WO1994014978A1 - Verbesserte ausbeuten von pcr-produkten in gegenwart von dna-einzelstrang bindendem protein und dessen präparation aus thermus flavus - Google Patents

Verbesserte ausbeuten von pcr-produkten in gegenwart von dna-einzelstrang bindendem protein und dessen präparation aus thermus flavus Download PDF

Info

Publication number
WO1994014978A1
WO1994014978A1 PCT/EP1993/003585 EP9303585W WO9414978A1 WO 1994014978 A1 WO1994014978 A1 WO 1994014978A1 EP 9303585 W EP9303585 W EP 9303585W WO 9414978 A1 WO9414978 A1 WO 9414978A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
strand
organism
thermus flavus
dna
dna single
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP1993/003585
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hans-B. Strack
Peter Kainz
Karim Othmann-Hassan
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of WO1994014978A1 publication Critical patent/WO1994014978A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria

Definitions

  • the polymerase chain reaction is a method of multiplying specific DNA sections (including genes) from any organism in a test tube with a rapidly expanding abundance of applications, especially in medical diagnostics, genetic engineering and basic biological research.
  • a suitable DNA polymerase in a suitable buffer, the four deoxiribonucleoside triphosphates as synthesis precursors and, in large excess, two generally chemically synthesized oligonucleotides are added.
  • These oligonucleotides must be sequence-complementary to one end or to the end of the opposite strand of the DNA section to be amplified.
  • the strands of the DNA are separated as single strands.
  • hybrids with the above-mentioned oligonucleotides are preferably formed, which thereby become primers (starting points) for the beginning of the synthesis and the respective addition to the double strand.
  • the (ideally) doubling after another denaturation is followed by a further doubling cycle and the process is repeated until a limiting factor occurs, e.g. the exhaustion of the synthesis precursors, the polymerase or the self-restoration of the synthesis products.
  • Suitable polymerases in the abovementioned sense are only suitable for commercial applications and for scientific research tasks if they have been isolated from or derived from theimophilic organisms - and only because this is the only way to carry out the repeated denaturation steps of the process without that each time anew polymerase must be added to the batch - again a crucial prerequisite for the automation of the process.
  • the specificity of the method is i. a. satisfactory, d. H. only the DNA segments selected by specifying the oligonucleotides used are propagated.
  • the present invention consists in isolating or enriching DNA single-strand-binding proteins from thermophilic organisms and adding these proteins isolated in this way or proteins genetically derived from them or the preparations enriched on them in batches of the polymerase chain reaction.
  • the approach carried out using the single-strand-binding protein results in a considerable increase in the yield of the polymer chain reaction in comparison to the control (lane 1) and thus at least the possibility of using to achieve an equivalent result in one fifth of the use of polymerase. It is shown using an example that a single-strand binding protein from a thermophilic organism, in the present case Thermus flavus, can interact with a polymerase from a thermophilic organism, in the present case also Thermus flavus, and this for improvement the polymer chain reaction can be used.
  • Fig. 1 shows the result of the gel retardation assay with the protein concentrate which was isolated according to Example 1, lanes 2, 6 and 7 belonging to approaches in which no concentrate was used.
  • Fig. 2 shows the result of a polymerase chain reaction (hereinafter also abbreviated as PCR) with and without the addition of the protein concentrate from Example 1, lane 1 relating to the reaction batch without addition and lane 2 relating to the reaction batch with addition.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Lane 3 is a so-called kilobase ladder, ie a calibration standard for determining molecular weight double-stranded DNA (Bethesda Research Laboratories,
  • FIG. 3 shows the optical density according to the densitometric evaluation (negative film) of lane 1 of Fig. 2.
  • Fig. 4 shows the optical density of the web 2 of Fig. 2 and
  • Fig. 5 shows the optical density of the web 3 of Fig. 2.
  • thermophilic bacterium Thermus flavus Process for isolating a DNA single-strand-binding protein from the thermophilic bacterium Thermus flavus.
  • Bacteria from the strain Thermus flavus - (German collection of microorganisms., Braunschweig, strain AT-62, No. 674) were in the culture medium DSM No. 74 (8 g polypeptone, 4 g yeast extract, 2 g sodium chloride / liter; pH 7.0) under the following Conditions drawn up: overnight at 75 ° C. in a shaking incubator (New Brunswick, 15Orpm) to an optical density of 1.56, measured at 600 nm. The bacterial cells were cooled to room temperature, collected as sediment by centrifugation and, until further use, at - Stored at 70 ° C. The yield was 1.2 g per liter (wet weight).
  • the pipetted supernatant was brought to a final concentration of 0.2M with potassium phosphate pH 6.5 and applied to a chromatography column filled with DEAE cellulose (DE 52 cellulose, Whatman; bed volume 200 ml).
  • DEAE cellulose was previously equilibrated with 0.2M potassium phosphate pH 6.5, 10mM beta-mercaptoethanol (buffer A). Unbound proteins were eluted with BufferA. The elution volume was 100 ml.
  • the eluate from the above chromatography (containing the unbound proteins) was mixed with 4 parts of 10 mM beta-mercaptoethanol and applied to another DEAE cellulose chromatography column as described above, but with a bed volume of only 40 ml.
  • the column was rinsed with 20 ml of 20 mM potassium phosphate pH 6.5, 10 mM beta-mercaptoethanol (buffer B) and the bound proteins were eluted using a linear gradient of buffer B and - 200 mM potassium phosphate, 10 mM beta-mercaptoethanol.
  • the elution volume was 100 ml, the volume of the individual fractions 5 ml.
  • the elution volume was 60 ml, the volume of the individual fractions 5 ml.
  • the fractions containing the approx. 13 kd protein were in a concentration range between 200 and 220 mM phosphate. These were combined and triple volume 0.1 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) pH 8.2, 2 mM DTE (dithioerythrol), 10% glycerol (v / v) was added.
  • the combined and diluted fractions from the phosphocellulose chromatography were further fractionated by means of heparin-Sepharose chromatography (Pharmacia).
  • the approximately 13 kd protein was eluted in the fractions in the range between 350 and 400 mM KCI. As with the above fractionation steps, this was verified by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. The corresponding fractions were combined, in a final concentration step mixed with twice the volume of buffer C, applied to a heparin-Sepharose column (bed volume: 1 ml) and eluted with 0.6M KCI in buffer C. The volume of the eluate was 400 ⁇ l. An analysis of an aliquot of this protein fraction by means of SDS polyacrylamide gel electrophoresis showed that the main protein fraction (> 90%) consisted of the ca13kd protein.
  • 13kd protein Designated concentrate This eluate was dialyzed overnight at 4 ° C against Tub Polymerase Storage Buffer (Amersham Cat.No.T0333Z), mixed with glycerin (final conc. 50%) and stored at -20 ° C. It is hereinafter referred to as 13kd protein Designated concentrate.
  • 13kd protein Designated concentrate By means of a gel retardation assay (see below) and single-stranded DNA cellulose chromatography, it was shown that the isolated 13kd protein is a single-stranded DNA, regardless of its nucleotide sequence binding protein.
  • the 13kd protein concentrate was prepared with both double-stranded and three single-stranded DNA oligonucleotides of different sequences.
  • the batches were incubated at 70 ° C. for 30 minutes and then analyzed by means of polyacrylamide gel electrophoresis (4-20% TB gradient gels, NOVEX CHEM 125 V, 50 minutes).
  • the nucleic acids were detected by means of ethidium bromide fluorescence.
  • Lanes 1 to 6 are from one electrophoresis run, lanes 7 to 9 are from another.
  • the result of the electrophoresis shows that the DNA-protein binding of the purified 13 kd protein was carried out exclusively to single-stranded DNA in a sequence-unspecific manner.
  • Deoxynucleoside triphosphates as 100mM stock solutions, pH 7.5; Ultrapure,
  • Buffer Tris ultrapur, BRL; Ammonium sulfate, Merck, MgCl 2, Merck
  • the 50 ⁇ l reaction mixtures contained 1 ⁇ M of each primer, 0.2mM of each dNTP, 10pg ⁇ -DNA, 5 ⁇ l 10x PCR buffer and 0.25 U hot tub polymerase (Fig. 2, lane 1) or 0.25U polymerase + 2 ⁇ l des purified 13kd protein. (Fig. 2, lane 2)
  • the amplification was carried out in two steps in the form of a 2-step PCR as follows:
  • cycle No. 1 The initial denaturation of the DNA (cycle No. 1) was carried out at 94 ° C. for 4 min.
  • Cycles 2-11 consisted of 65 ° C for 1.5 min (annealing of the primers and extension) and 94 ° C for 4 sec (denaturation step: separation of the complementary strands as a prerequisite for annealing new primers in the next PCR cycle).
  • the final primer annealing and extension step (cycle # 12) was at 65 ° C for 3 min.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Die Durchführung von Polymerasekettenreaktionen wird dadurch verbessert, daß dem Reaktionsansatz zusätzlich Präparationen von DNA-Einzelstrang-bindenden Proteinen aus thermophilen Organismen zugesetzt werden. Hierfür einsetzbare Präparationen lassen sich aus thermophilen Organismen, insbesondere aus Thermus flavus, Stamm AT-62; DSM Nr. 674, durch Fraktionierung eines Rohextraktes gewinnen, der aus Zellen eines solchen Organismus erhalten worden ist.

