daß er sehr einfach zu bedienen ist und die Kosten der
Anschaffung ( ca . DM 10 . 000 , - - ) we i t un ter denen eines FACS Gerätes liegen.
Als Nachweis der kindlichen Herkunft der angereicherten Zellen diente die Fluoreszenz in situ
Hybridisierung (FISH). Mit dieser Technik können fluoreszenzmarkierte Gensonden, die spezifisch für ein Chromosom sind, auf einem Objektträger mit der DNA fixierter Kerne hybridisiert werden. Die Spezifität der DNA-DNA Hybridisierung erlaubt einen spezifischen Nachweis der Gene in den DNA-haltigen Kernen. Unter dem Fluoreszenzmikroskop ist eine erfolgte Hybridisierung durch ein distinktes fluoreszierendes Signal in den Kernen erkennbar. Bei einem normalen menschlichen Chromosomensatz sind mit einer Chromosomen-spezifischen Probe der Autosomen (Nicht-Geschlechtschromosomen) zwei distinkte Sig nale in den Kernen zu erkennen. Bei einem aberranten Chromosomensatz mit einem überzähligen Chromosom (Aneupl oidie) kann man mit dieser Methode durch eine Chromosomen-spezifische Gensonde 3 Signale nachweisen. Wir verwendeten die Fluoreszenz in situ Hybridisierung zum Nachweis einer kindlichen
Aneuploidie nach Anreicherung fetaler Zellen aus dem Blut schwangerer Frauen, die einen Feten mit bekannter Chromosomenanomalie austrugen.
Diese Methode wurde gewählt, weil Aneuploidien die häufigste Ursache für genetische Fehl bi 1 düngen darstellen und einer Diagnose dieser Anomalien in der Schwangerschaft daher eine große Bedeutung zukommt. Besonders wichtig ist der Nachweis einer Trisomie der Chromosomen 13, 18 und 21, sowie Aneuploidien der Chromosomen X und Y. Dieses sind die einzigen Trisomien, die zur Geburt eines Feten führen können, die allerdings in allen drei Fällen schwer geschädigt sind. Eine wenig risikoreiche Technik zur Aspiration fetalen Gewebes aus mütterlichem Blut würde daher eine Screeni nguntersuchung auf eine dieser häufigsten genetischen Erkrankungen auch bei jungen Frauen ermöglichen.
Die Erfindung wird nachstehend in Verbindung mit den Tabellen und den Abbildungen an einem Ausführungsbeispiel erläutert. Es zeigt: Tab. 1: Schwangerschaftsgeschichte, Probenentnahme und Ergebnisse,
Tab. 2: Auswertung der Anreicherung von
nukleierten Erythrocyten,
Tab. 3: Hybri di si erungssi gnal e in Zellen aus mütterlichem Blut, Abb. 1: Prozentsatz der Zellen mit drei Signalen und
Abb. 2: Differentielle Zellzählungen. Blutproben
Vierzig ml heparini siertes Vollblut wurde von neun schwangeren Frauen abgenommen. Drei dieser Frauen trugen einen Feten mit einer Trisomie 18 aus
(Tab. 1).
Zur Kontrolle wurden zusätzlich jeweils 10 ml heparinisiertes Nabel schnurblut von vier normalen Neugeborenen und einem Neugeborenen mit einer Trisomie 18 untersucht. Nabel schnurblut ist immer kindlicher Herkunft.
Als Kontrolle wurden jeweils 40 ml Blut von drei nichtschwangeren Frauen und drei Männern untersucht.
Das Blut sollte vor der Verarbeitung nicht älter als 12 Stunden sein.
Zur gesonderten Bestimmung der Effektivität des Dreifachgradienten wurde Nabel schnurbl ut in Erwachsenenblut in einer Serie so verdünnt, daß das Verhältnis kernhaltiger Zellen von 1 : 10 bis
1 : 50.000 abnimmt, und anschließend ein Dreifachgradient mit jeder einzelnen Verdünnung durchgeführt.
