WO1994005696A1 - Nouveau peptide et agent antithrombotique, anticoagulant pour la circulation extracorporelle, inhibiteur de fusion cellulaire, inhibiteur de metastases cancereuses, agent de protection de preparation plaquettaire pour la transfusion, et ensemble contenant une preparation plaquettaire pour la transfusion - Google Patents

Description

明 細 書

新規べプチ ドとそれを用いた血小板凝集抑制剤、 体外循環用血 液凝固抑制剤、 細胞接着阻害剤、 ガン転移阻害剤、 輸血用血小板 製剤保護剤及び輸血用血小板製剤パッ ク。 技術分野

本発明は血小板凝集抑制作用を有する新規べプチ ド等、 並びに 当該べプチ ド等を有効成分と して含む血小板凝集抑制剤、 体外循 環用血液凝固抑制剤、 細胞接着阻害剤、 ガン転移阻害剤及び輸血 用血小板製剤保護剤並びにパッ ク中の輸血用血小板製剤中に当該 ペプチ ド等を含ませたことを特徵とする輸血用血小板製剤パッ ク に関する。 背景技術

血液中において、 血小板は、 損傷した血管の表面に相互に吸着 して、 出血を防止するという大きな役割を演じている。

しかしながら、 病的な環境下においては、 血小板の凝集は血栓 が形成される主要な原因となり、 この血栓が原因で血管が閉塞す ることが知られている。 そしてこの閉塞は、 組織や臓器への酸素 や栄養分の十分な供給を妨げ、 これが心筋梗塞や脳卒中に代表さ れる循環器の虚血性疾患の重大な原因となる。 そして、 今日にお いてかかる虚血性疾患は癌に次ぐ死亡率を示し、 大きな社会問題 なつ し 、る

外科手術時における人工心肺の使用や腎不全患者の腎透析のよ うに、 体外への血液の循環を伴う医学的処置を行う場合、 血液が 体外に循環する際にも血小板活性化と血小板凝集に起因する血液 凝固が起こ るこ とがあり、 これらの処置を実施する上で大きな障 害となっている。

よって、 これらの血栓あるいは血液凝固を防止するこ とは、 上 記虚血性疾患の発生、 あるいは安全な体外循環の実施のためには 非常に重要な事項である。

ところで血小板は、 血管損傷等により露出される内皮下組織に 存在するコラーゲン等の結合組織蛋白質や血漿中に存在する ト ロ ンビン等の血小板膜受容体への結合によって活性化される。 また 、 血小板内に存在するアデノ シンジフ ォスフ ヱイ ト （A D P ) 、 ア ドレナ リ ン、 セロ トニン、 ト ロ ンボキサン （T X) A 2等の放 出による自己分泌的な膜受容体への結合によっても活性化される 。 そして、 フ イ ブリ ノ一ゲン受容体を構成する 2種の糖蛋白質ュ ニッ 卜が細胞表面に提示され、 会合し、 受容体複合体 （ g p ll b Ili a ) を形成することによって、 フ イ ブリ ノ一ゲン架橋を介す る凝集が惹起される。

かかる g p ll b及び g p lll aを先天的に欠如した血小板無力 症 （thrombasthenia) においては、 血小板凝集能が認められない 。 よって、 g p II b III a複合体のフ イ ブリ ノ一ゲンとの結合が 血小板凝集において必須であるこ とは明らかである （Ruoslahti et al. , Science, 238， 491 (1987)) 。

上記の g p ll b Hl a複合体の性質に着目 して、 血小板の凝集 を抑制して血栓の生成を妨げよう とする試みがなされている。 例えば、 コラー （Coller) らは、 g p 11 b II I a複合体に対す るモノ ク ローナル抗体の F (ab' )₂フラ グメ ン トに強力な血小板凝 集抑制作用があることを報告しており （Blood, 68， 783, (1986))、 かかる作用を利用して、 血小板凝集抑制剤の開発が可能であるこ とを明らかにしている。

しかしながら、 当該モノ ク ローナル抗体は、 確かに血小板凝集 を抑制する治療薬と しての潜在性は認められる。 しかしながらそ の反面、 それ自体が高分子蛋白質であるため、 繰り返し投与する 場合は、 当該モノ ク ローナル抗体自体に作用する抗体が産生され ることが懸念される。

従って、 g p llb llla複合体に対するアンタゴニス トと して 性質を有し、 かつ免疫原性のない低分子化合物を有効成分とする 血小板凝集抑制剤の開発が期待されている。

また、 g p llb llla複合体とフイ ブリ ノ一ゲンの結合に関す る研究も精力的に行われている。 すなわち、 Ruoslahti らによる 一連の研究により導かれた、 細胞接着分子に共通のァ ミ ノ酸配列 である、 アルギニン一グリ シン一ァスパラギン酸 （ R G D ) の発 見 （Ruoslahti et al.， Nature, 309, 30- 33(1984))に始まって、 R GD配列を認識する レセプターの研究により、 今日では g p lib III a複合体は、 RGD配列を認識するィ ンテグリ ンフ ァ ミ リ ー に属する受容体であり （Philllips et al. , Blood, 71, 831-843(19 88))、 当該複合体とフイブリ ノ一ゲンとの結合においては、 特に フイ ブリ ノーゲン分子中に存在する 2つの RGD F (—フエニル ァラニン） 配列を認識して結合することが明らかにされている （ Andr ieux et a 1. , J. Biol. Chem. , 264, 9258-9265(1989)) ₀

さ らに、 フイ ブリ ノ一ゲンと同様に RGD配列を有する、 フ ォ ンビルブラ ン ト因子、 フイ ブロネクチン、 ビ トロネクチンや トロ ンボスポ ン ジ ン も g p ll b lll a複合体と結合する こ とが知られ ている （Pytela et al. , Science. , 231, 1559(1986) あるいは、 Ce 11, 42， 439， (1985)) 。

かかる知見から、 R G D配列を含む合成ペプチ ドが g p H b II I a複合体とフイ ブリ ノ一ゲンの結合を阻害して血小板の凝集を 抑制することが予想され、 現実に 400 ^Μの合成ペプチ ド G R G D S Pが、 A D Pで活性化された血小板の凝集を完全に阻害した ことが報告されている （Plow et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 82, 8057-8061(1985)) 。 また R G D Sについては、 46-50〃Mの 濃度で濃度依存的に 80〜90%の血小板の凝集を阻害することが判 明しており、 さ らにペプチ ド R G D Fは、 R G D Sの 4〜 5倍強 い血小板凝集抑制活性を示すことが判明している （Plow et al. , Blood, 70， 110- 115(1987)あるいは、 Harf inest et al. , 71, 132-13 6(1988))。

R G Dペプチ ドを有するテ トラペプチ ド誘導体に関しては、 特 開平卜 190699号公報、 特開平 2-62892 号公報、 E P O 422937 A1 号公報、 及び米国特許 4952562 号に記載されている。 ぺプチ ドか らなる誘導体に関してはさ らに、 特開昭 63-215696 号公報に記載 されている。 また、 R G Dペプチ ドの環状構造の誘導体について は、 特開平 3-118331号公報、 及び特開平 2-62892 号公報あるいは WO 91/01331号公報に記載されている。

なお、 現在輸血は全血輸血はまれで、 各々の血液成分を用途に 応じて選択して輸血する成分輸血が行われている。 かかる成分輸 血用に用いられる輸血用の血小板製剤は献血によって得られた全 血を製剤処理するか又はァフ ェ レ一シス法を用いた成分献血のい ずれかの方法で調製される血液製剤のうちの一つである。 そして 、 これらの血小板製剤は、 製剤処理後すぐに、 ポリオレフ イ ン製 又はポリ塩化ビニル製の特製の保存バッ クに入れられ、 室温で振 盪保存されるのが通常である。

また、 細胞と細胞外基質蛋白質との接着が様々な病態と関連が あることが近年明らかにされてきている。 特に、 ガン転移による ガン再発の機構と当該接着が密接に関連のあることが解明されつ つある。

ガンは近年の診断法の確立による早期発見法及び手術法等の進 歩により、 外科的に切除できるケースが増えてきているが、 その —方でガンによる死亡率は増加してきている。 このような状況の 大きな原因の一つと して、 上記ガン細胞の転移による再発が挙げ られる。 ガンの転移を抑える物質を確立することができれば、 上 記のガンの再発をかなり予防し得ると考えられるが、 現在有効な ガンの転移を防ぐ薬剤は開発されていない。

ガン転移のメカニズムにはまだ不明の点が多いが、 近年の研究 により徐々に解明されつつある。 すなわち、 ガン転移は原発巣か ら血液及びリ ンパ球中へのガン細胞の離脱及び血液中、 リ ンパ液 中から組織中へのガン細胞の移動という 2つの極めて重要なステ ップに分けることができる。 そして、 この両段階で血管の基底膜 等を構成する細胞外基質蛋白質が細胞移動の足場を提供すると考 えられている。

なお、 上記血管基底膜には、 フイ ブロネクチン、 コラーゲン、 ビ トロネクチン、 ラ ミニンをはじめとする様々な R G D配列を持 つ細胞外基底蛋白質が存在しており、 ガン細胞の細胞外基質蛋白 質への接着に R G D配列が非常に重要な役割を果たしている。 そ れ故、 この様なガン細胞と血管基底膜との接着を抑える化合物、 特に R G D類似化合物は、 ガン細胞の血液中への離脱 · 血液中か ら血管外への移動を阻害することにより、 ガン転移を抑制し得る 可能性が指摘されている。

近年、 高活性で生体内安定性の優れた薬剤を開発するために、

R G Dペプチ ドを鍵化合物として、 天然には存在しない構造を有 する化合物へ誘導する合成研究が盛んに行われている （Hartman et al. , J. Med. Chem. , 35, 4640-4642(1992) あるいは Callahan et a 1.， ibid, 35， 3970-3972(1992))。 この様な化合物は蛋白分解酵素 による影響を受け易い経口投与型の血小板凝集抑制剤と して有用 . であるが、 同時に、 非天然構造への誘導に伴う毒性の発現や、 体 内において薬剤が消失せずに蓄積されてしまう等の副作用が予想 され、 安全性についての問題が強く懸念されている。

また、 化合物の生体内安定性の向上は、 血小板凝集抑制作用や 血液凝固抑制作用の持続につながり、 出血傾向を惹起する等、 本 来血小板の有する重要な生理作用を長時間にわたり停止させてし まう可能性がある。

特に体外循環時や外科手術時においては上記の血小板凝集抑制 作用や血液凝固抑制作用の持続性が問題となる。 例えば、 実際に 血液凝固を抑えるために投与されている生体由来の医薬品である へパリ ンにおいてさえも、 その作用が適度な薬効時間を超えてし まい、 出血傾向を惹起する重篤な副作用が報告されている [秋沢 忠男ら、 日本臨床、 43巻、 377-391 頁 （ 1985年） ] 。

従って、 特に体外循環や外科手術時等において、 血小板の凝集 能力を一時的にのみ抑える目的で血小板凝集抑制剤を使用する場 合には、 当該薬剤は血小板凝集抑制能力に優れていることが望ま しいことは言うまでもないが、 それと同時に使用目的に応じた適 度な薬効時間を有し、 なおかつ当該薬剤の失活後は副作用のない 化合物に速やかに代謝される安全性に優れた特性を有することが 必要である。 前において述べたように、 R G Dペプチ ドそのも のの有する血小板凝集抑制活性や血液凝固抑制活性は実用に耐え られるほど高く はない。 しかしながら、 この R G Dペプチ ドはも ともと生体内に存在する蛋白分解酵素によつて、 生体にとって安 全でかつ有益なア ミ ノ酸に分解される優れた特徴がある。

本発明者はこの特徴を大いに利用し、 使用目的に応じた様々な 生体での保持時間を有し、 血小板凝集抑制能力又は血液凝固抑制 能力に優れ、 天然のペプチ ドに可能な限り近い構造を有し、 かつ 高活性である誘導ペプチ ドを造り出し、 これを有効成分と して含 む血小板凝集抑制剤の提供を企図する。 そして、 さ らに体外循環 時や手術時等に適する副作用の少ない血液凝固抑制剤の提供を企 図する。

また、 前に記載した輸血用の血小板製剤において、 現状では保 存に伴って血小板の機能 （血小板凝集能） の低下が著しく、 有効 な輸血を妨げる一つの要因となっている。 このような保存に伴う 血小板の機能の低下を防ぐような画期的な上記血小板製剤の保存 法は現在なく、 有効な保存法の確立は世界的な検討課題となって いる。 よって本発明は、 上記ペプチ ド等を有効成分と して含む輪 血用血小板製剤保護剤の提供を企図する。

なお保存に伴う血小板の機能低下は、 ①採血、 製剤処理、 保存 時の様々な物理的刺激により起こる保存中の血小板活性化や凝集

、 ②保存液の p Hの低下等が主な原因と考えられている。 これらの うち、 p Hの制御を目的と した保存液及び保存システムの改良は近 年盛んに行われているが、 十分な効果があるとはいえないのが現 状であ 。

また、 血小板凝集を抑えれば保存中の血小板の機能低下を抑制 できるのではないかとの考えから、 アスピリ ン、 プロスタグラ ン ディ ン等従来から知られている血小板凝集抑制物質を保存血に添 加する試みが実験室レベルではいく つか行われている。 しかしな がら、 これらの化合物は体内での分解性が極めて悪く 、 当該化合 物を含む血小板製剤を輪血すると全身の血液が固まりにく い状態 が数時間以上続く という致命的な問題点があり、 実用化には至つ ていない。

そこで、 生分解性に優れ、 安全でかつ強力な血小板凝集抑制活 性を有する前記誘導べプチ ドを輸血用血小板製剤に添加すること で、 保存に伴う血小板の凝集能力の低下や血小板数の減少を防ぐ ことができると考えた。 すなわち、 製剤パック中の血小板を保存 中に保護する作用をもつ化合物を開発することも本発明の目的で ある。

さ らに、 本発明ペプチ ド等の細胞接着抑制作用に着目 し、 上記 ぺプチ ド等を有効成分と して含む安全性に優れた細胞接着阻害剤 及びガン転移阻害剤の提供をも企図する。 発明の開示

