BRPI0619089A2 - partìculas virais de plantas e métodos para a inativação da mesma - Google Patents

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Abstract

PARTìCULAS VIRAIS DE PLANTAS E MéTODOS PARA A INATIVAçãO DA MESMA. A presente invenção refere-se aos vírus de plantas, produzidos por plantas, para uso como vacinas e similares. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a métodos de inativação simples, e partículas virais de plantas obtidas, desta maneira. A invenção descrita no presente documento proporciona meios e métodos para produzir uma vacina segura baseada em uma exibição de epitopos derivados de um agente patogênico sobre as superfícies de partículas similares a vírus de plantas inativado. Essa invenção ensina a inativação de partículas virais de plantas quiméricas e a integração da etapa de inativação no procedimento de purificação de partícula viral. O método de inativação torna o vírus incapaz de infectar plantas e a integridade de partículas virais é mantida.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PARTÍCU- LAS VIRAIS DE PLANTAS E MÉTODOS PARA A INATIVAÇÃO DA MES- MA".
DIREITOS GOVERNAMENTAIS
Esta invenção foi realizada em parte com suporte do governo sob Grant N5 1U01AI054641-01 outorgada pelo Instituto Nacional de Saúde. O governo tem certos direitos nesta invenção.
REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS DE DEPÓSITO CORRELATOS
Este pedido reivindica a prioridade de Pedido Provisório N0 de Série U.S. 60/742.197, depositado em 2 de dezembro de 2005, cuja descri- ção está incorporada à guisa de referência em sua totalidade. CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se geralmente a vírus de plantas, produzidos por plantas, para uso como vacinas e similares. Mais especifi- camente, a presente invenção refere-se a métodos de inativação de vírus e a partículas virais de plantas como vacinas e similares. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
A vacinação pode proteger indivíduos e todas as populações de agentes infecciosos. O desenvolvimento seguro e eficaz de vacinas, entre- tanto, nem sempre é fácil devido a inúmeros motivos que variam de identifi- cação de antígenos eficazes a preocupações de segurança com vacinas desenvolvidas. O uso de vírus como veículos de peptídeos estranhos foi ex- plorado no campo de vacinas virais de compósito. Tais vacinas são à base de vírus quiméricos, que são híbridos de componentes virais diferentes de animais. Geralmente, o componente principal de tais híbridos é derivado de um vírus que é ou se tornou inócuo, e o menor componente é um compo- nente antigênico de um vírus patogênico. Por exemplo, um poxvírus, tal co- mo, varíola ou um poliovírus atenuado pode ser usado como um vetor para componentes imunogênicos de outros vírus animais inclusive vírus huma- nos.
Entretanto, tais técnicas conforme discutido acima podem ser desvantajosas. Tais vacinas são produzidas a partir de vírus desenvolvidos em sistemas de cultura celular, que podem ser onerosos de se criar e execu- tar. A abordagem de vírus de compósito envolve a manipulação genética de vida, vírus infectante de animais, com o risco de causar mutações para no- vas formas do vírus com infecciosidade, antigenicidade e/ou patogenicidade alterada. Ademais, o vírus animal usado como o vetor pode ser um vírus ao qual o animal já pode ter sido exposto, e o animal já pode estar produzindo anticorpos ao vetor. Desta maneira, o vetor pode ser destruído pelo sistema imune antes de o sítio antigênico incorporado do segundo vírus induzir uma resposta imune.
Inúmeros métodos foram usados para a inativação de vírus em mamíferos. Esses incluem: radiação UV, radiação UV/psoraleno, produtos químicos à base de Pentose, Microondas, Formalina, BPL, pH, temperatura, e incubação em cloreto de amônio. A radiação UV foi usada para inativar vírus de plantas recombinantes. Veja, por exemplo, Langeveld et al. (2001) "Inactivated Recombinant Plant Vírus Protects Dogs from a Lethal Challenge with Canine Parvovirus", Vaccine 19:3661-3670.
As patentes que refere-sem a métodos para produzir as partícu- las e ao uso das partículas, particularmente como vacinas incluem Patente U.S. Ne 6.110.466, que discute partículas montadas de um vírus de planta que contém um peptídeo estranho predeterminado como parte da proteína capsidial do vírus e a Patente N° U.S. 6.884.623 que discute as partículas montadas de um vírus de planta que contém um inserto peptídico estranho na proteína capsidial do vírus, onde o sítio do inserto é, de preferência, isen- to de repetições diretas de seqüência que flanqueiam o inserto.
A Patente U.S. N° 5.602.242 refere-se a vírus de RNA recombi- nante para encapsidação de seqüências virais geneticamente engenheira- das em capsídeos heterólogos, de preferência, com capa em formato de bastão. Esta patente também refere-se a métodos para produzir e utilizar tais vírus recombinantes, especificamente com relação à transfecção de plantas para realizar alterações genotípicas e fenotípicas nas plantas. Meios para deletar ou inativar genes de proteína capsidial viral estão descritos em Ahlquist et al. (1981) "Complete Nucleotide Sequence of Brome Mosaic Vi- rus RNA3" J. Mol. Biol. 153:23-38.
Burge et al., "Effect of Heat on Vírus Inactivation by Ammonia", Appl. Environ. Microbiology, Aug 46(2):446-51, 1983, discute o efeito do ca- lor sobre a inativação do vírus com cloreto de amônio. O bacteriófago f2 e poliovírus 1 (um vírus de mamífero envelopado) foram estudados. Tempera- turas acima de 40°C foram consideradas prejudiciais ao vírus testado no presente documento. Cramer WN1 et al. "Kinetics of vírus inactivation by ammonia", Appl Environ Microbiology, Mar 45(3):760-5, 1983, como Burge et al., usaram cloreto de amônio, em uma faixa de pHs, para tratar a rede de esgotos em uma tentativa de inativar os vírus. Novamente, o bacteriófago f2 e poliovírus 1 (cepa CHAT) foram estudados. Os resultados deste testes são registrados para mostrar que a taxa de inativação do poliovírus foi muito menos influenciada, se de alguma forma, pelo efeito de concentração de NH4+ do que a taxa de inativação de f2. O documento discute possíveis apli- cações da metodologia de plantas em tratamento de esgoto como uma pos- sível alternativa de cloro, particularmente elementos do grupo enterovírus.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção inclui métodos para inativar um vírus de planta através da administração de sulfato de amônio em um material vege- tal selecionado do grupo que consiste em plantas, tecido vegetal, células vegetais e protoplastos em um pH acima de 8,0 para produzir uma partícula similar ao vírus inativado (VLP); incubar o material vegetal durante pelo me- nos dez horas; e então colher a VLP inativada do material vegetal. Esses métodos podem incluir a incorporação de um peptídeo estranho no vírus. O vírus pode estar em um vírus RNA não-envelopado. A VLP inativada pode apresentar um peptídeo um peptídeo bioativo heterólogo. O sulfato de amô- nio é administrado a uma concentração de 0,5M a 1,0M, geralmente a 0,7M.
O pH é geralmente 9,0 e o material vegetal pode ser incubado em tempera- tura ambiente. A VLP é não-infecciosa, devido ao fato de esta ser desprovi- da de ao menos uma parte de RNA presente no vírus de planta. Adicional- mente, essa não pode iniciar a infecção mediante inoculação e é incapaz de se replicar. A presente invenção também pode incluir a inativação de partí- culas virais de plantas quiméricas e a integração da etapa de inativação no procedimento de purificação de partícula viral. O método de inativação torna o vírus incapaz de infectar as plantas. A integridade da partícula viral é man- tida ao mesmo tempo em que o RNA genômico viral infeccioso que está presente dentro da partícula viral é destruído. Esses métodos podem ser representados em escala e podem ser integrados no processo de purifica- ção.
A presente invenção também inclui métodos para produzir uma VLP não-infecciosa através da administração de sulfato de amônio no mate- rial vegetal selecionado do grupo que consiste em plantas, tecidos vegetais, células vegetais e protoplastos e é desprovido de ao menos uma parte do RNA presente em um vírus de planta em um pH acima de 8,0; incubar o ma- terial vegetal durante pelo menos dez horas; e colher a VLP inativada do material vegetal, onde a VLP não é capaz de se replicar.
Adicionalmente, as modalidades da presente invenção podem incluir uma vacina, onde a vacina inclui um vírus e esse inclui um peptídeo estranho incorporado no vírus e a vacina é produzida através de um método que compreende administrar sulfato de amônio no material vegetal selecio- nado do grupo que consiste em plantas, tecidos vegetais, células vegetais e protoplastos em um pH acima de 8,0 para produzir uma VLP inativada; incu- bar o material vegetal durante pelo menos dez horas; e então, colher a VLP inativada do material vegetal. O peptídeo de VLP apresentado pode obter uma resposta imune quando a VLP for administrada em um mamífero. A vacina pode ser usada para vírus da gripe, vírus da encefalite eqüina do les- te, parvovirose canina, ou Bacillus anthracis. Adicionalmente, a vacina pode ser uma vacina de subunidade, onde o peptídeo é uma parte de um antíge- no e a parte é eficaz como uma vacina.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A Figura 1 mostra o RNA extraído de um vírus ativo PA10 e um vírus inativado PA10 executado em 1,2 % de gel agarose colorido com bro- meto de etídio que ilustra o RNA genômico do CPMV 1 e 2 no vírus ativo e RNA degradado na preparação de vírus inativo.
A Figura 2 ilustra um cromatograma AIEC de PA7E.
As Figuras 3 a 5 mostram a inativação de RNA por PA9, PA11 e PA18.
A Figura 6 mostra o gel SDS-PAGE de uma análise de estabili- dade de temperatura realizada em 5 dias por PA1S.
A Figura 7 ilustra anticorpos anti-PA em macacos imunizados com CPMV-PA conforme detectado por ELISA.
A Figura 8 mostra anticorpos anti-PA (IgG) em soro e lavado brônquico no 1402 dia.
BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQÜÊNCIAS
SEQ ID NO:1 é a seqüência peptídica do Epitopo PA1 usado de acordo com o Exemplo 3 da presente invenção.
SEQ ID N0:2 é a seqüência peptídica do Epitopo PA2 usado de acordo com o Exemplo 3 da presente invenção.
SEQ ID NO:3 é a seqüência peptídica do Epitopo PA3 usado de acordo com o Exemplo 3 da presente invenção.
SEQ ID N0:4 é a seqüência peptídica do Epitopo PA3E usado de acordo com o Exemplo 3 da presente invenção.
SEQ ID NO:5 é a seqüência peptídica do Epitopo PA4 usado de acordo com o Exemplo 3 da presente invenção.
SEQ ID N0:6 é a seqüência peptídica do Epitopo PA5 usado de acordo com o Exemplo 3 da presente invenção.
SEQ ID N0:7 é a seqüência peptídica do Epitopo PA6 usado de acordo com o Exemplo 3 da presente invenção.
SEQ ID N0:8 é a seqüência peptídica do Epitopo PA7 usado de acordo com o Exemplo 3 da presente invenção.
SEQ ID N0:9 é a seqüência peptídica do Epitopo PA7E usado de acordo com o Exemplo 3 da presente invenção.
SEQ ID N0:10 é a seqüência peptídica do Epitopo PA8 usado de acordo com o Exemplo 3 da presente invenção.
SEQ ID N0:11 é a seqüência peptídica do Epitopo PA9 usado de acordo com o Exemplo 3 da presente invenção.
SEQ ID ΝΟ.Ί2 é a seqüência peptídica do Epitopo PA10 usado de acordo com o Exemplo 3 da presente invenção.
SEQ ID N0:13 é a seqüência peptídica do Epitopo PA11 usado de acordo com o Exemplo 3 da presente invenção.
SEQ ID N0:14 é a seqüência peptídica do Epitopo PA12 usado de acordo com o Exemplo 3 da presente invenção.
SEQ ID N0:15 é a seqüência peptídica do Epitopo PA13 usado de acordo com o Exemplo 3 da presente invenção.
SEQIDN0:16 é a seqüência peptídica do Epitopo PA14 usado de acordo com o Exemplo 3 da presente invenção.
SEQ ID NO:17 é a seqüência peptídica do Epitopo PA15 usado de acordo com o Exemplo 3 da presente invenção.
SEQ ID NO:18 é a seqüência peptídica do Epitopo PA16 usado de acordo com o Exemplo 3 da presente invenção.
SEQ ID NO: 19 é a seqüência peptídica do Epitopo PA17 usado de acordo com o Exemplo 3 da presente invenção.
SEQ ID N0:20 é a seqüência peptídica do Epitopo PA18 usado de acordo com o Exemplo 3 da presente invenção.
SEQ ID NO:21 é a seqüência peptídica do Epitopo PA19 usado de acordo com o Exemplo 3 da presente invenção.
SEQ ID NO:22 é a seqüência peptídica do Epitopo PA20 usado de acordo com o Exemplo 3 da presente invenção.
SEQ ID NO:23 é a seqüência de aminoácido do antígeno protetor (PA) da presente vacina contra antraz.
SEQ ID NO:24 é a seqüência de aminoácido do epitopo M2e do vírus da gripe.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção será descrita agora de forma mais completa a seguir com referência às figuras em anexo, onde as modalidades da in- venção são mostradas. Esta invenção pode ser, entretanto, incorporada de diversas formas diferentes e não deve ser interpretada como limitadora das modalidades apresentadas.
A presente invenção refere-se em parte a novos métodos de inativação de vírus para preparar novas partículas similares a vírus de plan- tas para uso como vacinas e similares. Métodos para inativação de vírus são descritos no presente documento. A presente invenção proporciona exem- plos de inativação de partículas virais de plantas quiméricas e da integração da etapa de inativação no procedimento de purificação de partícula viral. O método de inativação torna o vírus incapaz de infectar plantas. As modalida- des da presente invenção podem incluir meios e métodos para produzir uma vacina segura baseada em uma exibição de epitopos derivados de um agen- te patogênico sobre a superfície de partículas similares a vírus de plantas inativado.
As modalidades da presente invenção incluem um procedimento eficaz e representado em escala para inativação de vírus para produzir par- tículas similares a vírus (VLPs) que são desprovidas do genoma infeccioso completo do vírus. Tais modalidades incluem utilizar um tampão de sulfato de amônio, geralmente em pH 9, como o tampão de extração inicial. O sulfa- to de amônio está referido como não-tóxico e aceitável pelas autoridades reguladoras.
As modalidades da presente invenção incluem a inativação viral com sulfato de amônio em uma faixa de pH de aproximadamente 9,0. A ina- tivação viral pode ocorrer por meio da clivagem e degradação de RNA. As partículas virais podem se tornar permeabilizadas permitindo a entrada de íons de amônio no vírus. Portanto, a incubação com íons de amônio deveria ser realizada em um pH acima de 8,0, pois nesse nível de pH o vírus "se dissemina" e "abre" sua estrutura, desta maneira, permitindo a penetração das moléculas pequenas através da capa viral.
A presente invenção também pode proporcionar novas partícu- las similares a vírus RNA, desprovidas do RNA tipicamente associado com essas, onde as ditas partículas similares a vírus compreendem um antígeno apropriadamente apresentado.
As modalidades da presente invenção incluem métodos para a integração de inativação de partículas de maneira contínua com outras ope- rações de purificação. Estes métodos podem incluir casos em que o tecido vegetal é coletado e homogeneizado em um tampão de extração, onde o tampão consiste de sulfato de amônio em pH 9 a 0,7 M e é incubado em temperatura ambiente durante cerca de 20 h. Após a incubação, as partícu- las não são mais infecciosas em plantas e não podem iniciar a infecção me- diante inoculação. As mesmas condições em pH 7,0 não inativaram o vírus e temperaturas maiores, isto é, 40° C foram consideradas prejudiciais à estru- tura do vírus.
Etapas e Parâmetros de Processo Adicionais
As modalidades da presente invenção também podem incluir moer/homogeneizar o material vegetal no tampão de inativação, incubar a pasta fluida em um tampão de inativação para degradar o RNA genômico viral, e purificar as partículas virais resultantes. O material moído pode ser, adicionalmente, clarificado por centrifugação/filtração antes da incubação no tampão de inativação. Após a incubação, as partículas podem ser precipita- das por PEG ou através do aumento da molaridade de sulfato de amônio a um nível que faz com que a partícula se precipite a partir da solução. As e- tapas de cromatografia e troca de tampão geralmente seguem a etapa de inativação. A etapa de inativação pode ser integrada em qualquer ponto no procedimento de purificação. Por exemplo, em alguns procedimentos, a ina- tivação foi integrada no processo da seguinte maneira: CPMV ligado à colu- na HIC em 0,7 M (NH4)2SO4 , pH 7 ► CPMV ligado por lavado com 0,7 M (NH4)2SO4 , pH 9 ► Eluição de CPMV com 0,7 M (NH4)2SO4, pH 9. As se- guintes faixas podem ser utilizadas: 0,5 a 1,0 M (NH4)2SO4, pH acima de 8,0 e temperatura entre 10 a 40°C.
Tipos e Seleção de Vírus Que Podem Ser Usados para Preparar VLPs
As vacinas da presente invenção podem estar na forma de antí- genos e fundidas com proteínas capsidiais de vírus RNA não-envelopados (+, -, e/ou de cadeia dupla). As modalidades da presente invenção podem incluir vírus RNA de plantas juntamente com vírus RNA icosaédricos de plantas. Embora o vírus do mosaico do caupi esteja exemplificado aqui, os métodos da presente invenção podem ser aplicados a outros vírus similares. Por exemplo, alguns vírus preferidos, para uso de acordo com a presente invenção, são:
Tabela 1
Tabela 1
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A presente invenção pode ser aplicada a qualquer vírus RNA de planta. Para demonstrar este sistema, o comovírus do mosaico do caupi (CPMV) foi selecionado. A estrutura tridimensional do CPMV é conhecida, essa permite a identificação de sítios adequados para modificação sem rompimento da estrutura de partícula. Até agora, os vírus de pelo menos nove gêneros de vírus de plantas e três vírus satélite ssRNA do subgrupo 2 tiveram suas estruturas terciária e quaternária resolvidas e em alta resolu- ção. Algumas destas estão listadas acima na Tabela 1.
Um grupo exemplificado de vírus de plantas para uso como veto- res é aquele cujas proteínas capsidiais possuem uma estrutura em β-barril. Uma vantagem do uso de vírus que possuem uma estrutura em β-barril é que as álças entre os filamentos individuais de β-folha proporcionam sítios convenientes para a inserção de peptídeos estranhos. A modificação de uma ou mais alças pode ser uma estratégia para a expressão de peptídeos estranhos de acordo com a presente invenção. Também são possíveis in- serções em outras regiões da proteína capsidial, tais como, inserções na terminação-N e/ou terminação-C. Todos os vírus de plantas que possuem simetria icosaédrica cu- jas estruturas foram resolvidas para se adaptar à dobra β-barril de oito ca- deias como exemplificado por CPMV, e é provável que isto represente uma estrutura comum em todos os vírus icosaédricos. Todos tais vírus são ade- quados para uso nesta invenção para a apresentação de seqüências peptí- dicas estranhas, que podem ocorrer nas alças entre as β-cadeias e/ou na terminação-N e/ou terminação-C.
Os métodos para modificar as seqüências de DNA para inserir seqüências heterólogas ou estranhas são bem-conhecidos na técnica. Ge- ralmente, a seqüência de RNA viral é convertida em uma transcrição de cD- NA de comprimento total e clonada em um vetor, então modificada ao inserir um segmento de DNA estranho em uma região capaz de tolerar tal inserção sem interromper a replicação de RNA1 formação de partícula ou atrapalhar a infecciosidade.
Os comovúirus consistem em um grupo de pelo menos quatorze vírus de plantas que infectam predominantemente legumes. Seus genomas consistem em duas moléculas de RNA senso positivo de cadeia única de diferentes tamanhos que são separadamente encapsídadas em partículas isométricas de aproximadamente 28 nm de diâmetro. Os dois tipos de partí- culas de nucleoproteína são chamados de componente intermediário (M) e inferior (B) como uma conseqüência de seu comportamento em gradientes de densidade de cloreto de césio, os RNAs dentro das partículas que são conhecidos como RNA M e B, respectivamente. Ambos os tipos de partícu- las possuem uma composição de proteína idêntica que consiste em 60 có- pias cada de uma proteína capsidial grande (VP37) e uma pequena (VP23). Além das partículas de nucleoproteína, as preparações de comovírus con- têm uma quantidade variável de capsídeos vazios (apenas proteína) que são conhecidos como componente superior (T).
No caso do tipo de elemento do grupo comovírus, o vírus do mosaico do caupi (CPMV), sabe-se que tanto o RNA M como B são poliade- nilados e possuem uma proteína pequena (VPg) covalentemente ligada à sua terminação 5'. Estudos mais limitados sobre outros comovírus sugerem que estas características sejam divididas pelos RNAs de todos os elementos do grupo. Ambos os RNAs de CPMV foram seqüenciados e mostrados para consistir em nucleotídeos 3481 (M) e 5889 (B), excluindo-se as caudas poli (A) (van Wezenbeek et al. 1983; Lomonossoff and Shanks, 1983). Ambos os RNAs contêm um único quadro de leitura aberto longo. A expressão dos produtos de gene viral ocorre através da síntese e clivagem subseqüente de grandes polipeptídeos precursores. Ambos os RNAs são requeridos para infecção de todas as plantas. O maior RNA B é capaz de replicação inde- pendente em protoplastos, embora nenhuma partícula viral seja produzida nesse caso (Goldbach et al., 1980). Esta observação, juntamente com estu- dos genéticos anteriores, foi estabelecido que as proteínas capsidiais são codificadas por RNA M, e a formação de partículas virais infecciosas depen- de da presença tanto do RNAs genômicos virais B como M.
Uma vantagem da família Comoviridae é que seu capsídeo con- tém sessenta cópias cada de 3 β-barris diferentes que podem ser individu- almente manipulados. Todas as outras famílias e gêneros de vírus listados acima possuem estruturas tridimensionais similares, porém com um único tipo de β-barril. (No caso de CPMV, por exemplo, o inserto estranho pode ser feito imediatamente antes do resíduo de prolina 23 (Pro23) na alça βΒ-βϋ da proteína capsidial pequena (VP23)). Veja Patente Ne U.S.6.884.623.
A presente invenção também pode ser aplicada a vírus de plan- tas icosaédricas (incluindo aqueles que contêm estruturas em β-barril) cujas estruturas de cristal ainda não foram determinadas. Quando houver uma homologia de seqüência significativa dentro dos genes da proteína capsidial entre um vírus cuja estrutura de cristal é desconhecida e um segundo vírus cuja estrutura de cristal é conhecida, o alinhamento das estruturas primárias irá permitir que os locais das alças entre as β-cadeias sejam deduzidos [vide Dolja, V. V. and Koonin, Ε. V. (1991) J. Gen. Virol., 72, pp 1481-1486]. Ade- mais, quando um vírus possuir apenas homologia de seqüência de proteína capsidial mínima com aqueles vírus cuja estrutura de cristal foi determinada, os alinhamentos estruturais primários podem ser usados em conjunto com algoritmos de predição estruturais secundários e terciários apropriados para permitir a determinação do local de sítios de inserção potenciais.
O CPMV e o vírus do mosqueado do feijoeiro (BPMV) mostram que as estruturas 3-D de BPMV e CPMV são muito similares e são típicas da família Comoviridae em geral.
CPMV compreende duas subunidades, as proteínas capsidiais pequenas (S) e as grandes (L), dessas há 60 cópias cada por partícula viral. As seqüências peptídicas estranhas podem ser expressas tanto a partir das proteínas L como S ou de ambas as proteínas capsidiais sobre o mesmo vírion.
CPMV é o vírus RNA bipartido. Para manipular o genoma de qualquer vírus RNA para expressar peptídeos estranhos, clones de cDNA do RNA podem ser usados. Os clones de cDNA de comprimento total de ambas as moléculas de RNA de CPMV estão disponíveis, esses podem ser mani- pulados para inserir seqüências de oligonucleotídeo que codificam um pep- tídeo estranho. Os clones de cDNA do genoma dos vírus RNA de plantas podem ser usados para gerar transcrições in vitro que são infecciosas quan- do inoculadas em plantas.
Em um aspecto adicional da presente invenção, os clones de cDNA de RNAs de CPMV MeB foram construídos, onde o clone de cDNA do RNA M contém uma seqüência de oligonucleotídeo inserida que codifica um peptídeo estranho, esses fazem uso da seqüência promotora de mosai- co das nervuras da mandioca (CsVMV) ligada às extremidades 5' dos cD- NAs virais para gerar transcrições infecciosas na planta. Esta técnica supera alguns dos problemas encontrados com o uso de transcrições geradas in vitro e é aplicável a todos os vírus RNA de plantas.
Outros vírus podem incluir vários bromovírus, em particular o vírus do mosqueado clorótico do caupi (CCMV) e os sobemovírus, em parti- cular, o vírus do mosaico do feijoeiro do sul (SBMV). Um segmento de RNA de um vírus tripartido também pode ser usado. Exemplos de tais vírus úteis são os vírus tripartidos de Bromoviridae, tal como o vírus do mosaico do ca- pim bromo (BMV) e vírus do mosqueado clorótico do caupi (CCMV), que são embalados em capsídeos in icosaédricos. O genoma de BMV é dividido entre RNA1S mensageiros senso 1, 2 e 3 de 3,2, 2,9 e 2,1 kb respectivamente. A proteína capsidial é codificada por RNA subgenômico 4 que é formado de RNA3. Para que as células se- jam infectadas com RNA3 de BMV, as proteínas codificadas por RNA1S de BMV 1 e 2 devem estar presentes. Estes três RNA1S de BMV são separada- mente encapsidados em partículas idênticas. Cada partícula contém 180 proteínas capsidiais. A proteína capsidial pode ser modificada para suportar inserções de peptídeo.
As proteínas capsidiais dos inúmeros vírus indicados na Tabela 1 foram comparadas. A similaridade dos elementos estruturais secundários e sua organização espacial são ilustradas na Figura 10 das Patentes norte- americanas No: 6.884.623. Qualquer alça que se situa entre as β-cadeias pode ser usada para inserção de epitopos estranhos. Entretanto, as inser- ções são feitas de modo que as adições fiquem expostas tanto sobre a su- perfície interna como externa do vírus e de modo que a montagem das su- bunidades de proteína capsidial e a infecciosidade do vírus não sejam elimi- nadas. A seleção de uma alça particular pode ser feita utilizando o conheci- mento da estrutura de subunidades de proteína capsidial individuais e suas interações umas com as outras, conforme indicado pela estrutura de cristal, de modo que seja improvável que qualquer inserção interfira com a monta- gem do vírus. A seleção do sítio de inserção preciso pode ser feito, inicial- mente, pela inspeção da estrutura de cristal, seguida por experimentação in vivo para identificar o sítio ótimo.
Desta maneira, a estrutura tridimensional de um vírus de plantas pode ser examinada para identificar partes de uma proteína capsidial que estão particularmente expostas à superfície do vírus e são, portanto, poten- cialmente bons sítios para inserção. A seqüência de aminoácido da parte exposta de uma proteína capsidial também pode ser examinada para ami- noácidos que rompem estruturas α-helicoidais, devido ao fato de se tratar de sítios potencialmente bons para inserção. Exemplos de aminoácidos ade- quados são prolina e hidroxiprolina, que em uma cadeia polipeptídica inter- rompem a α-hélice e criam um entortamento ou curva rígida na estrutura. As terminações N e C da proteína capsidial também são sítios atraentes para inserções.
Tipos de Antíqenos e Epitopos
As modalidades da presente invenção podem incluir métodos para vacinas de subunidade; isto é, o antígeno apresentado representa ape- nas um segmento ou segmentos de um antígeno que é conhecido como efi- caz. Tais vacinas (antígenos) podem ser inerentemente mais seguras do que vacinas de organismos inteiros ou de proteínas inteiras, pois estas são desprovidas de toda a funcionalidade associada com o processo infectivo ou patologia da doença.
As modalidades da presente invenção podem incluir métodos para desenvolver uma vacina de subunidade contra os efeitos de infecção por antraz (Bacillus anthracis). Nessa vacina contra antraz, SEQ ID No: 23, os antígenos de subunidade representam segmentos de cerca de 25 amino- ácidos derivados do autodenominado antígeno protetor ou PA. Essa proteí- na é conhecida como eficaz no aumento de imunidade a antraz e é a base de uma nova geração de vacina contra antraz.
As vacinas contra parvovirose canina também podem ser produ- zidas. Veja, por exemplo, Langeveld et al. (2001) "Inactivated Recombinant Plant Vírus Protects Dogs from a Lethal Challenge with Canine Parvovirus", Vaccine 19:3661-3670 e Langeveld et al. (1995) "Full Protection in MinkAga- inst Mink Enteritis Vírus with New Generation Canine Parvovirus Vaccines Based on Synthetic Peptídeo or Recombinant Protein", Vaccine 13:1033- 1037. Essas vacinas de subunidade à base de partícula viral já provaram ser eficazes contra um patógeno viral (Parvovirus) e protegeram os animais de um desafio letal com o agente infeccioso. As partículas quiméricas estão sendo atualmente produzidas em plantas de feijão-caupi mediante a infec- ção da planta com os RNAs ou DNAs virais recombinantes pré- engenheirados. Mediante à inoculação, o vírus recombinante espalha célula- a-células e à longa distância. Isso resulta em uma infecção sistêmica de plantas. O tecido vegetal infectado é coletado, e as partículas virais quiméri- cas são extraídas, formuladas, e usadas como vacinas. De acordo com as modalidades da presente invenção, pode ser vantajoso inativar os candida- tos à vacinação para satisfazer as exigências para a proteção ambiental.
Os presentes métodos de inativação podem ser aplicados não só a partículas que exibem epitopos antigênicos que são, então, usados co- mo vacinas, como também a partículas que exibem qualquer outro peptídeo útil, tal como, peptídeos de marcação, peptídeos antimicrobianos, e simila- res. Esta tecnologia também pode ser aplicada às partículas tipo selvagem ou modificadas que são, então, usadas para ligação covalente de diversas partes à superfície da partícula. Isto inclui a ligação de proteínas inclusive proteínas, peptídeos, carboidratos, lipídeos, ácidos nucléicos, agentes de detecção (tais como, corantes fluorescentes), agentes radioativos, Iigantes de marcação antigênicos, e similares. Os complexos de partícula podem ser usados como vacinas bem como para entrega dos agentes associados a tecidos marcados e similares. Esta tecnologia também pode ser aplicada antes da encapsulação de diversos agentes, tais como, fármacos, ácidos nucléicos estranhos para expressão de genes, toxinas estranhas e similares dentro das partículas que são, então, usadas para administração e entrega do agente encapsulado.
Incluídos entre os diversos epitopos de peptídeo que podem ser usados de acordo com a presente invenção, e expressos sobre a superfície dos capsídeos, estão aqueles de patógenos virais e bacterianos e cânceres inclusive aqueles de vírus influenza, vírus da encefalite eqüina do leste e B. anthracis.
O peptídeo estranho, que pode ser incorporado em vírus de plantas (vide, por exemplo, WO 92/18618), pode ser de tipos bem diversos. Pode haver algumas limitações devido à natureza e tamanho do peptídeo estranho e do sítio no qual este está localizado ou sobre a partícula viral. A seqüência de peptídeo não deveria interferir na capacidade de o vírus modi- ficado se organizar quando cultivado in vivo. Neste relatório descritivo o ter- mo "estranho", como aplicado a um peptídeo ou ao ácido nucléico que o co- difica, significa peptídeos ou seqüências de ácido nucléico que não são nati- vos de vírus de plantas usados como um vetor. Tais seqüências podem ser alternativamente descritas como seqüências exógenas ou heterólogas. O termo "peptídeo" inclui pequenos peptídeos e polipeptídeos. O peptídeo con- tém, geralmente, mais de 5 resíduos de aminoácido.
As partículas virais modificadas podem ser formadas de qual- quer peptídeo biologicamente útil. Exemplos de tais peptídeos são hormô- nios peptídicos; enzimas; fatores de crescimento; antígenos de origem pro- tozoária, viral, bacteriana, fungosa ou animal; anticorpos inclusive anticorpos anti-idiotípicos; imunorreguladores e citocinas, por exemplo, interferons e interleucinas; receptores; adesinas; e partes ou precursores de qualquer um dos tipos anteriores de peptídeo.
Entre a grande variedade de seqüências peptídicas bioativas apresentadas em vetores de vírus de plantas (de acordo com WO 92/18618, por exemplo) dá-se importância especial aos peptídeos antigênicos que são a base de vacinas, particularmente, vacinas virais e bacterianas em animais (inclusive seres humanos). Deve ser observado que as vacinas podem pos- suir aplicações profiláticas (isto é, prevenção de doenças) ou terapêuticas (isto é, tratamento de doenças). Para aplicações de vacina, proporcionas-se um sistema de apresentação de epitopo especialmente atraente. Quando usado para tais aplicações, o componente peptídico antigênico ficará locali- zada apropriadamente sobre a partícula viral para ser facilmente reconheci- da pelo sistema imune, por exemplo, pelo local sobre uma parte exposta da proteína capsidial do vírus. Desta maneira, em algumas modalidades da presente invenção fica estabelecido que há partículas montadas de um vírus de planta modificado que contêm um antígeno derivado de um patógeno, por exemplo, patógeno viral ou bacteriano em animais, incorporado em uma po- sição exposta sobre a superfície da proteína capsidial do vírus de planta. A partícula viral de planta modificada montada pode ser usada como o agente imunogênico de uma vacina. Tais partículas virais de plantas modificadas montadas que apresentam peptídeos antigênicos também possuem aplica- ções como o componente de apresentação de antígeno de um ensaio imu- nodiagnóstico para detecção de, por exemplo, patógemos de animais (inclu- sive seres humanos) e doenças. Nas modalidades da presente invenção, a VLP antigênica é ina- tivada e/ou se torna não-infecciosa enquanto mantém a integridade dos an- tígenos. Desta maneira, isso remove o risco de transmissão involuntária de partículas virais infecciosas, mesmo que se trate de vírus de plantas. Isso pode reduzir bastante as preocupações regulatórias. Desta maneira, a transmissão e disseminação do vírus de plantas em plantas, após ser admi- nistrado no indivíduo ou animal que está sendo tratado, são bem reduzidas. Este sistema é altamente versátil com relação ao tamanho do peptídeo es- tranho que pode ser inserido na proteína capsidial viral. Desta maneira, os peptídeos que contêm até 38 ou mais aminoácidos podem ser usados de acordo com a presente invenção. Métodos de Administração
Os métodos de administração destes vírus, agora recombinan- tes, podem incluir um aerossol administrado em to membranas mucosas. Entretanto, diversos métodos de administração podem ser usados de acordo com a presente invenção. Esses incluem administrações injetáveis (IP, IM, SC), ou administrações transdérmicas, intranasais ou orais. Vírus Candidatos, sua Morfologia de Capsídeo e Inserção de Antíqe- nos/Epitopos nos mesmos
O segmento de polinucleotídeo que codifica o peptídeo estranho pode ser inserido em qualquer local na proteína capsidial do vírus original que não interfere na capacidade de o vírus se replicar e infectar o hospedei- ro, e isso permite a produção e apresentação apropriadas do peptídeo sobre a partícula viral modificada. Geralmente, o polinucleotídeo estranho é inseri- do de modo que esse seja produzido como parte ou como fusão com a pro- teína capsidial.
As transcrições de RNA são preparadas, in vivo, tal como, em hospedeiros bacterianos, ou in vitro, como conhecido na técnica, e usadas para inocular um hospedeiro vegetal ou tecido vegetal apropriado. O RNA pode ser usado na forma encapsidada ou em solução, desde que a encapsi- dação ocorra dentro do organismo hospedeiro. Alternativamente, o DNA viral fundido com o promotor da RMA polimerase DNA-dependente pode ser u- sado para iniciar a transcrição dos RNAs virais in vivo no hospedeiro vege- tal. O RNA transcrito é, então, capaz de iniciar a infecção viral no hospedeiro vegetal.
Conforme será entendido por aquele versado na técnica, um determinado vírus pode requerer condições especiais para infecciosidade e replicação ótima, inclusive a presença de genes que atuam em eis ou em trans, sendo que todos estes podem estar presentes quando infectam-se a planta ou tecido vegetal. Por exemplo, para a infecciosidade de RNA3 de BMV, a presença de RNA1 e 2 de BMV é necessária. Ademais, a infecção por um vírus que possui os genes de especificidade de hospedeiro para um determinado hospedeiro em algumas circunstâncias permite a infecção do hospedeiro por um segundo vírus que normalmente não afeta aquele hos- pedeiro, por exemplo, os vírus TMV e BMV misturados irão infectar tanto a cevada como o tabaco mesmo que o BMV sozinho não contamine o tabaco e o TMV sozinho não contamine a cevada (Hamilton and Nichols (1977) Phytopathology, 67:484-489).
As plantas podem ser transfectadas sob condições de campo e/ou estufa. A abrasão do tecido da folha é geralmente requerida para a transfecção. As plantas podem ser inoculadas a qualquer momento durante o ciclo de crescimento, de preferência, quando as plantas estiverem jovens. A seleção do vírus e os detalhes de modificação serão questões de seleção dependendo dos parâmetros conhecidos e entendidos pelos versados na técnica.
Além de modificar a proteína capsidial, outros genes adequados podem ser inseridos no genoma viral original para expressão na planta hos- pedeira. Esses incluem genes para a produção de peptídeos, proteínas, produtos farmacêuticos comercialmente úteis, ou qualquer outro polipeptí- deo útil em plantas. Em geral, qualquer gene heterólogo cujo produto de ex- pressão é funcional dentro da célula vegetal pode ser inserido no sistema de expressão viral descrito acima no presente documento.
A própria proteína capsidial modificada pode ser inserida em um genoma de um vírus heterólogo. Para garantir a fidelidade de tradução do gene heterólogo da proteína capsidial também pode ser necessário modifi- car o códon ATG de iniciação de tradução pela proteína capsidial original se essa não estiver deletada, e isso pode ser realizado por meios conhecidos na técnica, tal como, substituição oligonucleotídeo-dirigida. Se a seqüência de proteína capsidial que será adicionada possuir seu próprio códon de ini- ciação de tradução, deleção ou inativação do códon de iniciação, a proteína original é necessária; alternativamente, entretanto, esse pode ser mantido e usado para iniciar a tradução da seqüência de proteína capsidial adicionada, desde que qualquer alteração de seqüência de aminoácido introduzida des- sa forma não interfira no empacotamento de RNA e formação de capsídeo.
Uma grande variedade de hospedeiros vegetais e células vege- tais suscetíveis pode ser usada. Essas incluem quaisquer plantas dicotiledô- neas e monocotiledôneas, tecidos da planta bem como células vegetais de- senvolvidas em cultura de suspensão ou que formam um calo. Etapas Adicionais do Processo
Para produzir as partículas virais modificadas, o ácido nucléico viral da planta pode ser modificado ao introduzir uma seqüência de nucleotí- deo que codifica o peptídeo estranho (tal como, um antígeno viral ou bacte- riano animal) como uma fusão com parte do genoma viral da planta que co- difica a proteína capsidial, infectam plantas ou células vegetais com o ácido nucléico viral modificado, e colher partículas montadas do vírus modificado. Os vírus isolados são, então, inativados de acordo com a presente invenção.
A seqüência de ácido nucléico que codifica o peptídeo estranho é tipicamente introduzida na parte do genoma viral da planta que codifica uma parte exposta da proteína capsidial. Este procedimento pode ser reali- zado através da manipulação de um cDNA correspondente ao RNA de um vírus RNA. No caso de um vírus RNA, uma transcrição de RNA do DNA mo- dificado é geralmente preparada para inoculação de células vegetais, ou de preferência, plantas inteiras, para atingir uma etapa de multiplicação antes da colheita de partículas montadas do vírus modificado. Alternativamente, os clones de cDNA de vírus RNA podem ser construídos em plasmídeos de modo que as extremidades 5' das seqüências de codificação de proteína capsidial viral sejam diretamente fundidas com o sítio de iniciação transcri- cional de um promotor ativo no hospedeiro vegetal. O peptídeo estranho é inicialmente expresso como parte da proteína capsidial e é, assim, produzido como parte da partícula viral inteira. O peptídeo pode ser, assim, produzido como uma molécula conjugada destinada para uso como tal. Alternadamen- te, a modificação genética do vírus pode ser projetada para permitir a libera- ção do peptídeo desejado da partícula viral mediante a aplicação de agentes apropriados que irão causar a clivagem da partícula viral. Isto pode ser obti- do ao inserir o aminoácido que flanqueia o peptídeo de interesse que é sen- sível à hidrólise ácida. Por exemplo, os aminoácidos asp-pro podem ser en- genheirados para flanquear o peptídeo inserido e o peptídeo pode ser libe- rado da partícula por meio de tratamento com um ácido suave.
Para produzir o vírus modificado em uma escala comercial, não é necessário preparar um inoculante ineficaz (transcrição de DNA ou RNA) para cada lote de produção de vírus. De preferência, um inoculante inicial pode ser usado para infectar plantas; o vírus modificado resultante pode ser amplificado nas plantas para produzir o vírus ou RNA viral totaljcomo inocu- lante para lotes subseqüentes.
O RNA ou DNA estranho pode ser inserido no genoma viral das plantas em uma variedade de configurações. Por exemplo, esse pode ser inserido como uma adição ao ácido nucléico existente que codifica a proteí- na capsidial ou como uma substituição da parte da seqüência existente que codifica a proteína capsidial. Esta seleção deve ser determinada em parte pela estrutura da proteína capsidial e pela facilidade com que as adições ou substituições podem ser feitas sem interferência na capacidade do vírus ge- neticamente modificado para organização nas partículas em plantas. A de- terminação do tamanho permissível e mais apropriado de adição ou deleção para os propósitos desta invenção pode ser obtida em cada caso particular, possivelmente com alguma experimentação adicional, devido à presente descrição. O uso de insertos adicionais parece oferecer mais flexibilidade do que os insertos de substituição, em alguns casos.
A multiplicação de vírus modificados em plantas é capaz de pro- duzir campos significativos. Como indicado acima, a seqüência de nucleotí- deo heteróloga inserida pode incluir aquela que codifica aminoácidos que são facilmente clivados de modo que, após uma etapa de multiplicação, o material desejado possa ser separado das partículas virais. Por exemplo, alguém poderia inserir dois peptídeos na proteína capsidial - um será usado para purificação da partícula modificada por, por exemplo, purificação por afinidade e clivado após a purificação; o outro poderia ser um peptídeo anti- gênico que será mantido sobre a partícula e usado para vacinação. Como uma alternativa de clivagem total do peptídeo, pode ser possível e desejado em alguns casos, liberar o peptídeo em uma forma em que permaneça intac- to dentro da maior parte do capsídeo.
De acordo com outro aspecto da presente invenção, dois sítios de enzima de restrição diferentes podem ser selecionados dentro do ácido nucléico viral que codifica a proteína capsidial e o ácido nucléico é limitado utilizando as enzimas de restrição apropriadas. Os pares de oligonucleotí- deos complementares são sintetizados codificando o peptídeo estranho que se deseja inserir na proteína capsidial viral. Os oligonucleotídeos terminam em extremidades que são compatíveis com os sítios de enzimas de restrição permitindo, assim, a inserção no ácido nucléico viral limitado. Este procedi- mento resulta na introdução de uma seqüência de nucleotídeo que codifica um peptídeo estranho na seqüência de proteína capsidial.
Como usado aqui, o termo "vírus RNA híbrido" ou "vírus RNA modificado" refere-se às seqüências de RNA viral recombinante que com- preendem seqüências virais infecciosas derivadas de um vírus RNA, e um segmento de polinucleotídeo de um epitopo/antígeno/peptídeo derivado de outra fonte. Desta maneira, antes da inativação, os RNAs virais híbridos ou modificados desta invenção são seqüências de RNA que compreendem se- qüências virais infecciosas derivadas de um vírus RNA, e um segmento de polinucleotídeo de um epitopo/antígeno/peptídeo derivado de outro vírus, bactéria, ou outras fontes. O termo "vírion RNA híbrido" ou "partícula viral híbrida" pode ser usado para se referir à forma encapsidada de tais vírus. Uma seqüência de RNA viral original adequada para receber um segmento polinucleotídeo codificado por peptídeo inserido é um exemplo de uma se- qüência correspondente àquela de um vírus RNA. Essas seqüências, quan- do modificadas por inserção ou de outra forma, são "derivadas da" seqüên- cia viral original/naturalmente ocorrente.
Tais seqüências virais devem, no mínimo, possuir as funções de replicabilidade no hospedeiro e a capacidade de infectar o hospedeiro. Os determinantes de tais funções podem ser requeridos em eis ou em outros casos podem ser fornecidos em trans. Um exemplo de uma condição de re- plicação satisfatória em trans é a necessidade da presença das proteínas codificadas por RNA1S 1 e 2 de BMV para permitir que o RNA3 de BMV se replique em um hospedeiro. Ao contrário, certos sinais de replicação devem estar presentes em eis (isto é, diretamente ligados a derivados de RNA3) para permitir a replicação de derivados de RNA3 através do mecanismo in- duzido na célula infectada por RNA1S 1 e 2. Outro exemplo de funções trans são proteínas codificadas por RNA1 de CPMV para permitir que o RNA2 de CPMV se replique em um hospedeiro. Ao contrário, certos sinais de replica- ção devem estar presentes em eis (isto é, diretamente ligados a derivados de RNA2) para permitir a replicação de derivados de RNA2 através do me- canismo induzido na célula infectada por RNA1.
Também pode ser desejado que as seqüências virais originais possuam sítios adequados para a adição de polinucleotídeos codificados por peptídeo estranhos ou heterólogos. Os termos "estranho" e "heterólogo" com referência a estes segmentos e seqüências de polinucleotídeo significam seqüências que não estão no vírus original em natureza. Similarmente, o peptídeo estranho ou heterólogo refere-se aqui ao antígeno ou epitopo que foi adicionado ao sistema de expressão/produção viral. Tais polinucleotídeos estranhos ou seqüências podem ser inseridos em qualquer local sem causar interferência nas funções necessárias das seqüências virais originais, isto é, a capacidade de se replicar e infectar um hospedeiro. Com referência à ex- pressão em um hospedeiro, um polinucleotídeo "heterólogo" ou "isolado" é um que não está naturalmente presente no local no hospedeiro onde este foi colocado. É desejado que a colocação dos segmentos codificadores por peptídeo heterólogo não interfira nas funções necessárias das seqüências virais originais.
Os segmentos de ácido nucléico inseridos não precisam ser na- turalmente ocorrentes, porém podem ser compósitos modificados de mais de um segmento de codificação, ou codificam mais de um peptí- deo/polipeptídeo. O RNA também pode ser modificado ao combinar inser- ções e deleções para controlar o comprimento total ou outras propriedades da molécula de RNA modificada.
As seqüências de RNA estranhas inseridas podem ser de ori- gem não-viral ou viral, e podem corresponder tanto ao RNA como ao DNA em natureza. Estas podem ser de origem procariótica ou eucariótica, contan- to que estejam em uma forma que possam ser diretamente traduzidas pelo mecanismo de tradução da célula receptora ou de outra forma reconhecidas e utilizadas para suas funções funcionais, estruturais ou reguladoras.
Qualquer planta pode ser infectada com uma seqüência de RNA desta invenção, como será avaliado pelo versado na técnica, ao proporcio- nar especificidade de hospedeiro e funções de replicação apropriadas. Com as construções apropriadas, outros organismos eucarióticos também podem ser infectados, bem como células simples e culturas de tecido. Esta inven- ção não se limita a nenhuma classe determinada de hospedeiro ou tipo de vírus RNA.
O termo "infecção sistêmica" significa infecção espalhada atra- vés do sistema do organismo hospedeiro para envolver mais do que as célu- las no sítio de inoculação original. O organismo hospedeiro total não precisa ser infectado; certos tecidos podem ser marcados para infecção. Os tecidos preferidos são tecidos das folhas.
O termo "transfectado" como aplicado ao organismo hospedeiro significa a incorporação das seqüências virais desta invenção nas células do organismo de tal maneira que sejam replicadas nestas. Para a transfecção, o organismo não precisa ser sistemicamente infectado, porém pode ser sis- temicamente infectado. Entretanto, a disseminação sistêmica do vírus não é requerida na presente invenção. Os métodos para iniciação de infecção do organismo hospedeiro são bem-conhecidos na técnica, e qualquer método adequado pode ser u- sado. Um método preferido para a infecção de plantas é colocar a planta ferida em contato com uma solução que contém o vírus ou RNA viral para fazer com que o vírus se replique ou contamine a planta.
As modalidades da presente invenção podem utilizar vírus de plantas como sistemas de vetor para produzir polipeptídeos tipo vacina e outros na e por meio das plantas. Um aspecto da presente invenção refere- se a partículas organizadas de um vírus RNA de planta que contém um pep- tídeo estranho predeterminado como parte da proteína capsidial do vírus, onde o RNA foi removido ou se tornou não-infeccioso utilizando os métodos da presente invenção. A presente invenção também pode incluir partículas organizadas de um vírus de planta que exibe um peptídeo estranho, onde a exibição interna é possível. A presente invenção também inclui vírus que são desprovidos de RNA infeccioso.
Como aplicado à preparação de vacinas, a presente invenção pode apresentar vantagens sobre as vacinas convencionais, vacinas recom- binantes baseadas em vírus ou bactérias animais, e vacinas peptídicas in- clusive: 1) custos de produção mais baixos, visto que rendimentos muito al- tos de partículas virais puras são obteníveis de plantas infectadas, e nenhu- ma etapa de produção de cultura de tecido é necessária; 2) segurança aper- feiçoada, visto que os vírus de plantas são incapazes de infectar e se repli- car em animais, e assim, não serão capazes de se modificar em formas viru- lentas, conforme pode ser o caso com vacinas virais animais convencionais e recombinantes; 3) estabilidade excepcional como comovírus visto que as preparações purificadas podem ser secas e armazenadas durante muitos anos sem perder a eficácia; 4) falta de conjugação do peptídeo resultando em imunogenicidade aumentada exibindo, assim, o peptídeo sobre a super- fície das partículas; e 5) vírus menores permitindo a introdução de genes quiméricos por manipulação irt vitro como comparada com a recombinação homóloga in vivo (transfecção).
Exceto onde indicado em contrário, os termos "um", "uma", e "o" como usado aqui refere-sem a ao menos um.
Todas as patentes, pedidos de patente, pedidos provisórios, e publicações referidas ou citadas aqui estão incorporadas à guisa de referên- cia em sua totalidade à medida que estes não são incompatíveis com os ensinamentos explícitos deste relatório descritivo.
A seguir estão exemplos que ilustram procedimentos para prati- car a invenção. Estes exemplos não deveriam ser interpretados como limita- dores. Todas as porcentagens são por peso e todas as proporções de mistu- ra de solvente são por volume exceto onde observado em contrário.
EXEMPLOS
Exemplo 1 - Sumário de Inativação de Partículas de CPMV Mais de 16 partículas de CPMV diferentes (conduzindo epitopos diferentes) bem como vírus CPMV do tipo selvagem foram inativados utili- zando este procedimento. O RNA foi isolado de vírus inativados e é execu- tado em um gel para determinar se o RNA está degradado. As partículas inativadas também foram inoculadas em plantas para testar a capacidade de induzir infecção. Nenhuma das plantas inoculadas produziu infecção viral. O RNA isolado de partículas virais inativadas foi degradado em cada caso tes- tado (vide Figura 1 como exemplo).
Exemplo 2 - Exemplos Adicionais de Inativação de CPMV
Um estudo foi feito para determinar se 0,8 M de sulfato de amô- nio pode inativar o CPMV enquanto preserva sua integridade. 0,8 M de sul- fato de amônio foi usado como parte do presente processo de purificação. O aumento no pH durante o processo poderia permeabilizar o vírus, porém também poderia aumentar a concentração de NH3 livre.
A conclusão deste estudo foi que 0,8 M de sulfato de amônio em pH 9 e em pH 7 tanto a 22°C como 40°C preservou a integridade do vírus e que a infecciosidade do vírus foi perdida apenas em pH 9. Os experimentos de controle onde o CPMV foi incubado em 30 mM de Tris-HCI a 22 e 40°C produziram partículas de CPMV completamente infectivas. A partir destes resultados, foi, adicionalmente, concluído que a combinação de 0,8 M de sulfato de amônio e pH 9 que é requerida para causar a inativação e não a temperatura ou sulfato de amônio separadamente. Os experimentos neste estudo foram realizados em um sap celular moído ajustado para concentra- ção de sulfato de amônio e pH apropriados e houve uma preocupação que um composto na pasta fluida estava causando inativação (por exemplo, pso- ralenos). Para provar ou invalidar isso, um segundo estudo foi realizado para determinar se partículas de CPMV purificadas podem ser inativadas utilizan- do uma combinação de sulfato de amônio e pH 9. Diversos produtos quími- cos de grau de pureza foram usados para determinar se algumas impurezas nos produtos químicos eram responsáveis pela inativação. Uma matriz expe- rimental foi configurada e todas as condições testadas como mostrado na Tabela 1. 0,7 M de sulfato de amônio foi usado como parte do processo reo- timizado de modo que uma fácil integração fosse possível.
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As concentrações de 0,5 M e 0,7 M de (NH4)2SO4 em pH 9 inati- varam o CPMV enquanto com aquela de 0,1 M de (NH4)2SO4 em pH 9 isso não ocorreu. A Figura 1 mostra RNA, extraído de vírus ativo e inativado, e- xecutado em 1,2 % de gel agarose e colorido com EtBr. Os resultados mos- tram a presença de RNA 1 e 2 genômico de CPMV no vírus ativo, e RNA degradado na preparação de vírus inativo. Os mesmos resultados foram ob- tidos em mais de 15 outras partículas virais quiméricas e no vírus tipo selva- gem.
Exemplo 3 - Partículas de CPMV quimérico usadas nos experimentos de inativação.
As partículas quiméricas de CPMV foram engenheiradas para expressar peptídeos derivados da proteína antígeno protetor ("PA") de Bacil- Ius anthracis. Os peptídeos foram expressos sobre as proteínas capsidiais grandes e/ou pequenas de CPMV, utilizando os métodos descritos nas pa- tentes U.S. 5.874.087, 5.958.422, e 6.110.466. Os seguintes peptídeos fo- ram expressos:
Tabela 3
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Exemplo 4 - Produção de Partículas de CPMV Quimérico em Plantas.
Sementes de feijão-caupi da Califórnia nQ 5 de Ferry Morse, có- digo do produto 1450, foram germinadas durante a noite em temperatura ambiente em toalhas de papel úmidas. As sementes germinadas foram transferidas para o solo. Sete dias após a germinação as mudas foram ino- culadas com WT ou partículas de CPMV quimérico. Após a inoculação, as plantas se desenvolveram a 25°C com um fotoperíodo de 16 horas à luz 8 horas no escuro durante duas a três semanas. As folhas que mostraram sin- tomas foram colhidas e congeladas a -80°C antes da purificação. Exemplo 5 - Inativação de Partículas de CPMV Quimérico e Purificação de Partículas Semelhantes a Vírus CPMV Quimérico Inativado
40g de tecido da folha de CPMV foram congelados a -80°C. O tecido da folha congelado foi esmagado pelas mãos e despejado em um misturador de alta velocidade Waring, código de produto 8011S. 120ml de tampão de inativação frio (0,5M de sulfato de amônio, 0,03M de base Tris pH 9,00, 0,2mM de PMSF) foram despejados nas folhas esmagadas. As fo- lhas foram trituradas 2 vezes durante 3 segundos em alta velocidade. A so- lução foi decantada em uma garrafa centrífuga de 500ml. O misturador foi lavado com 30ml de tampão de inativação frio e a lavagem foi despejada em uma garrafa centrífuga de 500ml. A solução foi centrifugada a 15.000G dü- rante 30 minutos para remover os resíduos celulares da planta. O sobrena- dante foi decantado em um cilindro graduado e incubado para inativar o ví- rus durante 20 horas em temperatura ambiente. Para precipitar o vírus CPMV1 a solução de PEG 6000 fria (20% de PEG 6000, 1M de NaCI) foi adi- cionada ao sobrenadante para conduzir a concentração de PEG final para 4% de PEG 6000 com 0,2M de NaCI, e a solução foi suavemente misturada. A solução foi permitida para se precipitar durante 1 hora em gelo. A solução precipitada de vírus foi, então, centrifugada a 15.000G durante 30 minutos para coletar o pélete viral CPMV. O sobranadante foi despejado e o vírus foi imediatamente ressuspenso no tampão de ligação de troca aniônica (30mM de base Tris, pH 7,50). Para purificar, adicionalmente, as partículas similares a vírus, a mistura de proteína foi fracionada por cromatografia de troca aniô- nica utilizando a resina de troca aniônica forte POROS 50 HQ de Applied Biosystems, código de produto 1-2559-11. O gradiente de volume da coluna 20 era a partir do tampão A, 30mM de base Tris, pH 6,75, até o tampão B, 30mM de base Tris, pH 6,75 com 1M de NaCI. A cromatografia foi realizada com um AKTAexpIorer de Amersham Biosciences, código de produto 18- 1112-41. A Figura 2 ilustra o cromatograma AIEC de PA7E. Todas as amos- tras listadas no Exemplo 3 foram processadas utilizando o método descrito neste Exemplo com resultados similares. Dois picos maiores foram detecta- dos. O traço azul é a absorvência a 280, o traço vermelho é a absorvência a 260, o traço verde é o tampão B em porcentagem, e o traço marrom é a condutividade. As marcações em vermelho na parte inferior do cromatogra- ma são as frações. O primeiro pico no gradiente, que continha as partículas similares a vírus desejadas, teve o tampão trocado por tampão PBS, pH 7,4 utilizando um concentrador giratório de membrana de corte de 100 kDa, có- digo do produto UFC910096. As amostras foram então armazenadas a -80° C. O segundo pico continha a partícula clivada infectada. Um gel SDS-PAGE foi preparado, com a carga AIEC de precipitado PA7E PEG, CPMV WT pa- drão, e as frações AIEC PA7E. SDS-PAGE foi executado em um Invitrogen Nupage 4-12% de Bis-Tris, 12 gel, código de produto NP0322. O tampão de corrida era um tampão de corrida MES SDS da Invitrogen Nupage, código de produto NP0002. O gel estava sendo executado com uma queda de vol- tagem de 200V durante 35 minutos. Lane 1 continha 5ul do marcador Iadder Invitrogen SeeBIue Plus2, código de produto LC5925. Lane 2 continha o precipitado PA7E de PEG ressuspenso que foi carregado na coluna AIEC. Lane 3 continha CPMV WT. Lanes 4 a 8 continham as partículas alvo purifi- cadas PA7E correspondentes ao pico 1 AIEC que foram coletadas e proces- sadas, adicionalmente. Lanes 9 a 10 continham o infectado de partículas clivadas PA7E correspondente ao pico 2 AIEC.
Exemplo 6 - Análise de Partículas Semelhantes a Vírus Quimérico Inativado - Extração de RNA Genômico Viral.
O Ambion RNAqueous, código de produto 1912, o kit foi usado para extrair o RNA genômico viral das amostras de CPMV inativado purifica- do por. As partículas virais de CPMV que não foram inativadas foram usadas como um controle (amostras ativas). As Figuras 3 a 5 mostram os resultados de inativação de RNA para PA9, PA10, PA11, PA12, e PA18. Todas as a- mostras listadas no Exemplo 3 foram processadas utilizando o método des- crito no Exemplo 6 com resultados similares. Precast 1,2% de E-Gels de Invitrogen, código de produto G501801, foi usado para visualizar o RNA ex- traído nas Figuras 1 a 3. Todos os marcadores Iadder nas Figuras 3 a 5 ti- nham cargas de 1 ul de 1 KB PLUS Ladder, código de produto 10787-026. Nas Figuras 3, lane 1 é 1 ul de marcador ladder. Lane 2 é ativo PA9. Lane 3 é inativado PA9. Lane 4 é marcador ladder. Lane 5 é PA10 ativo, lane 6 é PA10 inativo. Lane 7 é marcador ladder. Nas Figuras 4, lane 1 é 1 ul de lad- der. Lane 2 é PA11 ativo. Lane 3 é PA11 inativado. Lane 4 é ladder. Lane 5 é PA12 ativo, lane 6 é PA12 inativo. Lane 7 é marcador ladder. Nas Figuras 5, lane 1 é 1 ul de marcador ladder. Lane 2 é PA18 ativo. Lane 3 é PA18 ina- tivado. O RNA genômico viral foi degradado nas amostras inativadas como indicado pela detecção de "mancha", porém o RNA1 e RNA2 genômico de CPMV de comprimento total foram detectados em amostras que não foram submetidas à inativação.
Exemplo 7 - Análise de Partículas Semelhantes a Vírus CPMV Quimérico- Estabilidade por SDS-PAGE.
A estabilidade das proteínas capsidiais grandes e pequenas foi avaliada com SDS-PAGE. A Figura 6 mostra o gel SDS-PAGE de uma aná- lise de estabilidade de temperatura de 5 dias para PA1S como um exemplo. SDS-PAGE foi executado em um Invitrogen Nupage 4-12% de Bis-Tris, 12 gel, código de produto NP0322. O gel estava sendo executado com uma queda de voltagem de 150V durante 60 minutos. O tampão de corrida era um tampão de corrida MES SDS da Invitrogen Nupage, código de produto NP0002. Lane 1 continha 7ul de Invitrogen Benchmark Unstained Protein Ladder, código de produto 10747-012. Lane 2 continha partículas virais ina- tivadas PA1S incubadas em temperatura ambiente durante 5 dias. Lane 3 continha partículas virais inativadas PA1S incubadas a 4°C durante 5 dias. Lane 4 continha partículas virais inativadas PA1S incubadas a -20C durante 5 dias. Não detectou-se degradação de proteína.
Exemplo 8 - Análise de Partículas Semelhantes a Vírus CPMV Quimérico Inativado- Estabilidade por SEC.
A integridade das partículas similares a vírus organizadas foi avaliada utilizando cromatografia de exclusão por tamanho (SEC). Todas as amostras listadas no Exemplo 3 foram analisadas utilizando SEC com resul- tados similares. A coluna SEC usada foi uma coluna analítica com 30cm χ 7,8mm Tosoh TskGeI G5000 SEC de Supelco com tamanho de microesferas de 10 mícrons, código de produto 08023. A fase móvel de SEC possuía 0,1 M de NaP04 pH 7,00. Um único pico foi detectado correspondente às partículas virais organizadas. As partículas de CPMV organizadas foram elu- ídas a partir da coluna com um tempo de retenção de 14,0 minutos. Exemplo 9 - Análise de Partículas Semelhantes a Vírus CPMV Quimérico Inativado- Infecciosidade em Plantas.
As partículas de CPMV quimérico inativado listadas no Exemplo 3 foram testadas por sua capacidade de infectar plantas. As sementes de feijão-caupi da Califórnia ne 5 de Ferry Morse, código do produto 1450, fo- ram germinadas durante a noite em temperatura ambiente em toalhas de papel úmidas. As sementes germinadas foram transferidas para o solo. Sete dias após a germinação dez mudas foram inoculadas com WT ou partículas de CPMV quimérico. Após a inoculação, as plantas se desenvolveram a 25°C com um fotoperíodo de 16 horas à luz 8 horas no escuro durante duas a três semanas e observou-se a formação de sintomas. As plantas inocula- das com WT inativado ou partículas de CPMV quimérico não mostraram sin- tomas, porém as plantas inoculadas com WT ativo ou partículas de CPMV quimérico mostraram sintomas típicos de infecção por CPMV. As folhas ino- culadas com WT inativado ou partículas de CPMV quimérico foram colhidas e processadas para isolamento de partícula viral. 40g de tecido vegetal fo- ram congelados -80C. O tecido da folha congelado foi esmagado pelas mãos e despejado em um misturador de alta velocidade Waring, código de produto 8011S. 120ml de 30mM base Tris frio pH 7,50 0,2mM de PMSF fo- ram despejados nas folhas esmagadas. As folhas foram trituradas 2 vezes durante 3 segundos em alta velocidade. A solução foi decantada em uma garrafa centrífuga de 500ml. O misturador foi lavado com 30ml de tampão frio e a lavagem foi despejada em uma garrafa centrífuga de 500ml. A solu- ção foi centrifugada a 15.000G durante 30 minutos para remover os resíduos celulares da planta. O sobrenadante foi decantado em um cilindro graduado. Para precipitar o vírus CPMV, a solução de PEG 6000 fria (20% de PEG 6000, 1M de NaCI) foi adicionada ao sobrenadante para conduzir a concen- tração de PEG final para 4% de PEG 6000 com 0,2M de NaCI1 e a solução foi suavemente misturada. A solução foi permitida para se precipitar durante 1 hora em gelo. A solução precipitada de vírus foi, então, centrifugada a 15.000G durante 30 minutos para coletar as partículas virais no pélete. O sobranadante foi despejado e o pélete foi imediatamente ressuspenso no tampão de PBS, pH 7,4. As amostras foram avaliadas pela presença de par- tícula viral com SDS-PAGE. SDS-PAGE foi executado em 4 a 12% de Bis- Tris de Invitrogen Nupage, 12 gel, código de produto NP0322. O gel foi exe- cutado com uma queda de voltagem de 150V durante 60 minutos. O tampão de corrida era um tampão de corrida MES SDS da Invitrogen Nupage, códi- go de produto NP0002. Nenhuma partícula viral foi detectada. Exemplo 10 - Imunização de Camundongos com Partículas de CPMV Inati- vado que Contêm Epitopo PA.
Camundongos fêmea Balb/c com 7 semanas de idade foram injetados três vezes de forma intraperitoneal com 100 pg de CPMV-PA inati- vado purificado na presença de adjuvante. Os camundongos de controle receberam partículas de CPMV inativado com peptídeo ou apenas o adju- vante em PBS, pH 7,0. 100 μΙ de adjuvante Ribi (R-700; Ribi Immunochem Research, Hamilton, Montana) misturados com 100 μΙ da amostra foram u- sados. O volume total usado para administração é 200 μΙ. As injeções foram dadas em intervalos de 3 semanas.
Para imunização intranasal, CPMV-PA inativado, sem adjuvan- tes, foi administrado em camundongos anestesiados. Um volume total de 100 μl foi administrado nas duas narinas (50 μl em cada narina). Os camun- dongos de controle receberam CPMV inativado com peptídeo não- relacionado ou apenas PBS, pH 7,0.
As amostras de sangue foram obtidas 1 dia antes da primeira administração e 2 semanas após cada uma das duas administrações subse- qüentes.
O sumário dos estudos de imunização de camundongos é pro- porcionado abaixo: Tabela 4
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Exemplo 11 - Imunização de Primatas Não-Humanos com Partículas de. CPMV Inativado que Contêm Epitopos PA.
As partículas de CPMV inativado que contêm epitopos PA foram testadas por sua capacidade de gerar respostas de anticorpos aos peptí- deos de antraz co-expressos quando administrados em macacos rhesus. Quatro macacos foram imunizados de forma intramuscular com as constru- ções peptídicas de CPMV-PA inativado e um macaco com o controle de CPMV tipo selvagem inativado. Cada dose imunizante consiste em 2 mg da mistura de vírus-peptídeo de todas as 16 construções de PA-CPMV. Os a - nimais foram vacinados nos dias O, 7, 14, e 28.
Os anticorpos IgG e IgA foram monitorados utilizando ensaios ELISA com proteína PA como um alvo. Três a cinco ml de sangue foram retirados em heparina em cada dia de imunização. As células e plasma fo- ram separados e criopreservados. Os macacos anestesiados com cloridrato de cetamina foram submetidos à broncoscopia nos dias O, 14 e 28 e espé- cimes de lavagem brônquica obtidos e criopreservados. Os lavados brônqui- cos e plasma foram derretidos e os títulos de anticorpo IgG e IgA medidos em ensaios ELISA. Altos títulos tanto de anticorpos IgG como IgA foram de- tectados no plasma e lavado brônquico. Os resultados são mostrados na Figura 7 e 8.
Exemplo 12 - Imunização de Camundongos com Partículas de CPMV Inati- vado que Contêm o Epitopo M2e do Vírus Influenza
Camundongos fêmeas Balb/c com 7 semanas de idade foram injetados três vezes de forma intraperitoneal com 100 μg de CPMV inativado que expressa um peptídeo M2 influenza na presença de um adjuvante. A seqüência é SLLTEVETPIRNEGCRCNDSSD (SEQ ID NO: 24). Os camun- dongos de controle receberam partículas de CPMV inativado com peptídeo não-relacionado ou apenas adjuvante em PBS, pH 7,0. 100 μΙ de adjuvante Ribi (R-700; Ribi Immunochem Research, Hamilton, Montana) misturados com 100 μΙ da amostra foram usados. O volume total volume usado para administração é 200 μΙ. As injeções foram dadas em intervalos de 3 sema- nas.
Para imunização intranasal, o CPMV inativado que contém um peptídeo M2e influenza, sem adjuvantes, foi administrado em camundongos anestesiados. Um volume total de 100 μΙ foi administrado nas duas narinas (50 μl em cada narina). Os camundongos de controle receberam mice inati- vado com peptídeo não-relacionado ou apenas PBS, pH 7,0.
As amostras de sangue foram obtidas 1 dia antes da primeira administração e 2 semanas após cada uma das duas administrações subse- qüentes.
O sumário dos estudos de imunização de camundongos é forne- cido abaixo:
Tabela 6
<table>table see original document page 35</column></row><table>
A descrição anterior é ilustrativa da presente invenção, e não deve ser interpretada como uma limitação da mesma. A invenção é definida pelas seguintes reivindicações, com seus equivalentes incluídos no presente documento. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110> Rasochova, Lada
Phelps, Jamie Patrick
<120> "PARTÍCULAS VIRAIS DE PLANTAS E MÉTODOS PARA A INATIVAÇÃO DA MESMA" <130> DOW-200P <160> 24
<170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 25 <212> PRT
<213> Bacillus anthracis <400> 1
Ser Asn Ser Arg Lys Lys Arg Ser Thr Ser Ala Gly Pro Thr Val Pro 1 5 10 15
Asp Arg Asp Asn Asp Gly Ile Pro Asp 20 25
<210> 2 <211> 25 <212> PRT
<213> Baeillus anthracis <400> 2
Ser Pro Glu Ala Arg His Pro Leu Val Ala Ala Tyr Pro Ile Val His 1 5 10 15
Val Asp Met Glu Asn Ile Ile Leu Ser 20 25
<210> 3 <211> 25 <212> PRT
<213> Baeillus anthracis <400> 3
Arg Ile Ile Phe Asn Gly Lys Asp Leu Asn Leu Val Glu Arg Arg Ile 1 5 10 15 Ala Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu
20
25
<210> 4 <211> 26 <212> PRT
<213> Bacillus anthracis <400> 4
Glu Arg Ile Ile Phe Asn Gly Lys Asp Leu Asn Leu Val Glu Arg Arg 1 5 10 15
Ile Ala Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu
<210> 5 <211> 25 <212> PRT
<213> Bacillus anthracis <400> 5
Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys 1 5 10 15
Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn Pro Asn
<210> 6 <211> 21 <212> PRT
<213> Bacillus anthracis <400> 6
Ser Asp Phe Glu Lys Val Thr Gly Arg Ile Asp Lys Asn Val Ser Pro 1 5 10 15
Glu Ala Arg His Pro 20
<210> 7 <211> 25 <212> PRT
20
25
20
25 <213> Bacillus anthracis <400> 7
His Val Asp Met Glu Asn Ile Ile Leu Ser Lvs Asn Glu Asp Gln Ser 15 10 15
Thr Gln Asn Thr Asp Ser Gln Thr Arg 20 25
<210> 8 <211> 25 <212> PRT
<213> Bacillus anthracis <400> 8
Thr Asp Ser Gln Thr Arg Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Thr Ser Arg 1 5 10 15
Thr His Thr Ser Glu Val His Gly Asn 20 25
<210> 9 <211> 26 <212> PRT
<213> Bacillus anthracis <400> 9
Glu Thr Asp Ser Gln Thr Arg Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Thr Ser 1 5 10 15
Arg Thr His Thr Ser Glu Val His Gly Asn 20 25
<210> 10 <211> 25 <212> PRT
<213> Bacillus anthracis <400> 10
His Gly Asn Ala Glu Val His Ala Ser Phe Phe Asp Ile Gly Gly Ser 1 5 10 15
Val Ser Ala Gly Phe Ser Asn Ser Asn 20 25
<210> 11 <211> 21 <212> PRT
<213> Bacillus anthracis <400> 11
Ser Asn Ser Asn Ser Ser Thr Val Ala Ile Asp His Ser Leu Ser Leu 1 5 10 15
Ala Gly Glu Arg Thr 20
<210> 12 <211> 18 <212> PRT
<213> Bacillus anthracis <400> 12
Glu Thr Met Gly Leu Asn Thr Ala Asp Thr Ala Arg Leu Asn Ala Asn
15 10 15
Ile Arg
<210> 13
<211> 24
<212> PRT
<213> Bacillus anthracis <400> 13
Glu Pro Thr Thr Ser Leu Val Leu Gly Lys Asn Gln Thr Leu Ala Thr 15 10 15
Ile Lys Ala Lys Glu Asn Gln Glu 20
<210> 14 <211> 24 <212> PRT
<213> Bacillus anthracis <400> 14 Pro Ser Lys Asn Leu Ala Pro Ile Ala Leu Asn Ala Gln Asp Asp Phe 1 5 10 15
Ser Ser Thr Pro Ile Thr Met Asn 20
<210> 15 <211> 20 <212> PRT
<213> Bacillus anthracis <400> 15
Ser Glu Val Leu Pro Gln Ile Gln Glu Thr Thr Ala Arg Ile Ile Phe 1 5 10 15
Asn Gly Lys Asp 20
<210> 16 <211> 25 <212> PRT
<213> Bacillus anthracis <400> 16
Asn Gly Lys Asp Leu Asn Leu Val Glu Arg Arg Ile Ala Ala Val Asn
}
15 10 15
Pro Ser Asp Pro Leu Glu Thr Thr Lys 20 25
<210> 17 <211> 25 <212> PRT
<213> Bacillus anthracis <400> 17
Glu Thr Thr Lys Pro Asp Met Thr Leu Lys Glu Ala Leu Lys Ile Ala 1 5 10 15
Phe Gly Phe Asn Glu Pro Asn Gly Asn 20 25
<210> 18 <211> 23 <212> PRT
<213> Bacillus anthracis <400> 18
Gln Gly Lys Asp Ile Thr Glu Phe Asp Phe Asn Phe Asp Gln Gln Thr 1 5 10 15
Ser Gln Asn Ile Lys Asn Gln 20
<210> 19 <211> 20 <212> PRT
<213> Bacillus anthracis <400> 19
Asp Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser Val Val Lys Glu 1 5 10 15
Ala His Arg Glu 20
<210> 20 <211> 25 <212> PRT
<213> Bacillus anthracis <400> 20
Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu Leu Leu Asn Ile Asp 1 5 10 15
Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly 20 25
<210> 21 <211> 19 <212> PRT
<213> Bacillus anthracis <400> 21
Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe Ile 1 5 10 15
Asp Phe Lys
<210> 22
<211> 22
<212> PRT
<213> Bacillus anthracis
<400> 22
Thr Lys Glu Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser 1 5 10 15
Thr Asn Gly Ile Lys Lys 20
<210> 23
<211> 764
<212> PRT
<213> Bacillus anthracis
<400> 23
Met Lys Lys Arg Lys Val Leu Ile Pro Leu Met Ala Leu Ser Thr Ile 1 5 10 15
Leu Val Ser Ser Thr Gly Asn Leu Glu Val Ile Gln Ala Glu Val Lys 20 25 30
Gln Glu Asn Arg Leu Leu Asn Glu Ser Glu Ser Ser Ser Gln Gly Leu 35 40 45
Leu Gly Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Asn Phe Gln Ala Pro Met Val Val 50 55 60
Thr Ser Ser Thr Thr Gly Asp Leu Ser Ile Pro Ser Ser Glu Leu Glu 65 70 75 80
Asn Ile Pro Ser Glu Asn Gln Tyr Phe Gln Ser Ala Ile Trp Ser Gly 85 90 95
Phe Ile Lys Val Lys Lys Ser Asp Glu Tyr Thr Phe Ala Thr Ser Ala 100 105 110
Asp Asn His Val Thr Met Trp Val Asp Asp Gln Glu Val Ile Asn Lys 115 120 125 Ala Ser Asn Ser Asn Lys Ile Arg Leu Glu Lys Gly Arg Leu Tyr Gln
130 135 140
lle Lys Ile Gln Tyr Gln Arg Glu Asn Pro Thr Glu Lys Gly Leu Asp 145 150 155 160
Phe Lys Leu Tyr Trp Thr Asp Ser Gln Asn Lys Lys Glu Val Ile Ser
165 170 175
Ser Asp Asn Leu Gln Leu Pro Glu Leu Lys Gln Lys Ser Ser Asn Ser
180 185 190
Arg Lys Lys Arg Ser Thr Ser Ala Gly Pro Thr Val Pro Asp Arg Asp
195 200 205
Asn Asp Gly Ile Pro Asp Ser Leu Glu Val Glu Gly Tyr Thr Val Asp
210 215 220
Val Lys Asn Lys Arg Thr Phe Leu Ser Pro Trp Ile Ser Asn Ile His 225 230 235 240
Glu Lys Lys Gly Leu Thr Lys Tyr Lys Ser Ser Pro Glu Lys Trp Ser
245 250 255
Thr Ala Ser Asp Pro Tyr Ser Asp Phe Glu Lys Val Thr Gly Arg Ile
260 265 270
Asp Lys Asn Val Ser Pro Glu Ala Arg His Pro Leu Val Ala Ala Tyr
275 280 285
Pro Ile Val His Val Asp Met Glu Asn Ile Ile Leu Ser Lys Asn Glu
290 295 300
Asp Gln Ser Thr Gln Asn Thr Asp Ser Glu Thr Arg Thr Ile Ser Lys 305 310 315 320
Asn Thr Ser Thr Ser Arg Thr His Thr Ser Glu Val His Gly Asn Ala
325 330 335
Glu Val His Ala Ser Phe Phe Asp Ile Gly Gly Ser Val Ser Ala Gly
. 340 345 350
Phe Ser Asn Ser Asn Ser Ser Thr Val Ala Ile Asp His Ser Leu Ser
355 360 365
Leu Ala Gly Glu Arg Thr Trp Ala Glu Thr Met Gly Leu Asn Thr Ala 370 375 380 Asp Thr Ala Arg Leu Asn Ala Asn Ile Arg Tyr Val Asn Thr Gly Thr 385 390 395 400
Ala Pro Ile Tyr Asn Val Leu Pro Thr Thr Ser Leu Val Leu Gly Lys
405 410 415
Asn Gln Thr Leu Ala Thr Ile Lys Ala Lys Glu Asn Gln Leu Ser Gln
420 425 430
Ile Leu Ala Pro Asn Asn Tyr Tyr Pro Ser Lys Asn Leu Ala Pro Ile
435 440 445
Ala Leu Asn Ala Gln Asp Asp Phe Ser Ser Thr Pro Ile Thr Met Asn
450 455 460
Tyr Asn Gln Phe Leu Glu Leu Glu Lys Thr Lys Gln Leu Arg Leu Asp 465 470 475 480
Thr Asp Gln Val Tyr Gly Asn Ile Ala Thr Tyr Asn Phe Glu Asn Gly
485 490 495
Arg Val Arg Val Asp Thr Gly Ser Asn Trp Ser Glu Val Leu Pro Gln
500 505 510
Ile Gln Glu Thr Thr Ala Arg Ile Ile Phe Asn Gly Lys Asp Leu Asn
515 520 525
Leu Val Glu Arg Arg Ile Ala Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Glu
530 535 540
Thr Thr Lys Pro Asp Met Thr Leu Lys Glu Ala Leu Lys Ile Ala Phe 545 550 555 560
Gly Phe Asn Glu Pro Asn Gly Asn Leu Gln Tyr Gln Gly Lys Asp Ile
565 570 575
Thr Glu Phe Asp Phe Asn Phe Asp Gln Gln Thr Ser Gln Asn Ile Lys
580 585 590
Asn Gln Leu Ala Glu Leu Asn Ala Thr Asn Ile Tyr Thr Val Leu Asp
595 600 605
Lys Ile Lys Leu Asn Ala Lys Met Asn Ile Leu Ile Arg Asp Lys Arg
610 615 620
Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser Val 625 630 635 640 Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu
645 650 655
Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile
660 665 670
Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile Asn Asp Arg
675 680 685
Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe
690 695 700
Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn 705 710 715 720
Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile
725 730 735
Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly Ile Lys Lys
740 745 750
Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly
755 760
<210> 24 <211> 22 <212> PRT
<213> Bacillus anthracis <400> 24
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Gly Cys Arg 1 5 10 15
Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20

Claims (26)

1. Método para inativar um vírus de planta que compreende: administrar sulfato de amônio no material vegetal que expressão uma partícula similar a vírus em que o material vegetal é selecionado do grupo que consiste em plantas, tecidos vegetais, células vegetais e proto- plastos em um pH acima de 8,0; incubar o material vegetal durante pelo menos dez horas para produzir uma partícula similar a vírus (VLP); e colher a VLP inativada do material vegetal.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, que compreende adicionalmente ao menos um peptídeo estranho incorporado no vírus.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o dito vírus consiste em um vírus RNA não-envelopado.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a dita VLP inativada apresenta um peptídeo bioativo heterólogo.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o dito peptí- deo é um antígeno.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o dito pep- tídeo é um epitopo.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o sulfato de amônio é administrado em uma concentração de 0,5M a 1,0M.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o pH é pH 9,0.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o material vegetal é incubado entre 10°C a 40°C.
10. Método, de acordo com a reivindicação 2, em que o dito mé- todo compreende ligar o dito vírus da planta a uma coluna de cromatografia por interação hidrofóbica em 0,7 M de (NH4)2SO4 em pH 7, vírus ligado me- diante lavagem com 0,7 M de (NH4)2SO4 em pH 9, e eluir o dito vírus com 0,7 M de (NH4)2SO4 em pH 9.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o vírus possui um capsídeo que é icosaédrico.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o vírus é de uma família selecionada do grupo que consiste em Bromoviridae, Como- viridae, e Tombusviridae.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o vírus é de um gênero selecionado do grupo que consiste em Bromovirus, Comovi- rus, Tombusvirus, Alfamovirusl e Sobemovirus.
14. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o vírus é selecionado do grupo que consiste em vírus do mosaico do feijão caupi, ví- rus do mosqueado clorótico do feijão caupi, vírus do enfezamento do toma- teiro, vírus do mosaico da alfafa, vírus do mosaico do capim bromo e vírus do mosaico do feijoeiro do sul
15. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o vírus compreende proteínas capsidiais e os peptídeos são antígenos fundidos com proteínas capsidiais.
16. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o peptídeo é selecionado do grupo que consiste em um hormônio peptídico, uma enzi- ma, um fator do crescimento, um anticorpo, um imunorregulador, e uma cito- cina.
17. Método, de acordo com a reivindicação 3, em que o dito mé- todo compreende, adicionalmente, converter uma seqüência de RNA viral em uma transcrição de cDNA de comprimento total, clonar o dito cDNA em um vetor, e modificar o dito cDNA ao inserir um segmento de DNA estranho em uma região capaz de tolerar tal inserção sem interromper a replicação de RNA, formação de partícula ou infecciosidade.
18. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o peptídeo estranho incorporado no vírus é selecionado do grupo que consiste em uma subunidade de vírus influenza, vírus da encefalite eqüina do leste, parvoviro- se canina, e Bacillus anthracis.
19. Método para produzir uma VLP não-infecciosa que compre- ende: administrar sulfato de amônio no material vegetal selecionado do grupo que consiste em plantas, tecidos vegetais, células vegetais e proto- plastos e falta ao menos uma parte do RNA presente em um vírus de planta em um pH acima de 8,0; incubar o material vegetal durante pelo menos dez horas; e colher a VLP inativada do material vegetal, onde a dita VLP não é capaz de se replicar.
20. Vacina que compreende uma VLP em que a dita vacina compreende ao menos um peptídeo estranho incorporado no vírus e a vaci- na é produzida por um método que compreende administrar sulfato de amô- nio no material vegetal selecionado do grupo que consiste em plantas, teci- dos vegetais, células vegetais e protoplastos em um pH acima de 8,0 para produzir uma VLP inativada; incubar o material vegetal durante ao menos dez horas; e colher a VLP inativada do material vegetal.
21. Vacina, de acordo com a reivindicação 20, em que o peptí- deo de VLP apresentado obtém uma resposta imune quando a dita VLP for administrada em um mamífero.
22. Vacina, de acordo com a reivindicação 20, em que a vacina serve para vírus influenza, vírus da encefalite eqüina do leste, parvovirose canina ou BaciHus anthracis.
23. Vacina, de acordo com a reivindicação 20, em que o peptí- deo é um epitopo.
24. Vacina, de acordo com a reivindicação 23, em que o epitopo é um patógeno viral, um patógeno bacteriano ou câncer.
25. Vacina, de acordo com a reivindicação 20, em que a dita va- cina é uma vacina de subunidade, em que o dito peptídeo é uma parte de um antígeno e a dita parte é eficaz como uma vacina.
26. Vacina, de acordo com a reivindicação 20, em que o dito peptídeo estranho compreende SEQ ID NO: 23.
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