WO1994004261A1 - Utilisation d'une reaction de transacylation entre un polysaccharide esterifie et une substance polyaminee ou polyhydroxylee pour la fabrication de microparticules, microparticules ainsi realisees, procedes et compositions en contenant - Google Patents

Utilisation d'une reaction de transacylation entre un polysaccharide esterifie et une substance polyaminee ou polyhydroxylee pour la fabrication de microparticules, microparticules ainsi realisees, procedes et compositions en contenant Download PDF

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Definitions

  • the present invention essentially relates to the use of a transacylation reaction between an esterified polysaccharide and a polyamine or polyhydroxylated substance for the manufacture of microparticles, microparticles, their methods of manufacture and compositions comprising them. More specifically, the present invention essentially relates to the use of a transacylation reaction between on the one hand a polysaccharide carrying esterified carboxylic groups, and on the other hand either a "polyamine" substance, in particular a protein, or a polyhydroxylated substance, in particular a polysaccharide, for the manufacture of microparticles, in particular microcapsules, the microparticles thus produced, the processes for manufacturing such microparticles, in particular microcapsules, and the compositions containing them, such as compositions cosmetic, pharmaceutical, food, enzymatic, reagent or diagnostic.
  • microparticles in particular biocompatible microcapsules
  • these vesicles can indeed mask an unpleasant taste or odor, increase the stability of the encapsulated substances, prevent their evaporation, and ensure their prolonged release in situ.
  • the microparticles in particular the microcapsules, can also protect the active substance against degradation in the stomach, or protect the gastric mucosa against an irritant effect.
  • microcapsules can be administered by various routes, such as the oral route, application to the skin or mucous membranes, or the parenteral route.
  • proteins and polysaccharides are the most studied.
  • Various processes have thus been described for the preparation of microcapsules from proteins or polysaccharides or combinations of proteins and polysaccharides.
  • Certain methods comprise a first stage of emulsification of the aqueous protein or polysaccharide solution within a hydrophobic phase, followed by a stage of crosslinking using a bi- functional such as acid dichlorides.
  • a bi- functional such as acid dichlorides.
  • existing methods generally consist either of using a heating of the emulsion if the protein is heat denaturable (for example document US 3 137 631 Soloway ), or to incorporate a crosslinking agent in the hydrophobic phase (document US 4,138,362 Vassiliades).
  • complex coacervation methods are well known to those skilled in the art. They are applicable in particular to aqueous solutions of a protein and of a polyanionic substance such as for example a poly ⁇ saccharide carrying carboxylic groups.
  • the substance to be encapsulated is dispersed in the aqueous phase either in the form of a solid or in the form of droplets of an immiscible liquid.
  • the principle is to acidify the aqueous solution so as to bring the pH to a value such that the protein is positively charged and forms with the polyanionic substance an electrically neutral complex, which is deposited on the dispersed phase to be encapsulated.
  • the processes using the bifunctional crosslinking agents have the drawback of requiring repeated washing of the microcapsules obtained, so as to completely eliminate the excess crosslinking agent.
  • the chemical crosslinking reaction causes significant changes in the structure of proteins. For pharmaceutical applications, such alterations are to be avoided since they can be at the origin of the immunogenic properties of the microparticles.
  • enzymatic properties immobilized enzyme
  • oxygen transport properties hemoglobin
  • the complex coacervation processes are limited in their appli ⁇ cations: they can only be applied to the encapsulation of substances insoluble in water or liquids immiscible with water.
  • the wall of the microcapsules does not imply covalent bonds between the protein and the substance polyanionic, a consolidation treatment is necessary, as for example a treatment using a crosslinking agent.
  • the reaction mechanism involves migration of acyls in an alkaline medium in the O to N direction, the amino group causing a nucleophilic substitution of the ester, with release of 1,2-propanediol (Me Ray JE , Stainsby G., Wilso EL, Carbohydr. Polym., 5, 223-236, 1985; Stainsby G., Food Chem., 6, 3-14 1970).
  • This reaction is closely dependent on the pH of the aqueous phase : the system must be alkalized by my In a controlled manner and for a specific time, it takes time for the network formed to be destroyed by hydrolysis of glycosidic linkages of the polysaccharide.
  • the alkaline aqueous phase containing the two compounds in solution sets very quickly in mass if the pH is sufficiently high, making any emulsification in a hydrophobic phase impossible, while a stable film is not formed for the values lower pH. It is therefore necessary to emulsify the neutral aqueous phase containing the two biopolymers, used as the dispersed phase, within a hydrophobic phase, used as the dispersing phase, then initiate the transacylation reaction within the emulsion.
  • GB-A-962483 AGFA describes a reaction (esters of alginic acid), in particular glycol esters with amines such as hexamethylenediamine, proteins for the formation of a photographic layer binding agent. This document does not relate to the technical field of the manufacture of microcapsules which is a technical field totally different from that of photographic layers.
  • document GB-A-763309 Henkel relates to a process for the production of alginic acid amides and in particular gel-forming amides from this acid to produce gelation and surface coating, an application which appears be the essential application of esters or derivatives of alginic acid.
  • Document GB-A-1 135856 relates to a process for modifying alkyl alginates for glycol for the formation of suspending agents, binding agents and adhesives in particular for bonding materials powder or granules, the formation of water resistant surface coatings, elastic jellies (page 2, line 121 to page 3, line 104) or in cosmetics to use this binding capacity. This document therefore also in no way concerns the technical field of the manufacture of microcapsules.
  • the present invention aims to prepare microparticles, preferably microcapsules, stable, from polyamine compounds and in particular from proteins, or from polyhydroxylated compounds and in particular from polysaccharides, at laboratory temperature, without bifunctional crosslinking agent, and containing either a hydrophilic phase or a hydrophobic phase depending on whether one will prepare at the start, or an emulsion of a hydrophilic phase used as dispersed phase in a hydrophobic liquid as dispersing phase, or an emulsion of a hydrophobic phase used as a dispersed phase in an aqueous liquid used as a dispersing phase.
  • the present invention also aims to prepare microparticles, preferably microcapsules, from proteins by limiting the alterations of their structure so as to obtain improved biocompatibility and, in the case where the protein is endowed with 'a specific biological activity, so as to preserve this activity.
  • the present invention also aims to solve the problem of alkalinization of droplets of the neutral aqueous phase containing both an esterified polysaccharide, such as PGA on the one hand and the polyhydroxylated or polyamine compound on the other hand, a times dispersed within a hydrophobic phase in the emulsion state, and then of their neutralization by acidification at the end of the reaction, within the emulsion.
  • the present invention also aims, in the case of an emulsion of a hydrophobic liquid used as dispersed phase in an aqueous phase containing both the esterified polysaccharide on the one hand, and the poly ⁇ hydroxylated or polyamine compound of on the other hand, to carry out a localized alkalization around the droplets of the hydrophobic phase and not in the entire volume of the dispersing aqueous phase, so as to selectively initiate the transacylation reaction at the interface of the emulsion.
  • the present invention also aims to prepare microparticles, preferably microcapsules, from an esterified polysaccharide on the one hand, and polyamine or polyhydroxylated compounds soluble in hydrophobic liquids on the other hand, by producing separate solutions of the reactants in immiscible phases, and by triggering the trans ⁇ acylation reaction at the desired time at the interface of an emulsion according to the principles set out above.
  • the present invention also aims to solve the technical problems stated above, with the use of simple manufacturing methods which can be used on an industrial scale and which also make it possible to adjust the size of the microparticles, preferably microcapsules, in particular in a size range from less than 1 ⁇ m to 5,000 ⁇ m.
  • the in situ alkalinization of the aqueous droplets dispersed within a hydrophobic phase in the emulsion state can be carried out in an extremely simple manner by addition to the emulsion of 'a solution of an alkaline agent in an organic liquid miscible with the aqueous phase.
  • the transacylation reaction can thus be started after the emulsification step.
  • neutralization is then carried out in the same way by adding to the reaction medium a solution of an acid in an organic liquid miscible with the aqueous phase.
  • Microscopic spherules can thus be isolated, consisting of a polyamine substance such as a protein, or of a polyhydroxylated substance such as a polysaccharide, directly associated by covivalent bonds to a polycarboxylic polysaccharide without any other reagent added. .
  • microparticles preferably microcapsules
  • microparticles could be prepared by an inter-facial transacylation reaction starting on the one hand from an esterified polysaccharide such as PGA dissolved in the aqueous phase, and on the other hand part of a polyhydroxy compound such as a cellulose derivative, or polyamine, such as hexamethylenediamine, dissolved in a hydrophobic phase.
  • the aqueous phase can be used as a dispersed phase or as dispersing phase.
  • a neutral aqueous solution of the esterified polysaccharide should therefore be used and, once the emulsion obtained in the presence of the hydrophobic phase, initiate alkalization at the interface. It has been discovered that this problem can be easily resolved using the methods discussed above. In fact, in the case of the use of the aqueous phase as a dispersed phase, it has been possible to verify that the in situ alkalinization of the dispersed aqueous droplets can be carried out in the same way by addition to the emulsion of a solution of 'an alkaline substance in an organic liquid miscible with the aqueous phase.
  • microparticles preferably the microcapsules
  • the microparticles are then neutralized according to the same process using a solution of an acid in an organic liquid miscible with the aqueous phase.
  • hydrophobic phase used as the dispersed phase
  • microparticles preferably the microcapsules formed, are then neutralized by adding to the reaction medium a solution of an acid in an organic liquid miscible with the aqueous phase or in water. It is on the basis of this discovery, totally unexpected for those skilled in the art, that the present invention has been made.
  • the invention represents a decisive technical progress for those skilled in the art, taking into account that the microparticles, preferably the microcapsules obtained, which result from the establishment of covalent bonds by the transacylation reaction, are perfectly stable while their constitution involves only biocompatible substances, to the exclusion of any bifunctional crosslinking agent. They will thus find numerous applications in various fields such as pharmacy, cosmetics and the food industry.
  • microparticles preferably the microcapsules, both hydrophobic substances and hydrophilic substances
  • microparticles preferably micro- capsules, loaded with oils such as essential oils, or with oily solutions of active substances, can be as easily prepared as microparticles, preferably microcapsules, containing aqueous solutions or even suspensions or emulsions with an aqueous continuous phase.
  • composition of the microparticles preferably microcapsules
  • a polyamine such as a protein or a polyhydroxylated substance such as a polysaccharide respectively for react with the esterified polysaccharide.
  • the subject of the present invention is the use of a transacylation reaction between a polysaccharide carrying esterified carboxylic groups and a polyamine substance, in particular a polysaccharide carrying amino groups, such as chitosan, or a protein, or a polyhydroxylated substance, in particular a polysaccharide, for the manufacture of microparticles, in particular microcapsules.
  • these microparticles, in particular these microcapsules contain a cosmetic, pharmaceutical, food active principle, a protein endowed with a biological activity such as an enzyme or hemoglobin.
  • the present invention also relates to microparticles, in particular microcapsules, characterized in that they have a wall made up of the reaction product between a polysaccharide carrying esterified carboxylic groups and a poly ⁇ amino substance , such as a polysaccharide carrying amino groups, such as chitosan, or a protein, or a polyhydroxylated substance, such as a poly ⁇ saccharide.
  • a polysaccharide carrying esterified carboxylic groups and a poly ⁇ amino substance , such as a polysaccharide carrying amino groups, such as chitosan, or a protein, or a polyhydroxylated substance, such as a poly ⁇ saccharide.
  • these microparticles in particular these microcapsules, have a wall consisting of the reaction product between a polysaccharide carrying esterified carboxylic groups and a polyamine substance, such as a polysaccharide carrying amino groups, such as chitosan , or a protein, thereby presenting covalent amide bonds involving the amino groups of the polyamine and the carboxylic groups of the esterified polysaccharide.
  • a polysaccharide carrying amino groups such as chitosan
  • the proportions of the esterified polysaccharide relative to the polyamine, such as a protein, or a polysaccharide such as chitosan can vary from 0.4% to 60% by weight.
  • the microparticles in particular the microcapsules, are characterized in that they have a wall consisting of the reaction product of a polysaccharide carrying esterified carboxylic groups and of a polyhydroxylated substance, for example a poly ⁇ saccharide, via covalent ester bonds involving the carboxylic groups of the esterified polysaccharide and the hydroxyl groups of the polyhydroxylated compound.
  • the proportions of esterified polysaccharide relative to the polyhydroxy compounds can vary from 5% to 300% by weight.
  • these micro-particles in particular these microcapsules, contain a cosmetic, pharmaceutical, food active ingredient, or a protein with biological activity such as an enzyme or hemoglobin, or bubbles gas such as air.
  • the present invention relates to a process for the manufacture of microparticles, in particular microcapsules, characterized by the following successive steps: a) a neutral aqueous solution is prepared containing on the one hand a polysaccharide carrying esterified carboxylic groups, and on the other hand either a polyamine substance such as for example a polysaccharide carrying amino groups, such as chitosan, or a protein, or a polyhydroxylated substance such as for example a polysaccharide; b) a hydrophobic liquid is provided in which the esterified polysaccharide and the polyamine or polyhydroxylated substance are essentially insoluble; c) mixing the hydrophobic liquid and the aqueous solution to form an emulsion; d) a solution of an alkaline substance in an organic liquid miscible with the aqueous phase is added to the emulsion; e) after a predetermined period of time necessary to carry out a transesterification reaction,
  • an emulsion of the aqueous solution is formed as the phase dispersed in the hydrophobic liquid forming the continuous phase.
  • the hydrophobic liquid forms the dispersed phase
  • a solution of an alkaline substance in an organic liquid miscible with the aqueous phase is added to the hydrophobic liquid, then this hydrophobic phase is dispersed in the above-mentioned neutral aqueous solution forming the continuous phase so as to form the abovementioned emulsion, which allows the transacylation reaction to develop on the surface of the droplets dispersed by diffusion of alkaline ions to the interface.
  • the present invention relates to a process for the manufacture of microparticles, in particular microcapsules, characterized by the following successive steps: a) a neutral aqueous solution of a polysaccharide carrying esterified carboxylic groups is prepared ; b) preparing a hydrophobic solution of a polyamine substance such as for example a polysaccharide carrying amino groups, such as chitosan, or a protein, a diamine, or of a polyhydroxylated substance such as for example a polysaccharide, hydroxypropylcel- lulose, in a hydrophobic liquid, in which the esterified polysaccharide is essentially insoluble, then a solution of an alkaline agent in an organic liquid miscible with the aqueous phase is added to this solution; c) an emulsion of this mixture used as the dispersed phase is formed in the neutral aqueous solution of the esterified polysaccharide forming the continuous phase
  • the present invention also relates to a method for manufacturing microparticles, in particular microcapsules, characterized by the following successive steps: a) a neutral aqueous solution of a polysaccharide carrying esterified carboxylic groups is prepared. b) A solution of a polyamine substance or of a polyhydroxylated substance is prepared in a hydrophobic liquid, in which the esterified polysaccharide is essentially insoluble. c) An emulsion of the aqueous solution used as the phase dispersed in the hydrophobic liquid forming the continuous phase is formed.