体外循環に適した副作用の少ない血小板凝集抑制薬の開発には 、 上記のごと く天然のペプチ ドに可能な限り近い構造を有するこ とが必要である。 そこで、 本発明者は、 実用に耐え得る高活性化 合物を得る際に、 ア ミ ノ酸ゃビ夕 ミ ン等の副作用の少ない生体に 有用な化合物を RGD様の配列に付加するこ とによって、 高活性 で適度な作用時間を有するぺプチ ド等を創製した。 本べプチ ド等 が分解されると、 当該付加部分は本来の有用な物質と して生体に 受け入れられる。 すなわち、 その構造中に生体内で速やかに分解 されるぺプチ ド骨格をほぼ完全に残しながら、 高い血小板凝集抑 制活性等を持ち、 生体内での分解時間が概ね短く、 かつ作用時間 が異なる一群の化合物を見出した。 また、 これらの一群の化合物 を細胞接着阻害剤、 ガン転移阻害剤及び輸血用血小板製剤保護剤 の有効成分として用いることも可能であることを見出した。

即ち、 本願は以下の事項をその要旨とするものである。

(1) 一般式

A- B -A r g -G l y -A s p - C -D ( I ) (式中、 Aはアミ ノ酸、 ア ミ ノ酸誘導体、 ビタ ミ ン、 ビタ ミ ン 誘導体、 ビタ ミ ン様作用物質、 ビタ ミ ン様作用物質の誘導体、 核 酸の塩基、 核酸の塩基の誘導体及びヒダン トイ ン酢酸よりなる群 の中から選ばれた化合物 ； Bはアミ ノ酸 ； Cは疎水性官能基を有 するア ミ ノ酸 ； Dは水酸基又はァミ ノ基を示す）

で表される、 ペプチ ド、 ペプチ ド誘導体又はそれらの塩。

(2) Aにおけるア ミ ノ酸若しく はアミ ノ酸誘導体が、 プロ リ ン、 チォプロ リ ン、 ハイ ドロキシプロ リ ン、 デヒ ドロプロ リ ン、 2 — ォキソ一 4—チアゾリ ジンカルボン酸、 N—アルキルグリ シン又 は次の一般式

〔式中、 R > は、 水素原子、 一般式 一 (CH₂)_PCH] 又は一般式

(式中、 p は 0 〜 5 の整数である） 、 mは 2〜 5 の整数、 nは 0 〜 2 の整数である〕 で表されるイ ミ ノ酸誘導体、 ト リ ブ トフ ァ ン 又は次の一般式 R

(式中の R ₂ は水素原子又はアルキル基、 R ₃ は水素原子又は 0 一アルキル基、 R < は水素原子又はアルキル基、 R ₅ は水素原子 、 ア ミ ノ基又はア ミ ノ アシル基、 qは 0 〜 3 の整数である） で表 される ト リ プ トフ ァ ン誘導体、 ピログルタ ミ ン酸又は 2 —ァゼチ ジノ ン一 4 一力ルボン酸である、 前記（1) 記載のペプチ ド、 ぺプ チ ド誘導体又はそれらの塩。

(3) ビタ ミ ン様作用物質又はビタ ミ ン様作用物質の誘導体が、 ォ ロチン酸又はハイ ドロォロチン酸である、 前記（1 ) 記載のぺプチ ド、 ペプチ ド誘導体又はそれらの塩。

(4) Bがセリ ン、 グ シ ン、 リ ン、 ァラニ ン、 スレオニン又は 3 —ァラニンである、 前記（1 ) 〜（3) 記載のペプチ ド若しく はべ プチ ド誘導体又はそれらの塩。

(5) Cが ト リブ トフ ァ ン若しく はフヱニルァラニンである、 前記 ( 1 ) 〜（4) 一つに記載されたべプチ ド若しく はべプチ ド誘導体又 はそれらの塩。

(6) 前記（1 ) 〜（5) のいずれか一つに記載されたペプチ ド、 ぺプ チ ド誘導体又はそれらの塩を有効成分と して含む、 血小板凝集抑 制剤。

(7) 前記（1 ) 〜（5) のいずれか一つに記載されたペプチ ド、 ぺプ チ ド誘導体又はそれらの塩を有効成分と して含む、 体外循環用血 液凝固抑制剤。

(8) 前記（1) 〜（5) のいずれか一つに記載されたペプチ ド、 ぺプ チ ド誘導体又はそれらの塩を有効成分と して含む、 細胞接着阻害 剤。

(9) 前記（1 ) 〜（5) のいずれか一つに記載されたペプチ ド、 ぺプ チ ド誘導体又はそれらの塩を有効成分と して含む、 ガン転移阻害 剤。

( 10)前記（1) 〜（5) のいずれか一つに記載されたペプチ ド、 ぺプ チ ド誘導体又はそれらの塩を有効成分と して含む、 輸血用血小板 製剤保護剤。

( 11 )前記（1 ) 〜（5) のいずれか一つに記載された輸血用血小板保 護剤をパッ ク中の輸血用血小板製剤中に含ませたことを特徴とす る、 輸血用血小板製剤パッ ク。 以下、 本発明に関し詳細に説明 する。

① 一般式 （ I ) において、 Aはア ミ ノ酸、 ア ミ ノ酸誘導体、 ビ タ ミ ン、 ビタ ミ ン誘導体、 ビタ ミ ン様作用物質、 ビタ ミ ン様作用 物質の誘導体、 核酸の塩基、 核酸の塩基の誘導体及びヒダン トイ ン酢酸よりなる群の中から選ばれた化合物である。

a)本発明において、 ァ ミ ノ酸とは分子内にア ミ ノ基とカルボキシ ル基を有する分子のこ とをいう。

そ して、 当該ア ミ ノ酸又はア ミ ノ酸誘導体 Aと して本発明にお いて好ま しいものと しては、 プロ リ ンを含むイ ミ ノ酸、 分子内に ぺプチ ド結合 （ラ ク タム） を有するア ミ ノ酸、 ト リ ブ トフ ァ ン、 そ してこれらのア ミ ノ酸の誘導体を挙げるこ とができる。

なお、 本発明べプチ ド等を血小板凝集抑制剤又は体外循環用血 液凝固抑制剤の有効成分と して用いる場合において、 Aの部位に プロ リ ンが存在することは、 式 （ I ) に示すペプチ ド等 （以下、 本発明ペプチ ド等と記載する。 ） の血小板凝集抑制活性及び血液 凝固抑制活性を顕著に増幅させ得る故に好ま しい。

さ らに、 Aがプロ リ ンである場合は当該プロ リ ンのイ ミ ノ基を 修飾すると本発明べプチ ド等の血小板凝集抑制活性及び血液凝固 抑制活性が、 当該ィ ミ ノ基を修飾しない場合に比べて低下するこ とを本発明者は明らかにした。 すなわち、 実施例 16の化合物と実 施例 20の化合物とを比較することによって、 こ こで述べているプ 口 リ ンの存在による血小板凝集抑制活性増幅効果はプロ リ ン中の ィ ミ ノ基に起因するこ とは明白である。 従って、 Aがプロ リ ン以 外であってもィ ミ ノ基を有するァ ミ ノ酸であるこ とによって、 本 発明べプチ ド等は高い血小板凝集抑制活性を示し得る。

プロ リ ン誘導体と しては、 その環構造内に他のへテロ原子を有 するものや環に官能基が付加したものを挙げることができる。 例 えば具体的には、 チォプロ リ ン、 ハイ ド口キンプロ リ ン、 デヒ ド 口プロ リ ン、 ォキソチアゾリ ジンカルボン酸、 N _メチルプロ リ ン、 N —ァセチルプロ リ ン等を挙げることができる。

イ ミ ノ酸と しては、 好ま しく は N —アルキルグリ シンや環の大 きさの異なる一般式 （I I ) で示される環状イ ミ ノ酸を挙げること ができる （R , は水素原子） 。 なお、 N —アルキルグリ シンのァ ルキル部分は、 低級アルキル鎖であることが好ま しい。 具体的に は、 N —メ チルグリ シ ン （ザルコ シ ン） 、 N —ェチルグ リ シ ン、 N —ェチルグリ シン、 N —プロピルグリ シン、 N —イソプロ ピル グリ シン等を挙げることができる。 また、 一般式 （Π ) において 、 R , が水素原子以外である場合、 すなわちィ ミ ノ基が修飾され ている場合には、 本発明べプチ ド等の血小板凝集抑制能力は低下 する傾向にある。 しかしながら当該修飾は、 生体内における酵素 によるべプチ ドの N端からの分解を遅らせる効果があり、 分解速 度の異なる誘導体の入手には必要なものである。 かかる場合、 R , はアルキル基又は C 0—アルキル基であるが、 いずれも低級ァ ルキル基又は低級 C 0—アルキル基であるのが好ま しい。 さ らに pが 0〜 5の整数であるものが適当な塩基性度を有し、 かつ立体 障害性が低いという点で好ま しい。

当該環状イ ミ ノ酸の環構造の大きさは、 mを 2〜 8の範囲で選 択することが可能であるが、 当該環自身の立体障害性を低く押さ えることの必要性から、 mは好ま しく は 2〜 5である。 また、 一般式 （I I ) 中のカルボン酸の位置は、 直接的には本発 明べプチ ド等の血小板凝集抑制活性には影響しないが、 塩基性部 位であるィ ミ ノ基の向きを考慮すれば、 好ま しく はィ ミ ノ基に隣 接する 2位をあげることができる。 また、 環と当該カルボニルの 間にアルキル鎖を導入し得る。 当該アルキル鎖の鎖数を示す nは 0〜 6の範囲で選択し得るが、 カルボニルからィ ミ ノ基までの適 当な距離を保つ必要性を考慮すれば、 好ま しく は 0〜 2である。 すなわち、 当該環状ィ ミ ノ酸の好ま しい具体例と しては、 例え ば L— 2 —ァゼチジンカルボン酸、 0—， m―， p —の各ピペリ ジンカルボン酸、 ピロ リ ジン一 3 —カルボン酸、 ピロ リ ジン一 2 —酢酸等を挙げることができる。

Aを血液中において酵素による分解を受け易い化合物とするか 、 当該分解を受け難い化合物にするかによつて、 本発明ペプチ ド 等を有効成分と して含む本発明血小板凝集抑制剤及び血液凝固抑 制剤を使用目的に応じた作用時間を確保することができる。

主に、 体外循環用血液凝固抑制剤を企図する場合には、 Aを血 液中において酵素による分解を受け易い化合物とすることにより 、 生体内での作用時間を短縮することが可能である。 当該化合物 と しては、 例えば 4員環化合物のァゼチジンカルボン酸や 5員環 化合物のプロ リ ンを挙げることができる。

上記以外の一般的な血小板凝集抑制剤を企図する場合には、 逆 に Aを分解を受け難い化合物とすることにより、 生体内での作用 時間を延長することが可能である。 当該化合物と しては、 例えば 6員環化合物である L —ピペコ リ ン酸等を挙げることができる。 なお、 一般式 （ H ) においてィ ミ ノ基が、 イ ミ ド基に変わった 構造 （ラ ク タム） であっても良い。 かかる構造も、 分解酵素に対 する適度な安定性と高活性を有するぺプチ ド化合物を与える。 好 ま し く はピログルタ ミ ン酸ゃ 2 —ァゼチジノ ン一 4 —カルボン酸 などを挙げるこ とができる。

Aが ト リ ブ トフ ァ ン又はその誘導体である場合も、 本発明ぺプ チ ド等の血小板凝集抑制活性の向上が認められる。 これは、 ト リ ブ ト フ ァ ン中のイ ン ドール環による疎水的な作用による ものとの 考えられる。

一般式 （I I I ) で示される ト リ ブ トフ ァ ン誘導体において、 R 2 は水素原子又はアルキル基、 好ま し く は水素原子又は挺級アル キル基 ； R ₃ は水素原子又は 0—アルキル基、 好ま し く は水素原 子又は低級 0—アルキル基 ； R < は水素原子又はアルキル基、 好 ま し く は水素原子又は低級アルキル基 ； R ₅ は水素原子、 ァ ミ ノ 基又はァ ミ ノ アシル基である。 ア ミ ノ アシル基と しては例えば、 ア ミ ノ アセチル基ゃァ ミ ノ 力プロ リ ル基を代表的なものと して挙 げることができる。

さ らに Aがヒダン トイ ン酢酸である場合も活性の向上がみられ る。

b)本発明において、 Aと して用いられる ビタ ミ ンの種類はと く に 限定されない。 例えば、 ニコチ ン酸、 P-パン トテン酸、 ピオチン 、 プテロィルグルタ ミ ン酸等を挙げることができる。 また、 本発 明においてビタ ミ ン様作用物質とは、 その生理作用はビタ ミ ンに 近いが、 一般に、 ことにヒ ト及び哺乳動物では必ずしも栄養素と して外部から摂取する必要がない、 すなわち生体内において自己 合成のできる一群の化合物をいう。 具体的には、 ォロチン酸、 リ ポ酸等を挙げるこ とができる。

ビタ ミ ンも ビタ ミ ン様作用物質もペプチ ド骨格に共有結合で結 合しているこ とを特徴とするが、 ペプチ ド骨格に結合するために 、 相応する官能基を有することが必要で、 その官能基と しては、 例えばカルボキシル基等を挙げることができる。 また、 相応する 官能基を持たないビタ ミ ン等においても、 簡単な処理で相応する 官能基を誘導できるものであれば良い。 当該例と しては、 ニコチ ン酸ア ミ ド分子内のア ミ ドの加水分解によりカルボン酸を誘導す る場合等を挙げるこ とができる。 これらのペプチ ド骨格との結合 は、 生体内に存在する酵素によって容易に分解され、 その結果生 体に有用なビタ ミ ン若しく はビタ ミ ン様作用物質又はその中間代 謝産物或いは毒性の殆ど無い化合物に変わるようなものであれば 良く 、 例えば、 ア ミ ド結合、 エステル結合等がある。

また、 ビタ ミ ンやビタ ミ ン様作用物質の誘導体と しては、 これ らの化合物の中間代謝物、 あるいは生化学データブッ ク （日本生 化学会編、 東京化学同人） 等に記載されている関連化合物、 ある いは部分的に 1 あるいは 2箇所の構造を修飾した化合物であり、 その例と しては、 5 — ピリ ドキシン酸、 ピオチン Ρ -, L - スルホキ シ ド、 ピオチンスルホン、 ビオシチン、 プテロイ ン酸、 10—ホル ミ ルプテロイ ン酸、 7， 8 -ジヒ ドロ葉酸、 （-）い H， 葉酸、 ホモプロ ティ ン酸、 6 -カルボキシプテリ ン、 ジヒ ドロ リ ポ酸、 ビタ ミ ン様 作用物質のォロチン酸の二重結合が還元されたハイ ドロォロチン 酸などがある。

c)さ らに、 本発明における核酸の塩基またはその誘導体とは、 一 般にヌ ク レオチ ドを構成する塩基成分およびその誘導体を指すが 、 上記ビタ ミ ンゃビタ ミ ン様作用物質またはそれらの誘導体に関 して述べたことと同様な構造的特徴を有するものである。 好ま し く はピリ ミ ジン誘導体等、 例えば 5 _カルボキシメ チルゥラ シル 、 5 —カルボキシチォゥラシル等を例示することができる。

② Bはア ミ ノ酸であり、 その種類は特に限定されない。 しかし ながら、 立体障害の大きなア ミ ノ酸あるいは酸性のア ミ ノ酸は血 小板凝集抑制活性、 血液凝固抑制活性及び細胞接着抑制活性を低 下させる傾向がある故に、 比較的小さなァ ミ ノ酸が B と しては好 ま し く 、 例えばセリ ン、 グリ シン、 パリ ン、 ァラニン、 スレオニ ン又は 3—ァラニンであるのが好ま しい。 特にセリ ンが高活性を 示す故に好ま しい。

③ Cは受容体に結合する疎水的 ドメ イ ンと して、 疎水性官能基 を有するア ミ ノ酸を指す。 好ま しく は ト リブ トフ ァ ン又はフ エ二 ルァラニンを挙げるこ とができる。

④ Dは水酸基又はア ミ ノ基である。 なお、 Dが水酸基の場合は ァ ミ ノ基の場合に比べ血小板凝集抑制活性、 血液凝固抑制活性及 び細胞接着抑制活性が高い傾向がある。 しかし、 作用時間はア ミ ノ基である方が長く、 目的に応じて選択することができる。

⑤ なお、 体外循環用血液凝固抑制剤の有効成分と して本発明べ プチ ド等を用いる場合には、 これらの本発明べプチ ド等は各々異 なつた半減期を有するという点が有利になる。

すなわち、 血漿中での本発明べプチ ド等の半減期の範囲は約 10 分から長いものでは 4時間以上である。 しかし、 体内では速やか に分解される特性があるものが多く、 本発明ペプチ ド等の大部分 の体内半減期は短すぎて特定できないもの （約 2分以内） から 10 分以内である。 従って、 これらのペプチ ド等を体外循環に適用し た場合には、 装置内を循環している血液中では安定であるが、 体 内に入ると各種分解酵素により、 すばやく生体に有益な化合物に 分解されて血液凝固活性を失う という利点を有する。

よって、 従来から問題とされている体外循環時の抗血栓剤へパ リ ンによる出血傾向が増加する重篤な副作用を、 へパ リ ンを本発 明のペプチ ド等で代替することで克服することが可能である。 す なわち、 本発明べプチ ド等は体外循環用の血液凝固抑制剤の有効 成分と して非常に有用である。

さ らに体外循環では、 循環装置や使用目的に依って、 血液凝固 抑制剤の好ま しい作用時間が異なるが、 本発明ペプチ ド等各々の 作用時間 （半減期） の違いを利用すれば、 体外循環時間の長さや 使用目的の違いに応じて使い分けることが可能である。

本明細書において、 アミ ノ酸、 ペプチ ド、 保護基、 活性基、 そ の他に関して略号で表示する場合、 国際純正および応用化学連合 ( I U P A C ) 、 国際生化学連合 （ I B U ) の規定或いは該当分 野における慣用記号に従う ものとする。 また、 遺伝制御に直接関 連のある —アミ ノ酸に関して光学異性体があり うる場合は、 特 に明示しなければ L体を示すものとする。

以下にその例を示す。

A 1 aまたは A ァラニン

A r gまたは R アルギニ ン

A s pまたは D ァスパラギン酸

G 1 yまたは G グリ シ ン S e rまたは S ： セ リ ン

V a 1 または V ： ―ノくリ ン

T h rまたは T ： ース レオニン

T r pまたは W ： ト リ ブ ト フ ァ ン

P h eまたは F ： フ ヱニルァラニ ン

P r oまたは P ： プロ リ ン

Boc ： t—ブ トキシカルボニル

Bu' ： t一ブチル

OBu¹ ： t —ブチルエステル

Mtr ： 4-メ トキシ -2， 3， 6-ト リ メ チルベンゼン スルフ ォニル

Pmc 2， 2， 5, 7, 8-ペンタ メ チルク ロマ ン- 6-ス ノレフ ォニノレ

Fmoc ： 9-フルォ レニルメ トキシカルボニル 本発明のぺプチ ドおよびその類似化合物は、 市販のァ ミ ノ酸を 利用して、 簡単な操作で容易に合成することができる。 すなわち 、 ペプチ ド化学において通常用いられる方法、 例えば、 「ザ ぺ プチ ド （The Peptides) 」 第 1巻 [Schroder and Luhke著， Acad emic Press, New York, U. S.A. (1966 年） 〕 、 「ぺプチ ド合成の 基礎と実験」 〔泉屋信夫ら著、 丸善㈱ （ 1985年） 〕 等に記載され ている方法によ って製造することが可能であり、 液相法及び固相 法のいずれによっても製造できる。 さ らに、 カラム法、 バッチ法 のいずれの方法も用いることができる。

ぺプチ ド結合を形成するための縮合方法と して、 アジ ド法、 酸 クロライ ド法、 酸無水物法、 力ルポジィ ミ ド法、 カルボジィ ミ ド 一アディ ティ ブ法、 活性エステル法、 カルボ二ルイ ミ ダゾ一ル法

、 酸化還元法、 酵素法、 ゥ ッ ドワー ド試薬 Kを用いる方法等を例 示する こ とができる。 なお、 固相法での縮合反応は上記した方法 のう ち、 酸無水物法、 カルボジィ ミ ド法、 及び活性エステル法が 主な方法と して挙げられる。

さ らに、 固相法でペプチ ド鎖を延長するときは、 C末端ァ ミ ノ 酸を用いる有機溶媒に対して不溶な樹脂等の支持体に結合する。 こ こでは、 ア ミ ノ酸を樹脂に結合させる目的で官能基を導入した 樹脂や、 樹脂と官能基の間にスぺーサ一を挿入したもの、 更に条 件によって種々の箇所で切断できるハン ドル （handle) と称する 鎖を導入した樹脂を目的に応じて用いるこ と もできる。 このよう な樹脂と しては、 例えば、 ク ロロメ チル樹脂などのハロメ チル樹 脂、 ォキシメ チル樹脂、 4 — (ォキシメ チル） 一フエニルァセ ト ア ミ ドメ チル樹脂、 4 — (ォキシメ チル） 一フ ヱノキシメ チル樹 脂、 C末ア ミ ド化用樹脂などを挙げるこ とができる。

なお、 これらの縮合反応を行なう前に、 通常公知の手段によつ て当該縮合反応に関与しないカルボキシル基やア ミ ノ基ゃアルギ ニン残基中のグァニジ ド基等の保護手段を施すことができる。 ま た逆に当該縮合反応に直接関与するカルボキシル基やア ミ ノ基を 活性化することもできる。

保護手段に用いる保護基と しては、 有機化学の分野において通 常用いられている保護基、 例えば 「プロテクティ ブ グループス イ ン オーガニッ ク シンセシス (Protective Groups in Orga nic Synthesis) [Greened, John Wiley & Sons, Inc. (1981)] 等 に記載されている保護基によって保護するこ とが可能である。 セ リ ン残基等の水酸基を含むア ミ ノ酸残基中の水酸基の保護基と しては、 例えば卜ブチル基、 ベンジル基、 ト リ メ チルシ リ ル基、 テ トラハイ ドロ ビラ二ル基等を挙げるこ とができる。

カルボキシル基の保護基と しては、 例えば、 各種のメ チルエス テル、 ェチルエステル、 ベン ジ ンエステル、 p —ニ ト ロベン ジ ン エステル、 t —ブチルエステル、 シク ロへキシルエステル等の通 常公知の保護基を挙げるこ とができる。

ァ ミ ノ基の保護基と しては、 例えば、 ベンジルォキシカルボ二 ル基、 t —ブ トキシカルボニル基、 イ ソボルニルォキシカルボ二 ル基、 9 一フルォレニルメ トキシカルボ二ル基等を挙げるこ とが できる。

アルギニン残基中のグァニジノ基の保護基と しては、 例えば、 ニ トロ基、 ト シル基、 メ シチレンスルフ ォニル基、 4 ーメ トキシ 一 2， 3 , 6 — ト リ メ チルベンゼンスルフ ォニル基、 2， 2 , 5 ， 7 , 8 —ペンタメ チルク ロマン一 6 —スルフ ォニル基等を挙げ ることができる。

カルボキシル基の活性化されたものと しては、 例えば、 当該力 ルボキシル基に対応する酸無水物 ； アジ ド ； ペンタフルオロフ ヱ ノ ール、 2， 4 —ジニ トロフ エノ ール、 シァノ メ チルアルコール 、 p —ニ ト ロフ エノール、 N— ヒ ドロキシコハク酸イ ミ ド、 N— ヒ ドロキシ一 5 —ノノレボルネンー 2， 3 ジカルボキシ ミ ド、 N— ヒ ドロキシフタルイ ミ ド、 1 — ヒ ドロキシベンゾ ト リ アゾール等 との活性エステル等を挙げられる。

ァ ミ ノ基の活性化されたものと しては、 当該ア ミ ノ基に対応す る燐酸ア ミ ド等を挙げるこ とができる。 ペプチ ド合成の際の縮合反応は、 通常溶媒中で行なわれる。 当 該溶媒と しては、 例えば、 ク ロ口ホルム、 ジク ロロメ タ ン、 酢酸 ェチル、 N， N — ジメ チルホルムア ミ ド、 ジメ チルスルホキシ ド 、 ピリ ジン、 ジォキサン、 テ トラ ヒ ドロフラ ン、 N _メ チルピロ リ ドン、 水、 メ タノ ール等、 又はこれらの混合物を挙げるこ とが できる。 また、 当該縮合反応の反応温度は、 通常の場合と同様に 、 _ 30°C〜50°Cの範囲で行なう こ とができる。

さ らに、 本発明のぺプチ ド製造工程における保護基の脱離反応 の種類は、 ペプチ ド結合に影響を与えずに保護基を離脱させるこ とができる限りにおいて、 用いる保護基の種類に応じて選択する こ とができる。 例えば、 塩化水素、 臭化水素、 無水フ ッ化水素、 メ タ ンスルホン酸、 ト リ フルォロメ タ ンスルホン酸、 ト リ フルォ 口酢酸、 又はこれらの混合物等による酸処理、 水酸化ナ ト リ ウム 、 水酸化カ リ ウム、 ヒ ドラ ジ ン、 ジェチルァ ミ ン、 ピぺ リ ジ ン等 によるアル力 リ処理 ； 液体アンモニア中におけるナ ト リ ゥム処理 やパラ ジウム炭素による還元 ； 及び ト リ メ チルシ リル 卜 リ フラ一 ト、 ト リ メ チルシ リルプロマイ ド等のシ リル化処理等が挙げられ る。 なお、 上記の酸又はシリル化剤処理による脱保護基反応にお いては、 ァニソール、 フエノ ール、 ク レゾール、 チオア二ソ一ル 、 エタ ンジチオールの如きカチオン補足剤を添加するのが脱保護 基反応が効率的に実行されるという点において好ま しい。

なお、 固相法で合成した本発明べプチ ドの固相からの切断方法 も通常公知の方法に従う。 例えば、 上記の酸又はシ リ ル化剤によ る処理等を当該切断方法と して挙げるこ とができる。

このようにして製造された本発明ペプチ ドに対しては、 上記の 一連の反応の終了後に通常公知の分離、 精製手段を駆使すること ができる。 例えば、 抽¾、 分配、 再沈殿、 再結晶、 カラムクロマ トグラフィ 一等によって、 より純粋なかたちで本発明ペプチ ドを 収得することができる。

また、 本発明ペプチ ドは、 製造工程における反応条件によって 塩の形で得ることができる。 ここで当該塩と しては、 塩酸、 硫酸 、 硝酸、 リ ン酸などの無機酸塩類 ； ギ酸、 酢酸、 プロピオン酸、 グリ コール酸、 コハク酸、 リ ンゴ酸、 酒石酸、 クェン酸、 ト リ フ ルォロ酢酸等の有機酸類 ； ナ ト リ ウム、 カ リ ウム、 等のアルカ リ 金属塩 ； カルシウム塩等のアル力 リ土類金属塩類 ； アンモニゥム 、 エタ ノ ールァ ミ ン、 ト リ ェチルァ ミ ン、 ジ シ ク ロへシルァ ミ ン 等の有機ア ミ ン類等を挙げることができる。

上記で得た本発明べプチ ド等を血小板凝集抑制剤、 細胞接着阻 害剤、 ガン転移阻害剤又は輸血用血小板製剤保護剤 （以下、 血小 板凝集抑制剤等と記載する） の有効成分と して用いる場合には、 本発明ペプチ ド等を固体若しく は液体の医薬用担体又は希釈剤と 共に、 すなわち賦形剤や安定剤等と共に含む製剤とするのが好ま しい。 当該医薬製剤において、 前記有効成分の担体成分に対する 割合は、 1 〜90重量％の間で変動させることができる。 当該製剤 の剤形及び投与形態と しては、 顆粒剤、 細粒剤、 散剤、 錠剤、 力 プセル剤、 丸剤若しく は液剤等の剤形にして用いることができる 。 またさ らに、 原末のまま経口投与することも可能であり、 さ ら に、 注射剤と して、 静脈内投与、 筋肉内投与、 又は皮下投与する こともできる。 なお、 注射剤と して用いる場合には、 本発明ぺプ チ ド等を注射用の粉末と して、 用時調製することもできる。 経口、 経腸も しく は非経口投与に適した有機又は無機の、 さ ら に固体又は液体の医薬用に用いられる担体か希釈剤を、 本発明血 小板凝集抑制剤等を調製するために用いるこ とができる。 水、 ゼ ラチン、 乳糖、 デンプン、 ステアリ ン酸マグネシウム、 タルク、 動植物油脂、 ベンジルアルコール、 ガム、 ポリアルキレングリ コ ール、 石油樹脂、 やし油、 ラノ リ ンその他医薬に用いられる他の 担体は全て、 本発明の血小板凝集抑制剤の担体若しく は希釈剤と して用いることができる。 また、 安定剤や湿潤剤や乳化剤を加え たり、 浸透圧調製剤又は P H調整剤と して塩を補助薬と して、 適 宜用いることができる。

さ らに、 本発明血小板凝集抑制剤等は、 種々の疾患の治療にお いて、 前記有効成分の他に、 必要に応じて他の医薬と して有効な 成分、 例えば他の種類の血小板凝集抑制成分等を含有させること もできる。

顆粒剤、 細粒剤、 散剤、 錠剤又はカプセル剤の形態をとる場合 には、 前記有効成分を 5 〜80重量％含有させるのが好ま しい。 液 剤の場合には、 前記有効成分を 1 〜30重量％の割合で含有させる のが好ま しい。 さらに、 非経口投与剤のうち、 注射剤と して用い る場合には、 前記有効成分を 1 〜10重量％の割合で含有させるの が好ま しい。

臨床投与量は、 経口投与の場合、 成人に対し上記有効成分と し て、 1 日当たり 500 〜 1000mgを内服するのが好ま しい。 しかしな がら、 患者の年令、 症状等によって適宜投与量を増減させること もできる。 前記の本発明の血小板凝集抑制剤は、 1 日 1 回投与も 可能であるが、 適当な間隔を 2 〜 3回に分けて投与することもで きる。 さ らに、 注射剤と して用いる場合には、 上記有効成分と し て、 成人に対し 1 回当たり量 1 〜数 l OOmg 投与するのが好ま しい o

また、 本発明ペプチ ド等には体内での高分解性を特徴とするも のも含まれており、 それらの化合物について、 数時間から数日間 連続して血中濃度を高く保つ必要がある場合には、 点滴等の手段 により持続的に注入すればよい。 かかる場合、 注入量は 1 時間当 たり 50〜 500mg/Kg程度が目安となるが、 他の薬剤との併用時には さ らに使用量を減らすことも可能である。

なお、 体外循環用に本発明ペプチ ド等を用いる場合には、 上記 の注射剤あるいは点滴剤の形態で用いることができる。 投与場所 及び投与量は、 体外循環システムの違い、 及びシステムの持続時 間等により異なる力 例えば体外循環システムへの入口の部分か ら 1 時間当たり 1 〜100mg/Kgを持続的に注入することができる。 投与量は、 単独投与においても、 また他の薬剤との併用において も、 分解酵素が多量に存在する体内に比べ、 体外循環システム中 では少量で有効である。

体外循環用血液凝固抑制剤と して従来から用いられているへパ リ ンと本発明べプチ ド等とを併用することにより、 血液凝固に関 係する血小板凝集 · 凝固系という二つの重要な経路を抑制し、 よ り完全に血液凝固を抑制することができると考えられる。 また、 両者の相乗的効果も期待できるので、 前述したような副作用が問 題になっているへパリ ンの使用量を減らすことができる。 さ らに 、 クェン酸'や蛋白質分解酵素阻害剤 （例えばフザン） 、 あるいは t - PAのような血栓溶解剤等と本発明べプチ ド等との併用も有効で あると考えられる。

次に、 本発明輸血用 1¾小板保護剤をパッ ク中の輸血用血小板製 剤中に含ませたことを特徵とする本発明輸血用血小板製剤パッ ク において、 当該輸血用血小板製剤パッ クの形態は特に限定されな い。 すなわち、 通常臨床において用いられる輸血用血小板製剤パ ッ クが採り うる全ての形態を採用することができる。 具体的には 、 袋状、 瓶状等の形態を採ることが可能である。 また、 それらの 素材も特に限定されない。 例えば、 袋状の形態を採る場合には有 効成分の吸着を可能な限り抑制し得るビニール素材、 例えばポリ 塩化ビニル、 ポリオレフ イ ン等を、 また瓶状の形態を採る場合に は、 プラスティ ッ ク素材もガラス素材も当該瓶の素材と して用い ることができる。 また、 本発明輸血用血小板保護剤は、 本発明べ プチ ド等の量に換算して、 血小板成分量に対して最終濃度で 1 M 〜 1 mM、 好ま しく は 1 0〃M 〜50〃M 添加することができる。 な お、 通常輸血用血小板製剤パッ ク中に添加される他の成分も本発 明輸血用血小板保護剤と共に添加することができることは勿論で あ 図面の簡単な説明

第 1 図は、 ヒ ト血漿中での合成ペプチ ドの安定性を示した図（1 ) であり、 第 2図は、 ヒ ト血漿中での合成べプチ ドの安定性を示 した図（2 ) であり、 第 3図は、 マウ ス体内での合成ペプチ ドの安 定性を示した図であり、 第 4図は、 ビーグル犬を用いた血小板凝 集抑制活性及びプロ ト口ンビン時間の検討図であり、 第 5図は、 ビーグル犬を用いた人工透析モデル透析回路の模式図であり、 第 6図は、 ビーグル犬を用いた人工透析モデルにおける血液凝固効 果を示した図であり、 第 7図は、 保存に伴う血小板数の変化を示 した図であり、 第 8図は、 血小板凝集能の保存に伴う経時的変化 を示した図であり、 第 9図は、 HeLa細胞の各種細胞外基質蛋白質 の接着に対する実施例 9のべプチ ド等の影響について検討した図 であり、 第 1 0図は、 B16F10メ ラノ一マ細胞の各種細胞外基質蛋 白質の接着に対する実施例 9のペプチ ド等の影響について検討し た図である。

実施例

以下、 実施例等により本発明をより具体的に説明する。 しかし ながら本実施例によって本発明の技術的範囲が限定解釈されるも のではない。

[化合物の合成]

〔実施例 1 〕

Trp-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-OH 式（1)

の合成 ：

p-alkoxybenzyl alcolhol 型（式（2)) (Trpの導入量 ： 0.87me q/g;BACHEM社製) 樹脂

H0CH₂-Ph(l, 4)-0CH₂-Ph(l, 4)- Polymer 式（2) の 0.275g(0.25mmol)を反応容器に移し、 DMAP存在下 Fmoc_Trpを活 性エステルで導入後、 表 1 に示す振盪、 濾過ステップを繰り返し

Trp- Arg(Mtr)- Gly-Asp(0Bu¹)- Trp-樹脂 式（3) を得た。

表 I スァッ" 試薬又は溶媒 使用量 時 回 数

(ml/step) (分）

1. DMF 30 1 6

2. 20¾piperidine/DMF 6 2 1

3. 20¾piperidine/DMF 6 20 1

4. DMF 50 1 10

5. Fmoc-amino-acidと 6 2 ？ 1

HOBT/DMF (各 3当量）

6. D I P CD (3当量） 6 120 ネ ：振盪後除去することなく次のステップへ進む _c

ネ ： di isopropylcarbodi imide

得られた保護ペプチ ド樹脂を 0 °Cの ト リフルォロ酢酸中で、 m- ク レゾール、 エタ ンジチオール存在下、 1 M ト リ メ チルシ リルブ 口マイ ドと 1 M チオア二ソールで 1 時間処理を行つた。 窒素気流 中で ト リ メチルシリルプロマイ ドを留去後、 樹脂を濾去し、 濾液 にジェチルエーテルを氷冷下において加え、 樹脂から切断された ペプチ ドを粉末と して得た。 そして、 当該粉末をジェチルエーテ ルで洗浄した。 当該洗浄物をセフアデッ クス G— 1 0 (フアルマ シァ社製） を支持体と したゲル濾過ク口マ トグラフィ 一により脱 塩し、 これを凍結乾燥して粗ペプチ ドを得た。 この粗ペプチ ドを 高速液体ク ロマ トグラフ ィ ー （H P L C ) [カラム ： 0DS 5C, 8 ( PL bondasphere, ø 20 x 150mm). 移動相 ： （A) 0.1 FA， (B)100¾C H3CN/O.1¾TFA, gradient ： (A)： (B)=80:20 から (A)： (B)=70:30 、 20分間、 流速 17ml/min] にて精製し、 更にセフ アデッ クス G 一 2 5を支持体とするゲル瀘過により酢酸塩と して、 凍結乾燥す る こ とにより表題のぺプチ ド

Trp-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-OH 式（1) を lOOmg 得た。

ノ ^1析（6N HCl + phenol， 24hr, 110°C)

本検出法では ト リブ トフ ァ ンは酸加水分解中に分解されるため に検出できない。 また、 定量のために外部標準と して用いたア ミ ノ酸は標準ア ミ ノ酸であるために、 標準ア ミ ノ酸に含まれていな ぃァ ミ ノ酸に関しても検出できない。

A s p 0 9 0 ( 1 )

S e r 1 0 0 ( 1 )

G 1 y 1 1 1 ( 1 )

T r p ( 2 )

A r g 0 3 ( 1 )

H P L C分析

Cosmosi 1 5C18-AR ( 04.6 X 200mm)カラム （ナカライテスク社 製） を用い、 流速 1. Oml/minで、 0. TFA中ァセ トニ ト リ ル 10〜 40¾(60分） の gradient溶出での分析 H P L Cで、 保持時間 29.0分 の単一ピークを示した。

F A B - M S ： M+ H 計算値 806.3、 実測値 806 〔実施例 2〕 Trp-Val-Arg-Gly-Asp-Trp-OH 式（4)

の合成 ：

実施例 1 と同様の方法によって、 表題のぺプチ ドを lOOmg を合 成した。 - ア ミ ノ酸分析（6N HCl + phenol， 24hr, 110°C)

A s p 0. 9 5 ( 1 )

V a 1 1. 0 7 ( 1 )

G 1 y 1. 2 4 ( 1 )

T r p - ( 2 )

A r g 1. 0 0 ( 1 )

H P L C分析

Cosmosi 1 5C18-AR ( 04.6 x 200mm)カラムを用い、 流速 1.0ml /minで、 0.1¾TFA中ァセ トニ 卜 リル 10〜40 (40分） の gradient溶 出での分析 H P L Cで保持時間 24.0分の単一ピークを示した。 F A B - M S ： M+ H 計算値 818.4、 実測値 814

〔実施例 3〕

CH₃C0-Trp-Ser-Arg-Gly-Asp-Tr -NH₂ 式（5) の合成 ：

C末ァ ミ ド化 （式（6))樹脂

CH₃0-Ph(l, 4)-CH(NH-Fmoc)-Ph(l, 4)-0(CH₂) ₃C0NH-CH(CH₃ )-C0NH-CH₂-Ph-polymer 式（6)

樹脂（Trp の導入量 ： 0.6meq/g;BACHEM 社製） 0.45g(0.25mniol) を反応容器に移し、 前記表 1 に示す振盪、 濾過を経るステ ッ プを 繰り返し、

NH₂ - Trp- Ser(tBu)-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBu')- Trp-C末ア ミ ド 化樹脂 式（7) を得た。 この樹脂 1 当量に対して、 3 当量の無水 酢酸を N-ハイ ド口キンべンゾ ト リ アゾール （H0BT， 3 当量） 存在 下に、 ジメチルホルムア ミ ド（DMF) 中で縮合させ、

CH₃C0- Trp- Ser(tBu)-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBu')- Trp-C末ァ ミ ド 化樹脂 式（8) を得た。

得られた保護べプチ ド樹脂を実施例 1 と同様の方法によって、 表題のぺプチ ドを 20mg得た。

ァ ミ ノ酸分析（6N HCl + phenol, 24hr, 110°C)

A s p 0. 9 5 ( 1 )

S e r 1 . 0 0 ( 1 )

G 1 y 1 . 1 4 ( 1 )

T r p ( 2 )

A r g 0. 9 6 ( 1 )

H P L C分析

Cosmosi 1 5C18-ARC 04.6 x 200mm)カラム （ナカライテスク社 製） を用い、 流速 l. Oml/minで、 0.1¾TFA中ァセ トニ ト リル 10〜 40X(40分） の gradient溶出での分析 H P L Cで保持時間 25.0分の 単一ピークを示した。

F A B - M S ： M + H 計算値 847.4、 実測値 847

〔実施例 4〕

5-Methoxyindole-3-acetyl-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-0H 式 (9) の合成 ：

実施例 1 と同様の方法によって、 表題のぺプチ ドを 100mg 合成 した。

ア ミ ノ酸分析（6N HCl + phenol, 24hr, 110°C) A s p 0 8 9 ( 1 )

S e r 1 0 0 ( 1 )

G 1 y 1 1 2 ( 1 )

T r p ( 1 )

A r g 9 9 ( 1 )

H P L C分析

Cosmosi 1 5C18-AR ( 04.6 x 200mm)カラムを用い、 流速 1, 0ml /minで、 0. TFA中ァセ トニ ト リル 10〜40¾ί(40分） の gradient溶 出での分析 H P L Cで保持時間 28.0分の単一ピークを示した。 F A B - M S ： M+ H 計算値 807.3、 実測値 807

〔実施例 5〕

2-Methyl indole-3-acetyl-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-OH 式（10) の合成 ：

実施例 1 と同様の方法によって、 表題のぺプチ ドを lOOmg 合成 した。

ァ ミ ノ酸分析（6N HCl + phenol, 24hr, 110°C)

A s p 0 8 8 (

S e r 1 0 0 (

G 1 y 1 1 2 (

T r p (

A r g 9 9 (

H P L C分析

Cosmosi 1 5C18-AR ( 04.6 x 200mm)カラム （ナカライテスク社 製） を用い、 流速 1. Oml/minで、 0.1¾TFA中ァセ トニ ト リル 10〜 40% (40分） の gradient溶出での分析 H P L Cで保持時間 28.5分の 単一ピークを示した。 ―

F A B - M S ： M+ H 計算値 791.4、 実測値 791

〔実施例 6〕

Indole-3-butanoyl-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-OH 式（11) の合成 ：

実施例 1 と同様の方法によって、 表題のぺプチ ドを lOOmg 合成 した。

ァ ミ ノ酸分析（6N HCHphenol, 24hr, 110°C)

A s p 0. 8 7 (

S e r 1. 0 0 (

G 1 y 1 3 (

T r p (

A r g 0 1 (

H P L C分析

Cosmosi 1 5C18-AR ( 04.6 x 200mm)カラム （ナカライテスク社 製） を用い、 流速 1. Oml/minで、 0. TFA中ァセ トニ ト リル 10〜 40¾!(40分） の gradient溶出での分析 H P L Cで保持時間 33.0分の 単一ピークを示した。

F A B -M S ： M+ H 計算値 805.4、 実測値 805

〔実施例 7〕

Indole-3-acetyl-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-OH 式（12) の合成 ：

実施例 1 と同様の方法によって、 表題のぺプチ ドを lOOmg 合成 した。

ア ミ ノ酸分析（6N HCHphenol, 24hr, 110°C) A s 9—3 ( 1 )

S e r 0 0 ( 1 )

G 1 y 0 8 ( 1 )

T r p ( 1 )

A r g 1 2 ( 1 )

H P L C分析

Cosmosi 1 5C18-AR ( 04.6 X 200mm)カラム （ナカライテスク社 製） を用い、 流速 l. Oml/minで、 0. TFA中ァセ トニ ト リ ル 10〜 40!¾(40分） の gradient溶出での分析 H P L Cで保持時間 27.0分の 単一ピークを示した。

F A B - M S ： M + H 計算値 777.3、 実測値 777

〔実施例 8〕

Phe-Ser-Arg-Gly-Asp-Phe-OH 式（13) の合成 ：

実施例 1 と同様の方法によって、 表題のぺプチ ドを lOOmg 合成 した。

ア ミ ノ酸分析（6N HCl + phenol, 24hr， 110°C)

A s p 0 0 ( 1 )

S e r 0 1 ( 1 )

G 1 y 0 0 ( 1 )

P h e 8 3 ( 2 )

A r g 0 4 ( 1 )

H P L C分析

Cosmosi 1 5C18-AR ( 04.6 x 200mm)カラム （ナカライテスク社 製） を用い、 流速 l.Oml/minで、 0. TFA中ァセ トニ ト リ ル 10〜 40!U60分） の gradient溶出での分析 H P L Cで保持時間 21.0分の 単一ピークを示した。

F A B— M S ： M+ H 計算値 728.3、 実測値 728

〔実施例 9〕

Orotyl-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-OH 式（13) の合成 ：

実施例 1 と同様の方法によって、 表題のぺプチ ドを lOOmg 合成 した。

ァ ミ ノ酸分析（6N HC1十 phenol, 24hr， 110°C)

A s p 8 6 ( 1

S e r 0 0 ( 1

G 1 y 2 6 ( 1

T r p ( 1

A r g 0 0 ( 1

H P L C分析

Cosmosi 1 5C18-AR ( 04.6 x 200mm)カラム （ナカライテスク社 製） を用い、 流速 1. Oml/minで、 0.1 TFA中ァセ トニ ト リル 10〜 40¾(60分） の gradient溶出での分析 H P L Cで保持時間 20.0分の 単一ピークを示した。

F A B - M S ： M+ H 計算値 758.3、 実測値 758

〔実施例 1 0〕

Hydroorotyl-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-OH 式（14) の合成 ：

実施例 1 と同様の方法によって、 表題に示すぺプチ ドを lOOmg 合成した。 了 ミ ノ酸分析（6N HCl + pheno , 24hr, 110°C)

A s 1 3 5 1 )

S e r 0 8 7 1 )

G 1 y 1 0 0 1 )

T r p 1 )

A r g 9 7 1 )

H P L C分析

Cosmosi 1 5C18-AR ( 04.6 x 200mm)カラム （ナカライテスク社 製） を用い、 流速 1. Oml/minで、 0. TFA中ァセ トニ ト リル 10〜 40 60分） の gradient溶出での分析 H P L Cで保持時間 20.0分の 単一ピークを示した。

F A B - M S ： M + H 計算値 760.3、 実測値 760

〔実施例 1 1 〕

Pyrogl u tamy 1-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-0H 式（15) の合成 ：

実施例 1 と同様の方法によって、 表題に示すぺプチ ドを lOOmg 合成した。

アミ ノ酸分析（6N HCl + phenol, 24hr， 110°C)

A s p 0. 8 6 ( 1

S e r 1. 0 0 ( 1

G 1 u 1 . 1 2 ( 1

G 1 y 1. 2 2 ( 1

T r p ― ( 1

A r g 1 . 1 3 ( 1

H P L C分析 Cosmosi 1 5C18-AR ( 04.6 x 200mm)カ ラ ム （ナカ ラ イ テス ク社 製） を用い、 流速 l. Oml/minで、 0.1XTFA中ァセ トニ ト リル 10〜 40¾!(60分） の gradient溶出での分析 H P L Cで保持時間 14.0分の 単一ピークを示した。

F A B - M S ： M + H 計算値 731.3、 実測値 731

〔実施例 1 2〕

Trp-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-OH 式（16) の合成 ：

実施例 1 と同様の方法によって、 表題に示すぺプチ ドを lOOmg 合成した。

ア ミ ノ酸分析（6N HCl+phenol, 24hr, 110°C)

A s p 0. 9 2 . ( 1 )

A 1 a 1. 0 0 ( 1 )

G 1 y 1. 0 0 ( 1 )

T r p - ( 2 )

A r g 1 . 1 3 ( 1 )

H P L C分析

Cosmosi 1 5C18-AR ( φ 4.6 x 200mm)カ ラ ム （ナカ ライ テス ク社 製） を用い、 流速 1. Oml/minで、 0. TFA中ァセ トニ ト リル 10〜 40%(60分） の gradient溶出での分析 H P L Cで保持時間 30.0分の 単一ピークを示した。

F A B— M S ： M + H 計算値 790.3、 実測値 790

〔実施例 1 3〕

Trp - β Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-OH 式（17) の合成 ： 実施例 1 と同様の方法によって、 表題に示すぺプチ ドを lOOmg 合成した。

ァ ミ ノ酸分析（6N HCHphenol, 24hr, 110°C)

A s p 0. 9 0 ( 1 )

β A I a. 一 （ 1。

G 1 y 1 . 0 0 ( 1 )

T r p 一 （ 2 )

A r g 1 . 0 7 ( 1 )

H P L C分析

Cosmosil 5C18-AR ( 04.6 x 200mm)カ ラ ム （ナカ ラ イテスク社 製） を用い、 流速 1.0ml/minで、 0. TFA中ァセ トニ ト リル 10〜 40¾ί(60分） の gradient溶出での分析 H P L Cで保持時間 30.0分の 単一ピークを示した。

F A B - M S ： M+ H 計算値 790.3、 実測値 790

〔実施例 1 4〕

Trp-Gly-Arg-Gly-Asp-Trp-OH 式（18) の合成 ：

実施例 1 と同様の方法によって、 表題に示すぺプチ ドを lOOmg 合成した。

ァ ミ ノ酸分析（6N HCl+phenol, 24hr, 110。C)

A s p 0. 9 0 ( 1 )

G 1 y 2. 0 6 ( 2 )

T r P - （ 2 )

A r g 1 . 0 0 ( 1 )

H P L C分析 Cosmosi 1 5C18-AR ( Φ 4.6 x 200mni)カラム （ナカライテスク社 製） を用い、 流速 l. Oml/minで、 0. TFA中ァセ トニ ト リル 10〜 40¾ί(60分） の gradient溶出での分析 H P L Cで保持時間 30.0分の 単一ピークを示した。

F A B - M S ： M + H 計算値 776.3、 実測値 776

〔実施例 1 5〕

2-0xo-4-thiazol i dine carboxyl - Ser - Arg - Gly-Asp - Trp - OH 式（19)

の合成 ：

実施例 1 と同様の方法によって、 表題に示すぺプチ ドを lOOmg 合成した。

ァ ミ ノ酸分析（6N HCI+phenol, 24hr, 110°C)

A s p 0. 9 0 ( 1 )

S e r 1 . 0 0 ( 1 )

G 1 y 1. 0 6 ( 1 )

T r p - （ 1 )

A r g 1. 0 0 ( 1 )

H P L C分析

Cosmosi 1 5C18-AR ( φ 4.6 x 200mm)カラム （ナカライテスク社 製） を用い、 流速 1. Oml/minで、 0.1XTFA中ァセ トニ ト リル 10〜 40 60分） の gradient溶出での分析 H P L Cで保持時間 24.0分の 単一ピークを示した。

F A B - M S ： M + H 計算値 749.3、 実測値 749

〔実施例 1 6〕

Pro-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-OH 式（20) の合成 ：

p-alkoxybenzyl alcohol型（式（2)) (Trpの導入量 ： 0.87meq/ g;BACHEM社製） 樹脂 0.275g(0.25mmol)を反応容器に移し、 DAMPの 存在下で Fmoc- Trpを活性エステルでこれに導入した後、 表 1 に示 す振盪、 瀘過ステップを繰り返し、 保護ペプチ ド樹脂

Pro-Ser(Bu')-Arg(Pmc)-Gly-Asp(OBu^l ) -Trp-0-Res i n 式（21) を得た。

次に、 得られた保護ペプチ ド樹脂を 0 °Cの ト リ フルォロ酢酸中 で m—ク レゾール、 エタ ンジチオール及びチオア二ソール存在下 に 1 時間処理を行った。 エバポレーターで ト リ フルォロ酢酸を留 去後に、 樹脂を瀘去し、 瀘液にジェチルエーテルを氷冷下で加え 、 樹脂から切断されたペプチ ドを粉末と して得た。 そして、 当該 粉末をジェチルエーテルで洗浄した。 当該洗浄物をセフ アデッ ク ス G— 1 0 (フアルマシア社製） を支持体と したゲルクロマ トグ ラフィ 一により脱塩し、 これを凍結乾燥して粗べプチ ドを得た。 得られた粗ペプチ ドを高速液体クロマ トグラフィ ー （H P L C ) [カラム ： ODS 5C, a ( bondasphere, 20x i50mm)、 移動相 ： (A )0.1¾TFA, (B)100¾CH₃CN/0.1¾TFA, gradientは、 (A):(B)=90:1 0から（A):(B)=70:30 、 流速 17ml/min] で精製し、 更にセフアデ ッ クス G— 2 5 (フアルマシア社製） を支持体と したゲル瀘過ク 口マ トグラフィ一により酢酸塩と し、 これを凍結乾燥することに より Pro-Ser- Arg-Gly-Asp-Trp- 0Hで示される本発明べプチ ドを 40 mg得た。

ア ミ ノ酸分析（6N HC phenol, 24hr, 110°C)

A s p 0. 8 5 ( 1 ) S e r 1 0 0 ( 1 )

G 1 y 1 2 3 ( 1 )

T r p ( 1 )

A r g 1 1 3 ( 1 )

P r o 1 3 1 ( 1 )

H P L C分析

Cosmosi 1 5C18-AR ( φ 4.6 x 200mm)カラムを用い、 流速 1.0ml /minで、 0.1%TFA中ァセ トニ ト リル 10〜40¾ί(60分） の gradient溶 出での分析 H P L Cで、 保持時間 18.0分の単一ピークを示した。

F A B - M S M+ H 計算値 717.3、 実測値 717

〔実施例 1 7〕

(L-2-Azet idinecarboxyl)-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-OH 式（22) の合成 ：

実施例 1 6 と同様の方法によって、 表題に示すぺプチ ドを 40mg 合成した。

ァ ミ ノ酸分析（6N HCl+phenol, 24hr， 110°C)

A S p 0. 9 3 (

S e r 1. 0 0 (

G 1 y 1. 1 9 (

T r p (

A r g 1 5 C

H P L C分析

Cosmosi 1 5C18-AR ( φ 4.6 x 200mm)カラム（ ナカライテスク社 製） を用い、 流速 1. Oml/minで、 0.1¾TFA中ァセ トニ 卜 リル 10〜 40% (60分） の gradient溶出での分析 H P L Cで保持時間 18.0分の 単一ピークを示した。

F A B— M S ： M+ H 計算値 703.3、 実測値 703

〔実施例 1 8〕

(L-Pipecol inyl)-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-OH 式（23) の合成 ：

実施例 1 6 と同様の方法によって、 表題に示すぺプチ ドを 40mg 合成した。

21i_ 酸分析（6N HCl+phenol, 24hr, 110°C)

A s 0. 9 1 ( 1

S e r 1. 0 0 ( 1

G 1 y 1 . 1 5 ( 1

T r p ( 1

A r g 1 1 ( 1

H P L C分析

Cosmosi I 5C18-AR ( φ 4· 6 x 200mm)カ ラ ム（ ナカ ラ イ テスク社 製） を用い、 流速 1.0ml/minで、 0.1 TFA中ァセ トニ ト リル 10〜 40!¾(60分） の gradient溶出での分析 H P L Cで保持時間 20.0分の 単一ピークを示した。

F A B - M S ： M+ H 計算値 731.3、 実測値 731

〔実施例 1 9〕

5-Hydantoinacetyl-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-0H 式（24) の合成 ：

実施例 1 と同様の方法によって、 表題に示すぺプチ ドを 40mg合

-成した。 Ύ ミ ノ酸分析（6Ν HCl+phenol, 24hr, 110°C)

A s p 1 9 ( 1

S e r 0 0 ( 1

G 1 y 2 6 ( 1

T r p 一 ( 1

A r g 1 3 ( 1

H P L C分析

Cosmosil 5C18-AR ( φ 4.6 x 200ππη)カラム （ナカライテスク社 製） を用い、 流速 1. Oml/minで、 0.1 FA中ァセ トニ ト リル 10〜 40 60分） の gradient溶出での分析 H P L Cで保持時間 16.0分の 単一ピークを示した。

F A B— MS ： M + H 計算値 760.3、 実測値 760

〔実施例 2 0〕

(N-CH₃)Pro-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-0H 式（25) の合成 ：

実施例 1 6 と同様の方法によって、 表題に示すぺプチ ドを 40mg 合成した。

アミ ノ酸分析（6N HCl + phenol, 24hr, 110°C)

A s p 0， 8 4 (

S e r 1 . 0 0 (

G 1 y 1 . 1 6 (

T r p (

A r g 1 1 (

H P L C分析

Cosmosil 5C18-AR ( Φ 4.6 x 200mm)カ ラ ム（ ナカ ラ イ テスク社 製） を用い、 流速 l. Oml/minで、 0. l!HFA中ァセ トニ ト リル 10〜 40%(60分） の gradient溶出での分析 H P L Cで保持時間 21.0分の 単一ピークを示した。

F A B— M S ： M + H 計算値 731.3、 実測値 731

〔実施例 2 1 〕

ThioPro-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-OH 式（26) の合成 ：

実施例 1 6 と同様の方法によって、 表題に示すぺプチ ドを 40mg 合成した。

ァ ミ ノ酸分析（6N HCl + phenol, 24hr, 110°C)

A s 0. 8 4 ( 1 )

S e r 1 . 0 0 ( 1 )

G 1 y 1. 1 6 ( 1 )

T r p 一 ( 1 )

A r g 1. 1 1 ( 1 )

H P L C分析

Cosmosi 1 5C18-AR ( 04.6 X 200mm)カラム （ナカライテスク社 製） を用い、 流速 1. Oml/minで、 0.1¾TFA中ァセ トニ ト リル 10〜 40 60分） の gradient溶出での分析 H P L Cで保持時間 20.0分の 単一ピークを示した。

F A B - M S ： M + H 計算値 735.3、 実測値 735

〔実施例 2 2〕

(N-Acetyl)Pro-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-OH 式（27) の合成 ：

実施例 1 6 と同様の方法によって、 表題に示すぺプチ ドを 40mg 合成した。

JLノ酸分析（6N HCl + phenol, 24hr, 110°C)

A s p 0. 9 0 ( 1

S e r 1 . 0 0 ( 1

G l y 1. 1 7 ( 1

T r p — ( 1

A r g 1. 1 0 ( 1

P r o 1. 0 0 ( 1

H P L C分析

Cosmosi 1 5C18-AR ( Φ 4.6 x 200nnn)カラム （ナカライテスク社 製） を用い、 流速 1.0ml/minで、 0.1¾TFA中ァセ トニ ト リル 10〜 40%(60分） の gradient溶出での分析 H P L Cで保持時間 22.0分の 単一ピークを示した。

F A B - M S ： M + H 計算値 759.3、 実測値 759

〔実施例 2 3〕

Pro-Gly-Arg-Gly-Asp-Trp-OH 式（28)

の合成 ：

実施例 1 6 と同様の方法によって、 表題に示すぺプチ ドを 40mg 合成した。

了 ミ ノ酸分析（6N HCl + phenol, 24hr, 110°C)

A s p 0. 8 4 ( 1 )

G l y 1. 9 6 ( 2 )

T r p - （ 1 )

A r g 1. 0 6 ( 1 )

P r o 1. 0 0 ( 1 ) H P L C分析

Cosmosi 1 5C18-AR ( ø 4.6 x 200mm)カラム （ナカライテスク社 製） を用い、 流速 l. Oml/minで、 0. TFA中ァセ トニ ト リル 10〜 40% (60分） の gradient溶出での分析 H P L Cで保持時間 20.0分の 単一ピークを示した。

F A B — M S ： M+ H 計算値 687.3、 実測値 687

〔実施例 2 4〕

(4-hydroxy)Pro-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-0H 式（29) の合成 ：

実施例 1 6 と同様の方法によって、 表題に示すぺプチ ドを 40mg 合成した。

ア ミ ノ酸分析（6N HCHphenol, 24hr, 110°C)

A S P 0 8 8 ( 1 )

S e r 0 9 3 ( 1 )

G 1 y 1 0 4 ( 1 )

T r p - ( 1 )

A r g 0 0 ( 1 )

H P L C分析

Cosmosi 1 5C18-AR ( φ 4.6 x 200mm)カラム （ナカライテスク社 製） を用い、 流速 1. Oml/minで、 0.1¾JTFA中ァセ トニ ト リル 10〜 40%(60分） の gradient溶出での分析 H P L Cで保持時間 17.0分の 単一ピークを示した。

F A B— M S ： M+ H 計算値 733.3、 実測値 733

〔実施例 2 5〕

(3, 4-Dehydro)Pro-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-0H 式（30) の合成

実施例 1 6 と同様の方法によって、 表題に示すぺプチ ドを 40mg 合成した。

ア ミ ノ酸分析（6N HCl+phenol, 24hr, 110°C)

A s p 9 4 ( 1 )

S e r 9 4 ( 1 )

G 1 y 0 6 ( 1 )

T r p 一 （ 1 )

A r g 1 0 0 ( 1 )

H P L C分析

Cosmosi 1 5C18-AR ( φ 4· 6 x 200mm)カ ラ ム （ナカ ラ イ テス ク社 製） を用い、 流速 1.0ml An inで、 0..UTFA中ァセ トニ ト リル 10〜 40 60分） の gradient溶出での分析 H P L Cで保持時間 20.0分の 単一ピ一クを示した。

F A B - M S ： M + H 計算値 715.3、 実測値 715

〔実施例 2 6〕

Pro-Ser-Arg-Gly-Asp-Phe-OH 式（31) の合成 ：

実施例 1 6 と同様の方法によつて、 表題に示すぺプチ ドを 40mg 合成した。

ァ ミ ノ酸分析（6N HCl + phenol, 24hr, 110。C)

A s p 1. 0 4 ( 1 )

S e r 0. 9 0 ( 1 )

G 1 y 1 . 0 4 ( 1 )

P h e 1. 0 3 ( 1 ) A r g 1 . 0 0 ( 1 )

P r o 1 . 0 8 ( 1 )

H P L C分析

Cosmosi 1 5C18-AR ( Φ 4.6 x 200mm)カラム （ナカライテスク社 製） を用い、 流速 l. Oml/minで、 0. TFA中ァセ トニ ト リル 10〜 40 60分） の gradient溶出での分析 H P L Cで保持時間 17.0分の 単一ピークを示した。

F A B— M S ： M+ H 計算値 678.3、 実測値 678

〔実施例 2 7〕

Sar-Ser-Arg-Gly-Asp-Trp-OH 式（32) の合成 ：

実施例 1 6 と同様の方法によって、 表題に示すぺプチ ドを 40mg 合成した。

Zミ ノ酸分析（6N HCl+phenol， 24hr, 110°C)

A S P 0 8 7 ( 1 )

S e r 1 0 0 ( 1 )

G 1 y 1 1 4 ( 1 )

T r p 一 ( 1 )

A r g 1 0 4 ( 1 )

H P L C分析

Cosmosi 1 5C18-AR ( ø 4.6 x 200mm)カラム （ナカライテスク社 製） を用い、 流速 1. Oml/minで、 0.1XTFA中ァセ トニ ト リル 10〜 40%(60分） の gradient溶出での分析 H P L Cで保持時間 17.5分の 単一ピークを示した。

F A B— M S ： M + H 計算値 691.3、 実測値 691 〔試験例 1 〕 本発明の化合物の血小板凝集抑制能

合成べプチ ドの活性測定-

① PRPを用いた in vitroヒ ト血小板凝集

少なく とも 2週間以上いかなる薬も服用 していない健康な男性 を被験者と した。 採血は、 19号の注射針と 1/10容量の 3.8%のクェ ン酸ナ ト リ ウム溶液を予め入れておいたプラスチッ ク シリ ンジを 用い、 空腹時に下はく部の静脈から採血を行った。 採血後速やか に、 シ リ ンジを軽く攪拌して両液を混合した。 この血液を室温で 15分間遠心分離し（llOOrpm, 250g) 、 ブレーキをかけずに回転を 止めた後、 上清を駒込ピぺッ 卜で取り、 多血小板血漿 （P R P) と し室温で保存した。 遠心後の残りの血液をさ らに室温で 15分間 遠心分離し（3500rpm, 1500g)、 ブレーキをかけずに停止させた後 の上清を取り、 寡血小板血漿 （P P P ) と した。 P R P調整後血 小板数を計測し、 血小板数が 2 X 10⁸Zml以上のものについての み以下に述べる実験を行った。

血小板の凝集は、 8 チヤ ンネルの血小板凝集測定機（Hemat race r, Nikoh Bioscience, Tokyo, Japan)を用いて P R Pの光の透過 度の変化から測定した。 まず、 200 /z l の P P P, P R Pをガラ スキュべッ 卜に入れ、 37°Cでィ ンキュペー ト後、 透過度を測定し P P Pの透過度を 100%、 P R Pの透過度を 0 %と した。 次に、 生理食塩水またはサンプルを含む生理食塩水を P R Pに 10 1加 え 37°Cで 1 分間イ ンキュベー ト した後、 さ らに 100 g/mlのコラ 一ゲン溶液を 10 / 1 加え （終濃度 5 g/ml) 凝集を誘発し、 以後 7分間透過度を測定した。 実験は、 最初にコラーゲンと A D Pを 用いて凝集が起こることを確認し、 コラーゲンの最大凝集率が 70 %以上のものについてのみ、 実験に用いた。

サンプルは 2.2 X 10— ² Mになるように生理食塩水に溶解し、 こ れを基に 2倍の希釈系列を調整し実験に用いた。 生理食塩水に不 溶のサンプルについては 10%の D M S〇 (Dimethyl sulfoxide) を含む生理食塩水に溶解した。

結果は次のように計算する

ΜΆ^Μ^- I ^ 一サンプル添加時の最大凝集率

凝集抑制率 = ( 1 —— ] X inn 矸笪？Γ(Ί、 生食のみ添加時の最大凝集率 J 盯具^ u) サンプルの濃度に対し凝集抑制率をプロ ッ 卜 した図を作図し、 この図から凝集を 50%抑制する濃度 （IC₅。） を計算した。 表 2に 各サンプルの IC₅。を示す。

5 4

699S寸 60AV、

この表 2 により、 フイ ブリ ノ一ゲン分子中に存在するア ミ ノ酸 配列である R G D Sに比べ （表 2、 比較例 1 ) 、 R G D配列の両 端に Tr pなどの疎水性の基を持つ分子を導入することにより血小 板凝集阻害活性が大き く上昇することが判明した。 比較例と し て表 2 に挙げたフイ ブリ ノ一ゲン分子中のア ミ ノ酸配列である R G D S - 0 H ( ペプチ ド研究所 （箕面市） より購入） に比べて、 本発明べプチ ドの血小板凝集抑制能力が著しく 向上していること が判明した。

〔試験例 2〕 合成ペプチ ドの血漿中および生体内での安定性

( 1 ) 全血 · 血漿中での安定性評価

〔方 法〕

少なく とも 2週間以上いかなる薬も服用していない健康な男性 を被験者と し、 採血を行なった。 予め 1 / 1 0容量の 3. 8 %クェン酸 ナ ト リ ウム溶液を入れておいたブラスチッ クシリ ンジを用い、 空 腹時に下はく部の静脈から血液を採取した。 採血後速やかにシリ ンジを攪拌して両液を混合した。 全血中での安定性は、 この血液 をそのまま用いて実験を行なった。 一方、 血漿中での安定性は、 この血液を 10分間遠心分離し （800g) 、 ブレーキをかけずに回転 を止めた後の上清を血漿画分と し、 実験を行なった。

試験管に全血又は血漿を 225 ^ 1 入れ、 37°Cに加温した。 合成 ぺプチ ドは、 生理食塩水 （pH7. 4 ) に溶解し 1 mMの溶液と した。 この合成ペプチ ドの溶液を全血又は血漿に 25 z 1 添加し （最終濃 度 100 、 一定時間ィ ンキュベー 卜 した。 ィ ンキュベ一 ト後、 当該溶液を氷冷して分解反応を停止した。 血漿はこのまま— 20°C で凍結保存した。 一方、 全血は 2000 gで 4 °Cで 5分間遠心分離し 、 上清のみを凍結保存した。

サンプルは、 逆相の H P L Cで分析を行なった。 各合成べプチ ドのピーク面積を計算し、 ピーク面積の変化を指標に血液又は血 漿中での安定性を評価した。

第 1 図〜第 3図は、 一般式

A - S e r 一 A r g— G l y— A s p— T r p— O H で表される.ペプチ ド及びその類似化合物 （式中、 Aはア ミ ノ酸又 はァ ミ ノ酸誘導体、 ビタ ミ ン ' ビタ ミ ン様作用物質又はそれらの 誘導体、 核酸の塩基又はその誘導体） の血漿中での安定性を比較 した図である。 また、 表 3 はそれらの半減期をまとめたものであ o

• 表 3 ヒ ト血漿中での合成ペプチ ドの安定性

各合成べプチ ドの血漿中半減期 合成べプチド 半減期

実施例 9 2 4 0分以上

実施例 18 1 2 0分以上

実施例 16 7 4. 5分

実施例 1 1 1. 5分

実施例 11 2 4 0分以上 Aが天然のア ミ ノ酸であり、 かつ一級のア ミ ノ基をもつ ト リプ トフア ンの場合は非常に早い分解を受け、 その半減期は 1 1. 5分で あった。 これに対して Aが天然のア ミ ノ酸であるが、 二級のア ミ ノ基 （ィ ミ ノ基） を持つプロ リ ンの場合には、 血漿中ではプロ リ ンに比べて安定になり、 半減期は 74. 5分であった。 一方、 同じ二 級のア ミ ノ基 （ィ ミ ノ基） を持つプロ リ ン誘導体でも、 ヘテロ環 の炭素数あるいは側鎖の存在により、 血漿中の安定性は大き く異 なった。 ヘテロ 5員環構造を有するプロ リ ンに対し、 ヘテロ 4員 環構造を有するァゼチジンカルボン酸を導入した化合物は、 半減 期が 49分でありプロ リ ンよ り も血漿中の分解性が高かつた。 これ に対し、 ヘテロ 6員環構造を有するピペコ リ ン酸を導入した化合 物の血漿中での半減期は 120 分以上であり、 非常に安定であった これに対し、 Aにォロチン酸やピログルタ ミ ン酸など、 ヘテロ 環構造にカルボ二ル基を持つア ミ ノ酸、 核酸、 ビタ ミ ン誘導体を 導入した化合物は共に血漿中で極めて安定であり、 半減期は 240 分以上であった。

全血中での安定性も血漿中での安定性とほぼ同様に傾向を示し 、 半減期にも違いは見られなかった。

このように、 合成ペプチ ドの両端に導入する化合物を様々なも のに変えることにより、 血漿中での安定性の異なる様々な化合物 を得ることができる。 そして、 このような血液中での安定性が異 なる化合物は、 例えば体外循環用血液凝固抑制剤への応用等を考 えたときに、 人工透析や人工心肺等の体外循環システムの違い ·

0 0 手術時の出血量の違い、 等様々な状況の違いに応じた使い分けを 可能にし、 適用目的によって最適の化合物を適用できるという点 で大きな意味があると考えられる。

