JPH069687A - 新規ペプチドおよびそれを用いた血小板凝集阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 次式で示されるペプチドまたはその塩、 Ｘ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｙ−Ｚ （式中、Ｘは炭素数３─14の脂肪酸残基、Ｙは疎水性ア
ミノ酸残基、Ｚは水酸基又はＮＨ₂ を示す。）および前
記のペプチドまたはその塩を有効成分として含有する血
小板凝集阻害剤。 【効果】 本発明の新規なペプチドは、血小板凝集阻害
剤として有用であり、血小板血栓症、血栓塞栓症及び再
閉塞の予防、また心筋梗塞を予防することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、血小板凝集阻害作用を
もつ新規ペプチド、および該ペプチドを用いた血小板凝
集阻害剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】血液中に存在する血小板の役割のひとつ
は、損傷した血管の表面に吸着し、お互いに凝集するこ
とにより出血を防ぐことである。ところが、病的な環境
下においては血小板凝集と血液凝固による血栓形成が血
管の閉塞を生じ、組織、臓器に酸素や栄養素を供給でき
なくなり、心筋梗塞や脳卒中に代表される循環器の虚血
性疾患を惹起する。これらの循環器系疾患は癌に次ぐ高
い死亡率を示し、今日においても大きな社会問題であ
る。

【０００３】血小板は、血管損傷などにより露出される
内皮下組織のコラーゲンなどの結合組織蛋白質や血漿中
に存在するトロンビンなどの血小板膜受容体への結合、
あるいは血小板内の顆粒中に存在するアデノシンジフォ
スフェイト（ＡＤＰ）、アドレナリン、セロトニン、ト
ロンボキサン（ＴＸ）Ａ２などの放出によるオートクラ
イン的な膜受容体への結合によって活性化される。そし
て、フィブリノーゲン受容体である糖蛋白質が細胞表面
に提示され、その複合体（gpIIbIIIa）を形成すること
によって凝集可能となり、フィブリノーゲン架橋を介し
た凝集を起こす。

【０００４】このgpIIbIIIa複合体を先天的に欠如した
血小板無力症（thrombasthenia) においては血小板凝集
能がなく、強度の出血傾向を示すことから、本複合体の
フィブリノーゲンとの結合が血小板凝集において必須で
あることが明かである Ruoslahtiら, Science, 238, 49
1(1987) 。また、コラー(Coller)らはgpIIbIIIaに対す
るモノクローナル抗体のF(ab')₂ フラグメントに強力な
血小板凝集阻害作用があることを報告しており Blood,
68, 783(1986) 、gpIIbIIIaの機能を阻害することで、
血小板凝集阻害剤が開発可能なことを明らかにした。本
モノクローナル抗体は治療薬としての潜在性を有する
が、高分子蛋白質のため、繰り返し投与による抗体産出
の問題があり、その使用は制限されると思われる。従っ
て、gpIIbIIIaに対するアンタゴニストとして免疫原性
のない低分子化合物を創造すれば、繰り返し投与にも問
題はなく、治療薬としての価値は非常に高い。一方、gp
IIbIIIaとフィブリノーゲンの結合に関する研究は、Ruo
slahti らによる一連の研究により導かれた細胞接着分
子に共通のアミノ酸配列アルギニン−グリシン−アスパ
ラギン酸（ＲＧＤ）の発見 Nature, 309, 30−33(1984)
に始まった。そしてＲＧＤ配列を認識するレセプターの
研究から、gpIIbIIIaはＲＧＤ配列を認識するインテグ
リンファミリーに属する受容体であり Phillips ら、Bl
ood, 71, 831−843(1988)、フィブリノーゲンとの結合
においては、特にフィブリノーゲン分子中に存在する２
つのＲＧＤＦ配列を認識して結合していることが明らか
になっている Andrieux ら、J.Biol.Chem., 264, 9258
−9265(1989)。

【０００５】また、同様にＲＧＤ配列を有するVon Will
ebrand因子、フィブロネクチン、ビトロネクチン、トロ
ンボスポンジンも、やはりgpIIbIIIaに結合することが
判っている Pytela ら、Science, 231, 1559(1986)また
はCell, 42, 439(1985) 。これらの知見から、ＲＧＤ配
列を含む合成ペプチドがgpIIbIIIaとフィブリノーゲン
の結合を阻害して、血小板凝集を阻害することが予想さ
れ、既にいくつかの研究がなされている。合成ペプチド
ＧＲＧＤＳＰを用いた検討では、400 μＭでＡＤＰで活
性化された血小板凝集を完全に阻害した Plow ら、Pro
c,Natl,Acad,Sci,USA, 82, 8057−8061(1985)。また、
ＲＧＤＳでは、46−50μM の濃度で濃度依存的に80−90
％の凝集を阻害したが、アミノ酸を１残基付加したＲＧ
ＤＳＴではその活性は弱いものであった。しかし、ＲＧ
ＤＦではＲＧＤＳの４〜５倍強い活性を示した Plow
ら、Blood, 70, 110−115(1987) またはHarfinest ら、
Blood, 71,132−136(1988) 。