Dreifachgradient
Jeweils 2 ml heparinisiertes Vollblut werden mit 4 ml PBS Puffer (8.42 g NaCl, 0.2 g KCl . 0.299 g KH2PO4, 0.92 g NaHPO4, ad 1000 ml aqua dest.) gemischt und in ein 12 ml Zentri fugenröhrchen gegeben. Mit einer langen Kanüle werden nacheinander vorsichtig jeweils 2 ml Ficoll-Histopaque (Sigma,
München) folgender Dichten unterschichtet: Ficoll-Histopaque 1077, 1110 und 1119. Das Ficoll der
Dichte 1110 wird aus entsprechenden Anteilen der Dichten 1077 und 1119, die beide bei Sigma (München) erhältlich sind, gemischt. Die Gradienten werden 30 min bei 550g zentri fugiert. Es sind dann folgende drei distinkte Zellschichten in dem klaren Ficoll-überstand zu sehen:
Eine obere Schicht, die Lymphocyten und Monozyten enthält, eine mittlere Bande, die nukleierte Erythrocyten enthält, eine untere Bande mit neutrophilen Granulozyten.
Bei Blut aus Schwangeren ist die Zellzahl der angereicherten Zellen so gering, daß sie nicht sichtbar ist, ihre Lage ist jedoch an dem Übergang der beiden Ficol 1 schichten unterschiedlicher Dichte gut zu erkennen. Am Boden des Zentri fugationsröhrchens befindet sich ein dicker roter Saum kernloser Erythrocyten. über den Ficol 1 schichten liegt eine gelbliche Schicht mit Blutserum. Nacheinander werden mit einer 10 ml Spritze und einer TSK Subra Einmal kanüle,
0.9 × 120 (Ehrhardt, Geislingen) das Blutserum, die obere, die mittlere und untere Bande von dem
Gradienten abgenommen. Die unterste Zellschicht mit den nicht kernhaltigen Erythrocyten wird verworfen. Die mittlere Bande, die die angereicherten nukleier ten Erythrocyten enthält, wird mit 5 ml PBS-Puffer versetzt und drei mal mit PBS Puffer gewaschen, d. h. jeweils 8 min. bei 550 g zentrifugiert und das Zellpellet erneut mit PBS Puffer versetzt. Danach wird die Zel l suspension auf ca. 2 ml eingeengt, 100μl entnommen und in einer Zytozentri fuge
(Shandon, Frankfurt) 5 min. bei 500 g auf einen Objektträger zentrifugiert. Auf dem Objektträger werden die Blutzellen differentiell angefärbt mit einer Diff-Quick Färbelösung (Merz+Dade, Düdingen,
CH). Diese Färbung erlaubt die mikroskopische Unterscheidung der verschiedenen Blutzellen voneinander. Es wurden auf diese Weise jeweils 100 Zellen nach Separierung durch den Gradienten ausgezählt, um den Erfolg der Anreicherung nukleierter Erythrocyten in der mittleren Zellschicht zu überprüfen.
Antikörperfärbung In einer Thomakammer wurde die Zellzahl der mittleren Bande nach dem Dreifachgradienten bestimmt.
Bei der Verwendung von Nabel schnurblut wurde ein Aliquot dieser angereicherten Zeil Suspension zur Antikörpermarkierung eingesetzt, das einer Zellzahl von 10 Zellen entsprach.
Die Zellen wurden 10 min. bei 200 g zentrifugiert und das Pellet in 50μl PBS Puffer, der 10 % Serum enthält, aufgenommen. Das Serum wird nach dem Dreifachgradienten entnommen und vor der Verwendung 45 min. bei 56° C inkubiert. Die Verwendung des Serums bei der Antikörperinkubation verhindert die unspezifische Markierung von Monozyten. Zu den 50 αi.der Zel 1 suspensi on werden 50μl "anti-CD71" (Becton-Dickenson) gegeben und das Gemisch 10 min. bei 8° C inkubiert. Anschließend werden 20μlrat-anti-mouse IgG 2 (a+b) magnetische Microbeads (Miltenyi Biotech, Bergi sch-Gl adbach) dazugegeben und das Gemisch weitere 15 min. bei 8° C inkubiert. Nach Zentrifugation (200 g, 10 min.) wird der überstand abgenommen und die Zellen in 500 μl PBS/0.5 % B SA ( bov i ne se rum a l bumi ne , F l u k a , Buc h s ) re s u spend i ert.
