WO1994003196A1 - Neue sonde zur tumordiagnostik oder tumortherapie - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a new therapeutic or diagnostic agent which contains at least one nucleic acid as active substance, and is particularly suitable for the diagnosis or / and therapy of tumors.
  • Proteins that contain a home box play an important role in the development of multicellular differentiated tissue. It is believed that the transcriptional regulation by the homeobox proteins coordinates the exact spatial and temporal sequence of growth and differentiation in the developing embryo. From the literature (see, for example, K. Kongsuwan, JM Adams, Nucleic Acids Res. 17 (1989), 1881-1891; C. Blatt, D. Aberdam, R. Schwartz, L. Sachs, EMBO J. 7 (1988), 4283-4290; C. Blatt, Cancer Cells 2 (1990), 186-189; TH Rabbitts Cell 647 (1991), 641-644; AW Sasaki, J. Doskow, CL Macleod, MB Rodgers, LJ Goudas, MF Wilkinson, MOD34 (1991) 155-164) is known to have some homeobox-containing genes associated with oncogenesis.
  • the "paired” domain encoded by the "paired” box represents a DNA-binding domain (J. Treisman, E. Harris, C. Desplan, Genes. Dev. 5 (1991), 594-604; G. Chalepakis , R. Fritsch, H. Fickenscher, 0. Deutsch, M. Goulding, P. Gruss, Cell 66 (1991), 873-884) and has been found in various organisms such as Drosophila, Maus, Turtle, zebrafish, nematodes and humans identified. A connection between the "paired" domain and oncogenesis was previously unknown.
  • the object of the present invention was to provide a new agent which is particularly suitable for the diagnosis and therapy of tumors.
  • the object according to the invention is achieved by a method for producing an agent for tumor diagnosis and / or tumor therapy, which is characterized in that an active substance which
  • (c) contains at least one antibody against a Pax protein or a derivative thereof, optionally formulated with standard pharmaceutical excipients, auxiliaries and diluents.
  • Pax proteins ie proteins which contain the "paired" domain
  • Pax proteins can promote oncogenesis and can thus be classified as a new group of strong oncoproteins which promote cell proliferation, anchorage-independent growth and Induce angiogenesis. It was found that cells transformed with Pax genes showed all classic malignancy features, such as contact inhibition in the "focus assay", growth in soft agar and tumor induction in the nude mouse.
  • the therapeutic or diagnostic agent according to the invention can thus be used as a molecular probe in tumor diagnostics, since the use of a nucleic acid which hybridizes with a nucleotide sequence coding for a Pax protein has a qualitative and quantitative, cell and tissue-specific Determination of the expression of the respective Pax gene enables.
  • the agent according to the invention is also suitable as an antisense nucleic acid for the specific inhibition of the expression of genes which contain the Pax sequence, and thus also as a therapeutic agent.
  • an agent according to the invention must contain at least one nucleic acid which binds to a Pax gene.
  • the nucleic acid according to the invention preferably hybridizes to a Pax gene under "stringent conditions".
  • Stringent conditions in the sense of the present invention are defined as conditions which enable selective and detectable specific binding of the nucleic acid to a specific one or more Pax genes or Pax transcripts.
  • Such hybridization under stringent conditions preferably means that after hybridization at 68 ° C. in an aqueous solution or at 42 ° C. in 50% form and then washing the filter at 65 ° C. in an aqueous solution Binding of the probe to the Pax gene or the Pax RNA is detectable.
  • the therapeutic or diagnostic agent according to the invention preferably contains at least one nucleus as active substance.
  • small acid which (a) the nucleotide sequence coding for a Pax protein, (b) a part thereof, (c) one which hybridizes with a nucleic acid from (a) or / and (b) under stringent conditions (see above ) Nucleotide sequence or (d) a nucleotide sequence complementary to a nucleic acid from (a), (b) or / and (c).
  • nucleic acid of the invention be from a conserved region of the Pax gene, i.e. from the nucleotide sequence coding for the "paired" domain
  • the agent according to the invention contains at least one nucleic acid which (a) is a "paired" one for amino acids 5 to 19, 35 to 41, 68 to 74, 95 to 100 or / and 115 to 120 -Domain coding nucleotide sequence, (b) a part thereof, (c) a nucleotide sequence hybridizing with a nucleic acid from (a) or / and (b) under stringent conditions, or (d) a nucleic acid from (a), ( b) or / and (c) comprises complementary nucleotide sequence.
  • nucleic acid with a nucleotide sequence from a non-conserved area of the respective gene, ie preferably from the area not coding for the "paired" domain.
  • the agent according to the invention contains a nucleic acid that comes from any Pax gene.
  • suitable Pax genes are Pax-1 (Deutsch et al., Cell 53 (1988), 617-625), Pax-2 (Dressler et al., Development 109 (1990), 787-795; Nornes et al. , Development 109 (1990), 797-809), Pax-3 (Goulding et al., EMBO J. 10 (1991), 1135-1147), Pax-4, Pax-5 and Pax-6 (Walther et al.
  • Pax-7 Jostes et al., MOD 33 (1990), 27-38
  • Pax-8 Plachov et al., Development 110 (1990), 643-651
  • HuPl HuP2, HuP48
  • prd BSH4 and BSH9
  • Bopp et al., Cell 47 (1986), 1033-1040 Pox neuro and Pox meso
  • the nucleic acid in the agent according to the invention is - depending on the requirement - preferably an unmodified or modified DNA or RNA.
  • the length of the nucleic acid also depends on the respective area of application.
  • the agent according to the invention is used as a molecular probe in tumor diagnosis, it is preferably a DNA probe with a length of 10 to 100 nucleotides, preferably 12 to 50 nucleotides. Furthermore, it is preferred that the nucleic acid carries a radioactive or non-radioactive label which serves to detect the binding to a Pax gene.
  • the agent according to the invention is used as an antisense nucleic acid to inhibit gene expression, it is preferably an RNA which may contain modified bases in order to increase its stability in the body against degradation by ribonucleases.
  • the agent according to the invention is used as a molecular probe and / or as a therapeutic agent for inhibiting gene expression in a manner known to those skilled in the field of molecular biology.
  • the invention further relates to a therapeutic or diagnostic agent, which is characterized in that it contains at least one Pax protein as active substance.