  • the aforementioned process can also comprise a complementary step of separation of the microparticles, in particular of the microcapsules by any suitable means, in particular by natural decantation after having possibly carried out one or more washes.
  • the microparticles, in particular the microcapsules, once separated from the reaction medium can be placed in an aqueous or alcoholic calcium solution, so as to trigger a reaction between the functional groups of the polysaccharide esterified and calcium ions. It is well known that such a reaction generates a network structure capable of behaving like a matrix system.
  • the particular structure of the microparticles, in particular of the microcapsules obtained, is thus capable of allowing a more efficient trapping and / or a slow diffusion of the substances encapsulated or trapped in the matrix.
  • the polyamine substance or compound can be a protein, partially hydrolyzed or not, grafted or not of long hydrocarbon chain.
  • long hydrocarbon chain is meant chains having from 10 to 30 carbon atoms.
  • the polyamine substance or compound can also be chosen from a hydrophilic protein, that is to say soluble in water or dispersible in water, containing free amino groups. It is not essential that the protein materials used in the reaction are pure proteins. They can be used in the form of natural mixtures or not containing hydrophilic proteins, such as for example milk, or mixtures of atelocoliagen and glycosaminoglycans.
  • proteins which can be used in the invention and which fulfill the conditions which consist of being hydrophilic or which can be treated to be hydrophilic are albumin such as serum albumin, ovalbumin, alpha-lactalbumin, globulins , fibrinogen, casein, glutelins which preferably will have been degraded, solubilized scleroproteins, coUagen, atelocoagen, gelatin, hemoglobin, enzymes such as catalase.
  • albumin such as serum albumin, ovalbumin, alpha-lactalbumin, globulins , fibrinogen, casein, glutelins which preferably will have been degraded, solubilized scleroproteins, coUagen, atelocoagen, gelatin, hemoglobin, enzymes such as catalase.
  • mixtures containing hydrophilic proteins include whole or partially or skimmed milk, powdered milk, condensed milk, whey proteins, whole egg, egg yolk, mixtures of atelocoliagen and glycosaminoglycans.
  • the polyamine substance can be a polysaccharide carrying amino groups, such as chitosan, a diamine such as an alkylenediamine and, preferably having from 2 to 6 carbon atoms such as ethylenediamine, trimethylenediamine, tetramethylenediamine, pentamethylenediamine, hexamethylenediamine, a diamine comprising an aromatic nucleus such as m-phenylenediamine, p-phenylenediamine, an alkylene polyamine such as tetraethylene pentamine, an amino comprising a nitrogen atom integrated in a ring piperazine, these examples being given by way of illustration and not limitation.
  • a diamine such as an alkylenediamine and, preferably having from 2 to 6 carbon atoms
  • a diamine comprising an aromatic nucleus such as
  • the esterified polysaccharide is a hydrophilic polysaccharide carrying numerous carboxylic groups, which are esterified in a proportion at least equal to 50%, ie naturally, either by chemical modification.
  • the polysaccharide ester is chosen from propylene glycol alginate and pectins.
  • the concentration of polysaccharide ester in the aqueous phase is between 0.4% and 5% w / v, and better still from 0.7 to 2%, and more preferably close to 1%.
  • the concentration of protein or polyamine in the aqueous phase is between 0.2% and 35%.
  • the polyhydroxylated substance capable of reacting with the esterified polysaccharide is a polysaccharide or derivative of polysaccharide such as starch or partially hydrolyzed starch, hydroxyethyl starch, carboxymethyl starch, sodium alginate, guar gum, gum arabic, gum tragacanth, various cellulose derivatives such as hydroxypropylcellulose, carboxymethylcellulose, ethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, hydroxyethylcellulose.
  • the polyhydroxylated substance capable of reacting with the esterified polysaccharide is a polyalcohol such as polyvinyl alcohol, an alkylene glycol, in particular a C2-C6 alkylene glycol, for example ethylene glycol, 1,4-butanediol, hexamethylene glycol, glycerol, these polyalcohols being cited by way of illustration and without limitation.
  • a polyalcohol such as polyvinyl alcohol, an alkylene glycol, in particular a C2-C6 alkylene glycol, for example ethylene glycol, 1,4-butanediol, hexamethylene glycol, glycerol, these polyalcohols being cited by way of illustration and without limitation.
  • the aqueous phase can consist either of pure water, or of a tam ⁇ pon of pH between 5.9 and 8, preferably between 6.8 and 7.5.
  • any solvent described in the preceding documents can be used.
  • chloroform, dichloromethane, cyclohexane, paraffin oil, isopropyl myristate or alternatively natural or synthetic glycerides, pure or in mixtures, vegetable oils, for example vegetable oil, are used. peanut, olive oil, rapeseed oil, esters of fatty acids and of various alcohols such as, for example, methyl or ethyl oleates, alone or in mixtures.
  • the emulsion is produced in the presence of a surfactant.
  • a surfactant When the aqueous phase is used as the dispersed phase, it is possible, for example, to use a sorbitan ester or a lecithin, incorporated in the hydrophobic phase.
  • the hydrophobic phase When the hydrophobic phase is used as the dispersed phase, it is possible, for example, to use polysorbate incorporated in the aqueous phase.
  • a surfactant is not necessary for the proper functioning of the methods according to the invention and it can be omitted.
  • the alkaline organic liquid miscible with the aqueous phase is a solution.
  • the solution contains between 0.5 and 2% w / v of sodium hydroxide in 95% ethanol, and more preferably a concentration of sodium hydroxide close to 2%.
  • the time during which an alkaline pH is maintained for the development of the transacylation reaction is between 5 min and 1 h, preferably between 5 min and 30 min , more preferably it is 15 min.
  • the acidic organic liquid miscible with the aqueous phase is a solution of an organic monocarboxylic or polycarboxylic acid, whether or not carrying alcohol functions, such as acetic acid, citric acid , lactic acid, tartaric acid, succinic acid, malic acid, or a mineral acid such as hydrochloric acid, in an alcohol such as methanol or ethanol, pure or containing 5 to 10% water, or else in a polyol, such as glycerol or a polyethylene glycol.
  • the acid solution consists of 95% ethanol, containing between 1 and 10% (v / v) of acetic acid, and preferably between 7 and 8%.
  • the time of neutralization of the microcapsules is between 5 min and 1 h , preferably between 5 min and 30 min, more preferably it is 15 min.
  • one or more can be introduced into the aqueous phase or into the oily phase one or more active principles in the form of a solution, suspension or emulsion, in particular one or more substances of cosmetic, pharmaceutical or food interest.
  • microparticles in particular microcapsules.
  • gas bubbles such as air can be incorporated into an aqueous solution of protein and esterified polysaccharide by subjecting it to very vigorous stirring.
  • the method of the invention is then applied to the foam using it as an aqueous phase dispersed within a hydrophobic phase.
  • the microparticles, in particular the microcapsules contain a multitude of gas bubbles such as air imprisoned.
  • Such microparticles, in particular microcapsules find an indication for use in methods of medical diagnosis by ultrasound.
  • the microcapsules obtained according to the invention can constitute an immobilized form which is easy to use, in particular in the fields of biotechnologies, bioreagents or therapeutics.
  • immobilized or encapsulated enzymes find useful indications for use in replacement therapy, orally in digestive enzyme deficiencies, parenterally for the treatment of diseases linked to congenital enzyme deficiencies. They are also useful in the treatment of certain tumors, or locally for the treatment of wounds and ulcers, or even in extracorporeal blood purification systems.
  • Immobilization has the effect of protecting the enzyme against various inactivating agents, of slowing down the attack by the proteases, of reducing the immunogenicity.
  • microcapsules prepared from this protein and having retained its oxyphoric properties have applications as "artificial red cells", or in biotechnology for the oxygenation of bio ⁇ reactors.
  • the present invention also relates to a composition such as a cosmetic composition or a pharmaceutical composition, or a food composition, or an enzymatic composition, characterized in that it comprises microparticles, in particular microcapsules, having a wall consisting of the reaction product of a polyamine or polyhydroxylated substance with a polysaccharide carrying esterified carboxylic groups, either by means of amide bonds involving the amino groups of the protein or of the polyamine on the one hand, and d on the other hand the carboxylic groups of the polysaccharide, either by means of ester bonds involving on the one hand the hydroxyl groups of the polyhydroxylated substance, and on the other hand the carboxylic groups of the esterified polysaccharide.
  • hydrophobic solution of a polyamine or polyhydroxylated substance is prepared, the latter is chosen for its capacity for solubility in hydrophobic solution, as is well known in the art. skilled in the art.
  • microparticles are separated by centrifugation, then washed by resuspension in 95% ethanol containing 2% Tween 20®, then in 95% ethanol, then in distilled water. The microparticles can then be frozen and lyophilized.
  • Transparent spheres of average size 150 ⁇ m are obtained. After lyophilization, the rehydration of the powder obtained shows that the microparticles are intact and resume their spherical shape.
  • test portions of 25 mg of lyophilized microparticles are rehydrated by adding 1 ml of distilled water, then added 7.5 ml of different media :
  • the tubes are incubated at 37 ° C.
  • the stability of the microparticles is studied by microscopic examination.
  • the lysis time is the time at the end of which all the microparticles have disappeared from the medium.
  • microparticles prepared according to Example 1 are stable for more than 3 days in distilled water as in solutions of pH 1.2 or pH 7.5. They are degraded by proteases: in 15 min by pepsin, in 25 min by trypsin.
  • Example 1 The protocol described in Example 1 is reproduced by replacing the myopropyl isopropyl with fluid paraffin oil.
  • Example 1 The protocol described in Example 1 is reproduced by replacing human serum albumin with ovalbumin (LABOSl), used at the same concentration (20%) and by dissolving in the aqueous phase the patented blue N at the concentration. from 1 %.
  • the washing protocol is modified: the microparticles are washed with cyclohexane. They are then freed from the solvent by evaporation under vacuum, frozen and lyophilized. Obtained spherical microparticles, blue in color, with an average diameter of 200 ⁇ m. They resist more than 3 days to an incubation in distilled water, or in a solution of pH 1.2, or in a solution of pH 7.5.
  • microparticles resist pepsin for at least 24 hours and are lysed in 3 hours by trypsin. Stability test in distilled water at 45 ° C.
  • the microcapsules which have just been obtained in suspension in distilled water are centrifuged and removed from the supernatant. 1 g of the pellet of microcapsules thus wrung is taken and this test sample is suspended in 50 ml of sterile distilled water.
  • the bottle is capped and then placed in an oven at 45 ° C. It is observed that the microcapsules remained intact after 2 1/2 months of stay in an oven.
  • Example 3 Manufacture of microparticles with an average diameter of 75 ⁇ m from ovalbumin and PGA.
  • the protocol described in Example 3 is reproduced by replacing the myri ⁇ state of isopropyl with chloroform and using polyethylene glycol 200 instead of 95% ethanol to prepare the sodium hydroxide and acetic acid solutions.
  • Microparticles with an average diameter of 75 ⁇ m are obtained.
  • Example 1 The protocol described in Example 1 is reproduced by replacing human serum albumin with sheep hemoglobin (SIGMA), used at the concentration of 15% w / v. Bright red, spherical microparticles are obtained, with an average diameter of 250 ⁇ m, which can be lyophilized. These microparticles are destroyed by pepsin in 10 min, by trypsin in 3 h 30.
  • SIGMA sheep hemoglobin
  • Example 6 Manufacture of microparticles with an average diameter of 50 ⁇ m from hemoglobin and PGA.
  • Example 5 The protocol described in Example 5 is reproduced by replacing the myri ⁇ state of isopropyl with chloroform.
  • Red microparticles with an average diameter of 50 ⁇ m are obtained.
  • Example 7 Manufacture of microparticles with an average diameter of 250 ⁇ m from fibrinogen and PGA.
  • Example 1 The protocol described in Example 1 is reproduced by replacing human serum albumin with beef fibrinogen (SIGMA), used at a concentration of 6% w / v. Microparticles with granular content are obtained, with an average diameter of 250 ⁇ m, which can be lyophilized. These microparticles resist pepsin for more than 24 hours, while they are lysed in 3 hours by trypsin. Stability test in distilled water at 45 ° C
  • Example 8 Proceeding in the stability test conditions described in Example 3, it was observed that the microcapsules are intact after 2 1/2 months of stay in the oven at 45 ° C, the aqueous suspension.
  • Example 8 according to the invention
  • Example 1 The protocol described in Example 1 is reproduced by replacing human serum albumin with beef liver catalase (C-10 from SIGMA), used at a concentration of 20% w / v.
  • C-10 beef liver catalase
  • a 5 mg of lyophilized microparticles test sample is rehydrated by adding 1 ml of pH 7 phosphate buffer and magnetic agitation for 5 min at room temperature (20 ° C).
  • 3 ml of a previously titrated sodium perborate solution (with a 0.005M solution of KMn ⁇ 4) are added to 88.46 mmol / 1 of H2 ⁇ 2-
  • the reaction is stopped after 30 s by adding 3 ml of 1M H2SO4.
  • the medium is supplemented with 1 ml of 20% trichloroacetic acid and filtered through a 0.22 ⁇ m filter.
  • the remaining L 2 O 2 is assayed on an aliquot of the filtrate added with a drop of 1% MnCl 2, with a solution of 0.005 M KMn ⁇ 4.
  • the 5 mg of lyophilized microparticles which in fact correspond to 4.762 mg of catalase involved in the preparation, have the same activity as 0.125 mg of pure catalase which has not undergone lyophilization.
  • Example 9 If the microparticle manufacturing protocol described in Example 8 is applied but using instead of a 95% solution of sodium hydroxide in ethanol a solution of sodium hydroxide in polyethylene glycol 200 (PEG 200) at the same concentration, and, instead of a solution of acetic acid in ethanol at 95%, a solution of acetic acid in PEG 200 at the same concentration, stable microparticles (30 ⁇ m) are also obtained. If the catalase activity of a 5 mg sample of these freeze-dried microparticles is determined under the conditions described in Example 8, it is found that a single drop of 0.005 M KMn ⁇ 4 is sufficient to color the content of the assay vial: all I ⁇ 2O2 was therefore broken down into 30 s.
  • PEG 200 polyethylene glycol 200
  • Emulsification in a container thermostatically controlled at 40 ° C, 6 ml of this aqueous phase are emulsified in 40 ml of isopropyl myristate containing 2% Span 85 and preheated to the temperature of 40 * C (stirring speed: 2000 rpm / min).
  • Example 1 Alkalization, neutralization and washing are then carried out as described in Example 1.
  • the microparticles appear as spheres with an average diameter of 1 mm. After lyophilization, they give a white powder which rehydrates easily.
  • Example 12 Microparticles with an average diameter of 600 ⁇ m are obtained.
  • Example 12 according to the invention
  • Example 11 The protocol described in Example 11 is reproduced by adding, 15 min after the addition of the acidic alcoholic solution, 40 ml of 95% ethanol containing 2% Tween 20 and 2% CaCl2. Stirring is continued for 15 min, then the microparticles are separated by centrifugation and washed as described in Example 1.
  • Microparticles with granular content with an average diameter of 300 ⁇ m are obtained.