Description

VERBESSERTE AUSBEUTEN VON PCR-PROD TEN IN GEGENWART VON DNA-EINZELSTRANG BINDENDEM PROTEIN UND DESSEN PRAPARATION AUS THERMUS FLAVUS
Stand der Technik:
Die Polymerasekettenreaktion ist eine Methode zur Vermehrung spezifischer DNA- Abschnitte (u.a. Gene ) aus beliebigen Organismen im Reagenzglas mit einer rasch sich erweiternden Fülle von Anwendungen insbesondere in der medizinischen Diagnostik, in der Gentechnik und in der biologischen Grundlagenforschung. Zu ihrer Ausführung werden die zu vermehrende DNA, eine geeignete DNA-Polymerase in einem geeigneten Puffer.die vier Desoxiribonukleosidtriphosphate als Synthesevorläufer und in großem Überschuß zwei im allgemeinen chemisch¬ synthetisch hergestellte Oiigonukleotide zugegeben. Diese Oiigonukleotide müssen sequenzkomplementär zum einen Ende bzw. zum Ende des Gegenstranges des zu vermehrenden DNA-Abschnittes sein. Nach thermischer Denaturierung der DNA (i.A. durch Behandlung des Ansatzes für eine Minute bei 94°c ) liegen die Stränge der DNA als Einzelstränge getrennt vor . Nach Abkühlen bilden sich bevorzugt Hybride mit den genannten Oligonukleotiden, die dadurch zu Primern (Ansatzpunkten ) für die beginnende Synthese, die jeweilige Ergänzung zum Doppelstrang werden. Sobald die Synthese das andere Ende des zu vermehrenden Abschnittes erreicht oder überschritten hat, last sich der (im Idealfall ) erreichten Verdoppelung nach erneuter Denaturierung ein weiterer Verdopplungszyklus anschließen und das Verfahren sooft wiederholen, bis ein limitierender Faktor auftritt, z.B. die Erschöpfung der Synthesevoriäufer, der Polymerase oder die Selbstrenaturieaing der Syntheseprodukte. Als geeignete Polymerasen im oben genannten Sinne kommen sowohl bei kommerziellen Anwendungen als auch solchen in wissenschaftlichen Forschungsaufgaben nur solche in Betracht, die aus theimophilen Organismen isoliert wurden oder von solchen abgeleitet wurden - und zwar weil nur so die wiederholten Denaturierungsschritte des Verfahrens durchgeführt werden können, ohne daß jedesmal aufs neue Polymerase zum Ansatz gegeben werden muß- wiederum eine entscheidende Voraussetzung für die Automatisierung des Verfahrens. ( Siehe z.B. H.A. Erlich, PCR Technology, Stockton Press 1989, ISBN 0-935859-56-X ). Die Spezifität der Methode ist i. a. zufriedenstellend, d. h. es werden nur die jeweils durch die Vorgabe der eingesetzten Oiigonukleotide ausgewählten DNA-Abschnitte vermehrt.
Erwünschte Verbesserungen der Technik:
Die Ökonomie des Verfahrens, insbesondere hinsichtlich der Menge der einzusetzenden Reagentien .darunter besonders der Polymerase, andererseits die erreichbare Geschwindigkeit des gesamten Verfahrens, und für manche Anwendungen die Länge der vermehrbaren DNA-Abschnitte sowie die Genauigkeit des Kopiervorganges lassen Wünsche offen, trotz laufend fortgesetzter Versuche, durch Variation der chemischen und physikalischen Bedingungen Optimierungen zu erreichen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung: Die vorliegende Erfindung besteht darin, DNA-Einzelstrangbin- dende Proteine aus thermophilen Organismen zu isolieren oder anzureichern und diese so isolierten Proteine oder von ihnen gentechnisch abgeleitete Proteine bzw. die an ihnen angerei¬ cherten Präparationen in Ansätzen der Polymerase-Kettenreaktion zuzugeben.
Bei mehreren daraufhin biochemisch untersuchten Sy¬ stemen - allerdings jeweils aus nicht-thermophilen Organismen- wurde nachgewiesen, daß Zugabe von isolierten DNA-Einzelstrang- bindenden Proteinen aus dem gleichen Organismus im Test einer jeweils aus dem gleichen Organismus isolierten DNA-Polymerase zu einer jeweils beträchtlich beschleunigten Syntheseleistung führte, und zwar so, daß es auf die Relation der bestimmten Po¬ lymerase mit dem bestimmten Einzelstrang-bindenden Protein an¬ kommt. (Huberman, Kornberg und Alberts (1971), JMB 62,39.; Scherzinger et al, (1973) MGG 123,247.; Reuben and Gefter (1973) PNAS 70,1846.; (1974) JBC 249,3843.; Herrick and Alberts (1976) JBC 251,2124; 2133; Herrick, Delius and Alberts (1976) JBC, 2142; zusammengefaßt bei Kornberg (1980) DNA Replication, Freeman and Co., San Francisco ISBN