  • the Pax protein is preferably from the group consisting of Pax-1, Pax-2, Pax-3, Pax-4, Pax-5, Pax-6, Pax-7, Pax-8, HuPl, HuP2, HuP48, prd, BSH4, BSH9, Pox neuro and Pox meso selected.
  • the amino acid sequence of these proteins can be seen from the publications mentioned above, which have been mentioned in connection with the nucleic acid sequence. Human Pax proteins are particularly preferred.
  • the agent is preferably used in tumor diagnostics and / or tumor therapy.
  • Yet another object of the present invention is a therapeutic or diagnostic agent, which is characterized in that it contains at least one antibody against a Pax protein as the active substance.
  • Antibodies against one or more Pax proteins from the group consisting of Pax-1, Pax-2, Pax-3, Pax-4, Pax-5, Pax-6, Pax-7, Pax-8, HuPl are preferred , HuP2, HuP48, prd, BSH4, BSH9, Pox neuro and Pox meso.
  • Antibodies against human Pax proteins are particularly preferred.
  • the antibodies according to the invention are preferably monoclonal antibodies which are known in a known manner according to the Köhler-Millstein method by immunizing a test animal, preferably a mouse, with the corresponding Pax protein and / or a mixture of Pax proteins, obtaining anti- body-producing B cells or spleen cells from the immunized experimental animal and subsequent fusion of the antibody-producing cells with a suitable leukemia cell for the production of hybridomas are available.
  • suitable antibodies are Pax-1, Pax-2 and Pax-6 antibodies (Fig. 2).
  • the antibodies according to the invention can preferably be used in vitro or / and in vivo as agents in tumor diagnosis and / or tumor therapy.
  • the antibodies can also be used as fragments (eg Fab or F (ab) 2 fragments) and, if appropriate, coupled to a detectable group (enzyme, fluorescent marker, radioactive marker, nuclear magnetic resonance marker etc.) or to a toxin (eg ricin, diphtheria toxin etc. ) be used.
  • a detectable group enzyme, fluorescent marker, radioactive marker, nuclear magnetic resonance marker etc.
  • a toxin eg ricin, diphtheria toxin etc.
  • Antibody derivatives of this type are produced in a manner known to a person skilled in the field of immunology (for example by covalent coupling via a bi-functional linker).
  • Fig. 1 shows the schematic structure of the examined Pax proteins Pax-1, Pax-2, Pax-3, Pax-6 and Pax-8 as well as the mutated Pax protein Un.
  • Fig. 2 shows Western blots of cell extracts expressing Pax protein after incubation with specific antibodies and enzymatic detection of the antibody-protein binding.
  • FIG. 1 shows the schematic structure of these Pax proteins. The conserved domains within the proteins are shown as bars that also indicate their approximate positions within the open reading frames.
  • Pax-1 is the only Pax protein known to have a complete lack of homeodomain.
  • Pax-3 and Pax-6 contain complete homeodomains in addition to the "paired" domain. Both DNA binding motifs are separated from one another by at least 100 amino acids.
  • the proteins Pax-2 and Pax-8 contain only 23 amino acids of the ⁇ -helix of the homeodomain.
  • the point mutation from G to A in the gene coding for the Un protein is characterized by the resulting exchange of Gly for Ser.
  • the nucleotide and amino acid sequences are for Pax-1 in Deutsch et al. (Cell 53 (1988), 617-625) for Pax-2 by Dressler et al. (Development 109 (1990), 787-795), for Pax-3 in Goulding et al. (EMBO J. 10 (1991), 1135-1147), for Pax-6 by Walther and Gruss (Development 113 (1991), 1435-1439) and for Pax-8 by Plachov et al. (Development 110 (1990), 643-651).
  • the Pax cDNAs were inserted into the multiple cloning site of the vector pCMV5 (Anderson et al., J. Biol. Chem. 264 (1989), 8222-8229). These constructs were co-transfected with pGKneo as a selectable marker (Soriano et al., Cell 64 (1991), 693-702) in 208 and NIH 3T3 cells.
  • the 208 cells were cultivated in DMEM (Biochrome) and the addition of 10% fetal calf serum (Boehringer Mannheim).
  • the NIH 3T3 cells were cultured in DMEM with 5% newborn calf serum (Boehringer Mannheim).
  • Another third of the cells were seeded in either 0.6%, 0.9% or 1.2% soft agar, as described in Fidler et al., Anticancer Res. 11 (1991), 17-24. The remaining third was selected for DNA uptake by adding G418 (Gibco) for the cells 24 hours after the shock. 0.4 mg / 1 was added to the 208 cells and 0.6 mg / ml G418 to the NIH 3T3 cells. The morphologically transformed foci were picked and then cultivated. These cell isolates were grown by continuous incubation in the selection medium and used for the expression analysis and the transformation tests.
  • Table 1 shows the results of transforming 208 cells with Pax proteins.
  • the left column lists the DNAs that have been introduced into the cells.
  • pCMV means cells which only contain the pCMV construct as a negative control
  • pSV is the T antigen (SV40 virus) expression construct used as a positive control.
  • the different pCMV-Pax expression constructs are by the Name of the Pax protein they express.
  • the growth of the cells was tested in 0.6%, 0.9% and 1.2% soft agar.
  • the cell colonies were counted 2 to 3 weeks after plating. The experiments were carried out at least twice for each cell type.
  • + means growth in soft agar.
  • - means no growth.
  • + - means conflicting results in two experiments.
  • the last column shows the number of nude mice injected and the number of injections which led to tumor formation.
  • Male naked NMRI mice were injected subcutaneously in the flank at the age of 4 weeks with 1 to 5 ⁇ 10 5 transformed cells. The cells were trypsinized before the injection and washed twice with phosphate-buffered saline in order to exclude stimulating effects from the serum. The animals were examined for the formation of tumors on a weekly basis for a maximum of 3 months.
  • Transfected soft agar test Focus tumorigenicity DNA test Number of injections / number of tumors in nude mice
  • Table 1 show the oncogenic potential of the Pax genes or the "paired" domain.
  • the growth of the increasing soft agar concentrations can be related to the probability of the occurrence of tumors.
  • Cells which only contained the pCMV expression vector showed no growth in 0.6% soft agar and more.
  • Cells expressing the Pax-1, Pax-2, Pax-3, Pax-6 and Pax-8 protein were able to grow at concentrations up to 1.2% soft agar.