( 2 ) 生体内での安定性評価

〔方 法〕

安定性の評価には、 M C H ( I C R) 系のマウス （ォス、 体重 28〜32g)を用いた。 各合成べプチ ドを滅菌した生理食塩水に 10mM 〜20mMの濃度で溶解した物をサンプル溶液と し、 尾静脈からマウ ス 1匹当たり 0.15mlずつ静脈内投与を行なつた （ 1 〜 2 mg/mouse ) 。 一定時間後に、 腹部静脈からへパリ ン処理した注射器で採血 を行なった。 採血後、 血液はすぐに 4 °Cで遠心分離し （1500g[， 3 分） 、 上清を— 20°Cで凍結保存した。 各上清は、 前述の血漿中で の安定性評価の場合と同様に、 逆相の H P L Cで分析を行なった 第 3図及び表 4 は、 一般式

A - S e r - A r g - G 1 y— A s p— T r p— OH で表されるペプチ ド及びその類似化合物 （式中、 Aはア ミ ノ酸又 はァ ミ ノ酸誘導体、 ビタ ミ ン ' ビタ ミ ン様作用物質又はそれらの 誘導体、 核酸の塩基又はその誘導体） の生体内での安定性につい て調べた結果を示している。

表 4 マウ ス体内での合成べプチ ドの安定性

各合成べプチ ドのマウス体内での半減期

Aに ト リブ トフ ァ ン、 プロ リ ン等天然の L一アミ ノ酸を導入し た化合物は、 生体内での高分解性という特徴を有し、 静脈内投与 後、 採血までの時間でほぼ完全に分解された （生体内半減期 2分 以下） 。 これに対し、 プロ リ ン類似物質であるァゼチジンカルボ ン酸を導入した化合物は半減期 3. 3 分、 ビタ ミ ン様作用物質であ るォロチン酸を導入した化合物は半減期 6. 9 分であり、 天然の L 一ア ミ ノ酸を導入した化合物に比べ、 ある程度の高分解性を有し ていた。

このように、 前述の一般式で表されるペプチ ド性化合物は、 全 体的に生体内の高分解性と う特徵を有している。 これは、 体外 循環用血液凝固抑制剤への本発明べプチ ド等の応用を考慮したと きに、 極めて意義深い点である。 すなわち、 これらの化合物は、 体外で循環中には数分から数時間半減期を保ち血小板凝集を抑制 するに対し、 血液が体内に戻ると数分以内に分解される。 つまり 、 体外循環システム中では抗血栓作用があるにもかかわらず、 体 内での止血時間延長作用がないという非常に優れた特徴を有する 化合物である。

〔試験例 3〕 本発明ペプチ ド等に体外循環用血液凝固抑制剤と し ての有用性

( 1 ) 本発明べプチ ド等と現在抗凝固剤と して用いられているへパ リ ンが体内でどの位の期間、 分解あるいは排出されずに残り、 そ の作用が持続するかを調べるために、 ビーグル犬を用いた静脈内 投与の実験を行つた。

本発明べプチ ド等は、 血小板凝集を抑制する作用を有している ので、 化合物を体内に静脈から投与した後、 経時的に血液を採取 し、 各時点での血液の血小板凝集抑制活性を測定することで、 当 該ぺプチ ド等が分解されずに体内どの位残存しているかを知るこ とができる。 すなわち、 当該ペプチ ド等の体内における安定性を 推定することができる。

実験には、 体重約 l OKgの雄のビーグル犬を用いた。 実施例 9で 得た本発明ペプチ ド等を生理食塩水に溶解し、 とう側皮静脈より 21G の注射針を装着した注射筒を用いて投与した。 投与前及び投 与後、 5， 15， 30, 60， 12 180, 360分に無麻酔下でビーグル犬のとう 側皮静脈から 20G の注射針に延長チューブを装着したものを用い て自然流血により、 3.8?%クェン酸ナ ト リ ウム 1 容、 全血 9容の 割合で採血を行った。 採取した血液は、 lOOOrpm で 10分間の遠心 分離を行い、 多血小板血漿（PRP) を分取し、 さ らに 3000rpm で 15 分間の遠心分離で乏血小板血漿（PPP) を分取した。

血小板凝集能の測定は、 上記の PRP を用い、 コラーゲン及び A D Pによる血小板凝集を aggregometerで測定した。 A D P及びコ ラ一ゲンの添加濃度は、 八 0 で最終濃度7.5 〜10.0/ M 、 コラ 一ゲンで最終濃度 7.5 〜10·.0〃 g/mlと した。

第 4図の Aは、 実施例 9の本発明ペプチ ド等をビーグル犬の体 重 1 Kg当たり 5 mg投与した時の、 血小板凝集活性の回復の時間経 過を示す。 凝集素は、 10/z g/miのコラーゲンである。 投与直後の 5分後には血小板凝集は完全に抑制されるが、 時間経過と共に血 小板凝集活性の回復が見られ、 45〜60分後には完全に投与前のレ ベルにまで回復した。 コラーゲンの濃度を変えた場合、 あるいは 凝集素と して A D Pを用いた場合にも全く 同様の結果が得られた 。 このことは、 当該ペプチ ド等が、 長くても 60分以内に体内で分 解あるいは腎臓から体外に排出され、 血液中の濃度が低下したこ とを示している。

(2) 現在抗凝固剤と して用いられているへパリンを、 本発明ぺプ チ ド等に対する比較例と して用いた。

しかしへパリ ンは、 血小板に対しては作用を持たない物質であ り、 上記（1) のような方法では、 体内での安定性を測定すること ができない。 そこで、 へパ リ ンの主作用である抗凝固作用の変化 を経時的に測定することで、 体内における安定性を推定した。 実験は、 生理食塩液に溶解したへパリ ンを、 上記（1 ) と同様の 方法で静脈内に投与し、 経時的に血液を採取し、 P P P を調製した 抗凝固作用の測定は常法に従い、 上記の P P P を用いて、 試験管 内での血液凝固活性の指標であるプロ トロンビン時間と活性化部 分 トロンボプラスチン時間を測定することで行った。 それぞれの 測定は、 37 °Cで 3分間のプレイ ンキュベ一ショ ン条件下で行った ( AME LUNG KC - 10A, バク スター株式会社製） 。 プロ ト ロ ン ビン時 間及び活性化部分 トロンボプラスチン時間の延長 （すなわち、 凝 固までの時間の延長） が投与後どれ位継続するかで、 へパリ ンが 体内からどれ位の速度で消失するかを知ることができる。

第 4図の Bは、 ビーグル犬に体重 1 Kg当たり 200Uのへパリ ンを 静脈内投与した時の、 プロ トロンビン時間の延長傾向の経時的変 化を示した図である。 へパリ ン投与直後には、 プロ トロンビン時 間は投与前に比べ 1. 5 〜2. 0 倍にまで延長したが、 時間を経るに 従い、 プロ トロンビン時間は投与前のレベルに徐々に戻つだ。 し かし、 完全に投与前のレベルに回復するまでには、 2〜 3時間を 要した。 活性化部分 トロンボプラスチン時間についても同様の結 果が得られた。 このことは、 へパリ ンは体内での分解あるいは体 内からの排出が遅く、 数時間はその作用が残存することを示して いる。

このようにして、 従来から体外循環時の抗凝固剤と して用いら れているへパリ ンに比べ、 実施例 9 において調製した本発明ぺプ チ ド等は非常に早く その作用を消失した。 このことは、 人工透析 等の体外循環システム使用終了後も出血傾向が数時間続く という 問題点を有する現在の抗凝固剤であるへパリ ンの欠点を補う もの であり、 かかるへパリ ンに代わる新しい血液凝固抑制剤と して当 該ぺプチ ド等が十分に期待できるものであることを示している。

(3)ビーグル犬を用いた体外循環モデルでの実験

本発明べプチ ド等が、 体外循環システム中での血液凝固を抑制 する作用があることを確認するため、 体外循環モデルの一つであ るビーグル犬の人工透析モデルを用いた実験を行った（Hamano, et al. , Thromb. Res.55(1989)438-449 を参照のこ と） 。

実験には、 体重約 10〜12Kgのビーグル犬を用いた。 ベン トバル ピタール（ 約 30mg/Kg)で麻酔したビーグル犬の右後肢を切開し、 大腿動脈と大腿静脈を露出させた。 動脈及び静脈それぞれに力二 ユ ーレを揷入し、 第 5図に示すような回路構造の実験用人工透析 器 （Kuraray, Osaka, Japan)に連結した。 透析膜と しては、 中空糸 膜型 (RENAK-A, RA-04, 0.4m², Kawasumi Laboratori es， Tokyo)を使 用した。 大腿動脈と透析器の間には血液用のポンプを入れ、 体外 循環システムの中の血流量が常に 25ml/minになるようにして実験 を行った。

実験時の測定パラメータ一は、 ①透析膜上流部での圧力 （灌流 圧） ， ②血小板粘着率， ③全血凝固時間， の 3項目である。 ①の 圧力の測定は、 第 5図に示すように、 透析回路中、 透析膜上流部 に組み込んだ圧力計を用いて行った。 透析膜部位は異物との接触 が多く 、 また狭い空間を血流が通るため、 透析回路中で一番血液 凝固が起こりやすい部分であり、 こ こで血液凝固が起こると、 透 析膜が目詰ま りを起こ して上流部の血圧が上昇する。 すなわちこ の部分の灌流圧の変化は、 透析回路での血液凝固の程度の指標と なる。 一方②， ③については、. 透析部分への入口、 出口の部分で 一定時間おきに少量の血液をサンプリ ングし、 常法に従い測定し た。 それぞれに血小板の機能 （②） 、 血液凝固の機能 （活性化の 程度、 ③） 力 実験の進行と共に、 どのように変化するかを知る ためのパラメ一ターである。

実験は回路装着後すぐに、 動脈側 （透析回路入り口側） から、 生理食塩水に溶解した本発明べプチ ド等の連続注入を開始した。 注入量は 10mg/ 個体又は 30nig/ 個体であり、 全量を 1 時間かけて 徐々に注入した （注入量 1 m l /m i n) 。 対照実験においては、 生理 食塩水のみを同様の方法で連続注入した。 60分後に薬物の注入を 中止し、 以後 180 分まで、 血液を循環させ上記のパラメータ一に ついてさ らに測定を継続した。 ただし、 圧力力 500mmHg を越えた ものについては、 その段階で実験を終了した。

第 6図に、 実施例 9の化合物の灌流圧上圧に対する抑制効果に ついて調べた実験の結果を示す。 横軸は薬物投与開始後の時間を 、 縦軸は灌流圧を示している。 灌流圧は、 回路装着直後には 0 mm であり、 血液凝固が起こるとこの値が大き く なる。 生理食塩水 のみ注入した対照群では、 1 0分以降急激な灌流圧の上昇が認めら れ、 25分で 500minHg を越え、 測定不能となった。 このように、 薬 剤を何も投与しないと、 急速に透析回路中で、 特に透析膜部位で 血液の凝固が起こる。 これに対し、 実施例 9の本発明ペプチ ド等 を添加した場合には、 明らかな血液凝固の抑制作用が見られた。 投与量が 1 0 m g/ 個体のときには、 灌流圧の上昇の仕方が明らかに 遅く なり、 その効果は、 注入終了後も持続した。 さ らに、 薬剤投 与量を 30mg/ 個体に増加した場合には、 薬物注入中はほとんど、 灌流圧の上昇が見られなかった。

血小板凝集能、 全血凝固時間についても灌流圧の上昇パターン とほぼ平行した変化を示した （図示せず） 。 すなわち、 対照群で は、 時間と共に血小板凝集能の上昇、 全血凝固時間の短縮が起こ つた。 これは血小板が活性化され、 さ らに血液凝固系も活性化さ れていることを示しており、 血液凝固が非常に起こりやすい状態 であった。 一方、 実施例 9 の本発明ペプチ ド等を投与した例で は、 連続注入中、 血液の粘着能がほぼ 0 %まで下がり、 完全に血 小板活性が抑制された状態であることが判明した。 また、 この期 間全血凝集時間も有意に延長した。

このように本発明べプチ ド等は、 体外循環システム中での血液 凝固をほぼ完全に抑制した。 このことは、 現在使用されているへ パリ ンの代替物と して、 本発明べプチ ドが十分に使用可能である ことが示されている。 前述したように、 へパリ ンは体外循環シス テム中での血液凝固を完全に抑える反面、 体内からの排出速度が 遅く、 システム脱着後も数時間は、 血液凝固を抑制し、 出血傾向 を助長してしまう という大きな欠点を有する。 かかる点で本発明 ペプチ ド等は、 第 4図に既に示したごと く、 へパリ ンとは異なり 体内での分解性が極めて良好で、 注入を止めれば比較的速やかに 血液凝固は薬物投与前の正常なレベルに回復するという利点を有 する。 また、 本発明べプチ ド等は極めて低毒性であることから、 前記へパリ ンの欠点を補う全く新しい血液凝固抑制剤と して極め て有望である。

上記に示すように、 本発明べプチ ド等は生理食塩水あるいはク ェン酸溶液に溶解して 1 時間当たり 3 mg程度を体外循環システム の入口付近から点滴等で連続注入すれば、 十分な血液凝固効果が 期待できる。 実際にヒ トに適用する際には、 さ らに投与量を減ら すことも可能であると考えられる。

また、 クェン酸溶液、 へパ リ ン、 フザン、 血栓溶解剤等の作用 機序の全く異なる抗凝固剤と併用すれば、 相乗的な効果が期待で き、 両者の使用量を減らすことが可能であり、 より安全性を高め ることができる。

〔試験例 4〕 本発明べプチ ド等の輸血用血小板製剤保護剤と して 'の有用性

少なく とも 2週間以上いかなる薬も服用していない健康な男性 を被験者と した。 採血は、 目的とする最終濃度の 10倍の濃度の合 成べプチ ドを 3. 8 %クェン酸ナ ト リ ウム溶液に溶解した合成ぺプ チ ド溶液を 1 /10容量予めシリ ンジに入れておき、 19号の注射針を 用いて空腹時に、 下はく部の静脈より行った。 採血後、 速やかに シリ ンジを軽く撹拌して、 両液を混合した。 この血液に、 室温で 15分間遠心分離（l l OOrpm, 250 g)を施してブレーキをかけずに回転 を止めた後、 上清を駒込ピぺッ 卜で取り、 当該上清を血小板分画 と した。 さ らに残りの血液を遠心分離し （3000 rpm， 1000g：)、 上清 を寡血小板血漿と して保存した。

血小板分画は、 ポリプロ ピレン製の試験管に入れ、 通気性を確 保するためにメ ンブレンフィルターで蓋をした後、 振盪器にのせ 、 振幅 20 cm、 振盪数 2 Hzの条件で振盪しながら室温で保存を行つ た。 以上の操作は全て無菌的に行い、 保存中の細菌の増殖を防い だ。

一定時間保存後に血小板分画の一部を取り、 血小板数を測定し た後、 最終濃度 20 g/m lとなるようにプロスタグラ ンディ ン E l ( シグマ社製） を加え、 750 gで 10分間遠心分離を行い、 上清を除去 した後、 プロスタグラ ンディ ン E 1を含むへぺスータイ ロー ド緩衝 液で血小板を 2回洗浄し、 保護ペプチ ドを取り除いた。 最後に、 血小板を予め保存してあった寡血小板血漿に浮遊させ、 一定時間 イ ンキュベー ト した後、 前述した方法により血小板の凝集能を測 定した。

第 7図は、 保存に伴う血小板数の変化を示した図である。 生理 食塩水のみ添加した対照群では、 血小板数は保存時間にほぼ比例 して減少した。 これに対し、 実施例 9の化合物 （式（14) ) を添加 した群では、 無添加の対照群に比べ有意な血小板数の減少に対す る抑制効果が見られた。 この保護効果は添加するべプチ ド濃度依 存的であり、 400 fi を添加したときには 72時間の保存中に血小 板数の減少はほとんど見られなかった。

第 8図は、 血小板凝集能の保存に伴う経時的変化を示している 。 無添加の対照群では、 72時間の保存で血小板の凝集活性は 25 % まで減少したが、 実施例 9の化合物 （式（14) ) を添加した群では 凝集活性の低下が有意に抑制された。 この凝集活性の低下に対す る抑制効果は、 添加するべプチ ド化合物の濃度に依存しており、 400 を添加したときには 72時間の保存後にも血小板の凝集活 性は 60〜70 %残存していた。

このよう に血小板分画に本発明ペプチ ド等を添加することによ

6 δ り、 保存に伴う血小板数の減少、 血小板凝集能の低下の抑制等の 血小板保護作用が得られた。 従来から知られている、 R G D Sや R G D F等のペプチ ド性化合物は、 血小板分画に添加しても、 血 漿中の酵素の作用で数時間以内に分解されてしま う ことが確認さ れており、 これらの化合物が長時間の血小板保存時には使用でき ないのは明らかである。 また、 逆に非常に安定で体内に入っても 容易に分解されない化合物は、 輸血後に体内の全ての血小板の機 能を抑制することになり、 輸血の有効性を低下させてしまう こと になる。 その点、 本発明ペプチ ド等は、 血小板分画中での高安定 性、 体内での高分解性及び低毒性という特徵を有するという点で 非常に優れた血小板保護剤であると考えられる。

また、 本発明ペプチ ド等を酢酸塩やリ ン酸塩の形で投与するこ とで、 緩衝作用を付加し血小板分画の保存に伴う pHの変化を抑制 するような効果も期待できる。 さ らに本発明べプチ ド等の単独投 与ではなく、 アス ピ リ ン等の作用機作の異なる血小板凝集抑制薬 との併用による効果も期待できる。

〔試験例 5〕 本発明ペプチ ド等のガン転移抑制剤と しての有用性 ( 1 )細胞外基質蛋白質と しては、 1型コラーゲン （岩城ガラス， t ype I - c) 、 4型コラーゲン （岩城ガラス， t y pe I V)、 フイ ブ口 ネクチン （ヒ ト由来、 岩城ガラス） 、 ビ トロネクチン （ヒ ト由来 、 岩城ガラ ス） 、 ラ ミ ニ ン （マウ ス EHA 肉腫由来、 岩城ガラ ス） を用い、 これらの細胞外基質蛋白質を吸着させたプラスチッ クプ レー トに対する細胞の接着を調べる実験を行つた。

a) 細胞外基質蛋白質吸着プレー トの作成法

コラーゲンは、 塩酸で pH3. 0 に調節した生理食塩水で希釈し、 100 ^ g/mlに調製した希釈溶液を吸着に使用 した。 一方、 残りの 3 つの蛋白質は pH7.4 の PBS で希釈し、 20 g/mlに調製し使用し た。 -:

例えば 1型コラーゲン吸着プレー トを作成する際には、 1 型コ ラーゲンの希釈溶液を 0.4ml ずつ 24穴のプラスチッ クプレー トに 入れ、 37°Cで一晚保温し、 1 型コラーゲンを吸着プレー トに吸着 させた。 さ らに、 非特異的な細胞の吸着を防ぐために 3 %牛血清 アルブミ ン （シグマ社製） を含む PBS を各穴に入れ、 37°Cで 1〜 2時間処理した。 最後に PBS で 3回洗浄し、 1型コラーゲン吸着 プレー トと した。 その他の細胞外基質蛋白質についても全く 同様 の方法で吸着プレー トを作成した。

b)細胞接着阻害活性の測定法

本発明べプチ ド等を血清を含まない EMEM培地 （二ッスィ製） で希釈し、 5 mM， 0.5mM, 50 μ. Μ 及び 5 (i M の希釈系列を作製した 。 上記の細胞外基質蛋白質吸着プレー トに予め 300 の血清を 含まない EMEM培地を入れておき、 次に各穴に各濃度のぺプチ ド溶 液を 100 n 1 ずつ添加した。 実験は、 一つの濃度につき 4穴を用 いる 4連で行った。 ただし、 ペプチ ド無添加の対照群と しては、 血清を含まない EMEM培地だけを 100 a 1 添加した。 次に、 HeLa細 胞又は B16F10メ ラノ一マ細胞等の浮遊液 （ 5 X 10⁶ 個/ ml ) を用 意し、 各穴に 0.1ml ずつ添加した。 プラスチッ クプレー トを軽く 水平にゆすり、 撹拌後、 C0₂ イ ンキュベータ一中で 1 時間イ ンキ ュペー ト した。

c)接着細胞数の測定

上記に従い、 1 時間のイ ンキュベーシ ョ ンを行った後、 各穴 の溶液を全て取り除き、 さ らに PBS で 3回洗浄し、 未接着の細胞 を取り除いた。 次に 3 %のパラホルムアルデヒ ド溶液を 0.3 ml ず つ各穴に添加し、 室温で 20分放置した。 PBS で 2回洗浄後、 5 % メチレンブルー溶液を添加し細胞を染色した。 室温で 20分後に、 0.1Mのホウ酸緩衝液 （pH8.5)でよ く洗浄し、 余分なメ チレンブル 一を全て取り除き、 最後に 1規定塩酸を 0.3ml ずつ入れ、 20分放 置した。 細胞から遊離してきたメチレンブルーの濃度を分光光度 系を用い、 600nm の光の吸光度で測定した。 なお、 この測定系で は、 細胞外基質蛋白質に付着した細胞数は 600ηπι の吸光度に比例 するので、 正確な細胞数の測定が可能である。

(2)上記試験例（1) と同様の方法で、 比較例の化合物 R GD Sの 細胞接着に対する阻害効果を第 9図， 第 1 0図はそれぞれ HeLa細 胞， B16F10メ ラノ一マ細胞の各種細胞外基質蛋白質の接着に対す る実施例 9の化合物 （式（14)) 及び比較例である R G D Sの影響 を調べた結果である。 これらの図から明らかなように、 ラ ミニン への細胞接着に対しては効果は殆ど見られなかったが、 それ以外 の細胞外基質蛋白質に対する細胞接着は、 実施例 1 に示したぺプ チ ド （式（1) ) により濃度依存的に抑制された。 そして、 この効 果は比較例の RGD Sに比べ 10〜100 倍強かった。 ラ ミニンにつ いては、 従来から RGDの他に、

T y r— I l e - G l y - S e r -A r g

や

I l e - L y s -V a l -A l a -V a l

といつた配列が細胞接着に関係しているといわれており、 それぞ れの配列に対し特異的な受容体 （イ ンテグリ ン） が存在している 。 第 9図及び第 1 0図に示す実験でラ ミニンに対する細胞接着が 殆ど阻害されなかつたのは、 He La細胞又は B 16 F 10メ ラノーマ細胞 の細胞表面にこのようなラ ミニン特異的な受容体が多く発現して いたためと考えられる。

このように、 本発明ペプチ ド等は様々なガン細胞の細胞外基質 蛋白質に対する細胞接着を抑制する。 このことは、 これらのぺプ チ ド等がガン細胞の血管基底膜への接着を抑制し得るものである ことを示しており、 ガン転移抑制剤と しての可能性を強く示唆し ている。 また、 毒性の高い現在の抗ガン剤とは異なり、 極めて低 毒性の本発明の化合物は長期にわたる服用に耐え得るものであり 、 今まで存在しなかつた新しい分野の薬剤であるガン転移抑制剤 と して十分期待できるものである。

〔試験例 6〕 急性毒性試験

本発明ペプチ ド等をマウスに 100mg/Kgの割合で静脈投与を行つ たが、 何らの毒性も観察されなかった。

〔製剤例 1 〕

各実施例で得られた本発明べプチ ド等 l OOmg を生理食塩水 100m 1 に溶解し、 得られた溶液を無菌的に 2. 5m l 容のアンプルに充塡 、 封入し、 注射液製剤と した。

〔製剤例 2〕

各実施例で得られた本発明べプチ ド 500mg 、 結晶セルロース 50 mg、 乳糖 450mg からなる混合物に、 エタノールと水の混液 1 m lを 加え練合した。 当該混合物を常法に従って造粒して顆粒剤と した 産業上の利用可能性

本発明により、 血小板凝集阻害作用と血液凝固阻害作用とを有 する新規べプチ ド、 並びに当該べプチ ドを有効成分と して含有す る、 血栓崩壊治療中と治療後の血小板血栓症、 血栓閉塞症に対し て有効な、 更には再閉塞や心筋梗塞の予防も可能な血小板凝集抑 制剤、 及び体外循環時の血栓形成の主原因である血液凝固を抑制 し得る血液凝固抑制剤が提供される。

また、 本発明により、 輸血用血小板製剤保護剤、 細胞接着阻害 剤、 ガン転移阻害剤が提供される。

そしてさ らに、 本発明により、 パッ ク中に輸血用血小板製剤中 に上記輸血用血小板製剤保護剤を含ませたことを特徴とする輸血 用血小板製剤パッ クが提供される。

Claims

請 求 の 範 囲

1 . 一般式

A - B - A r g - G l y - A s p - C - D ( I ) (式中、 Aはア ミ ノ酸、 ア ミ ノ酸誘導体、 ビタ ミ ン、 ビタ ミ ン 誘導体、 ビタ ミ ン様作用物質、 ビタ ミ ン様作用物質の誘導体、 核 酸の塩基、 核酸の塩基の誘導体及びヒダン トイ ン酢酸よりなる群 の中から選ばれた化合物 ； Bはア ミ ノ酸 ； Cは疎水性官能基を有 するア ミ ノ酸 ； Dは水酸基又はア ミ ノ基を示す）

で表される、 ペプチ ド、 ペプチ ド誘導体又はそれらの塩。

2. Aにおけるア ミ ノ酸若しく はア ミ ノ酸誘導体が、 プロ リ ン、 チォプロ リ ン、 ハイ ドロキシプロ リ ン、 デヒ ドロプロ リ ン、 2 - ォキソ一 4 —チアゾリ ジンカルボン酸、 N—アルキルグリ シン又 は次の一般式

〔式中、 R , は、 水素原子、 一般式 一 (CH₂)_PCHコ 又は一般式

τ I (式中、 pは 0 5の整数である） 、 mは 2 5の整数、 nは 0 2の整数である〕 で表されるイ ミ ノ酸誘導体、 ト リブ トフ ァ ン 又は次の一般式

(in)

(式中の R ₂ は水素原子又はアルキル基、 R ₃ は水素原子又は 0 —アルキル基、 R < は水素原子又はアルキル基、 R ₅ は水素原子 、 ア ミ ノ基又はアミ ノアシル基、 qは 0 3の整数である） で表 される ト リプ トファ ン誘導体、 ピログルタ ミ ン酸又は 2 —ァゼチ ジノ ン一 4 一力ルボン酸である、 請求の範囲第 1項記載のぺプチ ド、 ペプチ ド誘導体又はそれらの塩。

3. ビタ ミ ン様作用物質又はビタ ミ ン様作用物質の誘導体が、 ォ ロチ ン酸又はハイ ド口才ロチ ン酸である、 請求の範囲第 1 項記載 のペプチ ド、 ペプチ ド誘導体又はそれらの塩。

4. Bがセ リ ン、 グリ シ ン、 ノくリ ン、 ァラニン、 ス レオニン又は β —了うニンである、 請求の範囲第 1項乃至同第 3項のいずれか —つに記載されたべプチ ド若しく はべプチ ド誘導体又はそれらの

5. C力く 卜 リブ 卜 フ ァ ン若しく はフ ヱニルァラニ ンである、 請求 の範囲第 I 項乃至同第 4項のいずれか一つに記載されたペプチ ド 若しく はべプチ ド誘導体又はそれらの塩。

6 . 請求の範囲第 1 項乃至同第 5項のいずれか一つに記載された ペプチ ド、 ぺプチ ド誘導体又はそれらの塩を有効成分と して含む 、 血小板凝集抑制剤。

7 . 請求の範囲第 1 項乃至同第 5項のいずれか一つに記載された ぺプチ ド、 ぺプチ ド誘導体又はそれらの塩を有効成分と して含む 、 体外循環用血液凝固抑制剤。

8 . 請求の範囲第 1 項乃至同第 5項のいずれか一つに記載された ぺプチ ド、 ぺプチ ド誘導体又はそれらの塩を有効成分と して含む 、 細胞接着阻害剤。

9 . 請求の範囲第 1項乃至同第 5項のいずれか一つに記載された ぺプチ ド、 ぺプチ ド誘導体又はそれらの塩を有効成分と して含む 、 ガン転移阻害剤。

1 0 . 請求の範囲第 1項乃至同第 5項のいずれか一つに記載され たべプチ ド、 ぺプチ ド誘導体又はそれらの塩を有効成分と して含 む、 輸血用血小板製剤保護剤。

1 1 . 請求の範囲第 1 0項に記載された輸血用血小板保護剤をパ ッ ク中の輸血用血小板製剤中に含ませたことを特徴とする、 輸血 用血小板製剤パッ ク。