Eine A2 Säule der Firma Milenyi Biotech, die mit Stahlwolle gefüllt ist und sich zur Separation von ca. 10 Zellen eignet, wird für die Zelltrennung wie folgt vorbereitet: An das untere Ende der Säule wird ein Dreiwegehahn angeschlossen und an den seitlichen Eingang eine mit 70 %igem Ethanol gefüllte 10 ml Spritze angesetzt. Das Ethanol wird von unten in die Säule hineingedrückt, bis der Flüssigkeitsspiegel den oberen Rand der A2 Säule erreicht hat. Der Dreiwegehahn wird geschlossen und von oben eine 100 ml Spritze mit Gewinde auf die Säule aufgeschraubt, die Aqua dest. enthält. Der Dreiwegehahn wird geöffnet, so daß die Säule nach unten auslaufen kann und mit Aqua dest. durchgespült wird. Anschließend wird die Säule mit PBS/0.5 % BSA durchgespült und das PBS/BSA Gemisch durch rechtzeitiges Schließen des Hahns in der Säule belassen, so daß der Puffer ca. 1 cm über der Stahlwolle steht. Durch diese Behandlung gelingt es, die Säule luftblasenfrei mit PBS/BSA Puffer zu füllen. Vorhandene Luftblasen würden eine spätere Bindung der Zellen an die Stahlwolle verhindern. Das PBS/BSA Gemisch muß 30 min. in der Säule verbleiben, damit sie mit BSA abgesättigt wird, um unspezifische Bindungen zu verhindern. Vor der Zellseparation wird die Säule an dem Magneten befestigt und durch öffnen des Dreiwegehahns der Puffer so weit entfernt, daß der Fl üssigkeitsspiegel kurz über der StahTwolle steht. Von oben werden die 500μl Zellsuspension nach Antikörperfärbung auf die Säule pipettiert und der Hahn so lange geöffnet, bis der obere Rand des Flüssigkeitsspiegels wieder fast die Stahlwolle erreicht hat. Danach werden 6 Fraktionen von jeweils 500μl PBS/0.5 % BSA hinzugegeben und die Säule damit gewaschen. Diese
Negativfraktion wird mit einer Nadel der Stärke 24 G eluiert und in einem Zentri fugenröhrchen gesammelt. Danach wird der Dreiwegehahn geschlossen und die Säule aus dem Magneten entfernt. Unten an dem Hahn wird seitlich eine Spritze mit PBS/0.5 % BSA befestigt. Nach Offnen des Hahns wird der Puffer mit der Spritze so weit in die Säule gepreßt, daß die Zellsuspension den oberen Säulenrand erreicht. Nach Schließen des Dreiwegehahns wird diese wieder in dem Magneten befestigt und eine Nadel der Stärke 22 G unten angebracht. Die Säule wird dann erneut 6 mal mit jeweils 500 μL PBS/0.5 % BSA eluiert, diese
Fraktion wird als Waschfraktion gesammelt. Nach dem Schließen des Dreiwegehahns wird die Säule aus dem Magneten entfernt, bis zum oberen Rand mit PBS/0.5 % BSA Puffer gefüllt und oben eine ebenfalls mit 3 ml PBS/BSA Puffer gefüllte Spritze aufgesetzt. Nach Entfernen der Nadel wird durch Druck auf die Spritze die "Positivfraktion" nach unten ausgespült.
Von allen drei Fraktionen "Negativ-", "Wasch-" und Positivfraktion" wurden Aliquots zur Zellzahlbestimmung und Zytozentrifugation entnommen. Im Anschluß an die Zytozentrifugation wurden die Objektträger differentiel 1 angefärbt und bei Nabelschnur- blut jeweils 100 Blutzellen ausgezählt, um die erfolgte Anreicherung zu überprüfen. Bei Schwangerenblut wurden alle Zellen des gesamten Zytospins ausgezählt.
Fluoreszenz In Situ Hybridisierung
Die positive Fraktion der magnetischen Zellseparation wurde zur Isolation der Interphasekerne
10 min. bei 200 g zentrifugiert, das Pellet in 5 ml 75 mM KCL resuspendiert und 10 min. bei 37° C inkubiert. Nach Zentrifugation (10 min. 150 g) wurde das Zellpellet vorsichtig in 5 ml Methanol/Eisessig (3 : l/v : v) resuspendiert und 10 min. bei 200 g zentrifugiert. Das Pellet wurde in dem Rücklauf des Methanol/Eisessig resuspendiert und mit einer Glaspasteurpipette auf einen Objektträger aufgetropft.