  • a growth in this semi-solid medium shows that the Pax proteins give the cells the ability for anchoring-independent growth.
  • the mutated Un protein was unable to completely transform these cells, as was the case due to the absence of anchorage-independent growth at higher soft agar concentrations.
  • the tumors generated by injection of pCMV-Pax expression constructs were analyzed by standard in situ hybridization protocols (Goulding, EMBO J. 10 (1991), 1135-1147).
  • the cells in the Pax tumors are spindle-shaped.
  • the tumors are well supplied with vessels and show a strong extracellular matrix production. All tumors were solid and encapsulated.
  • a methylene blue test was also performed to determine the ability of the cells to overcome contact inhibition. This test was carried out twice in untreated cells after trans ection. Cells which have taken up the transforming DNA are able to overgrow non-transformed cells, which results in darkly marked cell foci. As in the positive control with pSV, the formation of cell foci was observed in the cells transformed with Pax genes, while in the cells transformed with the negative control pCMV and in the non-transformed cells (208 and NIH 3T3 cells ) significantly fewer foci were visible.
  • Another cell extract which had been produced by transfecting cells with a pSV40 promoter / Pax-1 construct, contained even higher amounts of the Pax protein. In all cases, the Western blots showed that control cells transfected with pCMV produced much less or no detectable amounts of protein.

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Abstract

Ein erfindungsgemäßes therapeutisches oder diagnostisches Mittel enthält als Wirksubstanz mindestens eine Nukleinsäure, die mit einem Pax-Gen hybridisiert, oder mindestens ein Pax-Protein, oder mindestens einen Antikörper gegen ein Pax-Protein oder ein Derivat davon. Die erfindungsgemäßen Mittel finden Verwendung in der Tumordiagnostik oder/und Tumortherapie sowie als Antisense-Nukleinsäure zur Hemmung der Genexpression.

Description

Neue Sonde zur Tumordiagnostik oder Tumortherapie
BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues therapeutisches oder diagnostisches Mittel, das als Wirksubstanz mindestens eine Nukleinsäure enthält, und insbesondere zur Diagnose oder/und Therapie von Tumoren geeignet ist.
Proteine, die eine Homöobox enthalten, spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von vielzelligem diffenziertem Gewebe. Man nimmt an, daß die transkriptionale Regulation durch die Homöoboxproteine die genaue räumliche und zeitliche Abfolge von Wachstum und Differenzierung in dem sich ent¬ wickelnden Embryo koordiniert. Aus der Literatur (sie z.B. K. Kongsuwan, J.M. Adams, Nucleic Acids Res. 17 (1989), 1881- 1891; C. Blatt, D. Aberdam, R. Schwartz, L. Sachs, EMBO J. 7 (1988), 4283-4290; C. Blatt, Cancer Cells 2 (1990), 186-189; T.H. Rabbitts Cell 647 (1991), 641-644; A.W. Sasaki, J. Doskow, C.L. Macleod, M.B. Rodgers, L.J. Goudas, M.F. Wilkinson, MOD34 (1991), 155-164) ist bekannt, daß einige Homöobox-enthaltende Gene mit der Onkogenese in Zusammenhang stehen.
Eine Multigenfamilie, die ein gemeinsames konserviertes Se¬ quenzmotiv, die "Paired"-Box aufweist, steht ebenfalls mit der Entwicklungskontrolle und der Gewebespezifität in ver¬ schiedenen Organismen im Zusammenhang. Die von der "Paired"- Box kodierte "Paired"-Domäne stellt eine DNA-bindende Domäne dar (J. Treisman, E. Harris, C. Desplan, Genes.Dev. 5 (1991), 594-604; G. Chalepakis, R. Fritsch, H. Fickenscher, 0. Deutsch, M. Goulding, P. Gruss, Cell 66 (1991), 873-884) und wurde in verschiedenen Organismen, wie etwa Drosophila, Maus, Schildkröte, Zebrafisch, Nematoden und Menschen identifi¬ ziert. Ein Zusammenhang der "Paired"-Domäne mit der Onkogene- se war bisher nicht bekannt.
In der medizinischen Forschung werden große Anstrengungen auf die Bereitstellung neuer therapeutischer und diagnostischer Mittel im Zusammenhang mit der Entstehung von Tumoren unter¬ nommen. Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Bereit¬ stellung eines neuen Mittels, das insbesondere zur Diagnose und Therapie von Tumoren geeignet ist.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Herstellung eines Mittels zur Tumordiagnostik oder/und Tumor¬ therapie gelöst, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Wirksubstanz, die
(a) mindestens eine Nukleinsäure, die mit einem Pax-Gen hybridisiert,
(b) mindestens ein Pax-Protein, oder/und
(c) mindestens einen Antikörper gegen ein Pax-Protein oder ein Derivat davon enthält, gegebenenfalls mit pharmazeutisch üblichen Träger-, Hilfs- und Verdünnungsmitteln formuliert.
Überraschenderweise wurde festgestellt, daß Pax-Proteine, d.h. Proteine, welche die "Paired"-Domäne enthalten, die Onkogenese fördern können und somit als neue Gruppe von star¬ ken Onkoproteinen klassifiziert werden können, welche die Zellproliferation, das Verankerungs-unabhängige Wachstum und die Angiogenese induzieren. Es wurde festgestellt, daß mit Pax-Genen transformierte Zellen alle klassischen Malignitäts- erkmale, wie z.B. Kontaktinhibierung im "Focusassay", Wachs¬ tum in Weichagar und Tumorinduzierung in der Nacktmaus zeigten. Das erfindungsgemäße therapeutische oder diagnostische Mittel kann somit als molekulare Sonde in der Tumordiagnostik einge¬ setzt werden, da die Verwendung einer Nukleinsäure, die mit einer für ein Pax-Protein kodierenden Nukleotidsequenz hybri¬ disiert, eine qualitative und quantitative, zell- und gewebs- spezifische Bestimmung der Expression des jeweiligen Pax-Gens ermöglicht.
Das erfindungsgemäße Mittel ist jedoch auch als Antisense- Nukleinsäure zur spezifischen Hemmung der Expression von Genen, welche die Pax-Sequenz enthalten, und somit auch als therapeutisches Mittel geeignet.