0-7167-1102-8). Zwar existiert in der Literatur ein Bericht (Schwarz et al. (1990) NAR 18,1079), wonach die Zugabe des Gen- 32-Proteins des Bakteriophagen T4 (eines nicht-thermophilen Or¬ ganismus) zu der Polymerase aus Thermus aquaticus (eines ther¬ mophilen Organismus) in Ansätzen der Polymerasekettenreaktion die letztere fördere. Wir waren nicht in der Lage, dies in ei¬ genen Experimenten zu bestätigen, und abgesehen davon, daß es in der Literatur in folge keine bestätigenden Berichte für die genannte Behauptung gibt, ist dies aus zwei Gründen auch nicht zu erwarten: 1. Das Gen-32-Protein dürfte als aus einem nicht- thermophilen Organismus stammend für sich allein nicht die nö¬ tige thermische Stabilität aufweisen. 2. Für die Annahme des Zusammenwirkens einer Polymerase und eines Einzelstrang-binden¬ den Proteins aus im Stammbaum relativ weit auseinanderliegenden Organismen gibt es keinen Anlaß. Wir haben nach folgendem Protokoll ein Einzelstrang- bindendes Protein aus Thermus flavus weitgehend gereinigt: (Beispiel 1).
Die gemäß Beispiel 1 gewonnene Fraktion "13kd-Pro- tein-Konzentrat" , hautpsächlich enthaltend ein Protein von ei¬ nem Molekulargewicht von (nach der Position in der SDS-Gelelek- trophorese beurteilt) ca 13 kd wurde in eine Poly eraseketten- reaktion nach folgendem Protokoll eingesetzt: (Beispiel 2).
Wie ersichtlich, ergibt sich in dem Ansatz, der unter Einsatz des Einzelstrang-bindenden Proteins ausgeführt wurde (Bahn 2) eine beträchtliche Steigerung der Ausbeute der Polyme- rasekettenreaktion im Vergleich zur Kontrolle (Bahn 1) und da¬ mit zumindest die Möglichkeit, , mit einem Fünftel des Einsatzes an Polymerase ein gleichwertiges Resultat zu erzielen. Es ist damit an einem Beispiel gezeigt, daß ein Einzelstrang-bindendes Protein aus einem thermophilen Organismus, im vorliegenden Falle Thermus flavus, mit einer Polymerase aus einem thermophi¬ len Organismus, im vorliegenden Falle ebenfalls Thermus flavus, zusammenwirken kann, und das dies zur Verbesserung der Polyme- rasekettenreaktion nutzbar gemacht werden kann.
Die Erfindung wird an Hand der Beispiele und der Ab¬ bildungen näher erläutert.
Abb. 1 zeigt das Ergebnis des Gel-Retardations-Assay mit dem Proteinkonzentrat, das gemäß Beispiel 1 isoliert wurde, wobei die Bahnen 2, 6 und 7 zu Ansätzen gehören, bei denen kein Konzentrat mit verwendet worden ist. Abb. 2 zeigt das Ergebnis einer Polymerasekettenreaktion (nachstehend auch abgekürzt als PCR) mit und ohne Zusatz des Proteinkonzentrats von Beispiel 1, wobei Bahn 1 sich auf den Reaktionsansatz ohne Zusatz und Bahn 2 sich auf den Reaktionsansatz mit Zusatz bezieht.
Bahn 3 ist eine sogenannte Kilobasenleiter, d. h. ein Eichstandard für die Molekulargewichtsbestimmung doppelsträngiger DNA (Bethesda Research Laboratories,
1 μg Gesamt-DNA) Abb. 3 gibt die optische Dichte entsprechend der densitometrischen Auswertung (Negativfilm) der Bahn 1 von Abb. 2 wieder. Abb. 4 gibt die optische Dichte der Bahn 2 von Abb. 2 wieder und Abb. 5 gibt die optische Dichte der Bahn 3 von Abb. 2 wieder.
Beispiel 1 :
Verfahren zur Isolierung eines DNA-Eiπzelstrang- bindenden Proteins aus dem thermophilen Bakterium Thermus flavus.
Bakterien vom Stamm Thermus flavus -(Deutsche Sammlung von Mikro - Organismen., Braunschweig, Stamm AT-62, Nr.674 ) wurden im Kulturmedium DSM Nr. 74 ( 8g Polypepton, 4g Hefeextrakt, 2g Natriumchlorid / Liter; pH 7.0 ) unter folgenden Bedingungen aufgezogen: Über Nacht bei 75°C in einem Schüttelinkubator ( New Brunswick, 15Orpm ) bis zu einer optischen Dichte von 1.56, gemessen bei 600 nm. Die Bakterienzellen wurden auf Raumtemperatur abgekühlt, mittels Zentrifugation als Sediment gesammelt und bis zur weiteren Verwendung bei -70°C aufbewahrt. Die Ausbeute betrug 1.2g pro Liter ( Naßgewicht ).