Die anschließende Fluoreszenz in situ Hybridisierung mit einer DNA Sonde, die spezifisch für das Chromosom 18 ist, erfolgte mit einem Kit der Firma Oncor (Gaithersburg, USA) nach den Anweisungen des Herstellers. Die Kerne wurden nach der in situ Hybridisierung unter einem Zeiss Fluoreszenz-Mikroskop ausgewertet und mit einem Kodak Ectachrom 64 ASA Film fotografiert. Ergebni sse
Die Ergebnisse differentiel ler Zel 1 zähl ungen vor und nach dem Drei fachgradienten und nach MACS von sieben
Nabel schnurbl utproben sinds in der Abb. 2 dargestellt Die starke Anreicherung nach der kombinierten Anwen düng beider Methoden ist klar erkennbar. Die
Separationseffizienz des Drei fachgradienten steigt signifikant an, wenn die Zahl der nukleierten
Erythocyten in der Vollblutprobe abnimmt. Dies konnte in Untersuchungen von Dreifachgradienten mit Verdünnungsreihen von Nabel schnurbl ut in Erwachsenenblut nachgewiesen werden (Tab. 2). Man kann also davon ausgehen, daß bei der Separation von
Schwangerenbl ut die Effektivität des Dreifachgradienten deutlich höher ist als dies bei der Anreicherung aus Nabel schnurbl ut der Fall ist.
Tabelle 1 zeigt die Anzahl nukleierter Erythrocyten, die durch die Kombination beider Separationsmethoden aus dem Blut von neun Schwangeren isoliert werden konnten.
Nach Separation von drei männlichen Kontrol 1 bl utproben und drei Blutproben von nichtschwangeren Frauen konnten keine nukleierten Erythrocyten nachgewiesen werden.
Bei drei der untersuchten Schwangerschaften wurde bei bekannter Trisomie 18 des Feten (Tab. 1) im Anschluß an die Zellseparation eine Fluoreszenz in situ Hybridisierung mit einer Chromosom 18 spezifischen DNA Sonde durchgeführt. In allen drei Fällen war der Prozentsatz der Zellen mit drei Signalen im Vergleich zu Kontrollen signifikant erhöht (Tab. 3). Der Anteil der Zellen mit drei Signalen lag bei 12-, 12- und 14 % in den Fällen mit Trisomie 18. Bei vier Blutproben normaler Neugeborener lag der mittlere Prozentsatz der trisomen Zellen nach FISH bei 2.5 % . Abbildung 1 stellt diese Daten aus drei Schwangerschaften und vier Nabel schnurbl utkoπtrol len dar. Die beiden Verteilungskurven zeigen keine Überlappung und der Unterschied ist hoch signifikant.
Bei Patientin 3 untersuchten wir Nabelschnurblut, das von dem Feten mit Trisomie 18 in utero gewonnen wurde und fanden 70 % der Zellen mit drei Signalen.
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Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Pränataldiagnostik genetischer
Anomalien, das die Kombination folgender Schritte umfaßt: a) Voranreicherung kindlicher Zellen aus
mütterlichem Vollblut durch einen Mehrfach-Dichte-Gradienten,
b) Markierung der kindlichen Zellen mit
einem monoklonalen Antikörper und/oder Markierung mütterlicher Zellen mit entsprechenden spezifischen Antikörpern mit magnetischen Beads und Anreicherung der markierten fetalen Zellen bzw. Depletion der mütterlichen Zellen durch magnetische Separation,
c) Nachweis kindlicher genetisch bedingter Anomalien durch molekulargenetische
Nachweismethoden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung der kindlichen Zellen mit einem monoklonalen Antikörper gegen den Transferrinrezeptor erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 . dadurch gekennzeichnet, daß als kindliche Zellen nukleierte Erythrocyten angereichert werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß als kindliche Zellen Trophobl asten angereicht werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als kindliche Zellen Lymphocyten angereichert werden.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Antikörper ein "anti - CD71" ist.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, gekennzeichnet durch den Nachweis kindlicher Chromosomenstörungen durch
Fluoreszenz in situ Hybridisierung mit Chromosomen-spezifischen DNA Sonden.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die
Voranreicherung kindlicher Zellen durch einen Dreifach-Ficol 1 -Gradienten erfolgt.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die
Anreicherung der markierten fetalen Zellen durch einen magnetisch aktivierten Zeil Sorter (MACS) erfolgt.
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