Ein erfindungsgemäßes Mittel muß zum diagnostischen Nachweis oder/und zur therapeutischen Behandlung mindestens eine Nu¬ kleinsäure enthalten, welche eine Bindung mit einem Pax-Gen eingeht. Vorzugsweise hybridisiert die erfindungsgemäße Nu¬ kleinsäure unter "stringenten Bedingungen" an ein Pax-Gen. Stringente Bedingungen im Sinne der vorliegenden Erfindung sind als solche Bedingungen definiert, die eine selektive und nachweisbare spezifische Bindung der Nukleinsäure an ein be¬ stimmtes oder mehrere Pax-Gene oder Pax-Transkripte ermögli¬ chen. Eine derartige Hybridisierung unter stringenten Bedin¬ gungen bedeutet vorzugsweise, daß nach einer Hybridisierung bei 68°C in einer wäßrigen Lösung oder bei 42°C in 50 % Form- a id und anschließendem Waschen des Filters bei 65°C in einer wäßrigen Lösung noch eine Bindung der Sonde an das Pax-Gen oder die Pax-RNA nachweisbar ist. Bei Verwendung von kürzeren Nukleinsäuren als Sonden kann es jedoch erforderlich sein, weniger drastische Hybridisierungs- oder/und Waschbedingungen zu verwenden.
Das erfindungsgemäße therapeutische oder diagnostische Mittel enthält vorzugsweise als Wirksubstanz mindestens eine Nu- kleinsäure, die (a) die für ein Pax-Protein kodierende Nu¬ kleotidsequenz, (b) einen Teil davon, (c) eine mit einer Nukleinsäure aus (a) oder/und (b) unter stringenten Bedin¬ gungen hybridisierende (siehe oben) Nukleotidsequenz oder (d) eine zu einer Nukleinsäure aus (a), (b) oder/und (c) komple¬ mentäre Nukleotidsequenz umfaßt.
Wenn gewünscht wird, daß die erfindungsgemäße Nukleinsäure aus einem konservierten Bereich des Pax-Gens, d.h. aus der für die "Paired"-Domäne kodierenden Nukleotidsequenz stammen soll, verwendet man vorzugsweise eine Nukleinsäure, die (a) eine für die Aminosäuren 1 bis 74 einer "Paired"-Domäne ko¬ dierende Nukleotidsequenz, (b) einen Teil davon, (c) eine mit einer Nukleinsäure aus (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleotidsequenz oder (d) eine zu einer Nukleinsäure aus (a), (b) oder/und (c) komplementäre Nukleotidsequenz umfaßt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform für den obigen Zweck enthält das erfindungsgemäße Mittel mindestens eine Nukleinsäure, die (a) eine für die Aminosäuren 5 bis 19, 35 bis 41, 68 bis 74, 95 bis 100 oder/und 115 bis 120 einer "Paired"-Domäne kodierende Nukleotidsequenz, (b) einen Teil davon, (c) eine mit einer Nukleinsäure aus (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleotidse¬ quenz oder (d) eine zu einer Nukleinsäure aus (a) , (b) oder/und (c) komplementäre Nukleotidsequenz umfaßt.
Die voranstehend genannte Nomenklatur der Aminosäuren richtet sich dabei nach der Arbeit Walther et al., Genomics 11 (1991), 424-434, insbesondere Figur 2, die hiermit durch Bezugnahme zu einem Teil der Beschreibung wird.
Wenn es jedoch erforderlich ist, ein einziges Pax-Gen spezi¬ fisch nachzuweisen oder zu hemmen, wird man zweckmäßigerweise eine Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz aus einem nicht- konservierten Bereich des jeweiligen Gens verwenden, d.h. vorzugsweise aus dem nicht für die "Paired"-Domäne kodieren¬ den Bereich.
Das erfindungsgemäße Mittel enthält eine Nukleinsäure, die aus einem beliebigen Pax-Gen stammt. Beispiele für geeignete Pax-Gene sind Pax-1 (Deutsch et al., Cell 53 (1988), 617- 625), Pax-2 (Dressler et al., Development 109 (1990), 787- 795; Nornes et al., Development 109 (1990), 797-809), Pax-3 (Goulding et al., EMBO J. 10 (1991), 1135-1147), Pax-4, Pax-5 und Pax-6 (Walther et al. (1991), supra), Pax-7 (Jostes et al., MOD 33 (1990), 27-38), Pax-8 (Plachov et al., Develop¬ ment 110 (1990), 643-651), HuPl, HuP2, HuP48 (Burri et al., EMBO J. 8 (1989), 1183-1190), prd, BSH4 und BSH9 (Bopp et al., Cell 47 (1986), 1033-1040) und Pox neuro und Pox meso (Bopp et al., EMBO J. 8 (1989), 3447-3457). Die oben genann¬ ten Literaturstellen werden durch Bezugnahme zu einem Teil der Beschreibung. Besonders bevorzugt sind menschliche Pax- Gene.
Die Nukleinsäure in dem erfindungsgemäßen Mittel ist - je nach Erfordernis - vorzugsweise eine unmodifizierte oder modifizierte DNA oder RNA. Auch die Länge der Nukleinsäure richtet sich nach dem jeweiligen Anwendungsgebiet.
Bei Verwendung des erfindungsgemäßen Mittels als molekulare Sonde in der Tumordiagnostik handelt es sich vorzugsweise um eine DNA-Sonde mit einer Länge von 10 bis 100 Nukleotiden, vorzugsweise 12 bis 50 Nukleotiden. Weiterhin ist es bevor¬ zugt, daß die Nukleinsäure eine radioaktive oder nicht-radio¬ aktive Markierung trägt, die zum Nachweis der Bindung an ein Pax-Gen dient. Bei Verwendung des erfindungsgemäßen Mittels als Antisense- Nukleinsäure zur Hemmung der Genexpression handelt es sich vorzugsweise um eine RNA, die gegebenenfalls modifizierte Basen enthalten kann, um ihre Stabilität im Körper gegenüber einem Abbau durch Ribonukleasen zu erhöhen.
