WO1994017098A1 - Peptidos y vacunas sinteticos contra parvovirus - Google Patents

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WO1994017098A1
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José Ignacio CASAL ALVAREZ
Carmen Vela Olmo
Joannes Pieter Maria Langeveld
Robert Hans Meloen
Kristian Dalsgaard
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14311—Parvovirus, e.g. minute virus of mice
    • C12N2750/14322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • Parvoviruses form a viral family that possesses certain common traits (Cotmore et al., Adv. Virus Res. 33: 91-174 (1987)). They are the smallest known DNA viruses. Its genome is formed by a linear DNA molecule of about 5.0 kb in length enclosed within a protein capsid, of icosahedral symmetry and about 25 nm in size. Two large open reading phases are detected in the viral genome. The phase on the left codes for the non-structural proteins involved in viral replication, while the phase on the right codes for the structural proteins that form the viral capsid, which is made up of the VP1, VP2 and VP3 proteins. The mRNA of both reading phases is polyadenylated and 3'-coterminal.
  • the CPV capsid contains two proteins whose amino acid sequences overlap widely, VP1 (82-84 KDa) and VP2 (67-70 KDa) (Paradiso et al., J. Gen. Virol. 39, 800-807 (1982) ; Surleraux et al., Arch. Virol. 82, 233-240 (1984); J. Gen. Virol. 62, 113-125 (1982)).
  • PPV causes reproductive failures in sows, causing death and fetal mummification, abortions and other reproductive disorders of pregnant sows (Joo & Johnson, Veterinary Bulletin 46, 653-660 (1976); Mengeling, J. Am. Vet. Med. Assoc 172, 1291-1294 (1978)).
  • PPV contains a single stranded DNA molecule of approximately 5000 nucleotides (Mollitor et al., Virology 137, 241-254 (1984)). The complete PPV genome sequence has been described by our group (Ranz et al., J. Gen. Virol. 70, 2541-2553 (1989)).
  • a further object of this invention is new synthetic peptides, from the amino terminal end of PPV VP2, capable of inducing neutralizing antibodies against PPV that can be used in obtaining immunogenic compositions and in formulating new vaccines. Synthetic capable of protecting pigs from infection caused by PPV. These synthetic peptides are based on the immunogenic properties of the amino terminus of the majority protein VP2 of PPV. Immunogenic compositions and vaccines incorporating said peptide are another additional object of this invention.
  • FIGURES Figure 1 shows the results obtained by determining, by means of a virus-specific ELISA (enzyme immunoassay), the titre of anti-CPV antibodies present in serum of dogs immunized with the peptides of this invention (dogs 3029—- ⁇ — and 3030 - —-) and in a control dog (3025 — Q-)
  • the invention provides new peptides useful for the preparation of synthetic vaccines suitable for the protection of animals against infections caused by autonomous parvoviruses, such as CPV, MEV, FPLV and PPV.
  • the new vaccines contain at least one chemically synthesized peptide from the amino terminal region of the VP2 protein of CPV or the VP2 protein of PPV.
  • terminal amino region in the sense used in this description, the region comprising at least the first 25 amino acids of the VP2 protein should be understood.
  • N s 1 are capable of inducing neutralizing antibodies against MEV, so they can be used in the formulation of vaccines capable of protecting visions from infection caused by MEV. Indeed, it has been proven that mints vaccinated with a mixture of peptides 1L15 and 7L15 were protected against subsequent infection with virulent virus (Example 6). This experimental confirmation with MEV makes it possible to assume that the peptides included within the SEC. ID. N B 1 can induce protection in cats against FPLV due to the structural homology between CPV, MEV and FPLV, all of them belonging to the same subgroup.
  • All peptides included in the SEC are included within this invention. ID. N B 2 or resulting from the substitution of amino acids of those shown in SEC.ID. N s 2 by other functionally equivalent or from the deletion or insertion of some of said amino acids as long as the resulting peptides are capable of inducing neutralizing antibodies against PPV. For practical reasons synthetic peptides of a length between 6 and 20 amino acids are preferred.
  • the peptides of the invention should preferably be soluble to allow their coupling to suitable carrier proteins that enhance their immunogenic character, such as the KLH protein.
  • suitable carrier proteins such as the KLH protein.
  • the following steps were basically followed: a) Chemical synthesis of the peptides corresponding to the most immunogenic regions of PPV VP2 protein. b) Coupling of said peptides to a carrier protein. c) Selection of peptides that induced in rabbits an antibody response capable of neutralizing PPV. d) Immunization of pigs with the previously selected peptides.
  • Example 2 17 solid phase peptides were synthesized using Fmoc chemistry, as previously mentioned. in relation to synthetic CPV peptides.
  • the 17 synthesized peptides were coupled to the KLH carrier protein (Example 3) and used to immunize rabbits (Example 7).
  • KLH carrier protein Example 3
  • Example 7 the KLH carrier protein
  • peptides named 1L15, 5L16, 6L15, 8L15, 10L16 and 13L15 were capable of inducing antibodies that neutralized PPV (Table 5). Based on these results, it can be said that these peptides can be used in the formulation of new synthetic vaccines in order to protect animals against infection caused by PPV.
  • immunogenic compositions containing said peptides can be prepared in an immunogenic manner, whereby they can be used to formulate vaccines capable of protecting dogs, cats and minks from infection caused by CPV, FPLV and MEV respectively (for what they use peptides comprised within SEQ. ID. N B 1) and to formulate vaccines capable of protecting pigs against infection caused by PPV (for which will be used peptides comprised within SEQ. ID. N B two).
  • Said immunogenic compositions may be prepared by coupling at least one of the peptides of this invention to a suitable multimeric carrier protein or structure.
  • compositions comprising an immunogenic conjugate of a protein (KLH) and a peptide of this invention are provided.
  • these compositions may contain an immunogenic complex obtained by crosslinking the peptide or an immunogenic recombinant protein containing one of the peptides of this invention.
  • This invention also provides vaccines that are characterized in that they comprise one of the aforementioned immunogenic compositions in combination with at least one immunological adjuvant.
  • Such vaccines can be prepared by suspending at least one of the peptides of the invention coupled to a suitable multimeric carrier protein or structure, in an immunologically acceptable diluent plus an adjuvant.
  • a vaccine may contain a mixture of the peptides of this invention as immunogenic agents.
  • immunologically acceptable diluent saline solutions with tris buffer or other similar saline solutions can be used.
  • suspensions of alumina gels can be used alone or in combination with other adjuvants commonly used in the formulation of vaccines such as QuilA or related and of similar potency.
  • Example 1 CHEMICAL SYNTHESIS OF CPV PEPTIDES AND IMMUNOGENIC PEPTID SELECTION Based on data on the location of B epitopes in the CPV capsid (Langeveld et al., Cited above), the 21 peptides shown in Table 1 were synthesized.
  • each letter represents an amino acid sequence designated as code amino acid nomenclature in one - letter (Biochemistry Structural Louisot P., Ed AC, I th Edition (1977). , pp. 372-373); the amino terminal end is located on the left side of the sequence while the carboxy terminal end is located on the right side of the sequence; the peptide code reflects the position of the rest of the N-terminal end in the VP2 sequence
  • the peptides were purified using high performance liquid chromatography (HPLC). Quality was analyzed on a Delta PaK 5 or C18-100A column (0.39 x 15 cm), with a 680 model gradient controller and a detector
  • diode array model 991.
  • the peptides were purified on a 2 x 25 cm Bischoff Prap 2025 C18 column in a Hewlett Packard HPLC equipment, model 1082B and with a reading at 225 nm.
  • Gradients of methanol were used with an increase of methanol of 1% per min at a flow of 10 ml / min in water and 0.1% (v / v) of trifluoroacetic acid (TFA).
  • the initial methanol concentrations varied between 0 and 20%.
  • the amino acid composition analysis was performed according to the Pico-tag (Waters) procedures.
  • the length of the Peptides are variable, between 15 and 20 residues, not including the N-terminal cysteine that is used to perform the coupling. All of them were sufficiently soluble to allow their conjugation to KLH.
  • the synthesis of these 17 peptides was carried out by the chemistry of the Fmoc, according to the general procedure previously mentioned, on Rink R resins (Example 1). The sequences were obtained from PPV protein VP2 (Ranz et al., Cited supra; Sakurai et al. Virus Res. 13, 79-86 (1989)). The sequences are acetylated at the N-terminal end and amidated at the C-terminal. Some peptides were purified according to the protocol described in Example 1.
  • the coupling of purified peptides to the KLH carrier protein was performed according to standard procedures using m-maleimidobenzoyl-N-succinimide ester (MBS) as a coupling agent (Lerner et al. (1981) Proc. Nati. Acad Sci. USA 78, 3403-3407). The dialysis steps were done at 4 ° C and the other incubations at room temperature. To each mg of KLH 1 mg of peptide was added after binding of a "linker" to the protein and incubated overnight at room temperature.
  • MBS m-maleimidobenzoyl-N-succinimide ester
  • the conjugates were stored either directly (non-dialyzed conjugates) or dialyzed, with three changes of 0.1M sodium phosphate, pH: 5.0, overnight against phosphate buffered saline (PBS).
  • the conjugates were divided into aliquots containing 1 mg of KLH and stored at -20 ° C.
  • the ratios of ug of peptide per mg of KLH ranged between 82 and 304, depending on the peptide used.
  • Example 4 IMMUNIZATION OF RABBITS WITH CPV PEPTIDES New Zealand White rabbits were used for immunization with peptides to induce neutralizing antibodies.
  • the peptide-KLH (non-dialyzed) conjugates corresponding to 1 mg of peptide in 1 ml of buffer (PBS) were mixed with an equal volume of Freund's complete adjuvant (FCA) and injected intramuscularly and subcutaneously into rabbits. After 65 days the animals received a booster immunization with the same immunogen mixed with Freund's incomplete adjuvant (FIA). Bleeds were made on days 0, 57, 64 and 70.
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • FIA Freund's incomplete adjuvant
  • Bleeds were made on days 0, 57, 64 and 70.
  • the peptide ELISA titers were increased by a factor of at least 5 after immunization of the memory, the animals received a second memory with the same amount of conjugate in FI
  • an indirect ELISA assay was used.
  • Flat-bottom polystyrene plates were coated overnight with 1 ug of peptide in a 50 mM sodium carbonate solution pH 9.6 at 4 ° C.
  • the first antibody rabbit serum diluted in incubation buffer consisting of PBS containing 4% (v / v) of horse serum, 1% (v / v) of Tween 80 and 0.5 M NaCl was added after incubation. for lh at 25 ° C, the plates were washed with PBS containing 0.05% (v / v) Tween 80.
  • CPV neutralization "in vitro" Neutralization was determined by a monolayer protection experiment. Briefly, a known amount of CPV (100 HA units) was incubated with rabbit antiserum at different dilutions for 2 hours at 37 "C. Next, the samples were inoculated on CRFK susceptible cell monolayers (ATCC CCL 94) for 90 min at 37 ° C. The monolayers were covered with 1 ml of 1% agarose in fresh medium. At 5 days post infection the cells were fixed with 10% formaldehyde in PBS for 20 minutes, the agarose was removed and the remaining cells were stained with 1% violet crystal in 50% ethanol for 20 minutes. The level of protection was assessed by visual screening of infected monolayers.
  • Anti-virus ELISA ⁇ ⁇ 10 2 ; +: 10 2 -10 3 ; ++: 10 3 -10 4 ; +++: ⁇ 10 4 .
  • an immunization experiment was carried out that included subsequent infection with the same virus.
  • three Beagle SPF dogs (free of specific pathogens) were used.
  • Two of the dogs (identified as 3029 and 3030) were immunized with an equal mixture of peptides 1L15 and 7L15 conjugated separately to KLH.
  • the immunization cocktail (2.5 ml total volume) contained 1 mg of each of the KLH-coupled peptides adsorbed on alumina gels and adjuvated with QuilA (25 ⁇ g / dog).
  • the vaccination schedule was as follows: the first dose was given daily 0, 4 weeks later they were given a souvenir dose.
  • the dog that was used as a negative control received a buffer (PBS) / adjuvant mixture without conjugate.
  • the dogs were bled on days 0, 15, 29, 36, 43, 50, 57, 64, 71 and every three days from the discharge until the end of the experiment.
  • For the discharge feces of a dog were used that had died as a result of a parvoviru ⁇ infection and contained virulent virus.
  • the feces were homogenized in sterile culture medium and the virus was extracted with chloroform. This material was applied in oronasal swabs on the dogs at the time of infection. The presence of CPV in these feces had been verified by hemagglutination and cell culture techniques.
  • the anti-CPV antibody titer in the dogs' serum was evaluated by: a) ELISA is virus-specific
  • Example 4.1.B The protocol described in Example 4.1.B was repeated but as the first antibody serum from the dogs to be evaluated diluted in the incubation buffer was added. Plates were subsequently incubated with anti-dog IgG-peroxidase conjugates diluted 1/100 in the incubation buffer and finally the colored reaction was formed by adding tetramethylbenzidine, stopped with H 2 S0 4 and absorbance at 450 nm was measured.
  • Example 4.2 The protocol described in Example 4.2 was followed but the CPV was incubated with dog antiserum (3025, 3029 and 3030) at different dilutions. After inoculating the samples on monolayers of CRFK cells and continuing the aforementioned protocol, the results shown in Figure 3 were obtained, where it can be seen that the immunized dogs (3029 —- — and 3030 O-—) produced neutralizing antibodies at similar levels to those obtained using complete virus as immunogen (approximately 1: 1000). On the contrary, the control dog (3025 —g—) did not produce neutralizing antibodies at any time.
  • Group 1 (n o ⁇ 1-6) were vaccinated with 0.5 mg of peptide 1L15 coupled to 0.5 mg of KLH plus 0.5 mg of peptide 7L15 coupled to 0.5 mg of KLH, using 50 ⁇ g of ISCOM matrix as an adjuvant, all in one final volume 1 ml of PBS (pH. 7.2> group 2 (n ° "7-12) only received 1 ml of PBS (pH.
  • group 3 (n o ⁇ 13-18) received a conventional vaccine (BIOVAC R , United, DK) based on inactivated virus, which was administered according to the manufacturer's recommendations All minks received a single subcutaneous vaccine dose and were bled immediately before vaccination.
  • BIOVAC R United, DK
  • New Zealand White rabbits were used for immunization with peptides to induce neutralizing antibodies.
  • the peptide-KLH conjugates corresponding to 1 mg of peptide in 1 ml of buffer (PBS), were mixed with an equal volume of Freund's complete adjuvant (FCA) and injected intramuscularly and subcutaneously into rabbits. After 42 days the animals received a booster immunization with the same inraened mixed with Freund's incomplete adjuvant (FIA). Bleeds were made on days 0, 39, 50 and 71.
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • the plates were stained using a monolayer immuno peroxidase assay, using a porcine anti-PPV serum, peroxidase-bound rabbit anti-pig globulin and staining with amino-ethyl-carbazole, following conventional protocols (Holm-Jensen cited supra).
  • the endpoint titer was expressed as the inverse of the highest serum dilution that neutralized virus infection in the cell monolayer.
  • Example 8 PIG IMMUNIZATION To check the immunogenicity of the peptides on the host animal, the peptide named 5L16 was used as an example (Table 2).
  • Pigs were vaccinated twice with a three week interval. Serum samples were obtained daily.
  • PPV virions were adsorbed to flat bottom polystyrene plates (Nunc). They were then added to the plates serial dilutions (factor 2) of pig sera and incubated at 37 C for 1 h. The plates were washed and peroxidase conjugated pig anti-IgG rabbit serum was added. It was subsequently incubated during
  • the three mini-pigs failed to show anti-PPV antibody titer on days 0 and 25. Now, day by day 36 (10 days after revaccination) significant, although low titers had been developed (Table 6), indicating that the peptide vaccine is capable of inducing antibodies in pigs that recognize the epitope in purified PPV virions.
  • a Western Blot analysis was carried out to analyze the reactivity and specificity, against the different protomers of the virus, of the sera from the three immunized mini-pigs.
  • Example 7.1 Western Blot was analogous to that used in Example 7.1, with slight modifications.
  • the blocking buffer contained 1% casein instead of fetal calf serum and albumin.
  • peroxidase-labeled rabbit anti-IgG rabbit serum (Dako P164) was used.
  • Vaccines capable of protecting dogs, cats, minks and pigs can be prepared from infection caused by CPV, FPLV, MEV and PPV respectively, which contain one or more of the corresponding peptides provided by this invention coupled to a protein or structure.
  • carrier multimeric either in the form of an immunogenic complex or in the form of an immunogenic recombinant protein, together with an immunologically acceptable diluent such as a buffered saline solution at physiological pH, plus an adjuvant such as Alhydrogel in combination with QuilA (25 ug / animal ).
  • a single injection may be sufficient to confer protection to the animals against the disease although, in some cases, depending on the evaluation of the antibody titer, it may be convenient to use a 2 - dose recall.
  • ORGANISM Porcine parvovirus (PPV) CEPA: NADL-2 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEC. ID. N a : 2 Met Ser Glu Asn Val Glu Gln His Asn Pro lie Asn Ala Gly Thr Glu

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Abstract

Se describen péptidos sintéticos contra parvovirus autónomos capaces de inducir anticuerpos neutralizantes contra dichos virus. Estos péptidos corresponden a sitios antigénicos localizados en los 25 primeros aminoácidos del extremo amino terminal de las proteínas VP2 de Parvovirus. Cuando estos péptidos se acoplan a proteínas portadoras u otros complejos inmunogénicos pueden utilizarse en la formulación de vacunas adecuadas para proteger animales de la infección causada por dichos parvovirus.

Description

PEPTIDOS Y VACUNAS SINTÉTICOS CONTRA PARVOVIRUS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a péptidos virales, sintetizados químicamente, relacionados con el antígeno mayoritario (VP2) de la cápsida de los Parvovirus autónomos y a ensayos y a vacunas que utilizan dichos péptidos. A modo de ejemplo, dichos péptidos pueden inducir anticuerpos neutralizantes contra Parvoviruε canino (CPV) , el virus de la enteritis de los visones (MEV) y el Parvovirus porcino (PPV), por lo que pueden ser formulados en vacunas y conferir protección total en perros, visones y cerdos frente a CPV, MEV y PPV respectivamente.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los parvovirus forman una familia viral que posee ciertos rasgos comunes (Cotmore et al., Adv. Virus Res. 33:91-174 (1987)). Son los virus DNA más pequeños que se conocen. Su genoma está formado por una molécula de DNA lineal de unas 5.0 kb de longitud encerrado dentro de una cápsida proteica, de simetría icosaédrica y de unos 25 nm, aproximadamente, de tamaño. En el genoma viral se detectan dos grandes fases de lectura abierta. La fase de la izquierda codifica para las proteínas no estructurales implicadas en la replicación viral, mientras que la fase de la derecha codifica para las proteínas estructurales que forman la cápsida viral, la cual está constituida por las proteínas VP1, VP2 y VP3. El mRNA de ambas fases de lectura es poliadenilado y 3'-coterminal. En la cápsida viral existen 60 copias de VP2 por, aproximadamente, 10 copias de VP1 (Wobble et al., Biochemistry 23, 6565-6569, 1984) , que pueden estar dispuestas como homo- y heterodímeros (Paradiso, J. Virol. 46, 94-102, 1983). La VP2 es la proteína que contiene todos los determinantes antigénicos implicados en la neutralización del virus (López de Turiso et al., J. Gen. Virol., 72., 2445-2456 (1991); Langeveld et al., J. Virol., Vol. 67, No. 2, 765- 772 (1993); López de Turiso et al., J. Virol., Vol. 66, No. 5, 2748-2753 (1991)).
Los parvovirus autónomos son los responsables de un elevado número de enfermedades que afectan tanto a los seres humanos como a animales de interés y que pueden llegar a ser fatales debido a la tendencia de los parvovirus autónomos a replicarse en células proliferantes del cerebelo, tejido linfoide, epitelio intestinal o tejidos fetales. Entre estos parvovirus autónomos se encuentran el CPV, el MEV, el PPV, el parvovirus bovino (BPV), el parvovirus de los gansos (GPV) , el virus de la panleucopenia felina (FPLV) y el parvovirus B19 que afecta a los seres humanos.
A modo de ejemplo, en esta descripción se particularizará en los parvovirus autónomos CPV y PPV. A continuación se resumen algunas de las principales características de ambos parvovirus.
* Parvovirus canino fCPV^
El CPV es, dentro del género de los parvovirus autónomos, un miembro del subgrupo de los parvovirus felinos. Los otros miembros de este subgrupo, muy similares entre sí, son el virus de la panleucopenia felina (FPLV) y el MEV. El CPV causa enteritis severa en perros de todas las edades y miocarditis en cachorros de menos de 12 semanas de edad. El CPV se aisló por primera vez en 1978 (Burtonboy, G. et al., Arch. Virol. 61:1-11 (1979); Appel et al., Vet. Rec. 105. 156-179 (1979)) y se cree que ha surgido como una variante natural del FPLV o del MEV. Estudios sobre las secuencias de proteína y de DNA y estudios serológicos muestran una gran homología antigénica y genética entre CPV, FPLV, MEV y el Parvovirus de mapache (Tratschin et al., J. Gen. Virol. 61:33-41 (1982); Carlsson et al., J. Virol., 55, 574-582 (1985); Parrish et al., Arch. Virol. 72, 267-278 (1982); Reed et al., J. Virol. 62:266-276 (1988)). A pesar de esta homología presentan una exquisita especificidad del huésped "in vivo", aunque "in vitro" todos los virus se replican en células de riñon de gato (Appel et al., Vet. Rec. 105, 156-179 (1979); Trastschin, et al., J. Gen. Virol., 61:33-41 (1982)). La cápsida de CPV contiene dos proteínas cuyas secuencias de aminoácidos se solapan ampliamente, VPl (82-84 KDa) y VP2 (67-70 KDa) (Paradiso et al., J. Gen. Virol. 39, 800-807 (1982); Surleraux et al., Arch. Virol. 82, 233-240 (1984); J. Gen. Virol. 62, 113-125 (1982)). En cápsidas llenas (conteniendo DNA), la VP2 se rompe preferencialmente por digestión proteolítica en VP3 de 63-67 KDa (Paradiso et al., J. Gen. Virol. 39, 800-807 (1982); Surleraux et al. Arch. Virol., 82, 233-240 (1984)), después del ensamblaje de la cápsida (Paradiso, J. Virol. 39, 800-807 (1981)). Actualmente se conoce la estructura tridimensional de la cápsida del CPV (Tsao et al., Science 251: 1456-1464 (1991)).
Nuestro laboratorio ha investigado la inmunogenicidad de diferentes fragmentos de las proteínas que componen la cápsida viral del CPV, y como consecuencia de ello, se han descrito nuevas vacunas de origen recombinante basadas en la proteína VP2 y en fragmentos de VP2 y VPl. Estos hallazgos se resumen en las patentes españolas ns P9002074, relacionada con la expresión de dichos productos en sistemas bacterianos de E.coli; y n= P9100844, relacionada con la expresión de VP2 en un sistema de baculovirus recombinante.
Se han podido identificar 10 sitios antigénicos en la secuencia de la VP2 así como su localización espacial sobre la superficie de la cápsida (J. Langeveld et al., J. Virol. 67.No.2 (1993)). Se han descrito en CPV cuatro sitios potenciales de neutralización. Dos de dichos sitios fueron mapeados con péptidos sintéticos, y de ellos, uno se encuentra en el extremo N-terminal y el otro en las posiciones 147-163 de la VP2 (Rimmelz aan et al., J. Gen. Virol., 71:2741-2745 (1990)). Los otros dos sitios se mapearon sobre y alrededor de un gran dominio protuberante en el eje ternario de simetría de la cápsida viral (Parrish et al., Virology 166:293-307). El papel del extremo amino terminal de la VP2 en parvovirus es objeto de especulación. Este dominio es importante porque (a) se ha observado neutralización viral "in vitro" cuando se utiliza un anticuerpo monoclonal específico de ese sitio (López de Turiso et al., J. Gen. Virol. 72:2445-2456 (1991)), (b) es inmunogénico en varias especies animales (Langeveld et al., J. Virol., Vol. 67, No. 2, 765-772 (1993)) y (c) está implicado en la unión del virus a la célula.
Las vacunas peptídicas descritas en esta memoria están dirigidas contra una parte de ese sitio. Gracias al conocimiento de los sitios antigénicos en VP2 se diseñó una colección de péptidos sintéticos de posible interés en la formulación de vacunas. Péptidos sintéticos que incluían aminoácidos del extremo amino terminal de VP2 indujeron consistentemente anticuerpos neutralizantes en animales experimentales. Este dominio constituye, por tanto, un candidato atractivo para su inclusión en una vacuna de péptidos sintéticos.
Actualmente se dispone de vacunas convencionales a base de virus vivo o inactivado y de vacunas recombinantes contra CPV, pero no se dispone de vacunas sintéticas capaces de inducir anticuerpos neutralizantes contra CPV y proteger eficazmente a los perros de la infección causada por CPV. Estas vacunas proporcionarían numerosas ventajas no sólo económicas sino además operativas. Las vacunas basadas en péptidos sintéticos son seguras, ya que se eliminan los riesgos derivados del manejo y difusión de los agentes infecciosos inherentes a las vacunas convencionales, fáciles de producir, muy reproducibles y poseen gran estabilidad. En el caso de CPV, otra gran ventaja de una vacuna sintética es su potencial para evitar los problemas vacunales que se derivan de la inmunidad natural en jóvenes cachorros. Las vacunas convencionales contra CPV no garantizan protección completa en cachorros menores de 10 semanas porque éstos poseen anticuerpos maternales que eliminan la vacuna. Los datos conocidos hasta la fecha indican que entre la población general de anticuerpos anti-virus en animales infectados, los anticuerpos anti- péptido no están presentes en grandes cantidades, si es que hay. Si los anticuerpos inducidos por los péptidos sintéticos no son predominantes "in vivo", la vacuna peptídica permitiría la respuesta inmune en el neonato a una edad más temprana que en las condiciones actuales. Por consiguiente, un objeto de la presente invención lo constituyen nuevos péptidos, químicamente sintetizados, que incluyan la totalidad o parte del extremo amino terminal de la VP2 de CPV capaces de inducir anticuerpos y sean neutralizantes contra CPV.
Dada la estrecha homología (superior al 98%) entre CPV, MEV y FPLV, es muy probable que un agente capaz de inducir protección en perros tenga el mismo efecto en otros huéspedes, tales como gatos y visones. Este efecto, será demostrado, a título de ejemplo, en visones. Por consiguiente, estos nuevos péptidos pueden ser utilizados en la obtención de composiciones inmunogénicas y en la formulación de nuevas vacunas sintéticas capaces de proteger perros, y alternativamente, visones y gatos de las infecciones causadas por CPV, MEV y FPLV respectivamente. Dichas composiciones inmunogénicas y vacunas constituyen un objeto adicional de esta invención. * Parvovirus porcino (PPV.
El PPV causa fallos reproductivos en cerdas, ocasionando muerte y momificación fetal, abortos y otros transtornos reproductivos de las cerdas preñadas (Joo & Johnson, Veterinary Bulletin 46, 653-660 (1976); Mengeling, J. Am. Vet. Med. Assoc. 172, 1291-1294 (1978)). El PPV contiene una molécula de DNA de cadena sencilla de aproximadamente 5000 nucleótidos (Mollitor et al., Virology 137, 241-254 (1984)). La secuencia completa del genoma de PPV ha sido descrita por nuestro grupo (Ranz et al., J. Gen. Virol. 70, 2541-2553 (1989)). Se han descrito 4 proteínas específicas de virus: 3 proteínas que forman la cápsida (VPl, VP2 y VP3 de pesos moleculares 83000, 64000 y 60000 dalton, respectivamente) y una proteína no estructural NS1. De las tres proteínas estructurales, la VP2 de PPV, al igual que la VP2 de CPV, es la proteína que contiene todos los determinantes antigénicos implicados en la neutralización del PPV. Actualmente existen vacunas que protegen contra la parvovirosis porcina basadas en los métodos tradicionales de inactivación con agentes químicos y/o búsqueda de mutantes atenuados para el virus. Sin embargo, todos los intentos previos de producción de nuevas vacunas utilizando proteínas recombinantes producidas en microorganismos procarióticos (v.g. E.coli . han resultado fallidos.
Durante los últimos años, nuestro laboratorio ha trabajado en la biología molecular del PPV (A. Ranz et al., J. Gen. Virol. 20, 2541-2553 (1989); J.I. Casal et al., Virology, 177f 764-767 (1990)). Estas publicaciones se relacionan con el conocimiento de las secuencias del DNA viral que codifican para la proteínas que forman la cápsida del PPV. Estas secuencias nos permitieron identificar el gen que codificaba para la VP2 del PPV y su manipulación e inserción en vectores adecuados para su expresión en un sistema de baculovirus, tal como se describe en la patente española ns P9100845, relacionada con la expresión de VP2 de PPV en un sistema de baculovirus recombinante. Utilizando técnicas similares a las utilizadas con CPV se realizaron pruebas encaminadas a la determinación y búsqueda de sitios antigénicos en PPV. Los resultados obtenidos demostraron que, al igual que en CPV, el extremo amino terminal de la VP2 de PPV es üh sitio potencial de neutralización. Por tanto, aunque actualmente se dispone de vacunas convencionales y recombinantes contra PPV, no se dispone de una vacuna sintética capaz de proteger eficazmente a los cerdos de la infección causada por PPV. Sería conveniente disponer de vacunas sintéticas que incorporaran péptidos de pequeño tamaño capaces de inducir anticuerpos neutralizantes, lo cual tendría ventajas no sólo económicas sino además operativas.
Por consiguiente, un objeto adicional de esta invención lo constituyen nuevos péptidos sintéticos, procedentes del extremo amino terminal de la VP2 de PPV, capaces de inducir anticuerpos neutralizantes contra PPV que pueden ser utilizados en la obtención de composiciones inmunogénicas y en la formulación de nuevas vacunas sintéticas capaces de proteger cerdos de la infección causada por PPV. Estos péptidos sintéticos están basados en las propiedades inmunogénicas del extremo amino de la proteína mayoritaria VP2 de PPV. Las composiciones inmunogénicas y vacunas que incorporan dichos péptidoε constituyen otro objeto adicional de esta invención. Análogamente, debido a la similitud estructural existente entre los extremos araino terminales de las proteínas VP2 de todos los parvovirus autónomos y a que en todos los animales ensayados en esta invención (conejos, cobayas, perros, visones y cerdos) se han obtenido títulos consistentemente buenos de anticuerpos neutralizantes, se puede deducir que péptidos sintéticos localizados en posiciones similares, es decir, en el extremo amino terminal de las proteínas VP2 correspondientes, podrían utilizarse también para vacunar humanos contra el Parvovirus B19, bóvidos contra el Parvovirus bovino (BPV), gansos contra el Parvovirus de los gansos (GPV) y, en general, contra cualquier otro Parvovirus autónomo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: muestra los resultados obtenidos al determinar, mediante un ELISA (Inmunoensayo enzimático) específico de virus, el título de anticuerpos anti-CPV presentes en suero de perros inmunizados con los péptidos de esta invención (perros 3029—-Δ— y 3030 - —-) y en un perro control (3025—Q-)
Figura 2: muestra los resultados obtenidos al determinar, mediante un ELISA específico de péptido el título de anticuerpos anti-péptidos (1L15 y 7L15) presentes en el suero de perros inmunizados (3029 y 3030) y en el perro control
(3025) según la siguiente clave Q : título anti - 1L15 en suero del perro control
(3025) —A : título anti - 1L15 en suero del perro inmunizado (3029)
—G : título anti - 1L15 en suero del perro inmunizado (3030) B : título anti - 7L15 en suero del perro control (3025)
— : título anti - 7L15 en suero del perro inmunizado (3029)
—# : título anti - 7L15 en suero del perro inmunizado (3030) Figura 3 : muestra los resultados obtenidos al determinar el título de anticuerpos neutralizantes contra CPV en suero de perros control (3025-Q— ) e inmunizados con péptidos de esta invención (3029 —A—y 3030 --Q-). Figura 4 : muestra los resultados obtenidos al determinar la presencia de CPV en heces de perros inmunizados (3029-A—y 3030-0--) y en heces de perro control (3025 0 ) mediante un ELISA específico de antígeno viral.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona nuevos péptidos útiles para la elaboración de vacunas sintéticas adecuadas para la protección de animales contra infecciones causadas por parvovirus autónomos, tales como CPV, MEV, FPLV y PPV. Las nuevas vacunas contienen, al menos, un péptido sintetizado químicamente, procedente de la región amino terminal de la proteína VP2 de CPV o de la proteína VP2 de PPV. Por región amino terminal, en el sentido utilizado en esta descripción, debe entenderse la región que comprende, al menos, los 25 primeros aminoácidos de la proteína VP2.
CPV
Mediante el análisis PEPSCAN (Geysen H.M. , et al, Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 81:3998-4002 (1984)) se ha podido comprobar que existen 10 sitios antigénicos en la VP2 de CPV (Langeveld et al, citado supra). Otros autores han descrito otros sitios antigénicos (Rimmelzwaan et al., y Parrish et al., (1988) citados supra). En base a todos los sitios descritos se sintetizó una colección de péptidos que cubrían dichos sitios. Al investigar la inmunogenicidad de todos los péptidos sintetizados se comprobó que sólo aquellos péptidos procedentes de los 25 primeros aminoácidos del extremo amino terminal de la VP2 de CPV, conjugados a KLH [Keyhole Limpet Hemocyanine] , eran capaces de inducir antisueros neutralizantes en conejos. Dichos péptidos son capaces de proteger perros de los efectos patógenos de la infección causada por CPV. Los péptidos capaces de inducir anticuerpos neutralizantes contra CPV, proporcionados por esta invención, están contenidos dentro de la Secuencia Identificada nB 1 (SEC. ID. Na 1) [veáse el apartado relativo al Listado de Secuencias] . Quedan incluidos dentro de esta invención todos aquellos péptidos comprendidos dentro de la SEC. ID. Na 1 o que resulten de la sustitución de unos aminoácidos de los mostrados en la SEC. ID. NB 1 por otros funcionalmente equivalentes o de la delección o inserción de algunos de dichos aminoácidos siempre y cuando los péptidos resultantes sean capaces de inducir anticuerpos neutralizantes contra CPV. Por razones prácticas se prefieren péptidos sintéticos de una longitud comprendida entre 6 y 20 aminoácidos. En general, los péptidos de la invención deberán ser, preferentemente, solubles para permitir su acoplamiento a proteínas portadoras adecuadas que potencien su carácter inmunogénico, tal como la proteína KLH o cualquier otra de las habitualmente utilizadas en este campo. Para la obtención y selección de los péptidos sintéticos de esta invención se siguieron básicamente las siguientes etapas: a) Síntesis química de los péptidos correspondientes a las regiones más inmunogénicas de la proteína VP2 de CPV. b) Acoplamiento de dichos péptidos a una proteína portadora. c) Selección de los péptidos que inducían en conejos una respuesta de anticuerpos capaz de neutralizar al CPV. d) Inmunización de perros con los péptidos anteriormente seleccionados y realización de una prueba de descarga con virus virulento para comprobar la protección de los perros frente a la infección. Estas etapas se describirán posteriormente con más detalle. En una realización particular (Ejemplo 1), se sintetizaron 21 pentadecapéptidos utilizando la química de las Fmoc (Fields C. G. et al., Peptide Res., 4:95-101 (1991)) que consiste, brevemente, en:
(a) preparar una resina (Fase sólida) que incorpora el aminoácido del extremo C-terminal con su extremo amino protegido por un grupo protector adecuado tal como Fmoc (9-fluorofenil-metil-oxi-carbonil) u otro similar (ter- butoxicarbonil, benciloxicarbonil, p-toluensulfonil, trifenilmetilo, u o-nitrofenilsulfenilo) ;
(b) incorporar sucesivamente y en el orden adecuado los restantes aminoácidos con sus grupos amino debidamente protegidos;
(c) desproteger el péptido sintetizado y separarlo de la resina mediante tratamiento adecuado; y
(d) purificar el péptido químicamente sintetizado. Los 21 péptidos sintetizados se acoplaron (Ejemplo 3), en donde fue posible, a la proteína portadora KLH y se utilizaron para inmunizar conejos (Ejemplo 4). Efectuada la inmunización se comprobó que los péptidos 1L15, 2L15, 3L15, 4L15, 5L15, 6L15, 7L15, 8L15 y 9L15 eran capaces de inducir anticuerpos que neutralizaban a CPV.
Adicionalmente, se comprobó que perros vacunados con una mezcla de los péptidos 1L15 y 7L15 desarrollaban un alto título de anticuerpos neutralizantes contra el virus y quedaban protegidos frente a la infección posterior con virus virulento (Ejemplo 5). En base a estos resultados se puede afirmar que los péptidos proporcionados por esta invención pueden ser utilizados en la formulación de nuevas vacunas sintéticas al objeto de proteger animales contra la infección causada por CPV. Asimismo, debido a la similitud estructural y a la práctica identidad de las secuencias de los 25 primeros aminoácidos de los extremos amino terminales de las proteínas VP2 de CPV, MEV y FPLV, se ha podido demostrar que péptidos comprendidos dentro de la SEC. ID. Ns 1 son capaces de inducir anticuerpos neutralizantes contra MEV, por lo que pueden ser utilizados en la formulación de vacunas capaces de proteger visones de la infección causada por MEV. Efectivamente, se ha comprobado que visones vacunados con una mezcla de los péptidos 1L15 y 7L15 quedaban protegidos frente a la infección posterior con virus virulento (Ejemplo 6). Esta confirmación experimental con MEV permite suponer que los péptidos incluidos dentro de la SEC. ID. NB 1 pueden inducir protección en gatos frente al FPLV debido a la homología estructural entre CPV, MEV y FPLV, todos ellos pertenecientes al mismo subgrupo.
Además, dada la homología estructural existente entre todos los parvovirus autónomos se supuso que empleando el mismo procedimiento se podrían encontrar resultados análogos en otros parvovirus, tales como, PPV, BPV o el parvovirus humano B19. A modo de ejemplo se realizó esta demostración en PPV.
2. PPV
Esta invención también proporciona nuevos péptidos útiles para la elaboración de vacunas sintéticas adecuadas para la protección de cerdos contra la infección causada por PPV. Estos péptidos, sintetizados químicamente, proceden de la región amino terminal de la proteína VP2 de PPV. En primer lugar se investigó la inmunogenicidad de la VP2 de PPV utilizando una estrategia análoga a la seguida en el caso de la VP2 de CPV. Se analizó la secuencia por PEPSCAN y se sintetizó una colección de péptidos situados en las regiones antigénicas identificadas. Estos péptidos, acoplados a KLH, se utilizaron para inmunizar conejos y se pudo comprobar, nuevamente, que sólo aquellos péptidos comprendidos en la región amino terminal eran capaces de inducir anticuerpos neutralizantes contra PPV y proteger, por tanto, a los cerdos de los efectos patógenos de la infección causada por PPV. Estos péptidos sintéticos están incluidos dentro de la SEC.ID. NB 2.
Quedan incluidos dentro de esta invención todos aquellos péptidos comprendidos dentro de la SEC. ID. NB 2 o que resulten de la sustitución de unos aminoácidos de los mostrados en la SEC.ID. Ns 2 por otros funcionalmente equivalentes o de la delección o inserción de algunos de dichos aminoácidos siempre y cuando los péptidos resultantes sean capaces de inducir anticuerpos neutralizantes contra PPV. Por razones prácticas se prefieren péptidos sintéticos de una longitud comprendida entre 6 y 20 aminoácidos.
En general, los péptidos de la invención deberán ser, preferentemente, solubles para permitir su acoplamiento a proteínas portadoras adecuadas que potencien su carácter inmunogénico, tal como la proteína KLH. Para la obtención y selección de los péptidos sintéticos de esta invención se siguieron básicamente las siguientes etapas: a) Síntesis química de los péptidos correspondientes a las regiones más inmunogénicas de la proteína VP2 de PPV. b) Acoplamiento de dichos péptidos a una proteína portadora. c) Selección de los péptidos que inducían en conejos una respuesta de anticuerpos capaz de neutralizar al PPV. d) Inmunización de cerdos con los péptidos anteriormente seleccionados.
Estas etapas se describirán posteriormente con mayor detalle. En una realización particular (Ejemplo 2), se sintetizaron 17 péptidos en fase sólida utilizando la química de las Fmoc, tal como se ha mencionado previamente con relación a los péptidos sintéticos de CPV. Los 17 péptidos sintetizados se acoplaron a la proteína portadora KLH (Ejemplo 3) y se utilizaron para inmunizar conejos (Ejemplo 7). Efectuada la inmunización se comprobó que los péptidos denominados 1L15, 5L16, 6L15, 8L15, 10L16 y 13L15 eran capaces de inducir anticuerpos que neutralizaban a PPV (Tabla 5). En base a estos resultados se puede afirmar que dichos péptidos pueden ser utilizados en la formulación de nuevas vacunas sintéticas al objeto de proteger animales contra la infección causada por PPV.
3. Composiciones in unoσénicas y vacunas
A partir de los péptidos proporcionados por esta invención se pueden preparar composiciones inmunogénicas que contienen a dichos péptidos en forma inmunogénica, por lo que pueden utilizarse para formular vacunas capaces de proteger perros, gatos y visones de la infección causada por CPV, FPLV y MEV respectivamente (para lo que se utilizarán péptidos comprendidos dentro de la SEC. ID. NB 1) y para formular vacunas capaces de proteger cerdos de la infección causada por PPV (para lo que se utilizarán péptidos comprendidos dentro de la SEC. ID. NB 2). Dichas composiciones inmunogénicas pueden prepararse mediante acoplamiento de, al menos, uno de los péptidos de esta invención a una proteína o estructura multimérica portadora adecuada. En la solicitud de Patente PCT publicada con el nB WO 90/11298 se indican varias referencias relativas a métodos de acoplamiento y proteínas portadoras susceptibles de ser utilizadas. En una realización preferida de esta invención se proporcionan composiciones que comprenden un conjugado inmunogénico de una proteína (KLH) y un péptido de esta invención. Alternativamente, estas composiciones pueden contener un complejo inmunogénico obtenido por entrecruzamiento del péptido o una proteína recombinante inmunogénica que contenga uno de los péptidos de esta invención. Esta invención también proporciona vacunas que se caracterizan porque comprenden una de las composiciones inmunogénicas antes citadas en combinación con, al menos, un adyuvante inmunológico. Dichas vacunas pueden prepararse suspendiendo, al menos, uno de los péptidos de la invención acoplado a una proteína o estructura multimérica portadora adecuada, en un diluyente inmunológicamente aceptable más un adyuvante. Adicionalmente, una vacuna puede contener una mezcla de los péptidos de esta invención como agentes inmunógenos. Como diluyente inmunológicamente aceptable pueden utilizarse soluciones salinas con tampón tris u otras soluciones salinas similares. Como adyuvante pueden utilizarse suspensiones de geles de alúmina solas o combinadas con otros adyuvantes habitualmente utilizados en la formulación de vacunas como QuilA u otros relacionados y de potencia similar.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE UN MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN (EJEMPLOS)
Ejemplo 1 SÍNTESIS QUÍMICA DE PEPTIDOS DE CPV Y SELECCIÓN DE PEPTIDOS INMUNOGENICOS Basados en los datos sobre la localización de epítopos B en la cápsida de CPV (Langeveld et al., citado supra), se sintetizaron los 21 péptidos mostrados en la Tabla 1.
TABLA lx)
CÓDIGO PEPTIDO SECUENCIA
-10L15 *GQVKRDNLAPMSDGA#
- 5L15 *DNLAPMSDGAVQPDG#
1L15 *MSDGAVQPDGGQPAV#
2L15 *SDGAVQPDGGQPAVR#
3L15 *DGAVQPDGGQPAVRN#
4L15 *GAVQPDGGQPAVRNE#
5L15 *AVQPDGGQPAVRNER#
6L15 *VQPDGGQPAVRNERA#
7L15 *QPDGGQPAVRNERAT#
8L15 *PDGGQPAVRNERATG#
9L15 *DGGQPAVRNERATGS#
11L15 *GQPAVRNERATGSGN#
16L15 *RNERATGSGNGSGGG#
91L15 *AVNGNMALDDIHAQI#
157L17 *NWLKTVSEDATQPPTK#
172L15 *SLMVALDSNNTMPFT#
283L15 *RALGLPPFLNSLPQS#
296L15 *QSEGATNFGDIGVQQ#
498L15 *LFVKVAPNLTNEYDP#
549L15 *QQMSINVDNQFNYVP#
570L15 *KIVYEKSQLAPRKLY#
) Tanto en la Tabla 1 como en la Tabla 2: cada letra de la secuencia representa un aminoácido designado según el código de nomenclatura de aminoácidos en una sola letra (Bioquímica Estructural, P. Louisot, Ed. AC, Ia Edición (1977), págs. 372-373); en la parte izquierda de la secuencia se sitúa el extremo amino terminal mientras que el extremo carboxi terminal está situado a la derecha de la secuencia; el código del péptido refleja la posición del resto del extremo N-terminal en la secuencia de VP2
(antes de la L) y la longitud (L) del péptido, expresada como número de restos de aminoácidos (detrás de la L) ;
*: representa un resto de Cisteína con el grupo amino acetilado; y
#: indica que el grupo carboxi del resto del aminoácido terminal está amidado. Excepto el heptadecapéptido 157L17, la longitud de los péptidos era de 15 residuos de aminoácidos, sin incluir la cisteína N-terminal que se utilizó para el acoplamiento.
Dieciséis péptidos fueron lo bastante solubles como para permitir su conjugación a KLH, mientras que otros 5 exhibieron sólo una solubilidad limitada (menor del 10%).
La síntesis de estos péptidos se realizó mediante la química de las Fmoc (Saxon Biochemical, Alemania), según el procedimiento general previamente mencionado, sobre resinas RinkR (Saxon). La síntesis se realizó bien manualmente en vasos de vidrio o en un sintetizador
Applied Biosystems 430A. Las secuencias están acetiladas en el extremo N-terminal y amidadas en el C-terminal.
Los péptidos se purificaron utilizando cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). La calidad se analizó en una columna Delta PaK 5 u C18-100A (0.39 x 15 cm) , con un controlador de gradiente modelo 680 y un detector
"diode array" modelo 991. Se utilizó un gradiente de acetonitrilo del 0 al 80% (1%/min) en agua y ácido trifluoroacético (TFA) 0.1% a 30°C y un flujo de 1 ml/min. Antes de acoplarlos a KLH, los péptidos se purificaron sobre una columna C18 Bischoff Prap 2025 de 2 x 25 cm en un equipo HPLC de Hewlett Packard, modelo 1082B y con una lectura a 225 nm. Se utilizaron gradientes de metanol con un incremento de metanol del 1% por min a un flujo de 10 mi/ min en agua y 0.1% (v/v) de ácido trifluoroacético (TFA) . Dependiendo del péptido, las concentraciones iniciales de metanol variaron entre el 0 y el 20%. El análisis de la composición de aminoácidos, se realizó de acuerdo a los procedimientos de Pico-tag (Waters).
Ejemplo 2 SÍNTESIS QUÍMICA DE PEPTIDOS D-F pτ> V STCT.B TniJ DE PEPTIDOS INMUNOGENICOS
Basados en los datos sobre la localización de epítopos B en la cápsida de PPV, se sintetizaron los 17 péptidos que se muestran en la Tabla 2.
TABLA 2
Códiσo Secuencia
-7L15 *NTNSNSMSENVEQHN#
1L15 *MSENVEQHNPINAGT#
5L16 *VEQHNPINAGTELSAT#
6L15 *EQHNPINAGTELSAT#
7L15 *QHNPINAGTELSATG#
8L15 *HNPINAGTELSATGN#
10L16 *PINAGTELSATGNESG#
13L15 *AGTELSATGNESGGG#
83L17 IHVLNSESGSAGQMVQD#
225L15 *GQSQQITDSIQTGLH#
293L20 LTEPTTEGDQHPGTLPAANTC#
346L16 YSNGGPFLTPIVPTAD#
364L15 *YNDDEPNGAIRFTMG#
380L19 *QHGHLTTSSQELERYTFNP#
408L19 QQFNQQAPLNLENTNNGTL#
427L18 *LPSDPIGGKSNMHFMNTL#
294L11/87L8 TEPTTEGDQHPNSESGSAG#
Como puede apreciarse, de los 17 péptidos sintetizados, 8 están localizados en la región amino terminal de la VP2 de
PPV, mientras que los 9 restantes están localizados en regiones internas de la VP2 de PPV. La longitud de los péptidos es variable, entre 15 y 20 residuos, sin incluir la cisteína N-terminal que se utiliza para efectuar el acoplamiento. Todos ellos fueron suficientemente solubles para permitir su conjugación a KLH. La síntesis de estos 17 péptidos se realizó mediante la química de las Fmoc, según el procedimiento general previamente mencionado, sobre resinas RinkR (Ejemplo 1). Las secuencias se obtuvieron de la proteína VP2 de PPV (Ranz et al., citado supra; Sakurai et al.. Virus Res. 13, 79-86 (1989)). Las secuencias están acetiladas en el extremo N-terminal y amidadas en el C-terminal. Algunos péptidos se purificaron según el protocolo descrito en el Ejemplo 1.
Ejemplo 3 CONJUGACIÓN DE LOS PEPTIDOS A K-LH
El acoplamiento de los péptidos purificados a la proteína portadora KLH (Calbiochem) se realizó de acuerdo a procedimientos standard utilizando m-maleimidobenzoil-N- succinimida éster (MBS) como agente de acoplamiento (Lerner et al. (1981) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78, 3403- 3407). Los pasos de diálisis se hicieron a 4°C y las otras incubaciones a temperatura ambiente. A cada mg de KLH se le añadió 1 mg de péptido tras la unión de un "linker" a la proteína y se incubó durante la noche a temperatura ambiente. A continuación, los conjugados se almacenaron bien directamente (conjugados no dializados) o dializados, con tres cambios de fosfato sódico 0.1M, pH:5.0, durante la noche contra solución salina tamponada con fosfato (PBS). Los conjugados se dividieron en alícuotas conteniendo 1 mg de KLH y se almacenaron a -20°C. Las relaciones de ug de péptido por mg de KLH oscilaron entre 82 y 304, según el péptido utilizado.
Ejemplo 4 INMUNIZACIÓN DE CONEJOS CON PEPTIDOS DE CPV Se utilizaron conejos New Zealand White para la inmunización con péptidos cara a inducir anticuerpos neutralizantes. Los conjugados péptido-KLH (no dializados) correspondientes a 1 mg de péptido en 1 mi de buffer (PBS) , se mezclaron con un volumen igual de adyuvante completo de Freund (FCA) y se inyectaron intramuscular y subcutáneamente en conejos. Tras 65 días los animales recibieron una inmunización de recuerdo con el mismo inmunógeno mezclado con adyuvante incompleto de Freund (FIA). Se hicieron sangrías a los días 0, 57, 64 y 70. Cuando los títulos en el ELISA de péptidos se incrementaron por un factor de al menos 5 tras la inmunización del recuerdo, los animales recibieron un segundo recuerdo con la misma cantidad de conjugado en FIA al día 72 y se sangraron a los días 80 y 102.
4.1 Evaluación del título de anticuerpos anti-CPV en suero de conejos.
4.I.A. ELISA especifico de virus La presencia de anticuerpos específicos para CPV en el suero de los animales inmunizados fue determinada mediante un ensayo de ELISA indirecto. Como antígeno se utilizó virus purificado. Brevemente, placas de poliestireno se recubrieron con 0.5 ug de virus en 100 ul de buffer carbonato (0.05 M, pH 9.6) a 4°C durante la noche. Las placas se lavaron con PBS (NaCl 0.15M en fosfato sódico 0.1 M pH 7.4) conteniendo 0.05% Tween-20 y se incubaron con el antisuero durante 2h a 37°C, se lavaron de nuevo y se incubaron con IgG de cabra anti-conejo marcado con biotina, durante 1 h a temperatura ambiente. Posteriormente, se incubaron con estreptavidina marcada con peroxidasa durante 30 min a temperatura ambiente. Las placas se lavaron de nuevo y la reacción se reveló con o- fenilendiamina (OPD) como sustrato para la peroxidasa, durante 10 min en oscuridad y se leyó a 450 nm en un espectrofotómetro multicanal. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 3, donde puede apreciarse que todos los conejos produjeron anticuerpos contra CPV.
4.1.B ELISA especifico de péptidos
Para determinar la presencia de anticuerpos contra los péptidos se utilizó un ensayo de ELISA indirecto. Placas de poliestireno de fondo plano se recubrieron durante la noche con 1 ug de péptido en una solución de carbonato sódico 50 mM pH 9.6 a 4°C. A continuación se añadió el primer anticuerpo, suero de conejo diluido en buffer de incubación que consistía en PBS conteniendo 4% (v/v) de suero de caballo, 1% (v/v) de Tween 80 y NaCl 0.5 M. Tras incubar durante lh a 25°C, las placas se lavaron con PBS conteniendo 0.05% (v/v) de Tween 80. A continuación las placas se incubaron con conjugados IgG-peroxidasa anti¬ conejo diluidos °° en el buffer de incubación, y se lavaron las placas como anteriormente. Por último, la reacción coloreada se formó añadiendo el sustrato tetrametilbenzidina (Aldrich) en acetato sódico 0.1M, pH 5.5 y 0.035% (V/V) de H202 durante 20 min a temperatura ambiente. La reacción se paró añadiendo 50 ul de H2S04 1.5M. La absorbancia se midió a 450 nm. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 3 donde puede observarse que todos los conejos produjeron anticuerpos contra los péptidos utilizados en su inmunización.
4.2. Neutralización de CPV "in vitro" La neutralización se determinó mediante un experimento de protección de monocapa. Brevemente, una cantidad conocida de CPV (100 unidades de HA) se incubó con antisuero de conejo a diferentes diluciones durante 2 horas a 37"c. A continuación, las muestras se inocularon sobre monocapas de células susceptibles CRFK (ATCC CCL 94) durante 90 min a 37°C. Las monocapas se cubrieron con 1 mi de agarosa al 1% en medio fresco. A los 5 días post infección se fijaron las células con formaldehído al 10% en PBS durante 20 minutos, se retiró la agarosa y las células remanentes se tiñeron con cristal violeta al 1% en etanol al 50% durante 20 minutos. El nivel de protección se evaluó por "screening" visual de las monocapas infectadas. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 3 donde puede apreciarse que los péptidos 1L15, 2L15, 3L15, 4L15, 5L15, 6L15, 7L15, 8L15 y 9L15 fueron capaces de inducir anticuerpos neutralizantes contra CPV en conejos. Los resultados globales de la inmunización de conejos con péptidos de CPV se recogen en la Tabla 3, donde se puede observar que se obtuvieron valores de neutralización comprendidos entre 1/100 y 1/3200. A la vista de estos resultados se puede concluir afirmando que la mayoría de los péptidos localizados entre los péptidos 1L15 y 7L15 inducen una respuesta de anticuerpos neutralizantes incluso más eficaz que la mezcla utilizada en la vacunación de perros. Incluso en términos absolutos, los valores de neutralización obtenidos son superiores a los obtenidos con sueros de perros naturalmente infectados. Este resultado permite concluir afirmando que los 25 restos que componen el extremo amino terminal de la VP2 de CPV constituyen una región altamente inmunogénica y que péptidos comprendidos en ella contienen el potencial antigénico necesario para la preparación de vacunas sintéticas útiles en la prevención de la parvovirosis canina, felina y de visones.
TABLA 3
PEPTIDO ELISA TITULO
REACTIVIDAD REACTIVIDAD DE ANTI-PEPTIDO ANTI-VIRUS NEUTRALIZACIÓN
-10L15 ++ +
- 5L15 ++ ++
1L15 +++ + 1/100
2L15 +++ +++ 1/1600
3L15 +++ +++ 1/2400
4L15 +++ ++ 1/200
5L15 +++ +++ 1/3200
6L15 +++ +++ 1/1600
7L15 +++ +++ 1/500
8L15 +++• +++ 1/1600
9L15 +++ +++ 1/400
11L15 + +
16L15 ++** +
91L15 +** ++
157L17 ++ +
172L15 ++" +
283L15 ++ +++
296L15 +" ++
498L15 +" +
549L15 ±" ++
570L15 + ++
Explicación de los símbolos Títulos anti-péptidos: +:<103; ++:103-105; +++:^105.
ELISA anti-virus: ±<102; +:102-103; ++:103-104; +++:^104.
**: Medida por PEPSCAN (en el resto por ELISA anti- péptido) a una dilución de suero de 1/100, ±:<0.300;
-f-:0.3-1.0 y ++:^1.0 Como se puede observar todos los conejos produjeron anticuerpos contra los péptidos respectivos que se utilizaron en la inmunización. El resultado más interesante fue el obtenido con los péptidos 1L15, 2L15, 3L15, 4L15, 5L15, 6L15, 7L15, 8L15 y 9L15 que fueron capaces de inducir anticuerpos neutralizantes, algunos de ellos, los péptidos 2L15, 3L15, 5L15, 6L15 y 8L15 a niveles similares a los obtenidos al usar virus completo como inmunógeno (>1:1600). Cualquiera de estos péptidos, o combinaciones de ellos, puede ser seleccionado para la inducción de anticuerpos neutralizantes en perros y su aplicación como vacuna.
Ejemplo 5 INMUNIZACIÓN DE PERROS
Para comprobar el efecto vacunal de los péptidos sobre los huéspedes naturales (perros) se realizó un experimento de inmunización que incluyó infección posterior con el mismo virus. Como animales de experimentación se utilizaron tres perros Beagle SPF (libres de patógenos específicos). Dos de los perros (identificados como 3029 y 3030) se inmunizaron con una mezcla a partes iguales de los péptidos 1L15 y 7L15 conjugados por separado a KLH. La mezcla o "cocktail" de inmunización (2.5 mi de volumen total) contenía 1 mg de cada uno de los péptidos acoplados a KLH adsorbidos sobre geles de alúmina y adyuvantados con QuilA (25 ¿ig/perro) . El calendario de vacunación fue como sigue: la primera dosis se dio a día 0, 4 semanas más tarde se les dio una dosis de recuerdo. A las diez semanas se realizó el experimento de descarga de virus virulento, permaneciendo en observación durante 2 semanas más. El perro que se utilizó como control negativo (identificado como 3025) recibió una mezcla buffer (PBS)/adyuvante sin conjugado. Los perros se sangraron los días 0, 15, 29, 36, 43, 50, 57, 64, 71 y cada tres días desde la realización de la descarga hasta el fin del experimento. Para la descarga se utilizaron heces de un perro que había muerto como consecuencia de una infección por parvoviruε y que contenía virus virulento. Las heces se homogeneizaron en medio de cultivo estéril y el virus se extrajo con cloroformo. Este material se aplicó en torundas oronasales sobre los perros en el momento de la infección. La presencia de CPV en estas heces se había comprobado por técnicas de hemaglutinación y de cultivos celulares. Se evaluó el título de anticuerpos anti-CPV en el suero de los perros mediante: a) ELISA es ecifico de virus
Se siguió el protocolo descrito en el apartado 4.1.A anterior pero utilizando antisueros de perros como primer anticuerpo e incubando las placas que contenían dichos antisueros con Proteína A marcada con peroxidasa durante 1 hora a temperatura ambiente. La reacción se reveló con OPD y se leyó a 450 nm en un espectrofotómetro multicanal. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 1 donde puede apreciarse que al cabo de unos 15 días post-la vacunación, los sueros de los animales inmunizados (perros 3029 —jΔ,— y 3030 —-0— ) contenían altos títulos de anticuerpos anti-CPV, manteniéndose relativamente constantes tras la 2a inmunización (4a semana). Posteriormente, tras el experimento de descarga de virus virulento se produjo un ligero aumento en el título de anticuerpos contra CPV en los perros inmunizados y la muerte del perro control (perro 3025 —-Q—) al cabo de 6 días.
b) ELISA especifico de péptidos
Se repitió el protocolo descrito en el ejemplo 4.1.B pero como primer anticuerpo se añadió suero de los perros a evaluar diluido en el buffer de incubación. Las placas se incubaron posteriormente con conjugados IgG-peroxidasa anti-perro diluidos 1/100 en el buffer de incubación y finalmente la reacción coloreada se formó añadiendo tetrametilbenzidina, se paró con H2S04 y se midió la absorbancia a 450 nm.
Los resultados obtenidos se muestran en la figura 2 donde puede apreciarse que los perros inmunizados (3029 y 3030) produjeron anticuerpos que reconocían los péptidos 1L15 [-A-i3029) y -0-- (3030)] y 7L15 [-±-(3029) y -• - (3030)] mientras que el suero del perro control negativo (3025) no contenía anticuerpos que reconocían a los péptidos 1L15 (~ 3--) ni 7L15 ( B ) » Tras la descarga de virus virulento el perro control (3025) murió, mientras que los sueros de los perros inmunizados aumentaron ligeramente su contenido en anticuerpos que reconocían a los péptidos 1L15 y 7L15.
c) Neutralización de CPV "in vitro"
Se siguió el protocolo descrito en el ejemplo 4.2 pero el CPV se incubó con antisuero de los perros (3025, 3029 y 3030) a diferentes diluciones. Tras inocular las muestras sobre monocapas de células CRFK y continuar el protocolo anteriormente citado se obtuvieron los resultados que se muestran en la figura 3 donde puede apreciarse que los perros inmunizados (3029 —- —y 3030 O-—) produjeron anticuerpos neutralizantes a niveles similares a los obtenidos usando virus completo como inmunógeno (aproximadamente 1:1000). Por el contrario, el perro control (3025 —g— ) no produjo en ningún momento anticuerpos neutralizantes.
d) Determinación de CPV en heces de perros
Se determinó la presencia de CPV en heces de perros inmunizados mediante un ensayo de ELISA de doble anticuerpo (ELISA-DAS) según la metodología descrita por Rimmelzwaan et al (Vet. Quart. , 1990, 12, 14-20). Los resultados obtenidos se muestran en la figura 4 donde puede apreciarse que las heces de los perros inmunizados (3029 — —y 3030 --Q—) no contenían prácticamente CPV mientras que, por el contrario, las heces del perro control (3025—g—) contenían altos niveles de CPV después de la descarga de virus virulento.
e) Evaluación clínica
Junto a los datos serológicos previamente descritos se realizó un seguimiento clínico del curso de la enfermedad, registrándose fdiariamente la temperatura y signos externos. Asimismo, las heces de los animales se recolec¬ taron diariamente. Clínicamente, se observó que los animales inmunizados con los péptidos 1L15 y 7L15 (perros 3029 y 3030) no mostraron en ningún momento síntomas aparentes de la enfermedad, mientras que el perro control (3025) moría a los 6 días, mostrando todos los síntomas característicos de una parvovirosis (diarrea, sangre en las deposiciones y presencia de CPV) . Los dos perros inmunizados desarrollaron altos títulos de anticuerpos anti-péptido y anti-CPV, incluyendo una alta actividad neutralizante que alcanzó un máximo a la semana 5 (Fig. 3), siguiente a la Ia inmunización. La dosis de recuerdo no reforzó el título de anticuerpos. El perro control permaneció negativo durante el periodo de vacunación. Después de la descarga oronasal con CPV, los dos perros vacunados permanecieron sanos durante el periodo completo.
Ejemplo 6 INMUNIZACIÓN DE VISONES
Debido a la estrecha homología entre CPV, FPLV y MEV, se realizó este experimento de inmunización de visones al objeto de comprobar experimentalmente la eficacia de estos nuevos péptidos en el diseño de vacunas contra MEV.
6.a Inmunización Se utilizaron tres grupos de visones (genotipo A/A) , seronegativos para el virus de la enfermedad de las Aleutianas y el virus de la enteritis de los visones (MEV). El grupo 1 (noβ 1-6) fueron vacunados con 0.5 mg del péptido 1L15 acoplado a 0.5 mg de KLH más 0.5 mg del péptido 7L15 acoplado a 0.5 mg de KLH, utilizándose como adyuvante 50 ug de ISCOM matrix, todo ello en un volumen final de 1 mi de PBS (pH: 7.2>. El grupo 2 (n°" 7-12) sólo recibió 1 mi de PBS (pH: 7.2). El grupo 3 (noβ 13-18) recibió una vacuna convencional (BIOVACR, United, DK) basada en virus inactivado, que se administró siguiendo las recomendaciones del fabricante. Todos los visones recibieron una única dosis vacunal subcutánea y fueron sangrados inmediatamente antes de la vacunación.
6.b Descarga (challenge)
A los 21 días de la vacunación se tomaron muestras de sangre y se dejó a los visones en ayunas durante 24 h. A continuación se infectaron por ruta oronasal utilizando 0.8 mi de un homogeneizado intestinal de visones que sufrían infección aguda por MEV, al 25%. Diariamente se chequearon muestras fecales de todos los visones para la detección de MEV, utilizando un ELISA basado en antisueros específicos de conejos. Los animales del grupo 2 (controles negativos) secretaron cantidades masivas de virus a los días 5, 6 y 7 después de la descarga. Todos ellos fueron sacrificados indoloramente en estado moribundo a causa de una severa enfermedad. Los otros dos grupos de visones no secretaron virus en las heces. Tan sólo un visón del grupo 1 mostró una pequeña indicación de virus el día 6, aunque todos los animales fueron clínicamente normales, libres de diarrea y mantuvieron buen apetito a lo largo del experimento. El virus secretado por el grupo control fue extraído de las muestras fecales positivas y sometido a microscopía inmunoelectrónica, confirmándose la presencia de un gran número de partículas de MEV.
6.c Determinación de anticuerpos neutralizantes
Todos los sueros de los visones se chequearon para su actividad neutralizante contra MEV cultivado en células CRFK. El virus no neutralizado fue detectado mediante la técnica de la inmunoperoxidasa utilizando placas microtiter conteniendo células CRFK infectadas con 100 DICTBO (dosis infectiva en cultivo de tejido 50%) de MEV, infectadas durante 4 días y fijadas (M. Holm-Jensen, Acta Vet. Scand. , 22:85-98 (1981)). Posteriormente se incuba a 37BC durante 1 h con un anticuerpo ligado a peroxidasa y se revela. Los títulos obtenidos se muestran en la Tabla 4. El título del punto final se expresó como la inversa de la dilución de suero más alta que neutralizaba la infección del virus en la monocapa de células. A los 21 días posteriores a la vacunación, los grupos que habían recibido la vacuna comercial mostraban buenos títulos de neutralización (> 31ogl0). Los animales control y el grupo vacunado con la vacuna peptídica no mostraron anticuerpos neutralizantes en el ensayo "in vitro", lo que indica que se puede conseguir una protección completa contra la enfermedad, inducida por un péptido sintético, sin la inducción de anticuerpos neutralizantes "in vitro". Se puede especular con que la protección puede ser debida bien a la inhibición de un sitio de unión celular por los anticuerpos al péptido o a la inducción de un mecanismo mediado por células. Dos semanas después de la descarga todos los visones presentaban anticuerpos neutralizantes frente a MEV. En conclusión, se puede afirmar que con una vacuna sintética basada en los péptidos de esta invención se puede obtener una sólida protección de visones y, por tanto, pueden ser también formulados en la preparación de una vacuna efectiva. TABLA 4
Visón Título (loglO) Título (loglO)
[21 días post-] [1 4 días post vacunación] descarga]
1 <1.0 2.7
2 <1.0 3.1
3 <1.0 3.0
4 <1.0 >3.1
5 <1.0 >3.1
6 <1.0 3.1
7 <1.0 3.1
8 <1.0 >3.1
9 <1.0 >3.1
10 <1.0 >3.1
11 <1.0 >3.1
12 <1.0 3.0
13 >3.1 >3.1
14 >3.1 >3.1
15 >3.1 >3.1
16 >3.1 >3.1
17 >3.1 >3.1
18 >3.1 >3.1
Ejemplo 7 INMUNIZACIÓN DE CONEJOS CON PBPTIPOS DE PPV
Se utilizaron conejos New Zealand White para la inmunización con péptidos cara a inducir anticuerpos neutralizantes. Los conjugados péptido-KLH correspon¬ dientes a 1 mg de péptido en 1 mi de buffer (PBS), se mezclaron con un volumen igual de adyuvante completo de Freund (FCA) y se inyectaron intramuscular y subcutáneamente en conejos. Tras 42 días los animales recibieron una inmunización de recuerdo con el mismo inraunógeno mezclado con adyuvante incompleto de Freund (FIA). Se hicieron sangrías a los días 0, 39, 50 y 71. 7.1 Western Blot (inmunoblot)
Para determinar la especificidad de los anticuerpos inducidos por los péptidos en los conejos se utilizó un ensayo de Western Blot. Para ello, PPV completo purificado se corrió en un gel del 10% de poliacrilamida-SDS (dodecilsulfato sódico) en las condiciones habituales (Laemli, U.K., Nature 227:680-685 (1970). A continuación, las proteínas se transfirieron a filtros de PVDF (di¬ fluoruro de polivinilideno) (Millipore, EEUU), utilizando un aparato semiseco (KEM-En-Tec, DK) y la inmunotinción se llevó a cabo según técnicas establecidas (Burnette, W.N., Anal. Biochem. , 112:195-203 (1981); De Blas D.L. et al.. Anal. Biochem., 133:214-219 (1983). Brevemente, los filtros se bloquearon en una solución conteniendo 10% de suero fetal de ternera y 1% de seroalbúmina bovina (BSA) durante 30 minutos. A continuación se añadió suero de conejo anti-PPV, diluido 1:100, durante 2 h a temperatura ambiente y durante la noche a 5BC. Posteriormente se lava tres veces y, por último, se incuba durante 2 h con anti- IgG de conejo marcada con peroxidasa (Dako P217, DK) diluida 1:500. Como cromógeno se utilizó o-dianisidina. Los resultados indicando la reactividad con las proteínas estructurales se muestran en la Tabla 5.
7.2 Neutralización de PPV πin vi ro"
Diluciones dobles seriadas de cada suero, inactivados a 56aC durante 30 min, se prepararon en medio esencial mínimo de Eagle (Eagle's MEM) . Posteriormente, 50 ul de cada dilución se mezcló con 100-300 DICTso de la cepa danesa 893 de PPV (SVIV, Lindholm) en 50 ul de medio Eagle y se dejó incubar durante 60 min a 372C. A continuación, cada dilución se mezcló, en una placa de 96 pocilios, con 2000 células primarias de riñon de cerdo en 50 mi de medio Eagle's MEM y suero fetal de ternera hasta una concentración final del 7% y se dejó incubar durante 4-5 días a 37EC.
Las placas se tiñeron utilizando un ensayo de inmuno peroxidasa en monocapa, utilizando un suero anti-PPV porcino, inmuno globulina de conejo anti cerdo unida a peroxidasa y tinción con amino-etil-carbazol, siguiendo protocolos convencionales (Holm-Jensen citado supra). El título del punto final se expresó como la inversa de la dilución de suero más alta que neutralizaba la infección del virus en la monocapa de células.
Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 5 donde puede apreciarse que los péptidos 1L15, 5L16, 6L15, 8L15, 10L16 y 13L15 fueron capaces de inducir anticuerpos neutralizantes contra PPV en conejos.
TABLA 5
ANTISUEROS CONTRA EL WESTERN BLOT NEUTRALIZACIÓN PEPTIDO
-7L15 1L15 VP1,VP2 +
5L16 VP1,VP2 +
6L15 VP1,VP2 +
7L15
8L15 VP1,VP2 + 10L16 VP1,VP2 +
13L15 VP1,VP2,VP3 +
83L17 VP1,VP2,VP3 -
225L15 VP1,VP2,VP3 -
293L20 VP1,VP2,VP3 - 346L16 VP1,VP2,VP3 -
364L15 VP2,VP3 -
380L19 VP1,VP2,VP3 -
408L19 VP1,VP2,VP3 -
427L18 VP1,VP2,VP3 - 294L11/87L8 VP1,VP2,VP3 - Explicación de los símbolos: NEUTRALIZACIÓN: -:<2; + : 2-20.
Como se puede observar, todos los conejos produjeron anticuerpos contra las proteínas de la cápsida de PPV, como se pudo determinar por Western Blot. El resultado más interesante fue el obtenido con los péptidos 1L15, 5L16, 6L15, 8L15, 10L16 y 13L15 que fueron capaces de inducir anticuerpos capaces de neutralizar PPV "in vitro". Estos péptidos fueron seleccionados para la inducción de anticuerpos neutralizantes en cerdos y su aplicación como vacuna.
Ejemplo 8 INMUNIZACIÓN DE CERDOS Para comprobar la inmunogenicidad de los péptidos sobre el animal huésped se utilizó como ejemplo el péptido denominado 5L16 (Tabla 2).
Tres cerdos "mini pig" Góttingen, seronegativos para PPV, fueron vacunados, cada uno, con 1 mg de péptido 5L16 acoplado a a 1 mg de KLH. Como adyuvante se utilizó ISCOM
Matrix (500 jxg) y la muestra se llevó hasta 2 mi con PBS.
Los cerdos fueron vacunados dos veces con tres semanas de intervalo. Las muestras de suero se obtuvieron a los días
0, 25 y 36.
8.a Ensayo ELISA contra PPV
Se adsorbieron viriones de PPV a placas de poliestireno de fondo plano (Nunc) . A continuación se añadieron a las placas diluciones seriadas (factor 2) de los sueros de cerdo y se incubaron a 37aC durante 1 h. Las placas se lavaron y se añadió suero de conejo anti-IgG de cerdo conjugada a peroxidasa. Posteriormente se incubó durante
30 min a 37aC y se tiñó con OPD.
Los tres minicerdos fallaron a mostrar título de anticuerpos anti-PPV en los días 0 y 25. Ahora bien, a día 36 (10 días después de la revacunación) se habían desarrollado títulos significativos, aunque bajos (Tabla 6), indicando que la vacuna peptídica es capaz de inducir anticuerpos en cerdos que reconocen el epítopo en viriones purificados de PPV.
TABLA 6
Minicerdo ng Titulo día 0 Título día 25 Titulo día 36
284 28 35 130 283 21 43 226
280 28 31 1194
8.b Análisis por Western Blot
Se efectuó un análisis por Western Blot para analizar la reactividad y especificidad, contra los distintos protómeros del virus, de los sueros procedentes de los tres minicerdos inmunizados.
El procedimiento seguido para chequear la reactividad por
Western Blot fue análogo al utilizado en el Ejemplo 7.1, con ligeras modificaciones. El buffer de bloqueo contenía caseína al 1% en vez de suero fetal de ternera y albúmina.
Como conjugado se utilizó suero de conejo anti-IgG de cerdo marcada con peroxidasa (Dako P164).
Los resultados indicaron una reacción muy fuerte contra VPl y VP2 tras las dos inmunizaciones. Estos resultados confirman la gran inmunogenicidad de estos péptidos, lo que confirma su utilidad para la formulación de nuevas vacunas sub-unidad contra PPV.
Ejemplo 9 FORMULACIÓN DE UNA VACUNA
Pueden prepararse vacunas capaces de proteger perros, gatos, visones y cerdos de la infección causada por CPV, FPLV, MEV y PPV respectivamente, que contienen uno o más de los péptidos correspondientes proporcionados por esta invención acoplados a una proteína o estructura multimérica portadora o bien en forma de un complejo inmunogénico o en forma de una proteína recombinante inmunogénica, junto con un diluyente inmunológicamente aceptable tal como una solución salina tamponada a pH fisiológico, más un adyuvante tal como Alhydrogel en combinación con QuilA (25 ug/animal). Una única inyección puede ser suficiente para conferir protección a los animales frente a la enfermedad aunque, en algunos casos, según la evaluación del título de anticuerpos, puede resultar conveniente utilizar una 2a dosis de recuerdo.
Traducción de las leyendas de las figuras Figuras 1 y 3 (a) logaritmo del título (b) días
(c) perro control (3025)
(d) perro vacunado (3029)
(e) perro vacunado (3030)
(f) Ia inmunización (g) 2a inmunización
(h) descarga de virus virulento Figura 2
(a) logaritmo del título
(b) días (c) perro 3025, péptido 1L15
(d) perro 3029, péptido 1L15
(e) perro 3030, péptido 1L15
(f) perro 3025, péptido 7L15
(g) perro 3029, péptido 7L15 (h) perro 3030, péptido 7L15
(i) Ia inmunización (j) 2a inmunización (k) descarga de virus virulento Figura 4 (a) Absorbancia x 1000 (450 nm) (b) días
(c) perro control (3025)
(d) perro vacunado (3029)
(e) perro vacunado (3030)
(f) Ia inmunización
(g) 2a inmunización
(h) descarga de virus virulento
LISTADO DE SECUENCIAS
INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA IDENTIFICADA NB: 1: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 25 Aminoácidos TIPO: Aminoácidos TOPOLOGÍA: Lineal ii) TIPO DE LA MOLÉCULA: Péptido v) TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal vi) FUENTE ORIGINAL:
ORGANISMO: Parvovirus canino (CPV) CEPA: Tipo 2 xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Na : 1 Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg
1 5 10 15
Asn Glu Arg Ala Thr Gly Ser Gly Asn 20 25
INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA IDENTIFICADA Ne : 2 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 25 Aminoácidos TIPO: Aminoácidos TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE LA MOLÉCULA: Péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal (vi) FUENTE ORIGINAL:
ORGANISMO: Parvovirus porcino (PPV) CEPA: NADL-2 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Na : 2 Met Ser Glu Asn Val Glu Gln His Asn Pro lie Asn Ala Gly Thr Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ala Thr Gly Asn Glu Ser Gly 20 25

Claims

REIVINDICACIONES
1. Péptidos sintéticos, inmunogénicos, útiles para formular vacunas sintéticas contra parvovirus autónomos.
2. Péptidos según la reivindicación 1 que comprenden los 25 primeros restos de aminoácidos de la región amino terminal de la VP2 de dichos parvovirus autónomos o un fragmento de dicha región.
3. Péptidos según la reivindicación 2, comprendidos en la secuencia SEQ. ID. Na 1 o equivalentes a los de dicha SEQ. ID. Na 1 que resulten de la sustitución de unos aminoácidos por otros funcionalmente equivalentes o de la delección o inserción de algunos de dichos aminoácidos siempre y cuando los péptidos resultantes sean capaces de proteger perros, gatos y visones de la infección causada por CPV, FPLV y MEV, respectivamente.
4. Péptidos según la reivindicación 2, comprendidos en la secuencia SEQ. ID. NB 2 o equivalentes a los de dicha SEQ. ID. NB 2 que resulten de la sustitución de unos aminoácidos por otros funcionalmente equivalentes o de la delección o inserción de algunos de dichos aminoácidos siempre y cuando los péptidos resultantes sean capaces de proteger cerdos de la infección causada por PPV.
5. Una composición inmunogénica que comprende un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en forma inmunogénica.
6. Una composición según la reivindicación 5, que comprende un conjugado inmunogénico de una proteína y un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
7. Una composición según la reivindicación 5, que comprende un complejo inmunogénico formado por entrecruzamiento de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
8. Una composición según la reivindicación 5, que comprende un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 obtenido utilizando técnicas de Ingeniería Genética y expresión en microorganismos.
9. Una vacuna que comprende una composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 en combinación con un adyuvante inmunológico.
10. Vacuna sintética capaz de proteger animales de la infección causada por parvovirus autónomos, que comprende: a) al menos, un péptido sintético contenido dentro de la región amino terminal de la VP2 de dichos parvovirus autónomos, acoplado a una proteína o estructura multimérica portadora adecuada, y b) un diluyente inmunológicamente aceptable y un adyuvante.
11. Una vacuna según la reivindicación 10 que comprende un péptido comprendido dentro de los 25 primeros restos de aminoácidos de la región amino terminal de la VP2 de dichos parvovirus autónomos.
12. Una vacuna según la reivindicación 10, adecuada para proteger de la infección causada por un parvovirus autónomo seleccionado del grupo formado por parvovirus canino (CPV), el virus de la enteritis de los visones (MEV) , el virus de la panlucopenia felina (FPLV), parvovirus porcino (PPV), parvovirus bovino (BPV) , el parvovirus B19 humano u otro parvovirus autónomo.
13. Una vacuna según la reivindicación 10 que comprende, al menos, un péptido comprendido en la secuencia SEQ. ID. Na 1 o en un fragmento de la misma, o un péptido equivalente a los de dicha SEQ. ID. NB 1 que resulten de la sustitución de unos aminoácidos por otros funcionalmente equivalentes o de la delección o inserción de algunos de dichos aminoácidos siempre y cuando los péptidos resultantes sean capaces de proteger perros, gatos y visones de la infección causada por CPV, FPLV y MEV respectivamente.
14. Una vacuna según la reivindicación 10 que comprende, al menos, un péptido comprendido en la secuencia SEQ. ID. NB 2 o en un fragmento de la misma, o un péptido equivalente a los de dicha SEQ. ID. Na 2 que resulten de la sustitución de unos aminoácidos por otros funcionalmente equivalentes o de la delección o inserción de algunos de dichos aminoácidos siempre y cuando los péptidos resultantes sean capaces de proteger cerdos de la infección causada por PPV.
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