10g Bakterien (Naßgewicht ) wurden in 60ml TrisCI pH 7.5, 1mM Glutathion, 0.3mM Phenylmethylsulfonylfluorid ( PMSF ) suspendiert und unter Eiskühlung für 90 Sekunden bei 70 Watt mittels Ultraschall lysiert ( Branson Sonifier ). Das Zellysat wurde bei 25,000rpm (Beckman SW40 Ti - Rotor) 1 Stunde bei 4°C zentrifugiert.
Der abpipettierte Überstand .wurde mit Kaliumphosphat pH 6.5 auf eine Endkonzentration von 0.2M gebracht und auf eine mit DEAE Cellulose gefüllte Chromatographiesäule aufgetragen ( DE 52 Cellulose, Whatman; Bettvolumen 200ml ). Die DEAE Cellulose wurde zuvor mit 0.2M Kaliumphosphat pH 6.5, 10mM beta-Mercaptoethanol ( Puffer A ) äquilibriert. Ungebundene Proteine wurden mit PufferA eluiert. Das Elutionsvolumen betrug 100ml.
Das Eluat aus obiger Chromatographie (enthaltend die ungebundenen Proteine ) wurde mit 4 Teilen 10mM beta-Mercaptoethanol versetzt und auf eine weitere DEAE Cellulose - Chromatographiesäule wie oben beschrieben.jedoch mit einem Bettvolumen von nur 40ml aufgetragen. Die Säule wurde mit 20ml von 20mM Kaliumphosphat pH 6.5, 10mM beta-Mercaptoethanol ( Puffer B ) gespült und die gebundenen Proteine mittels eines linearen Gradienten von Puffer B und - 200 mM Kaliumphosphat ,10mM beta-Mercaptoethanol eluiert. Das Elutionsvolumen betrug 100ml, das Volumen der einzelnen Fraktionen 5ml. Mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde verifiziert, daß sich das ca 13 kd ( kilodaltons) Protein in den Fraktionen mit einem Phosphatgehalt zwischen 90 und 130mM verteilt. Diese wurden vereinigt und mit vierfachem Volumen 10mM beta-Mercaptoethanol verdünnt. Die vereinigten und verdünnten Fraktionen wurden auf eine Phosphocellulose- Chromatographiesäule (P11 -Cellulose, Whatman ) mit einem Bettvolumen von 10 ml aufgetragen. Die Säule wurde zur Entfernung nicht gebundener Proteine mit 20ml Puffer B gespült. Zum Eluieren der gebundenen Proteine wurde ein linearer Gradient von 30 mM Kaliumphosphat, 10mM beta-Mercaptoethanol und 300mM Kaliumphosphat, 10mM beta-Mercaptoethanol verwendet. Das Elutionsvolumen betrug 60ml, das Volumen der einzelnen Fraktionen 5ml. Die das ca 13kd Protein enthaltenden Fraktionen befanden sich in einem Konzentrationsbereich zwischen 200 und 220mM Phosphat. Diese wurden vereinigt und mit dreifachem Volumen 0.1 mM EDTA ( Ethylendiamintetraessigsäure ) pH 8, 2mM DTE ( Dithioerythrol ), 10% Glycerin ( v/v ) versetzt. Die vereinigten und verdünnten Fraktionen aus der Phosphocellulose- Chromatographie wurden mittels Heparin-Sepharose-Chromatographie (Pharmacia) weiter fraktioniert. Zur Äquilibrierung des Säulenmaterials wurde 20mM Kaliumphosphat pH 7.5, 20mM KCI, 0.1 mM EDTA, 2mM DTE, 10% Glycerin (v/v) (Puffer C ) verwendet. Die Säule( 3 ml Bettvolumen ) wurde mit 10ml Puffer C gespült.und die gebundenen Proteine mit Hilfe eines linearen Gradienten von Puffer C und 600mM Kaliumphosphat pH 7.5, 20mM KCI, 0.1 mM EDTA, 2mM DTE, 10% Glycerin (v/v) fraktioniert. Das Gesamtelutionsvolumen betrug 60 ml, das Volumen der einzelnen Fraktionen 5 ml. Das ca 13 kd Protein wurde in den Fraktionen im Bereich zwischen 350 und 400 mM KCI eluiert. Wie bei den obigen Fraktionierungsschritten wurde dies mittels SDS- Polyacrylamid - Gelelektrophorese verifiziert. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, in einem abschließenden Konzentrierungsschritt mit zweifachem Volumen Puffer C versetzt, auf ein Heparin-Sepharose-Säulchen aufgetragen ( Bettvolumen: 1 ml ) und mit 0.6M KCI in Puffer C eluiert. Das Volumen des Eluats betrug 400μl. Eine Analyse eines Aliquots dieser Proteinfraktion mittels SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese zeigte, daß der Hauptproteinanteil ( > 90 % ) aus dem ca13kd Protein bestand.