【０００６】ＲＧＤペプチドのＮ末端アミノ基及び Arg
−Gly 間のペプチド結合を欠如させた誘導体は特開平2
−78653 号公報および米国特許4,952,562号に記載され
ている。ＲＧＤを有する環状構造の誘導体は特開平3−1
18331号公報、特開平2−174797号公報および特開平2−6
2892 号公報あるいはＷＯ91／01331号に記載されてい
る。また、ＲＧＤを含むテトラペプチド誘導体に関して
は特開平1−190699号公報、特開平2−62892 号公報およ
びＥＰ0422937号、米国特許4,952,562号に記載されてい
る。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、血小
板凝集阻害能の高い新規ペプチドを提供するとともに、
それを用いた血小板凝集阻害剤を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らはＲＧＤペプ
チドの疎水性を上昇させる手段として、ペプチドのＮ末
端アミノ基に脂肪酸残基を加えることによって、疎水性
を向上させることを考え、関連誘導体を種々合成し、血
小板凝集阻害活性を鋭意検討した結果、Ｎ末端アミノ基
に脂肪酸残基を導入することは、疎水性の向上のみなら
ず、活性の向上にもつながることを見いだし、本発明を
完成するに至った。従来、アルギニン残基のＮ末端アミ
ノ基へのホルミル化およびアセチル化の報告はあるが、
より長い炭素鎖を有する脂肪酸を結合した誘導体の報告
はなく、これらの化合物は新規である。

【０００９】血小板凝集剤として実用可能な化合物を創
造するには、まず高活性を有する誘導体開発が必要であ
るが、生体内での化合物の安定化および経口剤として開
発するには吸収効率の向上も必須である。経口吸収の面
でみればＲＧＤペプチドはその構造から親水性が大き
く、活性の向上のみならず、疎水性を増大させるような
誘導が必要であり、脂肪酸残基の導入はこの目的を満た
すものである。

【００１０】すなわち、本発明は血小板凝集阻害活性を
有する新規ペプチドに関するもので、次式で示されるペ
プチドまたはその塩 Ｘ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｙ−Ｚ （式中、Ｘは炭素数３─14の脂肪酸残基、Ｙは疎水性ア
ミノ酸残基、Ｚは水酸基又はＮＨ₂ を示す。）である。

【００１１】上記式中のＸで示される脂肪酸残基の鎖長
としては炭素数４〜７を有するものが高活性で、好まし
いものである。また、疎水性アミノ酸残基としては、ト
リプトファン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残
基が好ましい。脂肪酸残基の炭素数の上限については炭
素数の増加に伴い、ペプチドの水溶性が減少する傾向が
あり、その活性測定の結果、炭素数14までの直鎖型また
は分岐型の脂肪酸が好ましい。

【００１２】本明細書において、アミノ酸、ペプチド、
保護基、活性基、その他に関し略号で表示する場合、国
際純正および応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）、国際生化学
連合（ＩＵＢ）の規定或は該当分野における慣用記号に
従うものとし、その例を次に挙げる。またアミノ酸など
に関し光学異性体がありうる場合は、特に明示しなけれ
ばＬ体を示すものとする。

【００１３】 Arg またはＲ ：アルギニン Asp またはＤ ：アスパラギン酸 Gly またはＧ ：グリシン Ser またはＳ ：セリン Thr またはＴ ：スレオニン Trp またはＷ ：トリプトファン Tyr またはＹ ：チロシン Pro またはＰ ：プロリン Boc ：ｔ−ブトキシカルボニル Bu^t ：ｔ−ブチル OBu^t ：ｔ−ブチルエステル Mtr ：4 −メトキシ−2,3,6 −トリメチルベンゼン
スルホニル Fmoc ：9 −フルオレニルメトキシカルボニル 本発明のペプチド類は、入手容易な市販のアミノ酸を利
用して、簡単な操作で容易に合成することができる。本
発明のペプチドは、ペプチド化学において通常用いられ
る方法、例えば、「ザ ペプチド(The Peptides)」第１
巻〔Schroder and Luhke著, Academic Press, New Yor
k, U.S.A.(1966年) 〕、「ペプチド合成の基礎と実験」
〔泉屋信夫ら著丸善（株）（1985年）〕などに記載され
ている方法によって製造することができ、液相法及び固
相法のいずれによっても製造できる。

【００１４】ペプチド結合を形成するための縮合方法と
して、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸
無水物法、カルボジイミド（ＤＣＣ）法、カルボジイミ
ド−アディティブ法、活性エステル法、カルボニルイミ
ダゾール法、酸化還元法、酵素法、ウッドワード試薬Ｋ
を用いる方法等が挙げられる。固相法でペプチド鎖を延
長するときは、Ｃ末端アミノ酸を有機溶媒に不溶な支持
体、例えば樹脂に結合する。アミノ酸を樹脂に結合する
ために、官能基を導入した樹脂や、樹脂と官能基の間に
スペーサーを挿入したもの、更に条件によって種々の箇
所で切断できるハンドル(handle)と称する鎖を導入した
樹脂が目的に応じて用いられる。このような樹脂として
は、例えば、クロロメチル樹脂などのハロメチル樹脂、
オキシメチル樹脂、４−（オキシメチル）−フェニルア
セトアミドメチル樹脂、或は４− (オキシメチル）−フ
ェノキシメチル樹脂、Ｃ末アミド化用樹脂などを挙げる
ことができる。

【００１５】固相法での縮合法は、主としてＤＣＣ法、
酸無水物法、活性エステル法が用いられる。縮合反応を
行なう前に、それ自体公知の手段により、反応に関与し
ないカルボキシル基、アミノ基等を保護したり、また反
応に関与するカルボキシル基、アミノ基を活性化しても
よい。

【００１６】カルボキシル基の保護基としては、例え
ば、メチル、エチル、ベンジル、ｐ−ニトロベンジル、
ｔ−ブチル、シクロヘキシル等のエステルを挙げること
ができる。アミノ基の保護基としては、例えば、ベンジ
ルオキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、イ
ソボルニルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメト
キシカルボニル基等を挙げることができる。

【００１７】アルギニン残基中のグアニジノ基の保護基
としては、例えば、ニトロ基、トシル基、メシチレンス
ルフォニル基、４−メトキシ−2,3,6−トリメチルベン
ゼンスルフォニル基、2,2,5,7,−ペンタメチルクロマン
−６−スルフォニル基等を挙げることができる。カルボ
キシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応す
る酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例、
ペンタフルオロフェノール、2,4−ジニトロフェノー
ル、シアノメチルアルコール、ｐ−ニトロフェノール、
Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、Ｎ−ヒドロキシ−5−
ノルボルネン−2,3−ジカルボキシミド、Ｎ−ヒドロキ
シフタルイミド、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール）
とのエステル〕等が挙げられる。アミノ基の活性化され
たものとしては、例えば、対応する燐酸アミドが挙げら
れる。

【００１８】縮合反応は、通常溶媒中で行なわれ、溶媒
としては、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、酢
酸エチル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルス
ルホキシド、ピリジン、ジオキサン、テトラヒドロフラ
ン、Ｎ−メチルピロリドン、水、メタノール等の溶媒、
又は、これらの混合物を用いることができる。反応温度
は、一般に使用される約−30℃〜約50℃の範囲で行なう
ことができる。

【００１９】本発明のペプチドの保護基脱離反応は、使
用する保護基の種類によって異なるが、ペプチド結合に
影響を与えず、保護基が除かれる方法であればいずれで
もよい。保護基の脱離法としては、例えば、塩化水素、
臭化水素、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフ
ルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、又はこれ
らの混合物等による酸処理、水酸化ナトリウム、水酸化
カリウム、ヒドラジン、ジエチルアミン、ビペリジン等
による塩基処理、液体アンモニア中ナトリウム、パラジ
ウム炭素による還元、及び、トリメチルシリルトリフラ
ート、トリメチルシリルブロマイド等のシリル化剤等が
挙げられる。上記酸及びシリル化剤処理による脱保護基
反応においては、アニソール、フェノール、クレゾー
ル、チオアニソール、エタンジチオールの如きカチオン
補足剤の添加が有効である。

【００２０】また、固相法で合成したペプチドの樹脂か
らの切断方法としては、上記酸およびシリル化剤処理が
挙げられる。この様にして製造された本発明のペプチド
は、反応終了後、それ自体公知のペプチドの分離手段、
例えば、抽出、分配、再沈澱、再結晶、カラムクロマト
グラフィー等によって収得することができる。

【００２１】また、本発明のペプチドは、その方法の条
件により塩の形で得られる。塩としては塩酸、硫酸、硝
酸、リン酸などの無機酸塩類、ギ酸、酢酸、プロピオン
酸、グリコール酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエ
ン酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸塩類、あるいはナ
トリウム、カリウムなどのアルカリ金属塩、カルシウム
塩等のアルカリ土類金属塩類、アンモニウム、エタノー
ルアミン、トリエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン
などの有機アミン類などのアミン塩等の各種の塩を意味
する。

【００２２】本ペプチドを血小板凝集阻害剤として臨床
に適応するに際しては、有効成分として本ペプチドを、
固体または液体の医薬用担体または希釈剤、すなわち、
賦形剤、安定剤等の添加剤とともに含む製剤とすること
が好ましい。該医薬製剤において、前記有効成分の担体
成分に対する割合は、１〜90重量％の間で変動させるこ
とができる。剤形及び投与形態としては、顆粒剤、細粒
剤、散剤、錠剤、カプセル剤、丸剤もしくは液剤等の剤
形にして、または原末のまま経口投与してもよいし、注
射剤として静脈内投与、筋肉内投与または皮下投与して
もよい。また、注射用の粉末にして、用時調製してもよ
い。

【００２３】経口、経腸もしくは非経口投与に適した医
薬用の有機または無機の、固体または液体の担体、もし
くは希釈剤を、本発明の血小板凝集阻害剤を調製するた
めに用いることができる。水、ゼラチン、乳糖、デンプ
ン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、動植物油脂、
ベンジルアルコール、ガム、ポリアルキレングリコー
ル、石油樹脂、やし油、ラノリンまたは医薬に用いられ
る他のキャリアー（担体）は全て、本発明の血小板凝集
剤の担体として用いることができる。また、安定剤、湿
潤剤、乳化剤や、浸透圧を変えたり、配合剤の適切なpH
を維持するための塩類を補助薬剤として適宜用いること
もができる。

【００２４】更に、本発明の血小板凝集剤は、種々の疾
患の治療において、本発明の血小板凝集剤とともに適切
に投与することができる他の医薬として有効な成分、例
えば他の適当な血小板凝集阻害剤を含有していてもよ
い。顆粒剤、細粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤の場合に
は、本発明の血小板凝集剤は前記有効成分を５〜80重量
％含有しているのが好ましく、液剤の場合には、対応す
る量（割合）は、１〜30重量％であるのが好ましい。ま
た、非経口投与のうち、注射剤の場合は0.1〜10重量％
が好ましい。

【００２５】臨床投与量は経口投与の場合、成人に対し
上記有効成分として、１日量500 〜1000mgを内服するの
が好ましいが、年令、症状により適宜増減することも可
能である。前記１日量の本発明の血小板凝集阻害剤は、
１日１回、または適当な間隔をおいて１日２もしくは３
回に分けて投与することが好ましい。また、注射剤とし
て用いる場合には、上記有効成分として、成人に対し１
回量１〜10mgを投与するのが好ましい。

【００２６】本発明のペプチドの急性毒性試験に関して
は、マウスに対して、100mg／kgの静脈投与では、何等
毒性は観察されなかった。

【００２７】

【実施例】以下、実施例、比較例、実験例及び製剤例に
より本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれ
ら実施例等によりその技術的範囲が限定されるものでは
ない。

【００２８】

【実施例１】 CH₃(CH₂)₄CO−Arg −Gly−Asp−Trp−NH
₂ の合成 Ｃ末端アミド化(CH₃O−Ph(1,4)−CH(NH−Fmoc)−Ph(1,
4)−O(CH₂)₃CONH−CH(CH₃)−CONH−CH₂−Ph−polymer)
樹脂（ＢＡＣＨＥＭ社製，Trp の導入量 : 0.6mmol／g)
の0.45g (0.25mmol)を反応容器に移し、表１に示す振
盪、濾過ステップを繰り返し、NH₂−Arg(Mtr)−Gly−As
p(OBu^t)−Trp−Ｃ末アミド化樹脂を得た。この樹脂１当
量へ、３当量のカプロン酸無水物をN −ハイドロキシベ
ンゾトリアゾール(HOBT,３当量）存在下に、ジメチルホ
ルムアミド(DMF) 中で縮合させ、CH₃.CH₂)₄CO−Arg(Mt
r)−Gly−Asp(OBu^t)−Trp Ｃ末アミド化樹脂を得た。

【００２９】得られた保護ペプチド樹脂をｍ−クレゾー
ル、エタンジチオール存在下に、1Mトリメチルシリルブ
ロマイドと1Mチオアニソールでトリフルオロ酢酸中、０
℃で１時間処理した。窒素気流中でトリメチルシリルブ
ロマイドを留去後に、樹脂を濾去し、濾液に氷冷下ジエ
チルエーテルを加え、樹脂から切断されたペプチドを粉
末として得、更にこの粉末をジエチルエーテルで洗浄し
た。これをセファデックスＧ−10を支持体とするゲル濾
過により脱塩し、凍結乾燥して粗ペプチドを得た。得ら
れた粗ペプチドを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ） カラム:ODS 5C₁₈(μ bondasphere,20×150mm)、
移動相:(A)0.1％TFA,(B)100％CH₃CN／0.1％TFA,gradien
t：(A)：(B)＝80：20から(A)：(B)＝70：30, 20 分間、
流速17mL／min にて精製し、更にセファデックスＧ−25
を支持体とするゲル濾過により酢酸塩とし、凍結乾燥す
ることにより表題のペプチドCH₃(CH₂)₄CO−Arg−Gly−A
sp−Trp−NH₂の酢酸塩20mgを得た。さらに、この酢酸塩
を、３mlの蒸留水に溶解し、１Ｎ炭酸ナトリウム水で正
確にpHを７に合わせた後、セファデックスＧ−10を支持
体とするゲル濾過カラムに注入し、蒸留水で溶出、ペプ
チド画分を凍結乾燥することによりペプチドCH₃(CH₂)₄C
O−Arg−Gly−Asp−Trp−NH₂ 16mgを得た。尚、以下の
実施例及び比較例において合成したペプチドは全て、酢
酸塩として調製した。従って、特に記載のないペプチド
はその酢酸塩を示す。アミノ酸分析 (6N HCl+phenol,24hr,110 ℃) Ａｓｐ 0.97 （1) Ｇｌｙ 0.97 （1) Ｔｒｐ ─ （1) Ａｒｇ 1.00 （1)ＨＰＬＣ分析 Cosmosil 5C18−AR(4.6×200mm)カラムを用い、流速 1.
0mL／minで、0.1％TFA中アセトニトリル10〜40％(60分)
のgradient溶出での分析ＨＰＬＣで、保持時間31.5分
の単一ピークを示した。ＦＡＢ−ＭＳ ： Ｍ＋Ｈ 計算値630.3 、実測値630

【００３０】

【表１】

【００３１】

【実施例２】 CH₃CH₂CO−Arg−Gly−Asp−Trp−NH₂の
合成 実施例１にあるカプロン酸無水物に代わりプロピオン酸
無水物を用い同様の方法によって、表題のペプチドCH₃C
H₂CO−Arg−Gly−Asp−Trp−NH₂15mg を得た。 アミノ酸分析 (6N HCl+phenol,24hr,110 ℃) Ａｓｐ 1.18 （1) Ｇｌｙ 1.26 （1) Ｔｒｐ ─ （1) Ａｒｇ 1.00 （1)ＨＰＬＣ分析 Cosmosil 5C18−AR(4.6×200mm)カラムを用い、流速 1.
0mL／min で、0.1％TFA 中アセトニトリル10〜40％(60
分) のgradient溶出での分析ＨＰＬＣで、保持時間20.5
分の単一ピークを示した。ＦＡＢ−ＭＳ ： Ｍ＋Ｈ 計算値588.3 、実測値588

【００３２】

【実施例３】 CH₃(CH₂)₂CO−Arg−Gly−Asp−Trp−NH₂
の合成 実施例１にあるカプロン酸無水物に代わりｎ−酪酸無水
物を用い同様の方法によって、表題のペプチドCH₃(CH₂)
₂CO−Arg−Gly−Asp−Trp−NH₂15mg を得た。 アミノ酸分析 (6N HCl+phenol,24hr,110 ℃) Ａｓｐ 0.98 （1) Ｇｌｙ 1.06 （1) Ｔｒｐ ─ （1) Ａｒｇ 1.00 （1)ＨＰＬＣ分析 Cosmosil 5C18−AR(4.6×200mm)カラムを用い、流速 1.
0mL／min で、0.1％TFA 中アセトニトリル10〜40％(60
分)のgradient溶出での分析ＨＰＬＣで、保持時間24.0
分の単一ピークを示した。ＦＡＢ−ＭＳ ： Ｍ＋Ｈ 計算値602.3 、実測値602

【００３３】

【実施例４】 CH₃(CH₂)₃CO−Arg−Gly−Asp−Trp−NH₂
の合成 実施例１にあるカプロン酸無水物に代わりｎ−吉草酸無
水物を用い同様の方法によって、表題のペプチドCH₃(CH
₂)₃CO−Arg−Gly−Asp−Trp−NH₂ 10mgを得た。アミノ酸分析 (6N HCl+phenol,24hr,110 ℃) Ａｓｐ 1.17 （1) Ｇｌｙ 1.24 （1) Ｔｒｐ ─ （1) Ａｒｇ 1.00 （1)ＨＰＬＣ分析 Cosmosil 5C18−AR(4.6×200mm)カラムを用い、流速 1.
0mL／min で、0.1％TFA 中アセトニトリル10〜40％(60
分) のgradient溶出での分析ＨＰＬＣで、保持時間28.0
分の単一ピークを示した。ＦＡＢ−ＭＳ ： Ｍ＋Ｈ 計算値616.13、実測値616

【００３４】

【実施例５】 CH₃(CH₂)₅CO−Arg−Gly−Asp−Trp−NH₂
の合成 実施例１にあるカプロン酸無水物に代わりｎ−ヘプタン
酸無水物を用い同様の方法によって、表題のペプチドCH
₃(CH₂)₅CO−Arg−Gly−Asp−Trp−NH₂ 18mgを得た。アミノ酸分析 (6N HCl+phenol,24hr,110 ℃) Ａｓｐ 1.15 （1) Ｇｌｙ 1.23 （1) Ｔｒｐ ─ （1) Ａｒｇ 1.00 （1)ＨＰＬＣ分析 Cosmosil 5C18−AR(4.6×200mm)カラムを用い、流速 1.
0mL／min で、0.1％TFA 中アセトニトリル10〜40％(60
分) のgradient溶出での分析ＨＰＬＣで、保持時間35.0
分の単一ピークを示した。ＦＡＢ−ＭＳ ： Ｍ＋Ｈ 計算値644.3 、実測値644

【００３５】

【実施例６】 CH₃(CH₂)₆CO−Arg−Gly−Asp−Trp−NH₂
の合成 実施例１にあるカプロン酸無水物に代わりｎ−オクタン
酸無水物を用い同様の方法によって、表題のペプチドCH
₃(CH₂)₆CO−Arg−Gly−Asp−Trp−NH₂ 17mgを得た。アミノ酸分析 (6N HCl+phenol,24hr,110 ℃) Ａｓｐ 0.89 （1) Ｇｌｙ 0.96 （1) Ｔｒｐ ─ （1) Ａｒｇ 1.00 （1)ＨＰＬＣ分析 Cosmosil 5C18−AR(4.6×200mm)カラムを用い、流速 1.
0mL／min で、0.1％TFA 中アセトニトリル10〜40％(60
分) のgradient溶出での分析ＨＰＬＣで、保持時間39.0
分の単一ピークを示した。ＦＡＢ−ＭＳ ： Ｍ＋Ｈ 計算値658.4 、実測値658