Die Anwendung des erfindungsgemäßen Mittels als molekulare Sonde oder/und als therapeutisches Mittel zur Hemmung der Genexpression erfolgt auf eine dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannte Weise.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein therapeutisches oder diagnostisches Mittel, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es als Wirksubstanz mindestens ein Pax-Protein enthält. Das Pax-Protein ist vorzugsweise aus der Gruppe, bestehend aus Pax-1, Pax-2, Pax-3, Pax-4, Pax-5, Pax-6, Pax-7, Pax-8, HuPl, HuP2, HuP48, prd, BSH4, BSH9, Pox neuro und Pox meso ausgewählt. Die Aminosäuresequenz dieser Proteine ist aus den oben genannten Veröffentlichungen ersichtlich, die in Zu¬ sammenhang mit der Nukleinsäuresequenz genannt worden sind. Besonders bevorzugt sind menschliche Pax-Proteine.
Das Mittel wird vorzugsweise in der Tumordiagnostik oder/und Tumortherapie verwendet.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein therapeutisches oder diagnostisches Mittel, welches da¬ durch gekennzeichnet ist, daß es als Wirksubstanz mindestens einen Antikörper gegen ein Pax-Protein enthält. Bevorzugt sind Antikörper, die gegen ein oder mehrere Pax-Proteine aus der Gruppe bestehend aus Pax-1, Pax-2, Pax-3, Pax-4, Pax-5, Pax-6, Pax-7, Pax-8, HuPl, HuP2, HuP48, prd, BSH4, BSH9, Pox neuro und Pox meso gerichtet sind. Besonders bevorzugt sind Antikörper gegen menschliche Pax-Proteine. Die erfindungsgemäßen Antikörper sind vorzugsweise monoklo- nale Antikörper, die auf bekannte Weise nach der Köhler- Millstein-Methode durch Immunisierung eines Versuchstieres, vorzugsweise einer Maus, mit dem entsprechenden Pax-Protein oder/und einem Gemisch von Pax-Proteinen, Gewinnung von Anti- körper-produzierenden B-Zellen oder Milzzellen aus dem immu¬ nisierten Versuchstier und anschließender Fusionierung der Antikörper-produzierenden Zellen mit einer geeigneten Leukä¬ miezelle zur Erzeugung von Hybridomen erhältlich sind. Beispiele für geeignete Antikörper sind Pax-1, Pax-2- und Pax-6-Antikörper (Abb.2).
Die erfindungsgemäßen Antikörper können vorzugsweise in vitro oder/und in vivo als Mittel in der Tumordiagnostik oder/und Tumortherapie verwendet werden. Dabei können die Antikörper auch als Fragmente (z.B. Fab oder F(ab)2 Fragmente) und gege¬ benenfalls gekoppelt an eine nachweisbare Gruppe (Enzym, Fluoreszenzmarker, radioaktiver Marker, Kernresonanzmarker etc.) oder an ein Toxin (z.B. Rizin, Diphterietoxin etc.) verwendet werden. Die Herstellung derartiger Antikörper-Deri¬ vate erfolgt auf eine dem Fachmann auf dem Gebiet der Immuno¬ logie bekannte Weise (z.B. durch kovalente Kopplung über einen bi-funktionellen Linker).
Das folgende Beispiel dient in Verbindung mit Abb. 1 und 2 zur weiteren Veranschaulichung der Erfindung.
Abb. 1 zeigt den schematischen Aufbau der untersuchten Pax- Proteine Pax-1, Pax-2, Pax-3, Pax-6 und Pax-8 sowie des muta- genisierten Pax-Proteins Un.
Abb. 2 zeigt Westernblots von Pax-Protein exprimierenden Zellextrakten nach Inkubation mit spezifischen Antikörpern und enzymatischem Nachweis der Antikörper-Protein-Bindung. Beispiel
1. Untersuchte Pax-Proteine
Es wurde die Wirkung der Proteine Pax-1, Pax-2, Pax-3, Pax-6 und Pax-8 sowie einem mutagenisierten Pax-Protein (Un) unter¬ sucht. In Abbildung 1 ist die schematische Struktur dieser Pax-Proteine gezeigt. Die konservierten Domänen innerhalb der Proteine sind als Balken gezeigt, die auch ihre annähernden Positionen innerhalb der offenen Leserahmen angeben. Pax-1 ist das einzige Pax-Protein, von dem ein vollständiges Fehlen der Homöodomäne bekannt ist. Pax-3 und Pax-6 enthalten voll¬ ständige Homöodomänen zusätzlich zur "Paired"-Domäne. Beide DNA-Bindungsmotive sind durch mindestens 100 Aminosäuren voneinander getrennt. Die Proteine Pax-2 und Pax-8 enthalten nur 23 Aminosäuren der α-Helix der Homöodomäne. Die Punktmu¬ tation von G zu A in dem für das Un-Protein kodierenden Gen ist durch den resultierenden Austausch von Gly nach Ser ge¬ kennzeichnet. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen sind für Pax-1 bei Deutsch et al. (Cell 53 (1988), 617-625), für Pax-2 bei Dressler et al. (Development 109 (1990), 787-795), für Pax-3 bei Goulding et al. (EMBO J. 10 (1991), 1135-1147), für Pax-6 bei Walther und Gruss (Development 113 (1991), 1435- 1439) und für Pax-8 bei Plachov et al. (Development 110 (1990), 643-651) offenbart.
2. Transformationstest
Die Pax-cDNAs wurden in die multiple Klonierungsstelle des Vektors pCMV5 (Anderson et al., J.Biol.Chem. 264 (1989), 8222-8229) insertiert. Diese Konstrukte wurden zusammen mit pGKneo als selektierbarer Marker (Soriano et al., Cell 64 (1991), 693-702) in 208- und NIH 3T3-Zellen kotransfiziert. Die 208-Zellen wurden in DMEM (Biochrome) und Zusatz von 10 % fötalem Kälberserum (Boehringer Mannheim) kultiviert. Die NIH 3T3-Zellen wurden in DMEM mit 5 % neugeborenem Kälberserum (Boehringer Mannheim) kultiviert. 2 μg des jeweiligen pCMV- Pax-Expressionsplasmids wurden zusammen mit 1 μg pGKneo und 7 μg Träger-DNA auf 70 % konfluenten Einzelzellschichten einer 100 mm Gewebekulturplatte unter Verwendung der Calciumphos- phatmethode mit Modifikationen (Weber und Schaffner, Nature 315 (1984), 75-77) transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden nach 24 Stunden in drei Gruppen aufgeteilt. Eine Grup¬ pe wurde für 2 bis 4 Wochen abhängig vom Anfang der Focusbil- dung stehengelassen. Danach wurden die Zellen mit einigen Tropfen Glutaraldehyd (Sig a) und mit 1 % Methylenblau (Sig- ma) in Wasser angefärbt. Die Gewebekulturplaten wurden mit Wasser gespült und die Foci gezählt.