Dieses Eluat wurde über Nacht bei 4°C gegen Tub Polymerase Storage Puffer ( Amersham Kat.Nr.T0333Z ) dialysiert, mit Glycerin versetzt ( Endkonz.50% )und bei -20°C aufbewahrt.Es wird im Folgenden als 13kd- Protein-Konzentrat bezeichnet. Mittels Gel Retardation Assay ( Siehe unten ) und Einzelstrang-DNA-Cellulose-Chromatographie wurde gezeigt, daß es sich bei dem isolierten 13kd Protein um ein einzelsträngige DNA unabhängig von deren Nucleotid-Sequenz bindendes Protein handelt.
Gel-Retardation Assay
Das 13kd-Protein-Konzentrat wurde sowohl mit zwei doppelsträngigen als auch mit drei einzelsträngigen DNA - Oligonucleotiden unterschiedlicher Sequenzen Die Gel-Retardation Ansätze waren wie folgt zusammengesetzt: 300ng des jeweiligen DNA-Oligonucleotids(Es =einzelsträngig ,Ds =doppelsträngig, Zahl = Anzahl der Nukleotide pro Einzelstrang, Sequenzen jeweils verschieden)und die unten angegebene Quantität des 13kd Protein- Konzentrats,4μl 5XTBE-Puffer (56g Tris Base, 27.5g Borsäure, 20ml 0.5M EDTA pH 8.0 ad 11 H2O ), H2O ad 20μl.
Die Ansätze wurden für die Dauer von 30 min bei 70°C inkubiert und anschließend mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert (4 - 20% TB- Gradientengele, NOVEX CHEM 125 V, 50 min). Der Nachweis der Nucleinsäuren erfolgte mittels Ethidiumbromid - Fluoreszenz.
Das Ergebnis ist in Abb.1 dargestellt. (Die Laufrichtung der Elektrophorese wird durch den Pfeil dargestellt) ,die einzelnen Bahnen enthielten Ansätze entsprechend folgender Tabelle:
Figure imgf000009_0001
Die Bahnen 1 bis 6 entstammen einem Elektrophoreselauf.die Bahneη7 bis 9 einem weiteren.
Das Ergebnis der Elektrophorese zeigt, daß die DNA-Proteinbindung des gereinigten 13kd Proteins ausschließlich an einzelsträngige DNA in sequenzunspezifischer Art und Weise erfolgte.
Beispiel 2:
Verfahren der PCR mit und ohne zusätzliche Zugabe des 13kd Protein-Konzentrats
(eines DNA-Einzelstrang-bindenden Proteins aus Thermus flavus).
PCR Amplifikation eines 1 kb DNA-Fragmentes aus Bakteriophagen λ DNA
I. Verwendete Chemikalien und Geräte:
1. Geräte: Thermal Cycler PHC.2 Techne
Thermal Reactor Hybaid
2. Chemikalien: λ-DNA ( Boehringer) Primer: Forward, 25mer, pos.30.042
( Sequenz: 5'- AAG ATG GCG AAC AAC AAG AAA CTG G -3'.)
Reverse:25mer, pos. 31.041
( Sequenz: 5'- GGC GAA AGC AGA AGC AGA TGA GAG A - 3').
Synthetisiert von Oligo etc. Inc., Wilsonville, Oregon.
Deoxynukleosidtriphosphate: als 100mM Stammlösungen, pH 7.5; Ultrapur,
Pharmacia
Enzym: Hot Tub Polymerase ( Amersham, Cat.Nr. T 0333Z ).
Puffer: Tris ultrapur, BRL; Ammonsulfat, Merck, MgCI2, Merck
10x PCR Puffer: 500 mM TrisCI pH 9.0
200 mM (NH4)2S04 7 mM MgCI2
II. Amplifikationsbedingungen:
Die 50μl Reaktionsgemische enthielten 1 μM von jedem Primer, 0.2mM von jedem dNTP, 10pg λ-DNA, 5μl 10x PCR-Puffer und 0.25 U Hot Tub Poly-merase (Abb. 2, Bahn 1 ) bzw.0.25U Polymerase + 2μl des gereinigten 13kd Proteins.( Abb. 2, Bahn 2)
Die Amplifikation wurde in 2 Teilschritten in Form einer 2-Stufen PCR wie folgt durchgeführt:
Die Anfangsdenaturierung der DNA ( Zyklus Nr. 1 ) erfolgte bei 94°C für 4 min. Die Zyklen 2-11 bestanden aus jeweils 65°C für 1.5 min ( Annealing der Primer und Extension ) und 94°C für 4 sec ( Denaturierungsschritt: Trennen der komplementären Stränge als Voraussetzung für ein Annealing neuer Primer im nächsten PCR-Zyklus ). Der abschließende Primer-Annealing und -Extension Schritt ( Zyklus Nr. 12 ) erfolgte bei 65°C für 3 min.
Aus den einzelnen PCR-Ansätzen wurden 5μl Aliquots entnommen und in der 2. PCR weiter amplifiziert (Bedingungen wie oben aber 25 anstatt 10 Zyklen). 20μl Aliquots der Ansätze wurden mittels horizontaler Agarose Elektrophorese aufgetrennt und mittels Ethidiumbromid-Fluoreszenz sichtbar gemacht. Das Ethidiumbromid gefärbte Gel wurde unter UV Licht fotographiert ( UV-Lichtquelle: Transilluminator, Pharmacia; Film: AGFA, PanF; 50ASA ; Belichtung 40 sec. bei Blende 8) und das Negativ densitometrisch ausgewertet ( SUN Station, Scanner: Modell DNA 35; PDI Software ).