【００３６】

【実施例７】 CH₃(CH₂)₇CO−Arg−Gly−Asp−Trp−NH₂
の合成 実施例１にあるカプロン酸無水物に代わりｎ−ノナン酸
無水物を用い同様の方法によって、表題のペプチドCH
₃(CH₂)₇CO−Arg−Gly−Asp−Trp−NH₂ 15mgを得た。アミノ酸分析 (6N HCl+phenol,24hr,110 ℃) Ａｓｐ 1.00 （1) Ｇｌｙ 1.02 （1) Ｔｒｐ ─ （1) Ａｒｇ 1.00 （1)ＨＰＬＣ分析 Cosmosil 5C18−AR(4.6×200mm)カラムを用い、流速 1.
0mL／min で、0.1％TFA 中アセトニトリル10〜40％(60
分) のgradient溶出での分析ＨＰＬＣで、保持時間43.0
分の単一ピークを示した。ＦＡＢ−ＭＳ ： Ｍ＋Ｈ 計算値672.4 、実測値672

【００３７】

【実施例８】 CH₃(CH₂)₁₀CO−Arg−Gly−Asp−Trp−NH
₂の合成 実施例１にあるカプロン酸無水物に代わりｎ−ドデカン
酸無水物を用い同様の方法によって、表題のペプチドCH
₃(CH₂)₁₀CO−Arg−Gly−Asp−Trp−NH₂24mg を得た。アミノ酸分析 (6N HCl+phenol,24hr,110 ℃) Ａｓｐ 1.00 （1) Ｇｌｙ 1.02 （1) Ｔｒｐ ─ （1) Ａｒｇ 1.00 （1)ＨＰＬＣ分析 Cosmosil 5C18−AR(4.6×200mm)カラムを用い、流速 1.
0mL／min で、0.1％TFA 中アセトニトリル10〜40％(60
分) のgradient溶出での分析ＨＰＬＣで、保持時間55.0
分の単一ピークを示した。ＦＡＢ−ＭＳ ： Ｍ＋Ｈ 計算値714.4 、実測値714

【００３８】

【実施例９】 CH₃(CH₂)₁₂CO−Arg−Gly−Asp−Trp−NH
₂の合成 実施例１にあるカプロン酸無水物に代わりｎ−テトラデ
カン酸無水物を用い同様の方法によって、表題のペプチ
ドCH₃(CH₂)₁₂CO−Arg−Gly−Asp−Trp−NH₂25mg を得
た。アミノ酸分析 (6N HCl+phenol,24hr,110 ℃) Ａｓｐ 1.00 （1) Ｇｌｙ 1.01 （1) Ｔｒｐ ─ （1) Ａｒｇ 0.99 （1)ＨＰＬＣ分析 Cosmosil 5C18−AR(4.6×200mm)カラムを用い、流速 1.
0mL／min で、0.1％TFA 中アセトニトリル20〜50％(60
分) のgradient溶出での分析ＨＰＬＣで、保持時間50.0
分の単一ピークを示した。ＦＡＢ−ＭＳ ： Ｍ＋Ｈ 計算値742.5 、実測値742

【００３９】

【実施例10】 CH₃(CH₂)₄CO−Arg−Gly−Asp−Phe−OH
の合成 Fmoc−Phe−OHが導入されたＰ−アルコキシベンジルア
ルコール樹脂(Phe導入量:0.78mmol／g 樹脂）を用い、
実施例１と同様の方法によって、表題のペプチドCH₃(CH
₂)₄CO−Arg−Gly−Asp−Phe−OH20mg を得た。アミノ酸分析 (6N HCl+phenol,24hr,110 ℃) Ａｓｐ 0.87 （1) Ｇｌｙ 0.99 （1) Ｐｈｅ 0.99 （1) Ａｒｇ 1.00 （1)ＨＰＬＣ分析 Cosmosil 5C1B−AR (4.6 ×200mm)カラムを用い、流速
1.0ml ／min で、0.1％TFA 中アセトニトリル10〜40％
（60分）のgradient溶出での分析ＨＰＬＣで保持時間3
4.5分の単一ピークを示した。ＦＡＢ−ＭＳ ： Ｍ＋Ｈ 計算値592.3 、実測値592

【実施例11】 CH₃(CH₂)₄CO−Arg−Gly−Asp−Trp−OH
の合成 Fmoc−Trp−OHが導入されたＰ−アルコキシベンジルア
ルコール樹脂(Trp導入量:0.78mmol／g 樹脂）を用い、
実施例１と同様の方法によって、表題のペプチドCH₃(CH
₂)₄CO−Arg−Gly−Asp−Trp−OH を20mg得た。アミノ酸分析 (6N HCl+phenol,24hr,110 ℃) Ａｓｐ 0.86 （1) Ｇｌｙ 1.00 （1) Ｔｒｐ − （1) Ａｒｇ 1.07 （1)ＨＰＬＣ分析 Cosmosil 5C18−AR (4.6 ×200mm)カラムを用い、流速
1.0ml ／min で、0.1％TFA 中アセトニトリル10〜40％
（60分）のgradient溶出での分析ＨＰＬＣで保持時間3
1.0分の単一ピークを示した。ＦＡＢ−ＭＳ ： Ｍ＋Ｈ 計算値631.3 、実測値631

【実施例12】 CH₃(CH₂)₄CO−Arg−Gly−Asp−Tyr−OH
の合成 Fmoc−Tyr(Bu)−OHが導入されたＰ−アルコキシベンジ
ルアルコール樹脂(Tyr導入量:0.88mmol／g 樹脂）を用
い、実施例１と同様の方法によって、表題のペプチドCH
₃(CH₂)₄CO−Arg−Gly−Asp−Tyr−OH を11mg得た。アミノ酸分析 (6N HCl+phenol,24hr,110 ℃) Ａｓｐ 1.00 （1) Ｇｌｙ 1.00 （1) Ｔｙｒ 1.00 （1) Ａｒｇ 0.98 （1)ＨＰＬＣ分析 μBondapak C18(3.9×300mm)カラムを用い、流速1.0ml
／min で、0.1％TFA中アセトニトリル０〜40％（60分）
のgradient溶出での分析ＨＰＬＣで保持時間37.2分の単
一ピークを示した。ＦＡＢ−ＭＳ ： Ｍ＋Ｈ 計算値607.7 、実測値608比較例１ HCO−Arg−Gly−Asp−Trp−NH₂ の合成 実施例１にあるカブロン酸無水物に代わり蟻酸および結
合剤としてＤＩＰＣＤを用い同様の方法によって、表題
のペプチドHCO−Arg−Gly−Asp−Trp−NH₂ 10mgを得
た。 アミノ酸分析（6N HCl+phenol, 24hr, 110℃) Ａｓｐ ０．８５（１） Ｇｌｙ ０．７７（１） Ｔｒｐ − （１） Ａｒｇ １．００（１）ＨＰＬＣ分析 Cosmosil 5C18−AR(4.6×200mm)カラムを用い、流速1.0
ml／min で、0.1％TFA中アセトニトリル10〜40％（60
分）のgradient溶出での分析ＨＰＬＣで、保持時間13.5
分の単一ピークを示した。ＦＡＢ−ＭＳ ： Ｍ＋Ｈ 計算値560.3 、実測値560比較例２ CH₃CO−Arg−Gly−Asp−Trp−NH₂の合成 実施例１にあるカブロン酸無水物の代わり無水酢酸を用
い同様の方法によって、表題のペプチドCH₃CO−Arg−Gl
y−Asp−Trp−NH₂ 22mg を得た。アミノ酸分析（6N HCl
+phenol, 24hr, 110℃） Ａｓｐ １．１９（１） Ｇｌｙ １．２５（１） Ｔｒｐ − （１） Ａｒｇ １．００（１）ＨＰＬＣ分析 Cosmosil 5C18−AR（4.6 ×200mm)カラムを用い、流速
1.0ml／min で、0.1％TFA 中アセトニトリル10〜40％
（60分）のgradient溶出での分析ＨＰＬＣで保持時間1
7.0分の単一ピークを示した。ＦＡＢ−ＭＳ ： Ｍ＋Ｈ 計算値574.3 、実測値574比較例３ H−Arg−Gly−Asp−Trp−NH₂ の合成 実施例１と同様の方法によって、表題のペプチドH−Arg
−Gly−Asp−Trp−NH₂ ５mgを得た。アミノ酸分析 （6N HCl+phenol, 24hr, 110℃)Ａｓｐ
１．２９（１） Ｇｌｙ １．２７（１） Ｔｒｐ − （１） Ａｒｇ １．００（１）ＨＰＬＣ分析 Cosmosil 5C18−AR（4.6×200mm)カラムを用い、流速1.
0ml／min で、0.1％TFA 中アセトニトリル０〜30％（60
分）のgradient溶出での分析ＨＰＬＣで保持時間29.8分
の単一ピークを示した。ＦＡＢ−ＭＳ ： Ｍ＋Ｈ 計算値532.3 、実測値532

【００４０】

【試験例１】 合成ペプチドの活性測定 〔PRPを用いたin−vitro ヒト血小板凝集〕少なくとも
２週間以上いかなる薬も服用していない健康な男性を被
験者とした。採血は、19号の注射針と1 ／10容量の3.8
％クエン酸ナトリウム溶液を予め入れておいたプラスチ
ックシリンジを用い、空腹時に下はく部の静脈から採血
を行った。採血後速やかに、シリンジを軽く攪拌して両
液を混合した。この血液を室温で15分間遠心分離し（11
00rpm, 250×g)、ブレーキをかけずに回転を止めた後、
上清を駒込ピペットで取り、多血小板血漿（ＰＲＰ）と
し室温で保存した。遠心後の残りの血液をさらに室温で
15分間遠心分離し（3500rpm,1500×g)、ブレーキをかけ
ずに停止させた後の上清を取り、寡血小板血漿（ＰＰ
Ｐ）とした。ＰＲＰ調製後血小板数を計測し、血小板数
が２ｘ10⁸／ml以上のものについてのみ以下に述べる実
験を行った。

【００４１】血小板の凝集は、８チャンネルの血小板凝
集測定機(Hematracer,Nikoh Bioscience,Tokyo,Japan)
を用いてＰＲＰの光の透過度の変化から測定した。ま
ず、200 μl のＰＰＰ，ＰＲＰをガラスキュベットにい
れ、37℃でインキュベート後、透過度を測定しＰＰＰの
透過度を100 ％、ＰＲＰの透過度を０％とした。次に、
生理食塩水またはサンプルを含む生理食塩水をＰＲＰに
10μl 加え37℃で１分間インキュベートした後、さらに
100 μg ／mlのコラーゲン溶液を10μl 加え（終濃度５
μg ／ml) 凝集を誘発し、以後７分間透過度を測定し
た。実験は、最初にコラーゲンとＡＤＰを用いて凝集が
起こることを確認し、コラーゲンの最大凝集率が70％以
上のものについてのみ、実験に用いた。

【００４２】サンプルは2.2x10^-2M になるように生理食
塩水に溶解し、これを基に２倍の希釈系列を調製し実験
に用いた。生理食塩水に不溶のサンプルについては10％
のＤＭＳＯ(Dimethyl sulfoxide)を含む生理食塩水に溶
解した。結果は次のように計算する。 サンプルの濃度に対し凝集抑制率をプロットした図を作
図し、この図から凝集を50％抑制する濃度(IC₅₀)を計算
した。被験者の個人差によるデータのばらつきを防ぐた
めに、毎回実験時には必ずポジティブコントロールとし
てインドメサシンとCH₃(CH₂)₄CO−Arg−Gly−Asp−Trp
−NH₂の２つのサンプルを測定し、これらに対する比活
性として各サンプルの抑制活性を評価した。表２に各サ
ンプルのIC ₅₀を示す。

【００４３】

【表２】

【００４４】表２に示すように、比較例のペプチドに比
して、本発明のペプチドは高い活性を示し、脂肪酸残基
の炭素数が４−７において特に活性のピークが見られ
た。このことは、Ｎ端がアミノ基のものやアセチル化体
等に比べ、ある程度長い脂肪酸残基が結合した方が、高
い活性が得られることを示している。また、炭素数８に
おいては、ペプチドの溶解性の点から本試験法では、活
性が弱まっている様に見えるが、経口吸収においては、
疎水性の高い方が吸収効率が良いことから、高い活性が
期待できる。

【００４５】先の実施例において合成した炭素数９〜14
のペプチドについても、若干の活性が認められた。しか
し、疎水性の増加に伴い、活性測定に用いたサンプル溶
解液に難溶となり、今回用いた活性検定法では正確な活
性の判断が困難であった。しかし、生体内、および経口
投与時においては上記炭素数８と同様な理由で、活性が
発揮されることが十分に予想される。

【００４６】

【試験例２】 急性毒性試験 本発明のペプチドの急性毒性試験に関しては、マウスに
対して、該ペプチドの100mg／kgを静脈投与し、１週間
観察した。その結果何等毒性は観察されなかった。

【００４７】

【製剤例１】 注射剤 実施例１で得られたペプチド100mgを生理的食塩液0.1Ｌ
に溶解し、得られる溶液を無菌的に2.5ml容のアンプル
に充填、封入し、注射用製剤とした。

【００４８】

【製剤例２】 顆粒剤 実施例１で得られたペプチド500mg、結晶セルローズ50m
g、乳糖450mg からなる混合物にエタノールと水の混液
１mlを加え練合した。この練合物を常法にしたがい造粒
機により造粒して顆粒剤とした。

【００４９】

【発明の効果】本発明の新規なペプチドは、血小板凝集
阻害剤として有用である。すなわち血栓崩壊治療中及び
治療後の血小板血栓症、血栓塞栓症及び再閉塞の予防及
び冠動脈や他の動脈の血管形成術後及び冠動脈バイパス
処理後の血小板血栓症、血栓塞栓症及び再閉塞の予防、
また心筋梗塞等を予防することができる。

【００５０】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：XaaはTrp,PheまたはTyr １に炭素数３−14の脂肪酸残基が結合 ４にＯＨまたはＮＨ₂ が結合

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 林 良雄 神奈川県川崎市中原区井田1618 新日本製 鐵株式会社先端技術研究所内 (72)発明者 佐藤 吉美 神奈川県川崎市中原区井田1618 新日本製 鐵株式会社先端技術研究所内 (72)発明者 片田 淳 神奈川県川崎市中原区井田1618 新日本製 鐵株式会社先端技術研究所内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次式で示されるペプチドまたはその塩。 Ｘ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｙ−Ｚ （式中、Ｘは炭素数３─14の脂肪酸残基、Ｙは疎水性ア
   ミノ酸残基、Ｚは水酸基又はＮＨ₂ を示す。）
2. 【請求項２】 脂肪酸残基の炭素数が４−７である、請
   求項１記載のペプチドまたはその塩。
3. 【請求項３】 疎水性アミノ酸残基が、トリプトファン
   残基、フェニルアラニン残基またはチロシン残基である
   請求項１または２記載のペプチドまたはその塩。
4. 【請求項４】 請求項１乃至３のいずれか記載のペプチ
   ドまたはその塩を有効成分として含有することを特徴と
   する血小板凝集阻害剤。