Ein weiteres Drittel der Zellen wurde entweder in 0,6 %, 0,9 % oder 1,2 % Weichagar ausgesät, wie bei Fidler et al., Anti- cancer Res. 11 (1991), 17-24 beschrieben ist. Das verbleiben¬ de Drittel wurde zur DNA-Aufnähme durch Zugabe von G418 (Gibco) 24 Stunden nach dem Schock für die Zellen ausgewählt. Bei den 208-Zellen wurden 0,4 mg/1 und bei den NIH 3T3-Zellen 0,6 mg/ml G418 zugesetzt. Die morphologisch transformierten Foci wurden gepickt und danach kultiviert. Diese Zellisolate wurden durch kontinuierliche Inkubation im Selektionsmedium vermehrt und für die Expressionsanalyse und die Transforma- tionstests verwendet.
3. Ergebnisse der Transformationstests
In Tabelle 1 sind die Ergebnisse einer Transformation von 208-Zellen mit Pax-Proteinen gezeigt. Die linke Spalte listet die DNAs auf, die in die Zellen eingeführt wurden. pCMV be¬ deutet Zellen, die nur das pCMV-Konstrukt als negative Kon¬ trolle enthalten, pSV ist das als positive Kontrolle verwen¬ dete T-Antigen (SV40-Virus) Expressionskonstrukt. Die ver¬ schiedenen pCMV-Pax-Expressionskonstrukte sind durch den Namen des Pax-Proteins angegeben, das sie exprimieren. Das Wachstum der Zellen wurde in 0,6 %, 0,9 % und 1,2 % Weichagar getestet. Die Zellkolonien wurden 2 bis 3 Wochen nach dem Plattieren gezählt. Die Experimente wurden für jeden Zelltyp mindestens 2 mal durchgeführt. + bedeutet Wachstum in Weich¬ agar. - bedeutet kein Wachstum. +- bedeutet widersprechende Ergebnisse in zwei Experimenten.
Die nächste Spalte listet auf, ob die entsprechenden trans¬ formierten Zellen in der Lage waren, bei Vermischen mit nor¬ malen 208-Zellen eine Focusbildung zu induzieren oder nicht. Dieses Mischexperiment wurde 2 mal ausgeführt.
Die letzte Spalte zeigt die Anzahl von injizierten Nacktmäu¬ sen und die Anzahl von Injektionen, die zu einer Tumorbildung führten. Männliche nackte NMRI Mäuse wurden hierzu subkutan in der Flanke im Alter von 4 Wochen mit 1 bis 5 x 105 trans¬ formierten Zellen injiziert. Die Zellen wurden vor der Injek¬ tion trypsinisiert und 2 x mit Phosphat-gepufferter Salzlö¬ sung gewaschen, um stimulierende Effekte aus dem Serum auszu¬ schließen. Die Tiere wurden für maximal 3 Monate auf einer wöchentlichen Basis auf die Bildung von Tumoren untersucht.
Tabelle 1
Transfizierte Weichagar-Test Focus- Tumorigenizität DNA test Anzahl von Injektio¬ nen/Anzahl von Tumo¬ ren in Nacktmäusen
0,6% 0,9% 1,2%
Figure imgf000013_0001
Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen das onkogene Potential der Pax-Gene bzw. der "Paired"-Domäne. Bei dem Test, der die unterschiedlichen Pax-Proteine exprimierenden Klone in Weich¬ agar mit unterschiedlichen Konzentrationen zeigt, kann das Wachstum der ansteigenden Weichagarkonzentrationen mit der Wahrscheinlichkeit des Auftretens von Tumoren in Beziehung gesetzt werden. Zellen, die nur den pCMV-Expressionsvektor enthielten, zeigten bei 0,6 % Weichagar und mehr kein Wachs¬ tum. Zellen, die das Pax-1-, Pax-2-, Pax-3-, Pax-6- bzw. Pax- 8-Protein exprimierten, konnten hingegen bei Konzentrationen bis zu 1,2 % Weichagar wachsen. Ein Wachstum in diesem halb¬ festen Medium zeigt, daß die Pax-Proteine den Zellen die Fähigkeit zum Verankerungs-unabhängigen Wachstum verleihen. Das mutierte Un-Protein war zu einer vollständigen Transfor¬ mation dieser Zellen nicht in der Lage, wie durch das Fehlen von Verankerungs-unabhängigem Wachstum bei höheren Weichagar- Konzentrationen ersichtlich ist.
Die durch Injektion von pCMV-Pax-Expressionskonstrukten er¬ zeugten Tumore wurden durch Standard in situ Hybridisierungs- protokolle (Goulding, EMBO J. 10 (1991), 1135-1147) analy¬ siert. Die Zellen in den Pax-Tumoren sind spindelförmig. Die Tumore sind gut mit Gefäßen versorgt und zeigen eine starke extrazelluläre Matrixproduktion. Alle Tumore waren fest und verkapselt.
Weiterhin wurde ein Methylenblau-Test durchgeführt, um die Fähigkeit der Zellen zur Überwindung der Kontakthemmung zu bestimmen. Dieser Test wurde 2 mal in unbehandelten Zellen nach Trans ektion durchgeführt. Zellen, welche die transfor¬ mierende DNA aufgenommen haben, sind in der Lage, nicht transformierte Zellen zu überwachsen, was in dunkel markier¬ ten Zellfoci resultiert. In den mit Pax-Genen transformierten Zellen wurden - wie in der positiven Kontrolle mit pSV - die Bildung von Zellfoci beobachtet, während in den mit der nega¬ tiven Kontrolle pCMV transformierten Zellen und in den nicht transformierten Zellen (208- und NIH 3T3-Zellen) deutlich weniger Foci sichtbar waren.
Die Ergebnisse des Weichagar-Tests stehen mit dem Auftreten von stark gefärbten Foci im Methylenblau-Test bei 208- und NIH 3T3-Zelltransfektionen unter Verwendung von Pax-Protei- nen, die funktionelle "Paired"-Domänen enthalten, und der Tumorentstehung in der Nacktmaus im Einklang. 4. Immunologischer Nachweis der Pax-Expression in transfi- zierten Zellen
Aus den nach Punkt 2 transfizierten NIH 3T3- und 208-Zellen wurden nach bekannten Protokollen (Balling et al., Cell 55, (1988), 531-535) Gesamtzellextrakte hergestellt. Nach Be¬ stimmung der Proteinkonzentration wurden jeweils 50 μg der Zellextrakte auf einem 12,5 % SDS-Polyacrylamidgel aufge¬ trennt und auf eine Immobilon-P-Membran durch halbtrockenen elektrischen Transfer überführt. Die Membran wurde in 5 % Trockenmilchpulver/phosphatgepufferter Salzlösung blockiert und über Nacht mit einer 1:200-Verdünnung der jeweiligen Pax- Antikörper inkubiert und mit der Peroxidase/Diaminobenzidin- Reaktion entwickelt (Balling et al., Supra) . Aus Abb. 2 ist ersichtlich, daß Antikörper gegen Pax-1, Pax-2, Pax-3 und Pax-6 eine Reaktion mit den entsprechenden transfizierten Zellen zeigten. Der Pax-2-Antikörper zeigte eine Kreuzreak¬ tion mit Pax-8 und ermöglichte eine Bestätigung der Pax-8- Expression mit den jeweiligen Zellextrakten (nicht darge¬ stellt) . Das Molekulargewicht der Pax-Proteine wurde durch Vergleich mit dem Regenbogen-Proteinmarker (Amersham) be¬ stimmt. Das scheinbare Molekulargewicht der Proteine ist in kD angegeben. Sowohl 208- als auch NIH 3T3-Zellextrakte ent¬ hielten etwa ähnliche Mengen der jeweiligen Pax-Proteine pro 50 μg Zellextrakt. Dies zeigt an, daß der CMV-Promotor in beiden Zellinien gleichermaßen gut funktioniert. Der Western- blot von Pax-1 zeigt, daß Pax-1 und das mutierte Un-Protein in etwa gleichen Mengen exprimiert werden. Ein weiterer Zell¬ extrakt, der durch Transfektion von Zellen mit einem pSV40 Promotor/Pax-1-Konstrukt hergestellt worden war, enthielt noch höhere Mengen des Pax-Proteins. In allen Fällen zeigten die Westernblots, daß mit pCMV transfizierte Kontrollzellen sehr viel weniger oder keine nachweisbaren Mengen an Protein erzeugten.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung eines Mittels zur Tumordiagno¬ stik oder/und Tumortherapie, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man eine Wirksubstanz, die
(a) mindestens eine Nukleinsäure, die mit einem Pax-Gen hybridisiert,
(b) mindestens ein Pax-Protein, oder/und
(c) mindestens einen Antikörper gegen ein Pax-Protein oder ein Derivat davon enthält, gegebenenfalls mit pharmazeutisch üblichen Träger-, Hilfs- und Verdünnungsmitteln formuliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß das Mittel als Wirksubstanz mindestens eine Nuklein¬ säure enthält, die mit einem Pax-Gen hybridisiert.
3. Verfahren nach Anspruch 2, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß das Mittel als Wirksubstanz mindestens eine Nuklein¬ säure enthält, die (a) die für ein Pax-Protein kodieren¬ de Nukleotidsequenz, (b) einen Teil davon, (c) eine mit einer Nukleinsäure aus (a) oder/und (b) unter stringen¬ ten Bedingungen hybridisierende Nukleotidsequenz oder
(d) eine zu einer Nukleinsäure aus (a), (b) oder/und (c) komplementäre Nukleotidsequenz umfaßt.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß das Mittel mindestens eine Nukleinsäure enthält, die (a) eine für die Aminosäuren 1 bis 74 einer "Paired"- Domäne kodierende Nukleotidsequenz, (b) einen Teil da¬ von, (c) eine mit einer Nukleinsäure aus (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nu¬ kleotidsequenz oder (d) eine zu einer Nukleinsäure aus (a), (b) oder/und (c) komplementäre Nukleotidsequenz umfaßt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß das Mittel mindestens eine Nukleinsäure enthält, die (a) eine für die Aminosäuren 5 bis 19, 35 bis 41, 68 bis 74, 95 bis 100 oder/und 115 bis 120 einer "Paired"-Domä¬ ne kodierende Nukleotidsequenz, (b) einen Teil davon,
(c) eine mit einer Nukleinsäure aus (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleotid¬ sequenz oder (d) eine zu einer Nukleinsäure aus (a), (b) oder/und (c) komplementäre Nukleotidsequenz umfaßt.
6. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß das Mittel Nukleotidsequenzen aus dem nicht-konser- vierten Bereich eines Pax-Gens enthält.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß das Mittel mindestens eine Nukleinsäure enthält, die Nukleotidsequenzen eines Pax-Gens, aus der Gruppe der Gene, bestehend aus Pax-1, Pax-2, Pax-3, Pax-4, Pax-5, Pax-6, Pax-7, Pax-8, HuPl, HuP2, HuP48, prd, BSH4 , BSH9, Pox neuro und Pox meso, enthält.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die Nukleinsäure eine DNA ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die Nukleinsäure eine gegebenenfalls modifizierte RNA ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 9 als moleku¬ lare Sonde in der Tumordiagnostik.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 9 als Anti- sense-Nukleinsäure zur Hemmung der Genexpression.
12. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß das Mittel als Wirksubstanz mindestens ein Pax-Pro¬ tein enthält.
13. Verfahren nach Anspruch 12, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß das Mittel mindestens ein Pax-Protein aus der Grup¬ pe, bestehend aus Pax-1, Pax-2, Pax-3, Pax-4, Pax-5, Pax-6, Pax-7, Pax-8, HuPl, HuP2, Hup48, prd, BSH9, Pox neuro und Pox meso, enthält.
14. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß das Mittel als Wirksubstanz mindestens einen Anti¬ körper gegen ein Pax-Protein oder ein Derivat davon enthält.
15. Verfahren nach Anspruch 14, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e , daß der Antikörper gegen ein oder mehrere Pax-Proteine aus der Gruppe, bestehend aus Pax-1, Pax-2, Pax-3, Pax- 4, Pax-5, Pax-6, Pax-7, Pax-8, HuPl, HuP2, Hup48, prd, BSH9, Pox neuro und Pox meso gerichtet ist.
16. Verfahren zur Diagnostik oder/und Therapie von Tumoren, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man eine Wirksubstanz, die
(a) mindestens eine Nukleinsäure, die mit einem Pax-Gen hybridisiert,
(b) mindestens ein Pax-Protein, oder/und
(c) mindestens einen Antikörper gegen ein Pax-Protein oder ein Derivat davon enthält, verwendet.
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998029566A3 (en) * 1996-12-31 1998-09-03 Max Planck Gesellschaft Novel method for testing the differentiation status in pancreatic cells of a mammal
WO2000049175A1 (en) * 1999-02-20 2000-08-24 Imperial College Innovations Limited Diagnosis and treatment of prostate cancer
WO2001046405A3 (en) * 1999-12-22 2002-03-07 Univ Mcgill Modulation of pax-2 for controlled apoptosis or survival of cells
EP1288311A3 (de) * 1996-12-31 2004-09-29 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Methode zum testen von wirkstoffen hinsichtlich der aktivierung von pax4 und der produktion von insulin produzierenden beta-zellen

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6028184A (en) * 1996-12-31 2000-02-22 Max-Plank-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Pax6 and Pax4 nucleic acid mixtures
DE19605105A1 (de) * 1996-02-12 1997-08-14 Gsf Forschungszentrum Umwelt Neue Sonde zur Früherkennung von epithelialen Dysplasien des mehrschichtigen Plattenepithels sowie zur Tumordiagnostik und Tumortherapie von Plattenepithelkarzinomen
GB9811598D0 (en) * 1998-05-30 1998-07-29 Imp College Innovations Ltd Diagnosis and treatment of cancer
US6723506B2 (en) 2000-01-20 2004-04-20 Brigham And Women's Hospital Method of identifying PAX8-PPAR gamma-nucleic acid molecules
CN1320634A (zh) * 2000-04-27 2001-11-07 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人含配对盒结构域的蛋白20和编码这种多肽的多核苷酸
CN1320616A (zh) * 2000-04-27 2001-11-07 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人Pax蛋白17和编码这种多肽的多核苷酸
CN1321681A (zh) * 2000-04-29 2001-11-14 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人Pax蛋白11.3和编码这种多肽的多核苷酸
US7601696B1 (en) 2003-08-22 2009-10-13 University Of South Florida Oct-1 as an oncoprotein and use of nucleic acid inhibitors of Oct-1 for cancer treatment
US8080534B2 (en) 2005-10-14 2011-12-20 Phigenix, Inc Targeting PAX2 for the treatment of breast cancer
KR101088885B1 (ko) * 2008-12-23 2011-12-07 연세대학교 산학협력단 바이오프로브, 그 제조방법, 상기를 사용한 분석 장치 및 분석 방법

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991009974A1 (en) * 1989-12-27 1991-07-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce Diagnostic probe for detecting human stomach cancer
WO1992013949A1 (fr) * 1991-02-08 1992-08-20 Roussel-Uclaf Sequences nucleotidiques codant pour des regions variables de chaines alpha des recepteurs des lymphocytes humains ainsi que leurs applications

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991009974A1 (en) * 1989-12-27 1991-07-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce Diagnostic probe for detecting human stomach cancer
WO1992013949A1 (fr) * 1991-02-08 1992-08-20 Roussel-Uclaf Sequences nucleotidiques codant pour des regions variables de chaines alpha des recepteurs des lymphocytes humains ainsi que leurs applications

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C. WALTHER ET AL.: "PAX: A MURINE MULTIGENE FAMILY OF PAIRED BOX- CONTAINING GENES.", GENOMICS, vol. 11, no. 2, October 1991 (1991-10-01), pages 424 - 434 *
CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 118, no. 13, 29 March 1993, Columbus, Ohio, US; abstract no. 117821q *
DATABASE MEDLINE US NATIONAL LIBRARY OF MEDICINE (NLM), BETHESDA, MD, US; *
G. R. DRESSLER ET AL: "PAX-2 IS A DNA-BINDING PROTEIN EXPRESSED IN EMBRYONIC KIDNEY AND WILMS TUMOR.", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, vol. 89, no. 11, February 1992 (1992-02-01), WASHINGTON US, pages 1179 - 1183 *
J.M. FEATHERSTONE ET AL.: "ISOLATION OF A GENE FROM XENOPUS BOREALIS CONTAING A PAIRED BOX.", BIOCHEM. SOC. TRANS., vol. 20, no. 1, 1992, pages 29S *
MEDLINE AN=92001534, (KARLSRUHE) *
OPSTELTEN DJ. ET AL.: "THE MOUSE HOMEOBOX GENE, S8, IS EXPRESSED DURING EMBRYOGENESIS PREDOMINANTLY IN MESENCHYME.", MECH. DEV., vol. 31, no. 1, March 1991 (1991-03-01), pages 29 - 41, XP027201904 *
S. KRAUSS ET AL.: "ZEBRAFISH PAX {B} IS INVOLVED IN THE FORMATION OF THE MIDBRAIN-HINDBRAIN BOUNDARY.", NATURE, vol. 360, no. 6399, 5 November 1992 (1992-11-05), LONDON GB, pages 87 - 89 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998029566A3 (en) * 1996-12-31 1998-09-03 Max Planck Gesellschaft Novel method for testing the differentiation status in pancreatic cells of a mammal
EP1288311A3 (de) * 1996-12-31 2004-09-29 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Methode zum testen von wirkstoffen hinsichtlich der aktivierung von pax4 und der produktion von insulin produzierenden beta-zellen
WO2000049175A1 (en) * 1999-02-20 2000-08-24 Imperial College Innovations Limited Diagnosis and treatment of prostate cancer
US6841350B2 (en) 1999-02-20 2005-01-11 The North West London Hospitals Nhs Trust Of Northwick Park Hospital Methods of diagnosing prostate cancer through the detection of the presence or absence of Pax 2 mRNA
WO2001046405A3 (en) * 1999-12-22 2002-03-07 Univ Mcgill Modulation of pax-2 for controlled apoptosis or survival of cells

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Publication number Publication date
DE59308082D1 (de) 1998-03-05
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DE4225569A1 (de) 1994-02-10
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