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur Durchführung von Polymerasekettenreaktionen, dadurch gekennzeichnet, daß dem Reaktionsansatz zusätzlich Präparationen von DNA- Einzelstrang-bindenden Proteinen aus thermophilen Organismen zugegeben werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß dem Reaktionsansatz Präparationen von DNA- Einzelstrang-bindenden Proteinen zugegeben werden.die ihrerseits aus solchen thermophiler Organismen gentechnisch abgeleitet sind,
3. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die für die Reaktion verwendete Polymerase und die zugegebene Präparation von DNA- Einzelstrang- bindenden Proteinen aus dem gleichen Organismus stammen.
4. Verfahren nach Anspruch 3 dadurch gekennzeichnet, daß der Organismus Thermus flavus ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, daß der Organismus Thermus flavus.Stamm AT-62;DSM Nr.674 ist.
6. Verfahren nach Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet, daß das Gen, von dem die für die Reaktion verwendete Polymerase codiert wird,und demjenigen, das für das DNA- Einzelstrang-bindende Protein codiert, aus dem gleichen Organismus stammen oder von solchen gentechnisch abgeleitet sind.
7. Verfahren nach Anspruch 6 dadurch gekennzeichnet, daß der Organismus Thermus flavus ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7 dadurch gekennzeichnet, daß der Organismus Thermus flavus.Stamm AT-62;DSM Nr.674 ist.
9:Verfahren zur Herstellung von Präparationen von DNA- Einzelstrang-bindenden Proteinen aus thermophilen Organismen.einsetzbar für eirse , Poiymerasekettenreaktion nach irgend einem der Ansprüchel bis δ.gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte : a.Herstellung eines Rohextraktes aus Zellen ,die ein solches DNA-Einzelstrang- bindendes Protein produzieren. b. Unterwerfung des Rohextraktes der Fraktionierung, die aus einer Auswahl folgender Schritte besteht : ; Chromatographie aufgrund einer Protein-Affinität an DNA ; Chromatographie aufgrund von Anionenaustausch; Chromatographie aufgrund von Kationenaustausch.
10: Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der thermophile Organismus Thermus flavus ist.
11:Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der thermophile Organismus Thermus flavus.Stamm AT-62; DSM Nr.674 ist.
12:Verfahren nach irgend einem der Ansprüche 9 bis 11.gekennzeichnet dadurch.daß die Präparationen gegenüber dem jeweiligen Rohextrakt an DNA Einzelstrang- bindenden Proteinen angereichert sind.
13:Verfahren zur Herstellung von Präparationen von DNA Einzelstrang-bindenden Proteinen .einsetzbar für eine Poiymerasekettenreaktion nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie von einem Gen codiert werden, c|a§ von einem Gen gentechnisch abgeleitet ist .das für ein DNA Einzelstrang- bindendes Protein nach Anspruch 1 codiert.
PCT/EP1993/003585 1992-12-18 1993-12-16 Verbesserte ausbeuten von pcr-produkten in gegenwart von dna-einzelstrang bindendem protein und dessen präparation aus thermus flavus Ceased WO1994014978A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ATA2512/92 1992-12-18
AT251292 1992-12-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1994014978A1 true WO1994014978A1 (de) 1994-07-07