  • Emulsification 24 ml of the foam are emulsified in the dispersed phase state in 80 ml of isopropyl myristate containing 2% Span 85, with a stirring speed of 2000 rpm.
  • the alkalization and acidification operations are then carried out as described in Example 1, but using 8 ml of the alkaline and acidic alcohol solutions.
  • the washes are carried out as described in Example 1.
  • Microparticles with an average diameter of 600 ⁇ m, beige in color, translucent are obtained, containing visible air bubbles (approximately 20 to 30 per microparticle), and floating on the surface of the water. After lyophilization, the microparticles once rehydrated appear under the microscope charged with air bubbles. They float on the water for at least 9 hours. After 48 h, the microparticles sedimented. Air bubbles are no longer present in the microparticles, which, instead of occupying them, serve as smooth circular cavities visible under an interference phase contrast optical microscope.
  • PGA PGA are dissolved in 6 ml of whole liquid milk by stirring.
  • 60 mg of insoluble red dye, RED DC 30, are dispersed in this solution by stirring.
  • Example 1 The protocol described in Example 1 is then reproduced using 6 ml of the above solution as the aqueous phase.
  • Red-colored microparticles are obtained, with an average diameter of 300 ⁇ m.
  • the microparticles are intact after lyophilization.
  • Example 1 The protocol described in Example 1 is then reproduced using 12 ml of the preceding emulsion as the aqueous phase and doubling all the volumes of the various reagents.
  • the microparticles are washed with distilled water added with 2% Tween 20, then with distilled water. After washing, very spherical microparticles are obtained, with an average diameter of 400 ⁇ m.
  • the microscopic examination shows a granular content within which the oil droplets are distinguished in the form of very small refractive spheres. The microparticles are intact after lyophilization.
  • aqueous phase 1.6 g of skimmed milk powder are dissolved in 8 ml of distilled water by stirring for 3 min. 80 mg of PGA are then dissolved in this solution by stirring for 6 min. In the solution obtained used as dispersing phase, 1 ml of essential oil of peppermint used as dispersed phase is emulsified, by stirring at 5000 rpm.
  • Example 1 The protocol described in Example 1 is then reproduced using 6 ml of the previous emulsion as the aqueous phase. Alkalization is carried out by adding 2 ml of a 2.8% potash solution in 95% ethanol, and acidification, by adding 2 ml of a 28.1% solution of citric acid hydrated to 1 mol H2O in 95% ethanol. The microparticles are washed as described in Example 15. Obtained well spherical microparticles, of average diameter
  • the microscopic examination shows a granular content within which the essential oil droplets are distinguished in the form of very small refractive spheres.
  • Example 1 The protocol described in Example 1 is then reproduced using 12 ml of the preceding solution as the aqueous phase and doubling all the volumes of the various reagents.
  • HMD Fluka ⁇ and PGA Manufacture of microparticles from hexamethylenediamine (HMD Fluka ⁇ and PGA.
  • Preparation of the aqueous phase 16 mg of HMD are dissolved in 4 ml of phosphate buffer pH 5.9. 200 mg of PGA is dissolved separately in 5 ml of phosphate buffer pH 5.9 The 4 ml of the HMD solution are mixed by stirring for 1 min with 4 ml of the PGA solution.
  • Example 1 The protocol described in Example 1 is then reproduced using 6 ml of the preceding solution as the aqueous phase and replacing the myri ⁇ state of isopropyl with methylene chloride.
  • Transparent microparticles are obtained, with an average diameter of 400 ⁇ m, which are intact after lyophilization. They are more than 24 h resistant to trypsin and pepsin.
  • Microparticles of average size 200 ⁇ m are obtained, with granular content.
  • microparticles from milk powder and pectin Preparation of the aqueous phase: in 8 ml of distilled water, 240 mg of apple pectin and 800 mg of GLORIA skimmed milk powder are dissolved. Then, the protocol described in Example 1 is applied, using 6 ml of the previous solution, replacing the isopropyl myristate with fluid paraffin oil and doubling the volumes of the alkaline and acid solutions. Spherical microparticles of size between 2 ⁇ m and 300 ⁇ m are obtained which can be lyophilized.
  • Example 22 according to the invention
  • aqueous phase 1.472 g of Plasmasteril (Frésismeus A.G.) corresponding to 1.28 g of HEA and 320 mg of PGA are dissolved in 8 ml of distilled water.
  • Example 2 Then the protocol described in Example 1 is applied, using 6 ml of the previous solution, and replacing the isopropyl myristate with fluid paraffin oil. Obtained spherical microparticles with an average size of 600 ⁇ m.
  • CMC CMC 7 LF, degree of substitution: 0.7, HERCULES
  • PGA PGA
  • Example 2 Then the protocol described in Example 1 is applied, using 6 ml of the previous solution. Granular microparticles of average size 1.8 mm are obtained.
  • Preparation of the hydrophobic phase in 20 ml of chloroform, 300 mg of hydroxypropylcellulose (Klucel EF, AQUALON) are dissolved.
  • Emulsification 3 ml of the aqueous phase are emulsified in the dispersed phase state in 20 ml of the hydrophobic phase by stirring at 2000 rpm for 5 min.
  • Example 2 The washes are carried out as described in Example 1. Spherical microcapsules, of average size 70 ⁇ m, are obtained. After lyophilization, the microcapsules are intact and rehydrate quickly, resuming their spherical shape.
  • Emulsification the 6 ml of the hydrophobic phase are emulsified in the dispersed phase state in 40 ml of the aqueous phase by stirring at 2000 rpm.
  • Example 15 After 15 min, 2 ml of acidic alcoholic solution prepared as described in Example 1 are added. After another time of 15 min, the microcapsules are centrifuged and washed as described in Example 15. Spherical microcapsules are obtained , of average size 10 ⁇ m.
  • Manufacture of microcapsules with an aqueous internal phase from hexamethylenediamine in solution in a hydrophobic liquid and from PGA in aqueous solution.
  • Example 1 the alkalization is carried out as described in Example 1. After 15 min, the acidification is carried out by addition of 1 ml of 95% ethanol containing 28.3% v / v ml of acetic acid. The washes are carried out as described in Example 1. Spherical microcapsules, of average size 5 ⁇ m, are obtained.
  • Emulsification 6 ml of the organic phase are emulsified in the dispersed phase state in 40 ml of the aqueous phase by stirring at 2000 rpm.
  • Microcapsules are obtained, with an average size of 50 ⁇ m.
  • Emulsification the 6 ml of the hydrophobic phase are emulsified in the dispersed phase state in the 40 ml of the aqueous phase by stirring at 2000 rpm.
  • reaction medium After 15 min, the reaction medium is diluted by adding 40 ml of distilled water and stirring for 1 min. Then the microcapsules are washed several times with distilled water.
  • Emulsification the 12 ml of the hydrophobic phase are emulsified in the dispersed phase state in the 40 ml of the aqueous phase by stirring at 2000 rpm.
  • Manufacture of microcapsules from egg yolk and PGA The preparation of the aqueous phase is carried out by dissolving 80 mg of PAG in 8 ml of egg yolk by stirring.
  • Example 1 The protocol described in Example 1 is then reproduced using 6 ml of the above solution as the aqueous phase.
  • Beige-colored microcapsules are obtained, with an average size of 300 ⁇ m after having been frozen and lyophilized. After lyophilization, rehydrating the powder obtained from microcapsules shows that the microcapsules are intact and resume their spherical shape.
  • aqueous internal phase from a protein grafted with a long carbon chain
  • Lamepon S® in solution in a hydrophobic liquid and PGA in aqueous solution
  • the preparation of the aqueous phase is carried out by dissolving 160 mg of PGA in 8 ml of distilled water.
  • the hydrophobic phase is prepared by dissolving 3 g of a protein grafted with a long carbon chain, or polyamide available commercially, for example that known under the trade name Lamepon S®, product available from the company LASERSON and SABETAY well known to those skilled in the art, in 30 ml of chloroform.
  • the emulsification is carried out by emulsifying 6 ml of the aqueous phase in the dispersed phase state in 30 ml of hydrophobic phase by stirring at 2000 rpm for 5 min.
  • chitosan for example the product commercially available under the commercial reference Seacur 143 from the company PROTAN, is dissolved in 10 ml of IM acetic acid , then the pH is adjusted to 5.6 with sodium hydroxide and then dissolved in this solution
  • Example 1 100 mg of PGA.
  • the protocol described in Example 1 is then reproduced using the previous solution as the aqueous phase.
  • a bulky sediment is obtained formed from microcapsules with a clear membrane, with a diameter between 50 and 500 ⁇ m.

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Abstract

L'invention concerne des microparticules, en particulier des microcapsules et leur procédé de fabrication. Ces microparticules, en particulier ces microcapsules, sont caractérisées en ce qu'elles présentent une paroi constituée du produit de réaction entre un polysaccharide porteur de groupements carboxyliques estérifiés et une substance polyaminée ou une substance polyhydroxylée, notamment par l'intermédiaire d'une réaction de transacylation. Ces microparticules ou ces microcapsules sont utiles pour la fabrication de compositions cosmétique, pharmaceutique ou alimentaire.

Description

Utilisation d'une réaction de transacylation entre un polysaccharide estérifié et une substance polvaminée ou polvhvdroxylée pour la fabrication de microparticules, microparticules ainsi réalisées, procédés et compositions en contenant.
La présente invention concerne essentiellement l'utilisation d'une réac¬ tion de transacylation entre un polysaccharide estérifié et une substance polyami- née ou polyhydroxylée pour la fabrication de microparticules, les microparticules, leurs procédés de fabrication ainsi que des compositions en comportant application. Plus précisément, la présente invention concerne essentiellement l'uti¬ lisation d'une réaction de transacylation entre d'une part un polysaccharide porteur de groupements carboxyliques estérifiés, et d'autre part soit une substance "poly- aminée, en particulier une protéine, soit une substance polyhydroxylée, en parti¬ culier un polysaccharide, pour la fabrication de microparticules, en particulier de microcapsules, les microparticules ainsi réalisées, les procédés de fabrication de telles microparticules, en particulier des microcapsules, et les compositions en contenant, telles que compositions cosmétiques, pharmaceutiques, alimentaires, enzymatiques, de réactifs ou de diagnostics.
La mise au point de microparticules, en particulier de microcapsules biocompatibles, présente un grand intérêt notamment dans les domaines cosmé¬ tique, pharmaceutique et alimentaire. Chargées d'une ou plusieurs substances actives, ces vésicules peuvent en effet permettre de masquer un goût ou une odeur désagréables, d'augmenter la stabilité des substances encapsulées, d'en prévenir l'évaporation, d'en assurer la libération prolongée in situ. Si la membrane résiste au milieu gastrique, les microparticules, en particulier les microcapsules, peuvent en outre protéger la substance active contre une dégradation dans l'estomac, ou protéger la muqueuse gastrique contre un effet irritant.
De telles microcapsules sont susceptibles d'être administrées par des voies diverses, telles que la voie orale, l'application sur la peau ou les muqueuses, ou la voie parentérale.
Parmi les divers matériaux candidats, les protéines et les polysaccha- rides sont les plus étudiés. Divers procédés ont été ainsi décrits pour la prépara¬ tion de microcapsules à partir de protéines ou de polysaccharides ou d'associa¬ tions de protéines et de polysaccharides. Certains procédés comportent un premier stade d'émulsification de la solution aqueuse de protéine ou de polysaccharide au sein d'une phase hydrophobe, suivi d'un stade de réticulation à l'aide d'un agent bi- fonctionnel tel que les dichlorures d'acide. On peut citer par exemple le document FR-A-2444 497 Mars, ou encore le document FR-A-2527 438 CNRS dans lequel la réticulation interfaciale est appliquée à des mélanges de protéines et de polysaccharides. Pour encapsuler des liquides hydrophobes émulsionnés comme phase dispersée dans une solution aqueuse de protéine ou de polysaccharide, les procédés existants consistent généralement soit à utiliser un chauffage de l'émulsion si la protéine est dénaturable à la chaleur (par exemple document US 3 137 631 Soloway), soit à incorporer un agent réticulant à la phase hydrophobe (document US 4 138 362 Vassiliades).
Par ailleurs, les procédés dits de coacervation complexe sont bien con¬ nus de l'homme de l'art. Ils sont applicables notamment à des solutions aqueuses d'une protéine et d'une substance polyanionique comme par exemple un poly¬ saccharide porteur de groupements carboxyliques. La substance à encapsuler est dispersée dans la phase aqueuse soit sous forme d'un solide, soit sous forme de gouttelettes d'un liquide non miscible. Le principe est d'acidifier la solution aqueuse de manière à amener le pH à une valeur telle que la protéine soit chargée positivement et forme avec la substance polyanionique un complexe électrique¬ ment neutre, lequel se dépose sur la phase dispersée à encapsuler. Les procédés utilisant les agents de réticulation bifonctionnels pré¬ sentent l'inconvénient d'imposer des lavages répétés des microcapsules obtenues, de manière à éliminer totalement l'agent réticulant en excès. En outre, la réaction chimique de réticulation provoque d'importantes altérations de la structure des protéines. Pour des applications pharmaceutiques, de telles altérations sont à éviter car elles peuvent être à l'origine de propriétés immunogenes des microparticules. De même, si l'on cherche à préserver les propriétés biologiques spécifiques de la protéine utilisée pour la préparation des microparticules telles que des propriétés enzymatiques (enzyme immobilisée) ou des propriétés de transport de l'oxygène (hémoglobine), on cherchera à minimiser toute dénaturation de la protéine pouvant diminuer son activité. Cet objectif ne peut évidemment pas être atteint avec les procédés utilisant la dénaturation thermique de protéines, procédés qui par ailleurs ont l'inconvénient de ne pas pouvoir s'appliquer à des substances thermolabiles.
Les procédés de coacervation complexe sont limités dans leurs appli¬ cations : ils ne peuvent être appliqués qu'à l'encapsulation de substances inso- lubies dans l'eau ou de liquides non miscibles à l'eau. En outre, la paroi des micro- capsules n'impliquant pas de liaisons covalentes entre la protéine et la substance polyanionique, un traitement de consolidation est nécessaire, comme par exempl un traitement à l'aide d'un agent réticulant.
Plusieurs brevets (GB-A-768309 Henkel ; GB-A-962483 AGFA décrivent la formation d'un film solide et thermostable par alcalinisation d'un solution aqueuse contenant d'une part un polysaccharide porteur de groupement carboxyliques estérifiés désigné ci-après par "polysaccharide estérifié" tel qu l'alginate de propylèneglycol (PGA), d'autre part une diamine ou une protéine. L réaction entre les groupements ester du polysaccharide estérifié et les groupement aminés de la diamine ou de la protéine conduit à la formation de liaisons amide. L mécanisme de la réaction implique une migration d'acyles en milieu alcalin dans l sens O vers N, le groupement aminé provoquant une substitution nucléophile d l'ester, avec libération de propane-diol-1,2 (Me Ray J.E., Stainsby G., Wilso E.L., Carbohydr. Polym., 5, 223-236, 1985 ; Stainsby G., Food Chem., 6, 3-14 1970). Cette réaction est sous la dépendance étroite du pH de la phase aqueuse : l système doit être alcalinisé de manière contrôlée et pendant un temps précis, faut de quoi le réseau formé ne tarde pas à se détruire par hydrolyse de liaison glycosidiques du polysaccharide.
D'autre part, les documents de la technique antérieure indiquent l possibilité d'obtenir des films solides par alcalinisation de solutions renfermant à l fois de l'alginate de propylèneglycol (PGA) et un composé polyhydroxylé tel qu l'amidon, la carboxyméthylcellulose ou l'alcool polyvinylique (Document B 1135856). Ce phénomène, qui se produit également dans une certaine mesur avec le PGA seul, est attribué à une réaction de transacylation (transestérification entre le PGA et le dérivé polyhydroxylé. Ces phénomènes n'avaient jamais été encore appliqués à des émul sions.
Si l'on se base sur les conditions décrites dans la littérature, c'est-à dire en utilisant un polysaccharide estérifié tel que le PGA, à degré de substitu tion élevé (>50 %), un pH compris entre 9,3 et 10,5 et un temps d'alcalinisation d 15 min suivi d'une neutralisation par ajout d'un acide, et si l'on tente d'applique directement la réaction à une émulsion d'une solution aqueuse alcaline contenant la fois du PGA d'une part, et d'autre part par un composé polyaminé tel qu'un protéine ou un composé polyhydroxylé tel qu'un polysaccharide, utilisée comm phase dispersée au sein d'une phase hydrophobe, il n'est pas possible d'obtenir de microparticules ou des microcapsules pour aucune concentration de PGA et d composé polyaminé ou polyhydroxylé. La phase aqueuse alcaline contenant les deux composés en solution se prend très rapidement en masse si le pH est suf¬ fisamment élevé, rendant toute émulsification dans une phase hydrophobe impos¬ sible, tandis qu'il ne se forme pas de film stable pour les valeurs de pH inférieures. II faut donc émulsionner la phase aqueuse neutre contenant les deux biopolymères, utilisée comme phase dispersée, au sein d'une phase hydrophobe, utilisée comme phase dispersante, puis déclencher la réaction de transacylation au sein de l'émul- sion. Toutefois, on se trouve devant le problème de faire en sorte que l'agent alcalin ajouté à I'émulsion diffuse à travers la phase hydrophobe et parvienne jusqu'à l'intérieur des gouttelettes de phase aqueuse dispersée. L'ajout à I'émulsion d'une solution alcaline aqueuse ne permet pas d'atteindre ce résultat. Le même problème se pose pour la neutralisation du milieu par acidification en fin de réac¬ tion, qui ne peut être réalisée par ajout d'une solution aqueuse acide.
De même, si l'on tente d'appliquer le phénomène à une émulsion d'une phase hydrophobe utilisée comme phase dispersée dans une phase aqueuse uti¬ lisée comme phase dispersante et constituée d'une solution alcaline de PGA et d'un composé polyaminé tel qu'une protéine ou d'un composé polyhydroxylé tel qu'un polysaccharide, il n'est pas possible d'obtenir des microcapsules, pour aucune concentration de PGA et de composé polyaminé ou polyhydroxylé. La phase aqueuse alcaline se prend en masse si le pH est suffisamment élevé, ou bien ne laisse pas déposer de film stable sur les gouttelettes hydrophobes dispersées pour les pH inférieurs.
Le document GB-A-962483 AGFA décrit une réaction (esters de l'acide alginique), en particulier des esters de glycol avec des aminés telles que l'hexaméthylènediamine, des protéines pour la formation d'un agent de liaison de couche photographique. Ce document ne concerne pas le domaine technique de la fabrication des microcapsules qui est un domaine technique totalement différent de celui des couches photographiques.
De même, le document GB-A-763309 Henkel concerne un procédé de production d'amides d'acide alginique et en particulier d'amides formateurs de gel à partir de cet acide pour réaliser une gélification et un revêtement de surface, application qui apparaît être l'application essentielle des esters ou des dérivés de l'acide alginique.
Le document GB-A-1 135856 est relatif à un procédé de modification des alginates d'alkylèπeglycol pour la formation d'agents de mise en suspension, d'agents liants et d'adhésifs en particulier pour lier des matériaux en poudre ou granules, la formation de revêtement de surface résistant à l'eau, des gelées élastiques (page 2, ligne 121 à la page 3, ligne 104) ou dans les produits cosmétiques pour utiliser cette capacité liante. Ce document ne concerne donc également en aucune façon le domaine technique de la fabrication de microcapsules.
La présente invention a pour but de préparer des microparticules, de préférence des microcapsules, stables, à partir de composés polyaminés et en particulier à partir de protéines, ou à partir de composés polyhydroxylés et en particulier à partir de polysaccharides, à température du laboratoire, sans agent réticulant bifonctionnel, et renfermant soit une phase hydrophile, soit une phase hydrophobe selon que l'on préparera au départ, soit une émulsion d'une phase hydrophile utilisée comme phase dispersée dans un liquide hydrophobe comme phase dispersante, soit une émulsion d'une phase hydrophobe utilisée comme phase dispersée dans un liquide aqueux utilisé comme phase dispersante. La présente invention a encore pour but de préparer des microparti¬ cules, de préférence des microcapsules, à partir de protéines en limitant les altéra¬ tions de leur structure de manière à obtenir une biocompatibilité améliorée et, dans le cas où la protéine est douée d'une activité biologique spécifique, de manière à préserver cette activité. La présente invention a encore pour but de résoudre le problème de l'alcalinisation des gouttelettes de la phase aqueuse neutre contenant à la fois un polysaccharide estérifié, tel que le PGA d'une part et le composé polyhydroxylé ou polyaminé d'autre part, une fois dispersées au sein d'une phase hydrophobe à l'état d'émulsion, puis de leur neutralisation par acidification en fin de réaction, au sein de I'émulsion.
La présente invention a également pour but, dans le cas d'une émulsion d'un liquide hydrophobe utilisé comme phase dispersée dans une phase aqueuse contenant à la fois le polysaccharide estérifié d'une part, et le composé poly¬ hydroxylé ou polyaminé d'autre part, de réaliser une alcalinisation localisée autour des gouttelettes de la phase hydrophobe et non dans la totalité du volume de la phase aqueuse dispersante, de manière à i-sclencher la réaction de transacylation sélectivement à l'interface de I'émulsion.
La présente invention a encore pour but de préparer des microparti¬ cules, de préférence des microcapsules, à partir d'un polysaccharide estérifié d'une part, et de composés polyaminés ou polyhydroxylés solubles dans des liquides hydrophobes d'autre part, en réalisant des solutions séparées des réactants dans des phases non miscibles, et en déclenchant au moment voulu la réaction de trans¬ acylation à l'interface d'une émulsion selon les principes exposés ci-dessus.
La présente invention a encore pour but de résoudre les problèmes techniques ci-dessus énoncés, avec l'utilisation de procédés de fabrication simples utilisables à l'échelle industrielle et permettant en outre de régler la taille des microparticules, de préférence des microcapsules, en particulier dans une plage de dimensions allant de moins de 1 μm à 5 000 μm.
Selon la présente invention, on a découvert de manière parfaitement inattendue que l'alcalinisation in situ des gouttelettes aqueuses dispersées au sein d'une phase hydrophobe à l'état d'émulsion pouvait être réalisée de manière extrêmement simple par addition à I'émulsion d'une solution d'un agent alcalin dans un liquide organique miscible à la phase aqueuse. La réaction de transacyla¬ tion peut ainsi être déclenchée après l'étape d'émulsification. Après réaction, la neutralisation est ensuite réalisée de la même manière par ajout au milieu réac- tionnel d'une solution d'un acide dans un liquide organique miscible à la phase aqueuse. Des sphérules microscopiques peuvent être ainsi isolées, constituées d'une substance polyaminée telle qu'une protéine, ou d'une substance poly¬ hydroxylée telle qu'un polysaccharide, directement associée par liaisons cova- lentes à un polysaccharide polycarboxylique sans aucun autre réactif ajouté. On a de même découvert de manière inattendue que l'addition à une phase hydrophobe d'un agent alcalin en solution dans un liquide organique mis¬ cible à la phase aqueuse permettait, une fois ce mélange émuisionné comme phase dispersée dans une phase aqueuse neutre contenant à la fois le polysaccharide esté¬ rifié d'une part, et le composé polyhydroxylé ou polyaminé d'autre part, une dif— fusion d'ions alcalins à l'interface, capable de déclencher in situ la réaction de transacylation et la formation d'une membrane autour des gouttelettes hydro- phobes, et que les microparticules, de préférence les microcapsules, ainsi formées puis neutralisées par addition d'une solution d'un acide dans un liquide organique miscible à l'eau ou dans l'eau, pouvaient être aisément séparées de la phase dis- persante sans problème de prise en masse.
Enfin, on a découvert que des microparticules, de préférence des microcapsules, pouvaient être préparées par une réaction de transacylation inter¬ faciale à partir d'une part d'un polysaccharide estérifié tel que le PGA dissous dans la phase aqueuse, et d'autre part d'un composé polyhydroxylé tel qu'un dérivé cel- lulosique, ou polyaminé, tel que l'hexaméthylènediamine, dissous dans une phase hydrophobe. La phase aqueuse peut être utilisée comme phase dispersée ou comme phase dispersante. Toutefois, si on alcalinise la solution de polysaccharide estéri¬ fié avant le stade d'émulsification, des réactions d'hydrolyse des groupements ester et de transestérification entre chaînes polysaccharidiques vont diminuer le nombre de groupements ester disponibles pour la réaction, ce qui n'est pas favorable à la formation de la membrane, tout en produisant une augmentation de viscosité de la phase aqueuse gênant l'émulsification.
On devra donc utiliser une solution aqueuse neutre du polysaccharide estérifié et, une fois I'émulsion obtenue en présence de la phase hydrophobe, déclencher une alcalinisation à l'interface. On a découvert que ce problème pouvait être aisément résolu en utilisant les procédés exposés plus haut. En effet, dans le cas de l'utilisation de la phase aqueuse comme phase dispersée, on a pu vérifier que l'alcalinisation in situ des gouttelettes aqueuses dispersées peut être réalisée de la même manière par addition à I'émulsion d'une solution d'une substance alcaline dans un liquide organique miscible à la phase aqueuse. Les microparticules, de préférence les microcapsules, sont neutralisées ensuite selon le même procédé à l'aide d'une solution d'un acide dans un liquide organique miscible à la phase aqueuse. De même, dans le cas où la phase hydrophobe est utilisée comme phase dispersée, on a constaté que l'on pouvait très facilement obtenir au sein de I'émul¬ sion une diffusion d'ions alcalins en périphérie des gouttelettes dispersées, par addition à la phase hydrophobe d'une solution d'un agent alcalin dans un liquide organique miscible à la phase aqueuse. De cette manière on déclenche une réaction de transacylation interfaciale. Les microparticules, de préférence les microcapsules formées, sont ensuite neutralisées par ajout au milieu réactionnel d'une solution d'un acide dans un liquide organique miscible à la phase aqueuse ou dans l'eau. C'est sur la base de cette découverte, totalement inattendue pour l'homme de l'art, que la présente invention a été réalisée. L'invention représente un progrès technique déterminant pour l'homme de l'art, compte tenu de ce que les microparticules, de préférence les microcapsules obtenues, qui résultent de l'établissement de liaisons covalentes par la réaction de transacylation, sont par- faitement stables alors que leur constitution ne fait intervenir que des substances biocompatibles, à l'exclusion de tout agent réticulant bifonctionnel. Elles pourront ainsi trouver de nombreuses applications dans divers domaines tels que la phar¬ macie, la cosmétique et l'industrie alimentaire. La possibilité d'incorporer aux microparticules, de préférence aux microcapsules, aussi bien des substances hydrophobes que des substances hydrophiles, constitue un autre avantage important de l'invention. Ainsi des microparticules, de préférence des micro- capsules, chargées d'huiles telles que les huiles essentielles, ou de solutions huileuses de substances actives, peuvent être aussi aisément préparées que des microparticules, de préférence des microcapsules, renfermant des solutions aqueuses ou même des suspensions ou des émulsions à phase continue aqueuse. En outre, la composition des microparticules, de préférence des microcapsules, pourra être choisie par exemple de manière à obtenir ou non une digestion par les protéases, en utilisant une polyaminé telle qu'une protéine ou une substance polyhydroxylée telle qu'un polysaccharide respectivement pour réagir avec le polysaccharide estérifié. Enfin, les conditions ménagées du procédé n'entraînent pas de dénaturation importante des protéines, de sorte qu'il peut être appliqué à des enzymes sans suppression de leur activité, ce qui donne un nouveau type d'enzymes immobilisées.
Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention a pour objet l'uti¬ lisation d'un réaction de transacylation entre un polysaccharide porteur de groupe- ments carboxyliques estérifiés et une substance polyaminée, en particulier un polysaccharide porteur de groupements aminé, tel que le chitosan, ou une protéine, ou une substance polyhydroxylée, en particulier un polysaccharide, pour la fabrication de microparticules, en particulier de microcapsules. De préférence, ces microparticules, en particulier ces microcapsules, contiennent un principe actif cosmétique, pharmaceutique, alimentaire, une protéine douée d'une activité biolo¬ gique telle qu'une enzyme ou l'hémoglobine.
Selon un deuxième aspect, la présente invention a également pour objet des microparticules, en particulier des microcapsules, caractérisée en ce qu'elles présentent une paroi constituée du produit de réaction entre un poly- saccharide porteur de groupements carboxyliques estérifiés et une substance poly¬ aminée, telle qu'un polysaccharide porteur de groupements aminé, tel que le chitosan, ou une protéine, ou une substance polyhydroxylée, telle qu'un poly¬ saccharide.
Selon une variante de réaction particulière, ces microparticules, en particulier ces microcapsules, présentent une paroi constituée du produit de réaction entre un polysaccharide porteur de groupements carboxyliques estérifiés et une substance polyaminée, telle qu'un polysaccharide porteur de groupements aminé, tel que le chitosan, ou une protéine, en présentant ainsi des liaisons covalentes amides impliquant les groupes aminé de la polyaminé et les groupe- ments carboxyliques du polysaccharide estérifié. Avantageusement, les propor¬ tions du polysaccharide estérifié par rapport à la polyaminé, telle qu'une protéine, ou un polysaccharide tel que le chitosan, peuvent varier de 0,4 % à 60 % en poids. Dans le cas particulier de l'emploi d'une diamine comme polyaminé, une proportion particulière de cette diamine par rap-port au polysaccharide estérifié peut être plus précisément comprise entre 5 et 30 % en poids. Selon une autre variante de réalisation, les microparticules, en parti¬ culier les microcapsules, sont caractérisées en ce qu'elles présentent une paroi constituée du produit de réaction d'un polysaccharide porteur de groupements carboxyliques estérifiés et d'une substance polyhydroxylée, par exemple un poly¬ saccharide, par l'intermédiaire de liaisons covalentes ester impliquant les groupements carboxyliques du polysaccharide estérifié et les groupements hydroxyles du composé polyhydroxylé. Avantageusement, les proportions de polysaccharide estérifié par rapport aux composés polyhydroxylés peuvent varier de 5 % à 300 % en poids.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, ces micro- particules, en particulier ces microcapsules, contiennent un principe actif cos¬ métique, pharmaceutique, alimentaire, ou une protéine à activité biologique telle qu'une enzyme ou l'hémoglobine, ou encore des bulles de gaz tel que l'air.
Selon un troisième aspect, la présente invention concerne un procédé de fabrication de microparticules, en particulier de microcapsules, caractérisé par les étapes successives suivantes : a) on prépare une solution aqueuse neutre renfermant d'une part un polysaccharide porteur de groupements carboxyliques estérifiés, et d'autre part soit une substance polyaminée comme par exemple un polysaccharide porteur de grou¬ pements aminé, tel que le chitosan, ou une protéine, soit une substance polyhydroxylée comme par exemple un polysaccharide ; b) on prévoit un liquide hydrophobe dans lequel le polysaccharide estérifié et la substance polyaminée ou polyhydroxylée sont essentiellement inso¬ lubles ; c) on mélange le liquide hydrophobe et la solution aqueuse pour for- mer une émulsion ; d) on ajoute à I'émulsion une solution d'une substance alcaline dans un liquide organique miscible à la phase aqueuse ; e) après une période de temps prédéterminée nécessaire pour réaliser une réaction de transestérification, en formant ainsi des microparticules, en parti- culier des microcapsules, on réalise une neutralisation de I'émulsion, de préférence en ajoutant à I'émulsion une solution d'une substance acide dans un liquide organique miscible à la phase aqueuse ; ce qui neutralise et stabilise les micro¬ particules, en particulier les microcapsules formées.
Selon une variante de réalisation, on forme une émulsion de la solution aqueuse comme phase dispersée dans le liquide hydrophobe formant la phase con- tinue.
Selon un autre mode de réalisation, le liquide hydrophobe forme la phase dispersée, dans ce cas, on ajoute dans le liquide hydrophobe une solution d'une substance alcaline dans un liquide organique miscible à la phase aqueuse, puis cette phase hydrophobe est dispersée dans la solution aqueuse neutre pré- citée formant la phase continue de manière à former I'émulsion précitée, ce qui permet de laisser se développer la réaction de transacylation à la surface des gout¬ telettes dispersées par diffusion des ions alcalins jusqu'à l'interface.
Ainsi, selon encore un quatrième aspect, la présente invention concerne un procédé de fabrication de microparticules, en particulier de micro- capsules, caractérisé par les étapes successives suivantes : a) on prépare une solution aqueuse neutre d'un polysaccharide porteur de groupements carboxyliques estérifiés ; b) on prépare une solution hydrophobe d'une substance polyaminée telle que par exemple un polysaccharide porteur de groupements aminé, tel que le chitosan, ou une protéine, une diamine, ou d'une substance polyhydroxylée telle que par exemple un polysaccharide, rhydroxypropylcel-lulose, dans un liquide hydrophobe, dans lequel le polysaccharide estérifié est essentiellement insoluble, puis on ajoute à cette solution une solution d'un agent alcalin dans un liquide organique miscible à la phase aqueuse ; c) on forme une émulsion de ce mélange utilisé comme phase disper¬ sée dans la solution aqueuse neutre du polysaccharide estérifié formant la phase continue, et on laisse se développer la réaction de transacylation à la surface des gouttelettes dispersées, par diffusion des ions alcalins jusqu'à l'interface ; d) après réaction pendant une période de temps prédéterminée, on ajoute au milieu reactionnel une solution d'une substance acide dans un liquide organique miscible à la phase aqueuse ou dans l'eau, de manière à neutraliser et ainsi stabiliser les microparticules, en particulier les microcapsules.
Selon un autre mode de réalisation, la présente invention concerne encore un procédé de fabrication de microparticules, en particulier de micro- capsules, caractérisé par les étapes successives suivantes : a) on prépare une solution aqueuse neutre d'un polysaccharide porteur de groupements carboxyliques estérifiés. b) On prépare une solution d'une substance polyaminée ou d'une substance polyhydroxylée dans un liquide hydrophobe, dans lequel le polysac- charide estérifié est essentiellement insoluble. c) On forme une émulsion de la solution aqueuse utilisée comme phase dispersée dans le liquide hydrophobe formant la phase continue. d) On ajoute à I'émulsion une solution d'une substance alcaline dans un liquide organique miscible à la phase aqueuse, de manière à déclencher la réaction interfaciale de transacylation et former ainsi des microparticules, en particulier des microcapsules. e) Après réaction, on ajoute à I'émulsion une solution d'une substance acide dans un liquide organique miscible à la phase aqueuse, de manière à neutra¬ liser et ainsi stabiliser les microparticules, en particulier les microcapsules. Avantageusement, le procédé précité peut encore comprendre une étape complémentaire de séparation des microparticules, en particulier des micro- capsules par tout moyen approprié, notamment par décantation naturelle après avoir éventuellement effectué un ou plusieurs lavages.
Selon une caractéristique avantageuse des procédés de fabrication selon l'invention, les microparticules, en particulier les microcapsules, une fois séparées du milieu reactionnel peuvent être placées dans une solution calcique aqueuse ou alcoolique, de manière à déclencher une réaction entre les groupes fonctionnels du polysaccharide estérifié et les ions calcium. Il est bien connu qu'une telle réaction engendre une structure en réseau susceptible de se comporter comme un système matriciel. La structure particulière des microparticules, en particulier des microcapsules obtenues, est ainsi susceptible de permettre un piégeage plus efficace et/ou une diffusion ralentie des substances encapsulées ou emprisonnées dans la matrice.
Selon une caractéristique avantageuse de l'invention qui est bien entendu applicable à l'un quelconque des aspects de l'invention, la substance ou le composé polyaminé peut être une protéine, partiellement hydrolysée ou non, greffée ou non de longue chaîne hydrocarbonée. Par longue chaîne hydrocarbonée, on entend des chaînes comportant de 10 à 30 atomes de carbone. La substance ou composé polyaminé peut également être choisie parmi une protéine hydrophile, c'est-à-dire soluble dans l'eau ou dispersible dans l'eau, contenant des groupements aminé libres. Il n'est pas essentiel que les matières protéiques utilisées dans la réac¬ tion soient des protéines pures. Elles peuvent être utilisées sous la forme de mélanges naturels ou non contenant des protéines hydrophiles, comme par exemple le lait, ou des mélanges d'atélocoliagène et de glycosaminoglycannes. Des exemples de protéines qui peuvent être utilisées dans l'invention et qui remplissent les conditions qui consistent à être hydrophiles ou bien qui peuvent être traitées pour être hydrophiles sont les albumines comme la sérumalbumine, l'ovalbumine, l'alpha-lactalbumine, des globulines, le fibrinogène, la caséine, des glutélines qui de préférence auront été dégradées, des scléroprotéines solubilisées, le coUagène, l'atélocoUagène, la gélatine, l'hémoglobine, des enzymes telles que la catalase.
Comme exemples de mélanges contenant des protéines hydrophiles, on peut citer le lait entier ou écrémé totalement ou partiellement, le lait en poudre, le lait condensé, les protéines du lactosérum, l'oeuf entier, le jaune d'oeuf, les mélanges d'atélocoliagène et de glycosaminoglycannes.
Dans le cadre de l'invention, la substance polyaminée peut être un polysaccharide porteur de groupements aminé, tel que le chitosan, une diamine telle qu'une alkylènediamine et, de préférence ayant de 2 à 6 atomes de carbone comme l'éthylènediamine, la triméthylènediamine, la tétraméthylènediamine, la pentaméthylènediamine, l'hexaméthylènediamine, une diamine comprenant un noyau aromatique telle que la m-phénylènediamine, la p-phénylènediamine, une alkylènepolyamine telle que la tétraéthylènepentamiπe, une aminé comportant un atome d'azote intégré dans un cycle comme la pipérazine, ces exemples étant cités à titre illustratif et non limitatif. Selon une autre caractéristique avantageuse de l'invention, applicable pour l'un quelconque des aspects de l'invention, le polysaccharide estérifié est un polysaccharide hydrophile porteur de nombreux groupements carboxyliques, lesquels sont estérifiés dans une proportion au moins égale à 50 %, soit naturellement, soit par modification chimique. Selon une caractéristique préférée, l'ester polysaccharidique est choisi parmi l'alginate de propylèneglycol et les pectines.
Selon une autre caractéristique avantageuse des procédés selon l'invention, la concentration en ester polysaccharidique dans la phase aqueuse est comprise entre 0,4 % et 5 % p/v, et encore mieux de 0,7 à 2 %, et encore de préférence voisine de 1 %. Selon une autre caractéristique avantageuse des procédés selon l'invention, la concentration en protéine ou polyaminé dans la phase aqueuse est comprise entre 0,2 % et 35 %.
Selon une autre caractéristique avantageuse de l'invention applicable pour l'ensemble des aspects de l'invention, la substance polyhydroxylée susceptible de réagir avec le polysaccharide estérifié est un polysaccharide ou dérivé de polysaccharide tel que l'amidon ou l'amidon partiellement hydrolyse, l'hydroxy- éthylamidon, le carboxyméthylamidon, l'alginate de sodium, la gomme guar, la gomme arabique, la gomme adragante, divers dérivés de cellulose tels que hydroxypropylcellulose, la carboxyméthylcellulose, l'éthylcellulose, l'hydroxy- propylméthylcellulose, l'hydroxyéthylcellulose.
Selon une autre caractéristique avantageuse de l'invention applicable pour l'ensemble des aspects de l'invention, la substance polyhydroxylée susceptible de réagir avec le polysaccharide estérifié est un polyalcool tel que l'alcool polyvinylique, un alkylèneglycol, en particulier un C2-C6 alkylèneglycol, par exemple l'éthylèneglycol, le 1,4-butanediol, l'hexaméthylèneglycol, le glycérol, ces polyalcools étant cités à titre illustratif et sans limitation.
La phase aqueuse peut être constituée soit d'eau pure, soit d'un tam¬ pon de pH compris entre 5,9 et 8, de préférence entre 6,8 et 7,5. Comme liquide hydrophobe dans lequel la protéine ou la polyaminé et l'ester polysaccharidique sont insolubles, on peut utiliser tout solvant décrit dans les documents précédents. De préférence, on utilise le chloroforme, le dichloro- méthane, le cyclohexane, l'huile de paraffine, le myristate d'isopropyle ou encore des glycérides naturels ou synthétiques, purs ou en mélanges, des huiles végétales par exemple l'huile d'arachide, l'huile d'olive, l'huile de colza, des esters d'acides gras et de divers alcools comme par exemple les oléates de méthyle ou d'éthyle, seuls ou en mélanges.
Selon une autre caractéristique avantageuse des procédés selon l'invention, I'émulsion est réalisée en présence d'un tensioactif. Quand la phase aqueuse est utilisée comme phase dispersée, on pourra utiliser par exemple un ester de sorbitanne ou une lécithine, incorporés à la phase hydrophobe. Quand la phase hydrophobe est utilisée comme phase dispersée, on pourra utiliser par exemple du polysorbate incorporé à la phase aqueuse. Toutefois, un tensioactif n'est pas néces¬ saire au bon déroulement des procédés selon l'invention et il peut être omis. Selon une autre caractéristique avantageuse des procédés selon l'invention, le liquide organique alcalin miscible à la phase aqueuse est une solu- tion de soude ou de potasse dans un alcool tel que le méthanol ou l'éthanol, uti¬ lisés purs ou renfermant 5 à 10 % d'eau, ou encore un polyol, tel que le glycérol ou un polyéthylèneglycol. Selon une caractéristique préférée, la solution contient entre 0,5 et 2 % p/v de soude dans l'éthanol à 95 %, et encore de préférence une concentration de soude voisine de 2 %.
Selon une autre caractéristique avantageuse des procédés selon l'invention, le temps pendant lequel un pH alcalin est maintenu pour le dévelop¬ pement de la réaction de transacylation est compris entre 5 min et 1 h, de préfé¬ rence entre 5 min et 30 min, de préférence encore il est de 15 min. Selon une autre caractéristique avantageuse des procédés selon l'invention, le liquide organique acide miscible à la phase aqueuse est une solution d'un acide organique monocarboxylique ou polycarboxylique, porteur ou non de fonctions alcool, comme l'acide acétique, l'acide citrique, l'acide lactique, l'acide tartrique, l'acide succinique, l'acide malique, ou d'un acide minéral comme l'acide chlorhydrique, dans un alcool tel que le méthanol ou l'éthanol, purs ou renfermant 5 à 10 % d'eau, ou encore dans un polyol, tel que le glycérol ou un polyéthylène¬ glycol. Selon une caractéristique préférée, la solution acide est constituée d'éthanol à 95 %, contenant entre 1 et 10 % (v/v) d'acide acétique, et de préférence entre 7 et 8 %. Selon une autre caractéristique avantageuse des procédés selon l'invention, le temps de neutralisation des microcapsules, c'est-à-dire le temps d'agitation nécessaire après ajout de la solution acide au milieu reactionnel, est compris entre 5 min et 1 h, de préférence entre 5 min et 30 min, de préférence encore il est de 15 min. Selon le type d'émulsion réalisée et le protocole choisi, on peut intro¬ duire dans la phase aqueuse ou dans la phase huileuse un ou plusieurs principes actifs à l'état de solution, de suspension ou d'émulsion, en particulier une ou plusieurs substances d'intérêt cosmétique, pharmaceutique ou alimentaire.
On peut également emprisonner une mousse à l'intérieur des micro- particules, en particulier des microcapsules. Ainsi par exemple, on peut incorporer des bulles de gaz tel que l'air à une solution aqueuse de protéine et de polysac¬ charide estérifié en la soumettant à une agitation très vive. On applique ensuite à la mousse le procédé de l'invention en l'utilisant comme phase aqueuse dispersée au sein d'une phase hydrophobe. Après séchage, les microparticules, en particulier les microcapsules, contiennent une multitude de bulles de gaz tel que de l'air emprisor ées. De telles microparticules, en particulier des microcapsules, trouvent une indication d'emploi dans les méthodes de diagnostic médical par échographie. Lorsqu'on utilise pour réagir avec le polysaccharide estérifié une pro¬ téine douée d'une activité biologique telle qu'une enzyme ou l'hémoglobine, les microcapsules obtenues selon l'invention peuvent constituer une forme immobi¬ lisée d'utilisation facile, notamment dans les domaines des biotechnologies, des bioréactifs ou de la thérapeutique. Ainsi, par exemple, pour le domaine de la théra¬ peutique, les enzymes immobilisées ou encapsulées trouvent des indications d'emploi intéressantes en thérapie substitutive, par voie orale dans les insuffisances en enzymes digestives, par voie parentérale pour le traitement des maladies liées à des déficiences enzymatiques congénitales. Elles sont également utiles dans le cadre du traitement de certaines tumeurs, ou localement pour le traitement des plaies et ulcères, ou même dans des systèmes extracorporels d'épuration sanguine. L'immobilisation a pour effet de protéger l'enzyme contre des agents inactivants divers, d'en ralentir l'attaque par les protéases, d'en diminuer l'immunogénicité. Pour ce qui concerne l'hémoglobine, des microcapsules préparées à partir de cette protéine et ayant conservé ses propriétés oxyphoriques ont des applications comme "hématies artificielles", ou encore en biotechnologie pour l'oxygénation des bio¬ réacteurs. Enfin, selon un cinquième aspect, la présente invention concerne encore une composition telle qu'une composition cosmétique ou une composition pharmaceutique, ou une composition alimentaire, ou une composition enzymatique, caractérisée en ce qu'elle comprend des microparticules, en particulier des microcapsules, présentant une paroi constituée du produit de réaction d'une substance polyaminée ou polyhydroxylée avec un polysaccharide porteur de groupements carboxyliques estérifiés, soit par l'intermédiaire de liaisons amide impliquant les groupements aminé de la protéine ou de la polyaminé d'une part, et d'autre part les groupements carboxyliques du polysaccharide, soit par l'intermédiaire de liaisons ester impliquant d'une part les groupements hydroxyle de la substance polyhydroxylée, et d'autre part les groupements carboxyliques du polysaccharide estérifié.
Diverses variantes de réalisation de cette composition résultent clairement des diverses caractéristiques ou variantes avantageuses des procédés de l'invention décrits selon l'un quelconque des autres aspects précédents, ainsi que de la description suivante faite en référence à de nombreux exemples de réalisation de l'invention donnés à titre illustratif et qui ont donc une portée générale. Ainsi, pour la réalisation de l'invention, il est clair que lorsqu'on utilise un procédé de fabrication dans lequel on prépare une solution aqueuse contenant un polysaccharide porteur de groupement carboxylique estérifié et une substance polyaminée ou une substance polyhydroxylée, cette substance doit être choisie pour sa capacité de solubilité en solution aqueuse. De même, lorsque dans le cadre d'un procédé de l'invention on prépare une solution hydrophobe d'une substance polyaminée ou polyhydroxylée, celle-ci est choisie pour ses capacités de solublité en solution hydrophobe, comme cela est bien connu à l'homme de l'art.
D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à la lumière de la description explicative qui va suivre, faite en réfé¬ rence à plusieurs exemples de réalisation de l'invention donnés simplement à titre d'illustration et qui ne sauraient donc en aucune façon limiter la portée de l'inven¬ tion.
Exemple 1 selon l'invention
Fabrication de microparticules de diamètre moyen 150 μm à partir de sérumalbumine humaine (HSA) et d'alginate de propylèneglycol (PGA). a^ Préparation de la phase aqueuse
On prépare, par agitation magnétique de 10 min à température ambiante, une solution dans l'eau distillée renfermant 20 % d'HSA (Centre de Transfusion Sanguine, Strasbourg) et 1 % d'un PGA présentant un taux d'esté- rification compris entre 80 et 85 % (Kelcoloïd S®, KELCO International). b) Emulsification
On émulsionne 6 ml de cette phase aqueuse utilisée comme phase dispersée dans 40 ml de myristate d'isopropyle contenant 2 % v/v de Span 85® comme phase dispersante, par agitation mécanique de 5 min à 2000 tr/min. c) Alcalinisation
On ajoute à I'émulsion en agitation 2 ml d'une solution de soude à 2 % p/v dans l'éthanol à 95 % et on laisse la réaction de transacylation se développer pendant 15 min, ce qui produit des microparticules. d) Acidification
On ajoute au milieu reactionnel en agitation 2 ml d'une solution à 7,6 % v/v d'acide acétique dans l'éthanol à 95 %. L'agitation est encore maintenue pendant 15 min de manière à permettre la neutralisation des microparticules for- mées. e) Lavages
Les microparticules sont séparées par centrifugation, puis lavées par remises en suspension dans de l'éthanol à 95 % renfermant 2 % de Tween 20®, puis dans l'éthanol à 95 %, puis dans l'eau distillée. Les microparticules peuvent être ensuite congelées et lyophilisées.
On obtient des sphères transparentes de taille moyenne 150 μm. Après lyophilisation, la réhydratation de la poudre obtenue montre que les microparticules sont intactes et reprennent leur forme sphérique.
Essais de stabilité dans divers milieux contenant ou non des protéases Dans des tubes à essais, des prises d'essai de 25 mg de microparticules lyophilisées sont réhydratées par addition de 1 ml d'eau distillée, puis additionnées de 7,5 ml de différents milieux :
- de l'eau distillée
- une solution de pH acide (1,2) additionnée ou non de pepsine (milieu gastrique artificiel, USP XXI)
- une solution de pH légèrement alcalin (7,5), additionnée ou non de trypsine (0,25 % p/v).
Les tubes sont incubés à 37*C. La stabilité des microparticules est étudiée par examen microscopique. Le temps de lyse est le temps au bout duquel toutes les microparticules ont disparu du milieu.
Résultats : les microparticules préparées selon l'exemple 1 sont stables plus de 3 j dans l'eau distillée comme dans les solutions de pH 1,2 ou de pH 7,5. Elles sont dégradées par les protéases : en 15 min par la pepsine, en 25 min par la trypsine.
Exemple 2 selon l'invention
Fabrication de microparticules de diamètre moyen 15 μm à partir d'HSA et de PGA.
Le protocole décrit à l'exemple 1 est reproduit en remplaçant le myri- state d'isopropyle par de l'huile de paraffine fluide.
On obtient des microparticules sphériques de diamètre moyen proche de 15 μm. Cet exemple montre que, pour des conditions d'émulsification données, on peut ajuster le diamètre des microparticules par le choix de la phase dispersante. Exemple 3 selon l'invention
Fabrication de microparticules de diamètre moyen 200 μm à partir d'ovalbumine et de PGA et contenant un colorant hydrosoluble.
Le protocole décrit à l'exemple 1 est reproduit en remplaçant la sérum- albumine humaine par l'ovalbumine (LABOSl), utilisée à la même concentration (20 %) et en dissolvant dans la phase aqueuse du bleu patenté N à la concentra¬ tion de 1 %. Le protocole de lavage est modifié : les microparticules sont lavées au cyclohexane. Elles sont ensuite débarrassées du solvant par évaporation sous vide, congelées et lyophilisées. On obtient des microparticules sphériques, de couleur bleue, de dia¬ mètre moyen 200 μm. Elles résistent plus de 3 j à une incubation dans l'eau distil¬ lée, ou dans une solution de pH 1,2, ou dans une solution de pH 7,5. Les micro- particules résistent au moins 24 h à la pepsine et sont lysées en 3 h par la trypsine. Essai de stabilité dans l'eau distillée à 45*C Les microcapsules qui viennent d'être obtenues en suspension dans l'eau distillée sont centrifugées et débarrassées du surnageant. On prélève 1 g du culot de microcapsules ainsi essorées et on met cette prise d'essai en suspension dans 50 ml d'eau distillée stérile. Le flacon est bouché puis placé à l'étuve à 45*C. On observe que les microcapsules sont restées intactes après 2 mois 1/2 de séjour en étuve.
Exemple 4 selon l'invention
Fabrication de microparticules de diamètre moyen 75 μm à partir d'ovalbumine et de PGA. Le protocole décrit à l'exemple 3 est reproduit en remplaçant le myri¬ state d'isopropyle par le chloroforme et en utilisant du polyéthylèneglycol 200 au lieu d'éthanol à 95 % pour préparer les solutions de soude et d'acide acétique.
On obtient des microparticules de diamètre moyen 75 μm.
Exemple 5 selon l'invention
Fabrication de microparticules de diamètre moyen 250 μm à partir d'hémoglobine et de PGA.
Le protocole décrit à l'exemple 1 est reproduit en remplaçant la sérum- albumine humaine par l'hémoglobine de mouton (SIGMA), utilisée à la concentra- tion de 15 % p/v. On obtient des microparticules de couleur rouge vif, sphériques, de diamètre moyen 250 μm, qui peuvent être lyophilisées. Ces microparticules sont détruites par la pepsine en 10 min, par la trypsine en 3 h 30.
Essai de stabilité dans l'eau distillée à 45*C Dans les mêmes conditions d'essai de stabilité que celles décrites à l'exemple 3, on observe que les microcapsules sont intactes après 2 mois 1/2 de séjour à l'étuve à 45*C, à l'état de suspension aqueuse.
Exemple 6 selon l'invention Fabrication de microparticules de diamètre moyen 50 μm à partir d'hémoglobine et de PGA.
Le protocole décrit à l'exemple 5 est reproduit en remplaçant le myri¬ state d'isopropyle par le chloroforme.
On obtient des microparticules rouges de diamètre moyen 50 μm. C'est un autre exemple qui montre que, pour des conditions d'émulsification données, le diamètre des microparticules peut être ajusté par le choix de la phase hydrophobe dispersante.
Exemple 7 selon l'invention Fabrication de microparticules de diamètre moyen 250 μm à partir de fibrinogène et de PGA.
Le protocole décrit à l'exemple 1 est reproduit en remplaçant la sérum- albumine humaine par le fibrinogène de boeuf (SIGMA), utilisé à la concentration de 6 % p/v. On obtient des microparticules à contenu granuleux, de diamètre moyen 250 μm, qui peuvent être lyophilisées. Ces microparticules résistent plus de 24 h à la pepsine, tandis qu'elles sont lysées en 3 h par la trypsine. Essai de stabilité dans l'eau distillée à 45*C
En procédant dans les conditions d'essai de stabilité décrites à l'exemple 3, on observe que les microcapsules sont intactes après 2 mois 1/2 de séjour à l'étuve à 45*C, à l'état de suspension aqueuse. Exemple 8 selon l'invention
Fabrication de microparticules de catalase immobilisée par le PGA.
Le protocole décrit à l'exemple 1 est reproduit en remplaçant la sérum- albumine humaine par de la catalase de foie de boeuf (C-10 de SIGMA), utilisée à la concentration de 20 % p/v.
On obtient des microparticules sphériques de diamètre moyen 75 μm, donnant après lyophilisation une poudre aisément réhydratable.
Une pincée de cette poudre mise au contact d'eau oxygénée à 110 volumes produit instantanément un important dégagement gazeux sous forme de multiples bulles.
Détermination de l'activité catalasique (Méthode de Feinstein, J. Biol. Chem., 1949, 180, p. 1197)
Une prise d'essai de 5 mg de microparticules lyophilisées est réhydratée par addition de 1 ml de tampon phosphate pH 7 et agitation magnétique de 5 min à température ambiante (20*C). On ajoute 3 ml d'une solution de perborate de sodium préalablement titrée (par une solution de KMnθ4 0,005M) à 88,46 mmol/1 d'H2θ2- La réaction est stoppée après 30 s par addition de 3 ml de H2SO4 1M. Le milieu est additionné de 1 ml d'acide trichloracétique à 20 % et filtré sur filtre 0,22 μm. LΗ2O2 restant est dosé sur une aliquote du filtrat additionnée d'une goutte de MnCl2 à 1 %, par une solution de KMnθ4 0,005M.
Résultats (moyenne de 3 essais) :
Après 30 s, il ne reste dans le milieu que 34,17 μmol de substrat sur les 265,37 μmol initialement présentes.
Des essais effectués parallèlement avec la catalase pure dans les mêmes conditions indiquent que, pour observer une activité comparable à celle de 5 mg de microparticules, il faut utiliser 1 ml d'une solution de catalase à 5 mg/40 ml (substrat résiduel après 30 s, moyenne de 3 essais : 37,5 μmol).
Ainsi, les 5 mg de microparticules lyophilisées, qui correspondent en fait à 4,762 mg de catalase mise en jeu dans la préparation, ont la même activité que 0,125 mg de catalase pure n'ayant pas subi de lyophilisation. Ces résultats démontrent que le procédé de préparation de microparticules selon l'invention per¬ met d'obtenir des microparticules présentant une activité enzymatique intéressante.
Exemple 9 selon l'invention Si on applique le protocole de fabrication de microparticules décrit à l'exemple 8 mais en utilisant au lieu d'une solution de soude dans l'éthanol à 95 % une solution de soude dans le polyéthylèneglycol 200 (PEG 200) à la même con¬ centration, et, au lieu d'une solution d'acide acétique dans l'éthanol à 95 %, une solution d'acide acétique dans le PEG 200 à la même concentration, on obtient également des microparticules stables (30 μm). Si on détermine l'activité catalasique d'un échantillon de 5 mg de ces microparticules lyophilisées dans les conditions décrites à l'exemple 8, on constate qu'une seule goutte de KMnθ4 0,005 M suffit à colorer le contenu de la fiole de dosage : tout IΗ2O2 a donc été décomposé en 30 s.
Ainsi, lorsque les solutions des agents alcalin et acide sont préparées avec un PEG au lieu d'ethanol, on limite la dénaturation de l'enzyme, ce qui per¬ met de préserver une plus grande part de l'activité enzymatique.
Exemple 10 selon l'invention
Fabrication de microparticules à partir de gélatine et de PGA. Préparation de la phase aqueuse : on prépare, à la température de 40*C,
8 ml d'une solution aqueuse de gélatine type B, bloom 150, à la concentration de 10 %, et de PGA à la concentration de 1 %.
Emulsification : dans un récipient thermostaté à 40*C, 6 ml de cette phase aqueuse sont émulsionnés dans 40 ml de myristate d'isopropyle contenant 2 % de Span 85 et préchauffés à la température de 40*C (vitesse d'agitation : 2000 tr/min).
L'alcalinisation, la neutralisation et les lavages sont ensuite effectués comme décrit dans l'exemple 1. Les microparticules apparaissent comme des sphères de diamètre moyen 1 mm. Après lyophilisation, elles donnent une poudre blanche qui se réhydrate facilement.
Exemple 11 selon l'invention
Fabrication de microparticules à partir d'atélocoliagène et chondroïtine sulfate et de PGA. Préparation de la phase aqueuse : une solution à 1,6 % d'atélocol¬ iagène et 0,6 % de chondroïtine sulfate dans un tampon phosphate pH 7,4 est addi¬ tionnée de PGA à la concentration de 0,7 %. Le protocole décrit à l'exemple 1 est ensuite appliqué à cette solution aqueuse.
On obtient des microparticules de diamètre moyen 600 μm. Exemple 12 selon l'invention
Fabrication de microparticules à partir d'atélocoliagène et chondroïtine sulfate et de PGA avec traitement ultérieur au CaCh.
Le protocole décrit à l'exemple 11 est reproduit en ajoutant, 15 min après l'ajout de la solution alcoolique acide, 40 ml d'ethanol à 95 % contenant 2 % de Tween 20 et 2 % de CaCl2. L'agitation est poursuivie pendant 15 min, puis les microparticules sont séparées par centrifugation et lavées comme décrit à l'exemple 1.
On obtient des microparticules à contenu granuleux de diamètre moyen 300 μm.
Exemple 13 selon l'invention
Fabrication de microparticules à partir d'atélocoliagène et chondroïtine sulfate et de PGA et contenant des bulles d'air. Préparation de la phase aqueuse : à une solution à 1,6 % d'atélocol¬ iagène et 0,6 % de chondroïtine sulfate dans un tampon phosphate pH 7,4, on ajoute du PGA à la concentration de 0,7 % et on mélange par agitation mécanique à faible vitesse (300 tr/min) pendant 6 min.
Incorporation d'air : de manière à incorporer des bulles d'air à la phase aqueuse, la vitesse d'agitation est augmentée à 5 000 tr/min et maintenue à cette valeur pendant 3 min, ce qui produit une mousse.
Emulsification : 24 ml de la mousse sont émulsionnés à l'état de phase dispersée dans 80 ml de myristate d'isopropyle contenant 2 % de Span 85, avec une vitesse d'agitation de 2 000 tr/min. Les opérations d'alcalinisation et d'acidification sont ensuite effectuées comme décrit dans l'exemple 1, mais en utilisant 8 ml des solutions alcooliques alcaline et acide. Les lavages sont effectués comme décrit dans l'exemple 1.
On obtient des microparticules de diamètre moyen 600 μm, de couleur beige, translucides, contenant des bulles d'air visibles (20 à 30 environ par micro- particule), et flottant à la surface de l'eau. Après lyophilisation, les microparticules une fois réhydratées apparaissent au microscope chargées de bulles d'air. Elles flottent sur l'eau pendant au moins 9 h. Après 48 h, les microparticules ont sédi- menté. Les bulles d'air ne sont plus présentes dans les microparticules, qui con¬ servent, à la place qu'elles occupaient, des cavités circulaires lisses visibles au microscope optique à contraste de phase interférentiel. Exemple 14 selon l'invention
Fabrication de microparticules à partir de lait entier et de PGA et con¬ tenant un pigment insoluble en suspension.
Préparation de la phase aqueuse : on dissout 60 mg de PGA dans 6 ml de lait liquide entier par agitation. On disperse dans cette solution 60 mg de colorant rouge insoluble, le RED DC 30, par agitation.
Le protocole décrit à l'exemple 1 est ensuite reproduit en utilisant comme phase aqueuse 6 ml de la solution précédente.
On obtient des microparticules de couleur rouge, de diamètre moyen 300 μm. Les microparticules sont intactes après lyophilisation.
Exemple 15 selon l'invention
Fabrication de microparticules à partir de lait écrémé en poudre et de PGA et contenant de l'huile d'olive émulsionnée dans la phase aqueuse. Préparation de la phase aqueuse : on dissout 4 g de lait en poudre écrémé dans 16 ml d'eau distillée par agitation de 3 min. 160 mg de PGA sont ensuite dissous dans cette solution par agitation de 6 min.
Dans la solution obtenue utilisée comme phase dispersante, on émul- sionne 3 ml d'huile d'olive utilisée comme phase dispersée, par agitation à 5 000 tr/ min.
Le protocole décrit à l'exemple 1 est ensuite reproduit en utilisant comme phase aqueuse 12 ml de I'émulsion précédente et en doublant tous les volumes des différents réactifs. Les microparticules sont lavées au moyen d'eau distillée additionnée de 2 % de Tween 20, puis avec de l'eau distillée. Après lavage, on obtient des microparticules bien sphériques, de dia¬ mètre moyen 400 μm. L'examen microscopique montre un contenu granuleux au sein duquel on distingue les gouttelettes d'huile sous forme de très petites sphères réfringentes. Les microparticules sont intactes après lyophilisation.
Exemple 16 selon l'invention
Fabrication de microparticules à partir de lait écrémé en poudre et de PGA et contenant de l'huile essentielle de menthe poiyrée émulsionnée dans la phase aqueuse.
Préparation de la phase aqueuse : on dissout 1,6 g de lait en poudre écrémé dans 8 ml d'eau distillée par agitation de 3 min. 80 mg de PGA sont ensuite dissous dans cette solution par agitation de 6 min. Dans la solution obtenue utilisée comme phase dispersante, on émul- sionne 1 ml d'huile essentielle de menthe poivrée utilisée comme phase dispersée, par agitation à 5 000 tr/min.
Le protocole décrit à l'exemple 1 est ensuite reproduit en utilisant comme phase aqueuse 6 ml de I'émulsion précédente. L'alcalinisation est réalisée par addition de 2 ml d'une solution de potasse à 2,8 % dans l'éthanol à 95 %, et l'acidification, par addition de 2 ml d'une solution à 28,1 % d'acide citrique hydraté à 1 mol H2O dans l'éthanol à 95 %. Les microparticules sont lavées comme décrit à l'exemple 15. On obtient des microparticules bien sphériques, de diamètre moyen
150 μm. L'examen microscopique montre un contenu granuleux au sein duquel on distingue les gouttelettes d'huile essentielle sous forme de très petites sphères réfringentes.
Exemple 17 selon l'invention
Fabrication de microparticules à partir d'un concentré de protéines du lactosérum et de PGA.
Préparation de la phase aqueuse : dans 16 ml d'eau distillée, on dissout 160 mg de PGA, et 3,2 g de concentré de protéines du lactosérum (Prosobel S65E, Bel Industries).
Le protocole décrit à l'exemple 1 est ensuite reproduit en utilisant comme phase aqueuse 12 ml de la solution précédente et en doublant tous les volumes des différents réactifs.
On obtient des microparticules sphériques à contenu granuleux, de diamètre moyen 500 μm, qui sont intactes après lyophilisation.
Exemple 18 selon l'invention
Fabrication de microparticules à partir d'hexaméthylènediamine (HMD Fluka^ et de PGA. Préparation de la phase aqueuse : on dissout 16 mg d'HMD dans 4 ml de tampon phosphate pH 5,9. On dissout séparément 200 mg de PGA dans 5 ml de tampon phosphate pH 5,9. On mélange par agitation de 1 min les 4 ml de la solu¬ tion d'HMD avec 4 ml de la solution de PGA.
Le protocole décrit à l'exemple 1 est ensuite reproduit en utilisant comme phase aqueuse 6 ml de la solution précédente et en remplaçant le myri¬ state d'isopropyle par du chlorure de méthylène. On obtient des microparticules transparentes, de diamètre moyen 400 μm, qui sont intactes après lyophilisation. Elles résistent plus de 24 h à la trypsine comme à la pepsine.
Exemplel9 selon l'invention
Fabrication de microparticules à partir d'ovalbumine et de pectine. Préparation de la phase aqueuse : dans 8 ml d'eau distillée, on dissout 240 mg de pectine de pomme (FLUKA, estérification : 70 à 75 %), et 800 mg d'ovalbumine. Puis le protocole décrit dans l'exemple 1 est appliqué, en utilisant 6 ml de la solution précédente, en remplaçant le myristate d'isopropyle par de l'huile de paraffine fluide, et en doublant les volumes des solutions alcaline et acide.
On obtient des microparticules de taille moyenne 200 μm, à contenu granuleux.
Exemple 20 selon l'invention
Fabrication de microparticules à partir de lait en poudre et de pectine. Préparation de la phase aqueuse : dans 8 ml d'eau distillée, on dissout 240 mg de pectine de pomme, et 800 mg de lait en poudre écrémé GLORIA. Puis, le protocole décrit dans l'exemple 1 est appliqué, en utilisant 6 ml de la solution précédente, en remplaçant le myristate d'isopropyle par de l'huile de paraffine fluide et en doublant les volumes des solutions alcaline et acide. On obtient des microparticules sphériques de taille comprise entre 2 μm et 300 μm qui peuvent être lyophilisées.
Exemple 21 selon l'invention
Fabrication de microparticules à partir d'alcool polvvinylique (PNA) et de PGA.
Préparation de la phase aqueuse : dans 8 ml d'eau distillée, on dissout à 40*C 80 mg de PNA (MERCK, degré d'hydrolyse : 98 %, poids moléculaire 72000) et 320 mg de PGA.
Puis, le protocole décrit dans l'exemple 1 est appliqué, en utilisant 6 ml de la solution précédente, et en remplaçant le myristate d'isopropyle par de l'huile de paraffine fluide. On obtient des microparticules sphériques de taille moyenne 1,2 mm. Exemple 22 selon l'invention
Fabrication de microparticules à partir d'hydroxyéthylamidon (ΗEA'i et de PGA.
Préparation de la phase aqueuse : dans 8 ml d'eau distillée, on dissout 1,472 g de Plasmastéril (Frésénius A.G.) correspondant à 1,28 g d'HEA, et 320 mg de PGA.
Puis le protocole décrit dans l'exemple 1 est appliqué, en utilisant 6 ml de la solution précédente, et en remplaçant le myristate d'isopropyle par de l'huile de paraffine fluide. On obtient des microparticules sphériques de taille moyenne 600 μm.
Exemple 23 selon l'invention
Fabrication de microparticules à partir de carboxyméthylcellulose et de PGA. Préparation de la phase aqueuse : dans 8 ml d'eau distillée, on dissout
80 mg de CMC (CMC 7 LF, degré de substitution : 0,7, HERCULES) et 320 mg de PGA, par agitation magnétique de 15 min à 40*C.
Puis le protocole décrit dans l'exemple 1 est appliqué, en utilisant 6 ml de la solution précédente. On obtient des microparticules granuleuses de taille moyenne 1,8 mm.
Exemple 24 selon l'invention
Fabrication de microcapsules à phase interne aqueuse à partir d'hvdroxypropylcellulose en solution dans un liquide hydrophobe et de PGA en solution aqueuse.
Préparation de la phase aqueuse : dans 4 ml d'eau distillée, on dissout 80 mg de PGA.
Préparation de la phase hydrophobe : dans 20 ml de chloroforme, on dissout 300 mg d'hydroxypropylcellulose (Klucel EF, AQUALON). Emulsification : 3 ml de la phase aqueuse sont émulsionnés à l'état de phase dispersée dans 20 ml de la phase hydrophobe par agitation à 2000 tr/min pendant 5 min.
Puis l'alcalinisation et l'acidification sont effectuées comme décrit dans l'exemple 1, mais en utilisant 1 ml de solution alcoolique de soude et 1 ml de la solution alcoolique d'acide acétique.
Les lavages sont effectués comme décrit dans l'exemple 1. On obtient des microcapsules sphériques, de taille moyenne 70 μm. Après lyophilisation, les microcapsules sont intactes et se réhydratent rapidement en reprenant leur forme sphérique.
Exemple 25 selon l'invention
Fabrication de microcapsules à phase interne hydrophobe à partir d'hvdroxypropylcellulose en solution dans un liquide hydrophobe et de PGA en solution aqueuse.
Préparation de la phase aqueuse : dans 40 ml d'eau distillée, on dissout 800 mg de PGA.
Préparation de la phase hydrophobe : à 6 ml de chloroforme, on ajoute 2 ml d'une solution à 2 % de soude dans l'éthanol à 95 %. On dissout dans ce mélange 160 mg d'hydroxypropylcellulose (Klucel EF, AQUALON).
Emulsification : les 6 ml de la phase hydrophobe sont émulsionnés à l'état de phase dispersée dans 40 ml de la phase aqueuse par agitation à 2 000 tr/ min.
Après 15 min, on ajoute 2 ml de solution alcoolique acide préparée comme décrit dans l'exemple 1. Après un nouveau temps de 15 min, les micro- capsules sont centrifugées et lavées comme décrit à l'exemple 15. On obtient des microcapsules sphériques, de taille moyenne 10 μm.
Exemple 26 selon l'invention
Fabrication de microcapsules à phase interne aqueuse à partir d'hexa- méthylènediamine en solution dans un liquide hydrophobe et de PGA en solution aqueuse.
Préparation de la phase aqueuse : dans 8 ml d'eau distillée, on dissout 160 mg de PGA.
Préparation de la phase hydrophobe : dans 40 ml de cyclohexane, on dissout 80 mg d'hexaméthylènediamine (FLUKA). Emulsification : 6 ml de la phase aqueuse sont émulsionnés à l'état de phase dispersée dans 40 ml de la phase hydrophobe par agitation à 2000 tr/min pendant 5 min.
Puis l'alcalinisation est effectuée comme décrit dans l'exemple 1. Après 15 min, l'acidification est réalisée par addition de 1 ml d'ethanol à 95 % renfermant 28,3 % v/v ml d'acide acétique. Les lavages sont effectués comme décrit dans l'exemple 1. On obtient des microcapsules sphériques, de taille moyenne 5 μm.
Exemple 27 selon l'invention
Fabrication de microcapsules à phase interne huileuse à partir d'hexa- méthylènediamine en solution dans un liquide hydrophobe et de PGA en solution aqueuse.
Préparation de la phase aqueuse : dans 40 ml d'eau distillée, on dissout 800 mg de PGA.
Préparation de la phase hydrophobe : dans 6 ml de cyclohexane addi- donnés de 2 ml d'ethanol à 95 %, contenant 2 % de soude, on dissout 16 mg d'hexaméthylènediamine.
Emulsification : 6 ml de la phase organique sont émulsionnés à l'état de phase dispersée dans 40 ml de la phase aqueuse par agitation à 2000 tr/min.
Après 15 min, l'acidification et les lavages ultérieurs sont effectués comme décrit dans l'exemple 25.
On obtient des microcapsules, de taille moyenne 50 μm.
Exemple 28 selon l'invention
Fabrication de microcapsules contenant du myristate d'isopropyle à partir de lait entier et de PGA.
Préparation de la phase aqueuse : dans 40 ml de lait entier, on dissout 400 mg de PGA.
Préparation de la phase hydrophobe : à 3 ml de myristate d'isopropyle, on ajoute 3 ml de la solution alcoolique de soude préparée comme décrit dans l'exemple 1, et on mélange par agitation magnétique pendant 2 min.
Emulsification : les 6 ml de la phase hydrophobe sont émulsionnés à l'état de phase dispersée dans les 40 ml de la phase aqueuse par agitation à 2000 tr/ min.
Après 15 min, on procède à la neutralisation par ajout de 3 ml de solution alcoolique acide préparée comme décrit à l'exemple 1.
Après 15 min, le milieu reactionnel est dilué par addition de 40 ml d'eau distillée et agitation pendant 1 min. Ensuite les microcapsules sont lavées plusieurs fois à l'eau distillée.
On obtient des microcapsules sphériques, de taille moyenne 5 μm. Exemple 29 selon l'invention
Fabrication de microcapsules contenant du myristate d'isopropyle à partir d'ovalbumine et de PGA.
Préparation de la phase aqueuse : dans 40 ml d'eau distillée, on dissout 4 g d'ovalbumine et 400 mg de PGA.
Préparation de la phase hydrophobe : à 8 ml de myristate d'isopropyle, on ajoute 4 ml de la solution alcoolique de soude préparée comme décrit dans l'exemple 1, et on mélange par agitation magnétique pendant 2 min.
Emulsification : les 12 ml de la phase hydrophobe sont émulsionnés à l'état de phase dispersée dans les 40 ml de la phase aqueuse par agitation à 2000 tr/ min.
Après 15 min, on procède à la neutralisation par ajout de 4 ml d'une solution acide préparée comme décrit à l'exemple 1. Après 15 min, on procède aux lavages comme décrit dans l'exemple 15. On obtient des microcapsules sphériques de taille moyenne 15 μm.
Lorsqu'on écrase les microcapsules en exerçant une pression sur la lamelle d'observation microscopique, on voit au microscope la gouttelette huileuse sortir de la membrane.
Exemple 30 selon l'invention
Fabrication de microcapsules à partir de jaune d'oeuf et de PGA La préparation de la phase aqueuse est réalisée en dissolvant 80 mg de PAG dans 8 ml de jaune d'oeuf par agitation.
Le protocole décrit à l'exemple 1 est ensuite reproduit en utilisant comme phase aqueuse 6 ml de la solution précédente.
On obtient des microcapsules de couleur beige, de taille moyenne 300μm après avoir été congelées et lyophilisées. Après lyophilisation, la réhydratation de la poudre obtenue de microcapsules montre que les microcapsules sont intactes et reprennent leur forme sphérique.
Exemple 31 selon l'invention
Fabrication de microcapsules à phase interne aqueuse à partir de pro¬ téine greffée d'une longue chaîne carbonée, par exemple le Lamepon S® en solution dans un liquide hydrophobe et de PGA en solution aqueuse La préparation de la phase aqueuse est réalisée en dissolvant 160 mg de PGA dans 8 ml d'eau distillée. La préparation de la phase hydrophobe est réalisée en dissolvant 3 g d'une protéine greffée d'une longue chaîne carbonée, ou polyamide disponible dans le commerce, par exemple celle connue sous le nom commercial Lamepon S®, produit disponible auprès de la société LASERSON et SABETAY bien connu à l'homme de l'art, dans 30 ml de chloroforme.
On réalise l'émulsification en émulsionnant 6 ml de la phase aqueuse à l'état de phase dispersée dans 30 ml de phase hydrophobe par agitation à 2000 tr/min pendant 5 min.
On procède ensuite à l'alcalinisation, à l'acidification et au lavage comme décrit dans l'exemple 1.
On obtient des microcapsules sphériques de taille moyenne 30 μm.
Exemple 32 selon l'invention
Fabrication de microcapsules à partir de chitosan et de PGA Pour la préparation de la phase aqueuse, on dissout 400 mg de chitosan, par exemple le produit commercialement disponible sous la référence commerciale Seacur 143 de la société PROTAN, dans 10 ml d'acide acétique IM, puis on ajuste le pH à 5,6 avec de la soude et on dissout ensuite dans cette solution
100 mg de PGA. Le protocole décrit à l'exemple 1 est ensuite reproduit en utilisant la solution précédente comme phase aqueuse.
On obtient un volumineux sédiment formé de microcapsules à membrane nette, de diamètre compris entre 50 et 500 μm.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'une réaction de transacylation entre un polysaccharide porteur de groupements carboxyliques estérifiés et une substance polyaminée, telle qu'une protéine ou une substance polyhydroxylée, telle qu'un polysaccharide porteur de groupements aminé, tel que le chitosan ou une protéine pour la fabrication de microparticules, en particulier de microcapsules.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les microparticules, en particulier les microcapsules, contiennent un principe actif cosmétique, pharmaceutique, alimentaire ou activité biologique telle qu'une pro¬ téine, en particulier une enzyme ou l'hémoglobine.
3. Microparticules, en particulier microcapsules, caractérisées en ce qu'elles présentent une paroi constituée du produit de réaction entre un-polysac- charide porteur de groupements carboxyliques estérifiés et une substance poly¬ aminée, telle qu'un polysaccharide porteur de groupements aminé, tel que le chitosan, ou une protéine, ou une substance polyhydroxylée, telle qu'un poly¬ saccharide, en particulier ayant un diamètre compris entre environ 0,1 μm et environ 5000 μm. 4. MicToparticules selon la revendication 3, caractérisées en ce que dans le cas d'une paroi formée par le produit de réaction d'un polysaccharide estérifié et d'une polyaminé, telle qu'un polysaccharide porteur de groupements aminé tel que chitosan, ou une protéine, le rapport en polysaccharide estérifié/polyamine est compris entre 0,
4 et 60 % en poids.
5. Microparticules selon la revendication 3, caractérisées en ce que dans le cas d'une paroi constituée du produit de réaction d'un polysaccharide estérifié et d'une substance polyhydroxylée, telle qu'un polysaccharide, le rapport polysaccharide estérifié/substance polyhydroxylée est compris entre 5 et 300 % en poids.
6. Microparticules selon une des revendications 3 à 5, caractérisées en ce que le polysaccharide estérifié précité comprend au moins 50 % de ses groupes carboxyliques estérifiés.
7. Microparticules selon une des revendications 3 à 6, caractérisées en ce que le polysaccharide estérifié précité est choisi parmi l'alginate de propylène- glycol et les pectines.
8. Microparticules selon une des revendications 2 à 7, caractérisées en ce qu'elles contiennent un principe actif cosmétique, pharmaceutique, alimentaire ou une substance douée d'une activité biologique telle qu'une protéine, par exemple une enzyme ou l'hémoglobine.
9. Procédé de fabrication de microparticules, en particulier de micro¬ capsules, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes : a) on prépare une solution aqueuse sensiblement neutre contenant un polysaccharide porteur de groupements carboxyliques estérifiés, une substance polyaminée, telle qu'un polysaccharide porteur de groupements aminé, tel que le chitosan, ou une protéine, ou une substance polyhydroxylée, telle qu'un polysaccharide ; b) on prévoit un liquide hydrophobe dans lequel le polysaccharide estérifié et la substance polyaminée ou polyhydroxylée sont essentiellement insolubles ; c) on mélange le liquide hydrophobe et la solution aqueuse pour for¬ mer une émulsion ; d) on ajoute soit au liquide hydrophobe soit à I'émulsion une solution d'une substance alcaline dans un liquide organique miscible à la phase aqueuse ; e) après une période de temps prédéterminée pour réaliser une réac- tion de transestérification, en formant ainsi des microparticules, en particulier des microcapsules, on neutralise I'émulsion de préférence en ajoutant à I'émulsion une solution d'une substance acide dans un milieu organique miscible à la phase aqueuse, de manière à neutraliser et stabiliser les microparticules, en particulier les microcapsules formées.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que dans le cas où la solution aqueuse forme une phase dispersée dans le liquide hydrophobe for¬ mant la phase continue, la solution de substance alcaline dans un liquide organique miscible à la phase aqueuse est ajoutée à I'émulsion.
11. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que dans le cas où la phase hydrophobe forme une phase dispersée dans la solution aqueuse neutre formant la phase continue, la solution de substance alcaline dans un liquide organique miscible à la phase aqueuse est ajoutée au liquide hydrophobe.
12. Procédé de préparation de microparticules, en particulier de micro¬ capsules, caractérisé par les étapes successives suivantes : a) on prépare une solution aqueuse neutre d'un polysaccharide porteur de groupements carboxyliques estérifiés ; b) on prépare une solution hydrophobe d'une substance polyaminée telle que par exemple un polysaccharide porteur de groupement aminé, tel que le chitosan ou une protéine, en particulier une protéine partiellement hydrolysée ou non, qui peut être greffée de longues chaînes hydrocarbonées, de préférence en C10--C30» ou une alkylènediamine, ou d'une substance polyhydroxylée telle que par exemple un polysaccharide, hydroxypropylcellulose, dans un liquide hydrophobe dans lequel le polysaccharide estérifié est essentiellement insoluble et on ajoute à cette solution une solution d'un agent alcalin dans un liquide organique miscible à la phase aqueuse ; c) on forme une émulsion de ce mélange utilisé comme phase dis¬ persée dans la solution aqueuse neutre du polysaccharide estérifié formant la phase continue, et on laisse se développer la réaction de transacylation à la surface des gouttelettes dispersées par diffusion des ions alcalins jusqu'à l'interface ; d) après réaction pendant une période de temps prédéterminée, on ajoute au milieu reactionnel une solution d'une substance acide dans un liquide organique miscible à la phase aqueuse ou dans l'eau, de manière à neutraliser et ainsi stabiliser les microparticules, en particulier les microcapsules formées.
13. Procédé de fabrication de microparticules, en particulier de micro¬ capsules, caractérisé par les étapes successives suivantes : a) on prépare une solution aqueuse neutre d'un polysaccharide porteur de groupements carboxyliques estérifiés ; b) on prépare une solution d'une substance polyaminée ou d'une substance polyhydroxylée dans un liquide hydrophobe, dans lequel le polysac¬ charide estérifié est essentiellement insoluble ; c) on forme une émulsion de la solution aqueuse utilisée comme phase dispersée dans le liquide hydrophobe formant la phase continue ; d) on ajoute à I'émulsion une solution d'une substance alcaline dans un liquide organique miscible à la phase aqueuse, de manière à déclencher la réaction interfaciale de transacylation et former ainsi des microparticules, en particulier des microcapsules ; e) après réaction pendant une période de temps prédéterminée, on ajoute à I'émulsion une solution d'une substance acide dans un liquide organique miscible à la phase aqueuse de manière à neutraliser et ainsi stabiliser les micro¬ particules, en particulier les microcapsules.
14. Procédé selon une des revendications 9 à 13, caractérisé en ce que les microparticules, en particulier les microcapsules une fois séparées du milieu reactionnel sont placées dans une solution calcique aqueuse ou alcoolique de manière à déclencher une réaction entre les groupes fonctionnels du polysac¬ charide estérifié et les ions calcium.
15. Procédé selon une des revendications 9 à 14, caractérisé en ce que la substance polyaminée précitée est choisie parmi un polysaccharide porteur de groupement aminé, tel que le chitosan, une protéine partiellement hydrolysée ou non, qu peut être greffée de longues chaînes hydrocarbonées, de préférence en Cιo-C3θ. une protéine contenant des groupements aminé libres, de préférence choisie parmi les groupes consistant de lait, de mélanges d'atélocoliagène et de glycosaminoglycannes, d'albumine comme la sérumalbumine, l'ovalbumine, l'alpha-lactalbumine, des globulines, le fibrinogène, la caséine, des glutélines, qui de préférence auront été dégradés, des scléroprotéines solubilisées, le coUagène, l'atélocoUagène, la gélatine, l'hémoglobine, des enzymes telles que la catalase, le lait entier ou écrémé totalement ou partiellement, le lait en poudre, le lait condensé, les protéines du lactosérum, l'oeuf entier, le jaune d'oeuf ; ou une diamine en particulier une alkylènediamine de préférence en C2-Cg telle que l'éthylènediamine, la triméthylènediamine, la tétraméthylènediamine, la pentaméthylènediamine, l'hexaméthylènediamine, une diamine à noyau aromatique tel que m-phénylènediamine, p-phénylènediamine, une aminé acyclique contenant un atome d'azote dans le cycle telle que la piperazine, une alkylènepolyamine telle que la tétraéthylènepentamine.
16. Procédé selon une des revendications 9 à 15, caractérisé en ce que le polysaccharide estérifié précité est un polysaccharide hydrophile porteur de groupements carboxyliques dont au moins 50 % sont estérifiés.
17. Procédé selon une des revendications 9 à 16, caractérisé en ce que le polysaccharide estérifié précité est choisi parmi l'alginate de propylèneglycol et les pectines.
18. Procédé selon une des revendications 9 à 17, caractérisé en ce que la substance polyhydroxylée précitée est choisie parmi un polysaccharide ou dérivé de polysaccharide tel que l'amidon ou l'amidon partiellement hydrolyse, l'hydroxyéthylamidon, le carboxyméthylamidon, l'alginate de sodium, la gomme guar, la gomme arabique, la gomme adragante, les dérivés de cellulose tels que l'hydroxypropylcellulose, la carboxyméthylcellulose, l'éthylcellulose, l'hydroxy- propylméthylcellulose, l'hydroxyéthylcellulose, ou un polyalcool tel que l'alcool polyvinylique, un alkylèneglycol en particulier en C2-C6, tel que l'éthylèneglycol, le 1,4-butanediol, l'hexaméthylèneglycol, le glycérol.
19. Procédé selon une des revendications 9 à 18, caractérisé en ce que le liquide hydrophobe précité est choisi parmi le myristate d'isopropyle, l'huile de paraffine, le cyclohexane, le chloroforme et le dichlorométhane, des glycérines naturelles ou synthétiques, pures ou en mélanges, des huiles végétales telles qu'huile d'arachide, huile d'olive, huile de colza, des esters d'acides gras et de divers alcools tels qu'oléate de méthyle ou d'éthyle, utilisables seuls ou en mélanges.
20. Procédé selon une des revendications 9 à 19, caractérisé en ce que I'émulsion précitée est réalisée en présence d'un tensioactif, en particulier un ester de sorbitanne ou une lécithine, ou un polysorbate.
21. Procédé selon une des revendications 9 à 20, caractérisé en ce que le liquide organique alcalin miscible à la phase aqueuse est une solution de soude ou de potasse dans un alcool tel que le méthanol ou l'éthanol utilisé pur ou renfer¬ mant 5 à 10 % d'eau, ou encore un polyol tel que le glycérol ou un polyéihylène- glycol, de préférence la solution contient entre 0,5 et 2 % en p/v de soude dans l'éthanol à 95 %.
22. Procédé selon une des revendications 9 à 21, caractérisé en ce que le liquide organique acide miscible à la phase aqueuse est une solution d'un acide organique monocarboxylique ou polycarboxylique porteur ou non de fonction alcool comme l'acide acétique, l'acide citrique, l'acide lactique, l'acide tartrique, l'acide succinique, l'acide malique, ou d'un acide minéral comme l'acide chlor- hydrique, dans un alcool tel que le méthanol ou l'éthanol, pur ou renfermant 5 à 10 % d'eau, ou encore dans un polyol tel que le glycérol ou un polyéthylèneglycol, de préférence la solution acide est constituée d'ethanol à 95 % contenant entre 1 et 10 % (v/v) d'acide acétique, de préférence entre 7 et 8 %.
23. Procédé selon une des revendications 9 à 22, caractérisé en ce que les microparticules, en particulier les microcapsules contiennent une mousse, par exemple formée de bulles de gaz tel que l'air.
24. Procédé selon l'une des revendications 9 à 23, caractérisé en ce que les microparticules, en particulier microcapsules, contiennent une phase aqueuse ou une phase hydrophobe.
25. Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que la phase aqueuse ou la phase hydrophe contenue dans les microparticules, en particulier les microcapsules, contient un ou plusieurs principes actifs à l'état de solution, de suspension ou d'émulsion, en particulier une ou plusieurs substances d'intérêt cosmétique, pharmaceutique ou alimentaire.
26. Composition telle que composition cosmétique, pharmaceutique ou alimentaire, ou enzymatique, caractérisée en ce qu'elle comprend des microparti¬ cules, en particulier des microcapsules, présentant une paroi constituée du produit de réaction d'une substance polyaminée ou polyhydroxylée avec un polysaccharide porteur de groupements carboxyliques estérifiés, en particulier telles que définies à l'une quelconque des revendications 3 à 8, ou telles qu'obtenues par le procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 25.
27. Composition selon la revendication 26, caractérisée en ce que les microparticules, en particulier les microcapsules contiennent une phase aqueuse ou une phase hydrophobe.
28. Composition selon la revendication 27, caractérisée en ce que la phase aqueuse ou la phase hydrophobe contenue dans les microparticules, en particulier les microcapsules, contient un ou plusieurs principes actifs à l'état de solution, de suspension ou d'émulsion, en particulier une ou plusieurs substances d'intérêt cosmétique, pharmaceutique ou alimentaire.
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