Family

ID=3535621

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP1993/003585 Ceased WO1994014978A1 (de) 1992-12-18 1993-12-16 Verbesserte ausbeuten von pcr-produkten in gegenwart von dna-einzelstrang bindendem protein und dessen präparation aus thermus flavus

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO1994014978A1 (de)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996039525A1 (en) * 1995-06-06 1996-12-12 The Mount Sinai Medical Center Of The City University Of New York Cloning and expression of thermostable muts genes and proteins and uses therefor
EP1985703A2 (de) 1994-11-02 2008-10-29 Allelix Neuroscience, Inc. Spezifische Peripherie-Nervensystem-Natriumkanäle, DNS-Kodierung dafür, Kristallisierung, Röntgenstrahldiffraktion, Computermolekülformung, rationales Drogendesign, Drogenscreening und Verfahren zur Herstellung und Verwendung davon
US7662593B2 (en) 2004-12-21 2010-02-16 Aisin Seiki Kabushiki Kaisha Activation method of protein derived from extremely thermophilic bacterium in nucleic acid amplification reaction and use thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0395398A2 (de) * 1989-04-27 1990-10-31 Life Technologies Inc. Verstärkung von Nukleinsäure-Sequenzen unter Verwendung von Stichsequenz-Oligonukleotiden als Primer
WO1991006679A1 (en) * 1989-10-24 1991-05-16 Stratagene An improved method for hybridizing nucleic acids using single-stranded nucleic acid binding protein

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0395398A2 (de) * 1989-04-27 1990-10-31 Life Technologies Inc. Verstärkung von Nukleinsäure-Sequenzen unter Verwendung von Stichsequenz-Oligonukleotiden als Primer
WO1991006679A1 (en) * 1989-10-24 1991-05-16 Stratagene An improved method for hybridizing nucleic acids using single-stranded nucleic acid binding protein

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J.K. BALL AND U. DESSELBERGER: "Incorporation of single-stranded DNA binding protein early in polymerase chain reaction product sequencing reactions prevents enzyme pausing", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, vol. 207, no. 2, December 1992 (1992-12-01), ACADEMIC PRESS, INC., NEW YORK, US;, pages 349 - 351 *
K. SCHWARZ ET AL.: "Improved yields of long PCR products using gene 32 protein", NUCL. ACIDS RES., vol. 18, no. 4, 25 February 1990 (1990-02-25), IRL PRESS, OXFORD, ENGLAND;, pages 1079 *
M. PANACCIO AND A. LEW: "PCR based diagnosis in the presence of 8% (v/v) blood", NUCL. ACIDS RES., vol. 19, no. 5, 11 March 1991 (1991-03-11), IRL PRESS, OXFORD, ENGLAND;, pages 1151 *
R.G. OSHIMA: "Single-stranded DNA binding protein facilitates amplification of genomic sequences by PCR", BIOTECHNIQUES, vol. 13, no. 2, August 1992 (1992-08-01), EATON PUBL. CO., MA,US;, pages 188 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1985703A2 (de) 1994-11-02 2008-10-29 Allelix Neuroscience, Inc. Spezifische Peripherie-Nervensystem-Natriumkanäle, DNS-Kodierung dafür, Kristallisierung, Röntgenstrahldiffraktion, Computermolekülformung, rationales Drogendesign, Drogenscreening und Verfahren zur Herstellung und Verwendung davon
WO1996039525A1 (en) * 1995-06-06 1996-12-12 The Mount Sinai Medical Center Of The City University Of New York Cloning and expression of thermostable muts genes and proteins and uses therefor
US5877280A (en) * 1995-06-06 1999-03-02 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Thermostable muts proteins
US7662593B2 (en) 2004-12-21 2010-02-16 Aisin Seiki Kabushiki Kaisha Activation method of protein derived from extremely thermophilic bacterium in nucleic acid amplification reaction and use thereof

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3687287T3 (de) Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen.
DE69122712T2 (de) Verfahren zur nukleinsäure hybridisierung und amplifizierung
DE68915202T2 (de) Verfahren zur Vermehrung und zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen.
AT402203B (de) Verfahren zur transkriptionsfreien amplifizierung von nucleinsäuren
DE3850093T2 (de) Verfahren zur Amplifizierung von Nukleinsäuren.
DE69029105T2 (de) Schnellverfahren zum Nachweis und/oder zur Identifizierung einer Einzelbase in einer Nukleinsäuresequenz und seine Verwendungen
DE69512003T2 (de) Oligonukleotid verwendbar als Primer in einem Amplifikationsverfahren auf der Basis einer Strangverdrängungsreplikation
DE69534728T2 (de) Amplifizierung von langen Nukleinsäuresequenzen mit PCR
DE69219727T2 (de) Nukleinsäure Zielerzeugung
DE69030955T2 (de) Nukleinsäureverstärkung
DE69205181T2 (de) Strangverdrängungsamplifikation.
DE19826758C1 (de) Darstellung von linearen kovalent geschlossenen DNA-Molekülen als Expressionskonstrukte
DE69031043T2 (de) In vitro-dns-synthesereaktionen unter verwendung von geändertem phi-29-dns-polymerase und für besagte polymerase kodierendes dns-bruchstück
DE69527171T2 (de) Strangverdrängungsamplifikation unter Verwendung von thermophilen Enzymen
DE3486467T2 (de) Verfahren zum Nachweis, Identifizieren und Quantifizieren von Organismen und Viren
DE69133389T2 (de) Direkte Klonierung von PCR amplifizierten Nukleinsäuren
DE3687537T2 (de) Verfahren zur amplifikation, zum nachweis und/oder zur klonierung von nukleinsaeuresequenzen.
DE60122962T2 (de) Reverse Transkription bei hoher Temperatur durch die Verwendung von mutierten DNA Polymerasen
DE69523360T2 (de) Isotherme Amplifikation von Nukleinsäuren durch Strangverdrängung
DE69708865T2 (de) Verfahren zur direkten sequenzierung während "template"-amplifikation
DE69523068T2 (de) 'terminal repeat'- amplifikation
DE69801749T2 (de) Eine methode zum klonieren von mrna und darstellung von differentiell exprimierten transcripten (dodet)
WO1996034114A1 (de) Simultane sequenzierung von nukleinsäuren
EP0597076B1 (de) Simultane sequenzierung von nukleinsäuren
DE69425450T2 (de) Detektion und Identifikation von Mycobakterien

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase