WO1995002061A1 - Verfahren zur biotechnologischen herstellung von alkoholen, aldehyden und carbonsäuren - Google Patents

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    • Y10S435/853—Lactobacillus
    • Y10S435/855—Lactobacillus brevis

Definitions

  • the invention relates to a process for the biotechnological production of alcohols, aldehydes and carboxylic acids.
  • Chemical oxidations usually show low regional specificities. In addition, toxic and / or difficult to handle reagents are often required for the oxidation.
  • the genus Pseudomonas is known to oxidize p-cymen in three steps via alcohol and aldehyde to p-isopropylbenzoic acid (J. Bacteriol. 129, 1356-1364 and 1365-1374 (1977) and ibid. 171, 5155-5161 ( 1989)).
  • Aspergillus cellulosae (Phytochemistry, 31, 2725 - 2727 (1992)) and others. to perilla alcohol.
  • Bhattacharyya et al. have in a number of papers (Indian. J. Biochem. 5, 79-91 and 92-101 (1968), Indian. J. Biochem. 3, 144-157 (1966) and Biochem. Biophys. Res. Co mun 29, No. 3, 275-279 (1967)) investigated the oxidation of terpenes (for example, lemons, ⁇ - and ⁇ -pinene) by Pseudomonas PL strains. These PL strains also oxidize p-cyyres to cumic acid (Indian. J. Biochem. 5, 161-167 (1968)).
  • the work cited shows that in addition to the desired methyl group oxidations in benzylic and allylic positions, the microorganisms cause a whole series of additional oxidations on the starting materials used (such as limonene, p-cymene, etc.).
  • EP-OS 442 430, EP-OS 466 042 and EP-OS 477 828 describe technically usable methyl group oxidations.
  • the disadvantage of these reactions is the induction of the microorganisms by e.g. p-xylene as the only source of carbon and energy.
  • the reactions described are limited to 5- and 6-membered heterocycles.
  • the invention relates to a process for the preparation of compounds of the formula I.
  • R 1 is a Wasserstoffato, a C ⁇ - 4 alkyl, C 2 - 4 alkenyl or an optionally substituted aryl group
  • R 2 is a Wasserstoffato, a C ⁇ _ 4 alkyl, C 2 - 4 ⁇ represents alkenyl or an optionally substituted aryl group or dar ⁇
  • R 1 and R 2 together with the carbon atoms to which they are attached a) represent a 6-ring which contains 1 or 2 further double bonds and / or by 1, 2 or 3 halogen atoms, C 4 alkyl, C 2 - 4 -Alkenyl, C ⁇ - 4 -acyl, C ⁇ - 4 alkoxy groups and / or 1 or 2 cyano, amino, C ⁇ _ 4 alkylamino or di-C ⁇ - 4 alkylamino groups and / or a nitro group can and / or to which a further aromatic or heteroaromatic 6-ring can be fused to a ring system which can be substituted by one to four C 4 alkoxy, C 4 alkyl, C 2 4 alkenyl, nitrile , Nitro, carboxyl, C 4 alkoxy carbonyl, amino, C 4 alkylamino, di C 4 alkylamino and / or an optionally substituted benzoyl group and / or one to four halogen atoms ,
  • R 3 represents a hydrogen or halogen atom, a C 4 alkyl or C2 4 alkenyl group, or an optionally halogen-substituted aryloxy or benzoyl group and
  • R 4 represents a -CH 2 OH, or -CHO or -COOH group
  • ⁇ O — R 2 have the meaning given above, selectively oxidized with the aid of a microorganism.
  • Alkyl radicals for R 1 and R 2 are mentioned.
  • Preferred alkyl radicals are methyl, ethyl and propyl radicals.
  • alkenyl residues are vinyl, 5 1-methylvinyl, cis-1-butenyl, trans-1-butenyl, cis-2-butenyl, trans-2-butenyl, 3-butenyl, 2-methyl-1-propenyl- , 2-methyl-2-propenyl, 1-methyl-l-propenyl, l-methyl-2-propenyl and 1-ethylvinyl radicals.
  • the 2-methyl-1-propenyl radical is preferred.
  • R 1 is a substituted aryl group, this preferably carries C 4 alkyl, C 2 4 alkenyl and / or halogen radicals.
  • alkyl radicals methyl, ethyl, n-propyl, 1-methylethyl, butyl, 1-methylpropyl, 2-methylpropyl and 1,1-dimethylethyl groups.
  • Preferred alkyl radicals are methyl, ethyl and n-propyl radicals.
  • alkenyl radicals are vinyl, 1-methylvinyl, cis-1-butenyl, trans-1-butenyl, cis-2-butenyl, trans-2-butenyl, 3-butenyl, 2-methyl-1-propenyl, 2-Methyl-2-propenyl, 1-methyl-1-propenyl, 1-methyl-2-propenyl and 1-ethyl vinyl radicals 0 may be mentioned.
  • the 2-methyl-1-propenyl radical is preferred.
  • Halogen atoms are fluorine, chlorine or bromine. Chlorine is preferred.
  • the number of substituents on the aryl radical is normally 1-3. 1 or 2 radicals are preferred.
  • phenyl and naphthyl radicals in particular may be mentioned for R 1 as aryl radicals.
  • R 2 is a substituted aryl group, this preferably carries C 4 -alkyl, C 2 - 4 alkenyl and / or halogen radicals.
  • alkyl radicals 0 methyl, ethyl, n-propyl, 1-methylethyl,
  • alkyl radicals are methyl, ethyl and propyl radicals.
  • alkenyl radicals are vinyl, 1-methylvinyl, cis-1-butenyl, trans-1-butenyl, cis-2-butenyl, trans-2-butenyl, 3-butenyl, 5-2-methyl-1-propenyl- , 2-methyl-2-propenyl, 1-methyl-l-propenyl, l-methyl-2-propenyl and 1-ethylvinyl radicals.
  • the 2-methyl-1-propenyl radical is preferred.
  • Halogen atoms are fluorine, chlorine or bromine. Chlorine is preferred.
  • the number of substituents on the aryl radical is normally 1-3. Preferably 0 is 1 or 2 radicals.
  • Preferred radicals for R 2 are: phenyl, methyl, p-methoxyphenyl, 1,3-dioxanyl and 5,5-dimethyl-1,3-dioxanyl.
  • the aryl radicals for R 2 include the phenyl and naphthyl radicals. If R 1 and R 2 are part of a ring or ring system, the following should be mentioned as preferred: phenyl, benzoyl, naphthyl, quinolinyl, isoquinolinyl, benzofuryl and benzoxazyl.
  • Alkyl such as methyl, ethyl, propyl, 1-methylethyl, butyl, 1-methylpropyl, 2-methylpropyl, 1,1-dimethylethyl (especially methyl, ethyl and propyl); Alkoxy such as methoxy, ethoxy, propyloxy, 1-methylethoxy, butyloxy, 1-methylpropyloxy, 2-methylpropyloxy, 1,1-dimethylethoxy (especially methoxy and 1-methylethoxy); Alkenyl such as vinyl, 1-methylvinyl, cis-1-propenyl, trans-1-propenyl, 2-propenyl, cis-1-butenyl, trans-1-butenyl, cis-2-butenyl, trans-2-butenyl, 3- Butenyl, 2-methyl-1-propenyl, 2-methyl-2-propenyl, 1-methyl-1-propenyl, 1-methyl-2-propenyl, 1-ethyl vinyl (
  • the number of substituents on the ring is usually 1-3, preferably 1 or 2.
  • Ci_4-alkyl radicals on the amino group in the ring systems in R 1 . and R 2 may be mentioned: ethyl, propyl, 1-methylethyl, butyl, 1-methylpropyl, 2-methylpropyl, 1, 1-dimethylethyl and in particular methyl.
  • R 3 methyl, ethyl, n-propyl, 1-methylethyl, butyl, 1-methylpropyl, 2-methylpropyl, 1,1-dimethylethyl, vinyl, 1-methylvinyl, cis-1-propenyl, trans -1-propenyl, 2-propenyl, cis-1-butenyl, trans-1-butenyl, cis-2-butenyl, trans-2-butenyl, 3-butenyl, 2-methyl-1-propenyl, 2-methyl-2 -propenyl, 1-methyl-l-propenyl, l-methyl-2-propenyl, 1-ethyl vinyl, fluorine, chlorine and bromine.
  • Preferred for R 3 are: methyl, ethyl, n-propyl and 2-methyl-1-propenyl.
  • the new process is particularly suitable for the production of alcohols and especially carboxylic acids.
  • bacteria can be isolated from soil samples and stem collections. Ren or identify who perform the oxidation of the invention.
  • Suitable for the reaction according to the invention are, for example, bacteria which, in the past, are known under the generic names Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Caseobacter, Gordona, Microoccus, Mycobacterium, Nocardia, Planococcus, Proactinomyces, Rhodococcus, Staphylococcus, Serratia and Tsukamurella and specifically under the generic and species names Arthrobacter sp., Bacillus rubropertinctus, Bacillus mycoides roseus, Bacillus rubricus, Corynebacterium rubrum, Gordona lentifragmenta, Gordona rubropertinctus, Gordona rubra, Micrococcus roseus, Micrococcus roseus Micrococcus roseus micrococcus roseus micrococcus roseus micrococcus roseus micrococcus roseus micrococcus roseus micrococcus roseus micrococcus roseus micrococcus roseus micrococcus roseus micrococcus rose
  • the large number of bacteria suitable for the reaction reflects the very varied taxonomic history of the Mycobacteriaceae, Nocardiaceae and Micrococcaceae families with their genus Corynebacterium, Gordona, Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, Tsukamurella, Micrococcus, Staphyloccus and Planocyloccus.
  • the taxonomic position of the genera listed has undergone a major change in recent years and is still in flux because incorrect genus and species names are corrected and existing strains are sorted into new genres. Close kinship relationships exist within these genera and species. Bacteria that action are likely to be found in the above genera and species.
  • Rhodococcus ruber Nocardia pellegrino
  • DSM 43232 Rhodococcus ruber (Rhodococcus rubrus, Nocardia sp.)
  • DSM 43250 Rhodococcus ruber
  • Rhodococcus ruber Rhodococcus rubrus, Nocardia sp.
  • DSM 4325 Rhodococcus ruber (Rhodocococcusia.
  • Nodococcus rub Nodococcus rub (Rhodococcus rubrus, Nocardia sp.), DSM 43335, Rhodococcus ruber (Rhodococcus rubrus, Nocardia sp.) Rhodococcus ruber (Gordona lentifragmenta) IMET 7477, Rhodococcus ruber (Nocardia rubra) LMG 5366, Micrococcus roseus (Micrococcus roseus roseofulvus, Micro ⁇ coccus t Tragus ruber) ATCC 178, Micrococcus roseus (Micro ⁇ coccus rubens, Microcvcusus roseus Microusv ruber) ATCC 186, Micrococcus roseus (Rhodococcus roseus) ATCC 516, Micrococcus roseus (Rhodococcus ruber) ATCC 534 and Micrococcus roseus ATCC 9815.
  • Rhodococcus ruber DSM 8316 strain and mutants derived from it are particularly suitable for oxidation. This strain is characterized by the data determined in the plant.
  • Rhodococcus ruber DSM 8316 is an isolate from soil samples.
  • the methyl group In order to be oxidizable to the corresponding alcohol, aldehyde or carboxylic acid, the methyl group must be in the benzyl or allyl position. If several benzyl- or allyl-containing methyl groups are present in the starting material, usually only one methyl group is selectively oxidized. In rare cases ( ⁇ 5%) another methyl group is oxidized.
  • the starting materials are broken down via the sequence alcohol, aldehyde and carboxylic acid and serve the wild-type strains listed as a source of carbon and energy, it is expedient to obtain the desired products with block mutants of the bacteria mentioned ⁇ teries to work, which lead to the oxidation only to the alcohol, or only to the aldehyde or only to the carboxylic acid.
  • mutagenic substances e.g. Nitrosoguanidines, ethyl methanesulfonate, sodium nitrite, or the effects of electromagnetic radiation such as UV, gamma or X-rays.
  • a corresponding regulation for the production of N-methyl-N'-nitrosoganidine is Biochem. Biophys. Res. Commun. 18, 788 (1965).
  • transposable genetic elements can also be used for mutagenesis.
  • the property of no longer growing on the products of the oxidation as the only C source can be used.
  • the process according to the invention for the oxidation of benzylic and allylic methyl groups on condensed and uncondensed aromatics, heteroaromatics and aliphatics is expediently carried out in such a way that the bacteria or their mutants are cultivated in a suitable medium with a suitable carbon and energy source in the presence of the corresponding starting materials or the starting materials are added after 24 to 72 h of culturing the nutrient solution. Poorly soluble educts are expediently added to the nutrient medium with a commercially available emulsifier (e.g. Tween® 80) as an emulsion.
  • a commercially available emulsifier e.g. Tween® 80
  • the fermentation takes place continuously or discontinuously for 1 to 14 days.
  • the oxidation is carried out with active bacteria, but it is also possible with dormant bacteria, albeit at a much slower rate.
  • Nutrient media containing carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts and possibly small amounts of trace elements and vitamins are suitable.
  • Inorganic or organic nitrogen compounds or materials containing these compounds can be used as nitrogen sources. Examples are ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, brewer's yeast autolysate, soybean flour, wheat gluten, yeast extract, yeast, urea and potato protein.
  • carbon sources which can be used are sugars such as glucose, polyols such as glycerol or fats such as soybean oil.
  • inorganic salts examples include the salts of calcium, magnesium, manganese, potassium, zinc, copper and iron. Phosphate ion should be mentioned in particular as the anion of the salts.
  • growth factors are added to the nutrient medium, e.g. Biotin, riboflavin and / or other vitamins.
  • the mixing ratio of the nutrients mentioned depends on the type of fermentation and is determined in each individual case.
  • educt concentrations of about 1 to 100 g / 1 are suitable for carrying out the process according to the invention, concentrations of about 3 to 50 g / 1 are preferred, concentrations of about 5 to 20 g / 1 are particularly preferred.
  • breeding conditions are determined so that the best possible yields are achieved.
  • Preferred breeding temperatures are 15 ° C to 40 ° C. Temperatures between 25 ° C and 35 ° C are particularly advantageous.
  • the pH is preferably held in a range from 3 to 9. PH values between 5 and 8 are particularly advantageous. In general, an incubation period of 15 to 120 hours is sufficient. The maximum amount of the desired product accumulates in the medium within this time.
  • the reaction conversion can easily be monitored and controlled by taking a sample and examining it, for example by gas chromatography or by means of HPLC analysis.
  • the products can be isolated and purified from the culture liquid by known methods.
  • the solid biomass is expediently separated from the nutrient medium, the valuable substance is extracted, for example with an organic solvent, if appropriate after the medium has been acidified beforehand, and the valuable substance is isolated from the extracted phase.
  • Column chromatographic methods are also expedient for the workup. Examples
  • the culture broths (see Tables 1 and 3) were then worked up and analyzed (cf. Example 4).
  • the products were identified by GC, GC / MS and IH-NMR. Authentic, chemically synthesized samples served as reference.
  • the 3-formyl-2-methyl-2-propenoic acid (2,2-dimethylpropylene) acetal (formula III) is a new compound which is well suited for the production of polyenes and carotenoids.
  • Example 2 Analogously to Example 1, the microorganisms listed in Table 2 were grown in medium A. In each case 5 g / l of the starting materials mentioned in Table 3 had been added to the medium. Table 3 also shows the products detected as in Example 1.
  • Rhodococcus ruber IMET 7308, IMET 7337, IMET 7437 and IMET 7477
  • DSM 8316 was grown in a 500 ml Erlenmeyer flask in 100 ml medium A. 5 g / 1 of 2- (4-methylphenoxy) propane was added to the medium. After 24 h and 48 h of incubation, a further 2.5 g / l of starting material were added. After 120 h of incubation, the culture broth was worked up. In addition to 4-isopropoxybenzoic acid as the main product, small quantities of 4-isopropoxybenzaldehyde and 4-isopropoxybenzyl alcohol were identified as products. The products were identified as described in Example 1.
  • DSM 8316 was grown in 20 ml of medium B overnight (30 ° C., 120 rpm, 16 h ) . The cells were then harvested (centrifugation: 10 min, 4 ° C., 5000 g) and washed twice with 100 mM Tris / HCl buffer ( pH 7.2). The cells obtained in this way were adjusted with the buffer to an optical density at 600 nm of 0.75.
  • the strain DSM 8316 was identified at the DSM (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Braunschweig) as Rhodococcus ruber.
  • the determination protocol is as follows:
  • Mycolic acids chain length of C 30 -C 50
  • Fatty acid pattern unbranched saturated and unsaturated fatty acids plus tuberculostearic acid. This fatty acid pattern is diagnostic for rhodococci and their relatives. 5 5. Menaquinones: MK-8 (H 2 )
  • DSM 8316 is a Rhodococcus ruber strain with a Willcox Propability of 90%.

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Abstract

Es wird ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Alkoholen, Aldehyden und Carbonsäuren durch Oxidation von Verbindungen der Formel R<1>-C(CH3)=CR<2>R<3>, worin R<1>, R<2> und R<3> die in der Beschreibung angegebene Bedeutung besitzen, mit Hilfe von Mikroorganismen beschrieben.

Description

Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Alkoholen, Aldehyden und Carbonsäuren
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnologischen Her¬ stellung von Alkoholen, Aldehyden und Carbonsäuren.
Hochfunktionalisierte Alkohole, Aldehyde und Carbonsäuren sind interessante und gesuchte Produkte für die Herstellung von Phar- aka, Polymeren, Feinchemikalien usw., die oft durch Oxidation entsprechender Vorstufen synthetisiert werden.
Chemische Oxidationen zeigen in der Regel geringe Regio- spezifitäten. Außerdem werden für die Oxidation oft toxische und/oder schwer handhabbare Reagenzien benötigt.
Von Bakterien ist die Fähigkeit zur Oxidation von Methylgruppen prinzipiell bekannt.
So beschreiben Raymond et al (Appl. Microbiol. 15, 857 - 865 (1967) ) die Oxidation von Methylgruppen durch Cooxidation mit n-Paraffinen bei der Gattung Nocardia.
Von der Gattung Pseudomonas ist bekannt, daß sie p-Cymen in drei Schritten über den Alkohol und Aldehyd zur p-lsopropylbenzoesäure oxidiert (J. Bacteriol. 129, 1356 - 1364 und 1365 - 1374 (1977) und ebenda 171, 5155 - 5161 (1989)).
Neben dieser Oxidation benzylischer Methylgruppen ist auch die Oxidation allylischer Methylgruppen mit Hilfe einer Reihe von Mikroorganismen bekannt.
So beschreiben Noma et al. die Oxidation von Limonen durch
Aspergillus cellulosae (Phytochemistry, 31, 2725 - 2727 (1992)) u.a. zu Perillaalkohol.
Pseudomonas incognita oxidiert Linalool u.a. zu 8-Hydroxylinalool (J. Bacteriol. 171, 5155 - 5161 (1989)).
Bhattacharyya et al. haben in einer ganzen Reihe von Arbeiten (Indian. J. Biochem. 5, 79 - 91 und 92 - 101 (1968), Indian. J. Biochem. 3, 144 - 157 (1966) und Biochem. Biophys. Res. Co mun. 29, No. 3, 275 - 279 (1967)) die Oxidation von Terpenen (z.B. Li¬ monen, α- und ß-Pinen) durch Pseudomonas PL-Stämme untersucht. Diese PL-Stämme oxidieren auch p-Cyrαen zur Cuminsäure (Indian. J. Biochem. 5, 161 - 167 (1968)). Die angeführten Arbeiten zeigen jedoch, daß neben den gewünschten Methylgruppenoxidationen in benzylischer und allylischer Position durch die Mikroorganismen eine ganze Reihe zusätzlicher Oxidationen an den eingesetzten Edukten (wie Limonen, p-Cymen etc.) passieren.
Die in CH-PS 677791 und Tetrahedron 48, 6681 - 6688 (1992)) be¬ schriebene Oxidation einer allylischen Methylgruppe von Terpenen mit Mikroorganismen der Gattungen Bacillus, Pseudomonas, Absidia, Rhizopus, Streptomyces, Mycobacterium, Cunninghamella, Nocardia etc. ist ebenfalls mit dem Problem von Nebenreaktionen behaftet.
Die beschriebenen Reaktionen sind deshalb technisch nicht anwend¬ bar.
EP-OS 442 430, EP-OS 466 042 und EP-OS 477 828 beschreiben tech¬ nisch nutzbare Methylgruppenoxidationen. Nachteil dieser Umsetzungen ist jedoch die Induktion der Mikroorganismen durch z.B. p-Xylol als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle. Außer- dem sind die beschriebenen Reaktionen auf 5- und 6-gliedrige He- terozyklen beschränkt.
Technische Verfahren, mit Mikroorganismen, die sowohl benzylische als auch allylische Methylgruppenpositionen bei einer breiten Pallette von aromatischen, heteroaromatischen und aliphatischen Substanzen selektiv oxidieren, sind bisher nicht bekannt.
Es wurde nun ein technisch brauchbares Verfahren mikrobiellen Herstellung von Alkoholen, Aldehyden und Carbonsäuren gefunden.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I
Rl\c^R
I, R2^C^R3
worin
R1 ein Wasserstoffato , eine Cι-4-Alkyl-, C2-4-Alkenyl- oder eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe ist R2 ein Wasserstoffato , eine Cι_4-Alkyl-, C2-4~Alkenyl- oder eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe dar¬ stellt oder
R1 und R2 zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind a) einen 6-Ring darstellen, der 1 oder 2 weitere Doppelbindungen enthalten und/oder durch 1, 2 oder 3 Halogenatome, Cι-4-Alkyl-, C2-4-Alkenyl-, Cι-4-Acyl-, Cι-4-Alkoxygruppen und/oder 1 oder 2 Cyano-, Amino-, Cι_4-Alkylamino- oder Di-Cι-4-alkylaminogruppen und/oder eine Nitrogruppe substituiert sein kann und/oder an den ein weiterer aromatischer oder heteroaromatischer 6-Ring zu einem Ringsystem ankondensiert sein kann, das durch ein bis vier Cι-4-Alkoxy-, Cι-4-Alkyl-, C2-4-Alkenyl-, Nitril-, Nitro-, Carboxyl-, Cι-4-Alkoxy- carbonyl-, Amino-, Cι_4-Alkylamino-, Di-Cι-4-alkylamino- und/oder eine gegebenenfalls substituierte Benzoyl- gruppe und/oder ein bis vier Halogenatome substituiert sein kann, oder b) einen heterocyclischen 5-Ring dar- stellen, der 1, 2 oder 3 Heteroatome enthält und/oder eine weitere Doppelbindungen enthalten kann und an den ein weiterer aromatischer oder heteroaromatischer Ring ankondensiert sein kann, der durch ein bis vier Cι-4-Alkoxy-, Cι-4-Alkyl-, C2-4-Alkenyl-, Nitril-, Nitro- Carboxyl-, Cι_4-Alkoxycarbonyl-, Amino-, Cι-4-Alkyl- amino-, Di-Cι-4-alkylamino- und/oder eine gegebenen¬ falls substituierte Benzoylgruppe und/oder ein bis vier Halogenatome substituiert sein kann,
R3 ein Wasserstoff- oder Halogenatom, eine Cι-4-Alkyl- oder C2-4~Alkenylgruppe, oder eine gegebenenfalls halogensubstituierte Aryloxy- oder Benzoylgruppe dar¬ stellt und
R4 eine -CH2OH-, oder -CHO- oder -COOH-Gruppe bedeutet,
welches darin besteht, daß man eine Verbindung der Formel II
Figure imgf000005_0001
worin ΈO—R2 die oben angegebene Bedeutung besitzen, mit Hilfe eines Mikroorganismus selektiv oxidiert. Als Alkylreste seien für R1 und R2 genannt: Methyl-, Ethyl-, ■ n-Propyl-, 1-Methylethyl-, Butyl-, 1-Methylpropyl-, 2-Methyl- propyl- und 1,1-Dimethylethylgruppen. Bevorzugte Alkylreste sind Methyl-, Ethyl- und Propylreste. Als Alkenylreste sind Vinyl-, 5 1-Methylvinyl-, cis-1-Butenyl, trans-1-Butenyl-, cis-2-Butenyl, trans-2-Butenyl, 3-Butenyl-, 2-Methyl-1-propenyl-, 2-Methyl-2-propenyl-, 1-Methyl-l-propenyl-, l-Methyl-2-propenyl- und 1-Ethylvinylreste zu nennen. Bevorzugt ist der 2-Methyl-l-propenyl-Rest. 0
Ist R1 eine substituierte Arylgruppe, so trägt diese vorzugsweise Cι-4-Alkyl-, C2-4-Alkenyl- und/oder Halogenreste. Als Alkylreste seien genannt: Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, 1-Methylethyl-, Butyl-, 1-Methylpropyl-, 2-Methylpropyl- und 1,1-Dimethylethyl- 5 gruppen. Bevorzugte Alkylreste sind Methyl-, Ethyl- und n-Propyl¬ reste. Als Alkenylreste sind Vinyl-, 1-Methylvinyl-, cis-1-Butenyl, trans-1-Butenyl-, cis-2-Butenyl, trans-2-Butenyl, 3-Butenyl-, 2-Methyl-l-propenyl-, 2-Methyl-2-propenyl-, 1-Methyl-l-propenyl-, l-Methyl-2-propenyl- und 1-Ethylvinylreste 0 zu nennen. Bevorzugt ist der 2-Methyl-l-propenyl-Rest. Als
Halogenatome sind Fluor, Chlor oder Brom zu nennen. Bevorzugt ist Chlor. Die Zahl der Substituenten am Arylrest beträgt normaler¬ weise 1 - 3. Bevorzugt sind 1 oder 2 Reste.
5 Als Arylreste seien für R1 besonders der Phenyl- und Naphthylrest genannt.
Ist R2 eine substituierte Arylgruppe, so trägt diese vorzugsweise Cι-4-Alkyl-, C2-4-Alkenyl- und/oder Halogenreste. Als Alkylreste 0 seien genannt: Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, 1-Methylethyl-,
Butyl-, 1-Methylpropyl-, 2-Methylpropyl- und 1,1-Dimethylethyl- gruppen. Bevorzugte Alkylreste sind Methyl-, Ethyl- und Propylre¬ ste. Als Alkenylreste sind Vinyl-, 1-Methylvinyl-, cis-1-Butenyl, trans-1-Butenyl-, cis-2-Butenyl, trans-2-Butenyl, 3-Butenyl-, 5 2-Methyl-l-propenyl-, 2-Methyl-2-propenyl-, 1-Methyl-l-propenyl-, l-Methyl-2-propenyl- und 1-Ethylvinylreste zu nennen. Bevorzugt ist der 2-Methyl-l-propenyl-Rest. Als Halogenatome sind Fluor, Chlor oder Brom zu nennen. Bevorzugt ist Chlor. Die Zahl der Sub¬ stituenten am Arylrest beträgt normalerweise 1 - 3. Bevorzugt 0 sind 1 oder 2 Reste.
Bevorzugte Reste für R2 sind: Phenyl, Methyl, p-Methoxyphenyl, 1,3-Dioxanyl und 5,5-Dimethyl-l,3-dioxanyl.
5 Als Arylreste seien für R2 besonders der Phenyl- und Naphthylrest genannt. Sind R1 und R2 Teil eines Ringes bzw. Ringsystems, so sind fol¬ gende als bevorzugt zu nennen: Phenyl, Benzoyl, Naphthyl, Chinolinyl, Isochinolinyl, Benzofuryl und Benzoxazyl.
Als Substituenten dieser Ringsysteme sind zu nennen:
Alkyl wie Methyl, Ethyl, Propyl, 1-Methylethyl, Butyl, 1-Methyl- propyl, 2-Methylpropyl, 1,1-Dimethylethyl (insbesondere Methyl, Ethyl und Propyl); Alkoxy wie Methoxy, Ethoxy, Propyloxy, 1-Methylethoxy, Butyloxy, 1-Methylpropyloxy, 2-Methylpropyloxy, 1,1-Dimethylethoxy (insbesondere Methoxy und 1-Methylethoxy) ; Alkenyl wie Vinyl, 1-Methylvinyl, cis-1-Propenyl, trans-1-Propenyl, 2-Propenyl, cis-1-Butenyl, trans-1-Butenyl, cis-2-Butenyl, trans-2-Butenyl, 3-Butenyl, 2-Methyl-1-propenyl, 2-Methyl-2-propenyl, 1-Methyl-l-propenyl, l-Methyl-2-propenyl, 1-Ethylvinyl (insbesondere 2-Methyl-1-propenyl) ; Halogen wie Fluor, Chlor, Brom und Iod (insbesondere Fluor und Chlor) ; Alkoxycarbonyl wie Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Propyloxy- carbonyl, 1-Methylethoxycarbonyl, Butyloxycarbonyl und 1,1-Dimethylethoxycarbonyl (insbesondere Methoxycarbonyl und 1-Methylethoxycarbonyl) .
Die Zahl der Substituenten am Ring beträgt normalerweise 1 - 3, vorzugsweise 1 oder 2.
Als Ci_4-Alkylreste an der Aminogruppe in den Ringsystemen in R1 . und R2 seien genannt: Ethyl, Propyl, 1-Methylethyl, Butyl, 1-Methylpropyl, 2-Methylpropyl, 1, 1-Dimethylethyl und insbeson¬ dere Methyl.
Für R3 seien folgende Reste speziell genannt: Methyl, Ethyl, n- Propyl, 1-Methylethyl, Butyl, 1-Methylpropyl, 2-Methylpropyl, 1,1-Dimethylethyl, Vinyl, 1-Methylvinyl, cis-1-Propenyl, trans-1-Propenyl, 2-Propenyl, cis-1-Butenyl, trans-1-Butenyl, cis-2-Butenyl, trans-2-Butenyl, 3-Butenyl, 2-Methyl-1-propenyl, 2-Methyl-2-propenyl, 1-Methyl-l-propenyl, l-Methyl-2-propenyl, 1-Ethylvinyl, Fluor, Chlor und Brom. Bevorzugt für R3 sind: Methyl, Ethyl, n-Propyl und 2-Methyl-1-propenyl.
Das neue Verfahren eignet sich besonders gut zur Herstellung von Alkoholen und insbesondere Carbonsäuren.
Durch Screening nach der Vorschrift von Drews (Mikrobiologisches Praktikum, 3. Auflage, Springer Verlag, Seite 47 bis 48, 1976) lassen sich aus Bodenproben und Stammsammlungen Bakterien isolie- ren bzw. identifizieren, die die erfindungsgemäße Oxidation durchführen.
Für die erfindungsgemäße Reaktion eignen sich beispielsweise Bak- terien, die in der Vergangenheit unter den Gattungsnamen Arthro- bacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Caseobacter, Gordona, Microoccus, Mycobacterium, Nocardia, Planococcus, Pro- actinomyces, Rhodococcus, Staphylococcus, Serratia und Tsukamu- rella und speziell unter den Gattungs- und Artnamen Arthrobacter sp., Bacillus rubropertinctus, Bacillus mycoides roseus, Bacillus rubricus, Corynebacterium rubrum, Gordona lentifragmenta, Gordona rubropertinctus, Gordona rubra, Micrococcus roseus, Micrococcus roseus roseofulvus, Micrococcus tetragenus ruber, Micrococcus ru- bens, Micrococcus flavoroseus, Micrococcus corallinus, Micrococ- cus agilis, Mycobacterium rubropertinctus, Nocardia corallina, Nocardia rubra, Nocardia sp., Nocardia salmonicolor, Nocardia pellegrino, Proactinoπyces ruber, Proactino yces rubropertinctus, Rhodococcus ruber, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus erythro- polis, Rhodococcus rubra, Rhodococcus rubrus, Rhodococcus sp., Rhodococcus roseus, Rhodococcus lentifragmentus, Rhodococcus agi¬ lis, Serratia rubropertincta und Staphylococcus roseus geführt wurden.
Die Vielzahl der für die Reaktion in Frage kommenden Bakterien spiegelt die sehr wechselvolle taxonomische Historie der Familien Mycobacteriaceae, Nocardiaceae und Micrococcaceae mit ihren Gat¬ tungen Corynebacterium, Gordona, Mycobacterium, Nocardia, Rhodo¬ coccus, Tsukamurella, Micrococcus, Staphylococcus und Planococcus wieder.
Näheres ist The Prokaryotes (ed. Balows A. et al) 1992, Vol II., Bergey's Manual of Determinating Bacteriology, Eighth Edition (ed. Cowan S. et al) 1974, Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (ed. Seneath, P.H.A. et al.) 1986, Vol II, ATCC- Catalogue of Bacteria & Bacteriophages 17th Edition 1989, Kocur, M. et al, Int. J. Syst. Bacteriol. 20, 233 - 240 (1970), und Tsukamura, M. et al, Int. J. Syst. Bacteriol. 25, 377 - 382 (1975) und J. Gen. Microbiol. 68, 15 - 26 (1971), 80, 553 - 555 (1974) und 125, 205 - 208 (1981) zu entnehmen.
Die taxonomische Stellung der aufgeführten Gattungen unterlag in den letzten Jahren einem starken Wandel und befindet sich noch immer im Fluß, da falsche Gattungs- und Artnamen korrigiert werden und bestehende Stämme in neue Gattungen sortiert werden. Innerhalb dieser Gattungen und Arten bestehen enge verwandt¬ schaftliche Beziehungen. Bakterien, die die erfindungsgemäße Re- aktion dμrchführen, sind mit einer guten Wahrscheinlichkeit in den oben genannten Gattungen und Arten zu finden.
Besonders geeignet für die Methylgruppenoxidation sind folgende Stämme:
Rhodococcus ruber (Nocardia pellegrino) DSM 43232, Rhodococcus ruber (Rhodococcus rubrus, Nocardia sp.) DSM 43250, Rhodococcus ruber (Rhodococcus rubrus, Nocardia sp.) DSM 43251, Rhodococcus ruber (Rhodococcus rubrus, Nocardia sp.) DSM 43252, Rhodococcus ruber (Rhodococcus rubrus, Nocardia sp.) DSM 43335, Rhodococcus ruber (Rhodococcus rubrus, Nocardia sp.) DSM 43338, Rhodococcus ruber (Nocardia pellegrino) IMET 7308, Rhodococcus ruber IMET 7337, Rhodococcus ruber (Rhodococcus lentifragmentus, Gordona lentifragmenta) IMET 7437 und Rhodococcus ruber (Gordona lentifragmenta) IMET 7477, Rhodococcus ruber (Nocardia rubra) LMG 5366, Micrococcus roseus (Micrococcus roseus roseofulvus, Micro¬ coccus tetragenus ruber) ATCC 178, Micrococcus roseus (Micro¬ coccus rubens, Micrococcus roseus roseofulvus, Micrococcus tetra- genus ruber) ATCC 186, Micrococcus roseus (Rhodococcus roseus) ATCC 516, Micrococcus roseus (Rhodococcus ruber) ATCC 534 und Micrococcus roseus ATCC 9815.
Die Angaben in den Klammern geben die frühere Stammbezeichnungen wieder.
Ganz besonders eignet sich für die Oxidation der Stamm Rhodococcus ruber DSM 8316, sowie sich davon ableitende Mutanten. Dieser Stamm ist durch die in der Anlage ermittelten Daten charakterisiert.
Bei Rhodococcus ruber DSM 8316 handelt es sich um ein Isolat aus Bodenproben.
Die Methylgruppe muß, um zum entsprechenden Alkohol, Aldehyd oder Carbonsäure oxidierbar zu sein, benzyl- oder allylständig sein. Sind mehrere benzyl- oder allylständige Methylgruppen im Edukt vorhanden, so wird in der Regel nur eine Methylgruppe selektiv oxidiert. In seltenen Fällen (< 5 %) wird eine weitere Methyl- gruppe oxidiert.
Da die Edukte über die Sequenz Alkohol, Aldehyd und Carbonsäure abgebaut werden und den aufgeführten Wildtypstämmen als Kohlen¬ stoff- und Energiequelle dienen, ist es zweckmäßig, zur Gewinnung der gewünschten Produkte mit Blockmutanten der aufgeführten Bak- θ terien zu arbeiten, die die Oxidation nur bis zum Alkohol, oder nur zum Aldehyd oder nur zur Carbonsäure führen.
Zur Erzeugung solcher Blockmutanten können bekannte mikrobiologi- sehe Techniken eingesetzt werden. Zur Auslösung von Mutationen können alle gängigen Methoden verwendet werden wie die Anwendung von mutagenen Substanzen, z.B. Nitrosoguanidine, Ethylmethansul- fonat, Natriumnitrit, oder die Einwirkung von elektromagnetischer Strahlung wie UV-, Gamma- oder Röntgenstrahlung. Eine ent- sprechende Vorschrift zur Herstellung von N-Methyl-N'-nitroso- guanidin ist Biochem. Biophys. Res. Commun. 18, 788 (1965) zu entnehmen. Weiterhin können zur Mutagenese auch transponierbare genetische Elemente verwendet werden.
Zur Isolierung der Mutanten kann beispielsweise die Eigenschaft, auf den Produkten der Oxidation als einziger C-Quelle nicht mehr zu wachsen, benutzt werden.
Das Arbeiten mit solchen Blockmutanten ist eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Oxidation benzylischer und allylischer Methylgruppen an kondensierten und nichtkondensierten Aromaten, Heteroaromaten sowie Aliphaten wird zweckmäßig derart durchgeführt, daß die Bakterien oder deren Mutanten in einem ge¬ eigneten Medium mit einer geeigneten Kohlenstoff- und Energie¬ quelle in Gegenwart der entsprechenden Edukte kultiviert werden oder die Edukte nach 24 bis 72 h Kultivierung der Nährlösung zu¬ gegeben werden. Schwerlösliche Edukte werden zweckmäßig mit einem handelsüblichen Emulgator (z.B. Tween® 80) als Emulsion dem Nähr¬ medium zugegeben.
Die Fermentation erfolgt kontinuierlich oder diskontinuierlich für 1 bis 14 Tage.
In der Regel wird die Oxidation mit aktiven Bakterien durchge¬ führt, sie gelingt jedoch auch mit ruhenden Bakterien, allerdings mit wesentlich geringerer Geschwindigkeit.
Geeignet sind Nährmedien, die Kohlenstoffquellen, Stickstoff¬ quellen, anorganische Salze und gegebenenfalls geringe Mengen an Spurenelementen und Vitaminen enthalten. Als Stickstoffquellen können anorganische bzw. organische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten, verwendet werden. Beispiele sind Ammoniumsalze, Nitrate, Maisquellwasser, Bierhefe- autolysat, Sojabohnenmehl, Weizengluten, Hefeextrakt, Hefe, Harn¬ stoff und Kartoffelprotein.
Als Kohlenstoff uellen können beispielsweise Zucker wie Glucose, Polyole wie Glycerin oder Fette wie Sojaöl verwendet werden.
Beispiele für anorganische Salze sind die Salze von Calcium, Magnesium, Mangan, Kalium, Zink, Kupfer und Eisen. Als Anion der Salze ist besonders das Phosphation zu nennen.
Gegebenenfalls werden dem Nährmedium Wachstumsfaktoren zugesetzt, wie z.B. Biotin, Riboflavin und/oder andere Vitamine.
Das Mischungsverhältnis der genannten Nährstoffe hängt von der Art der Fermentation ab und wird im Einzelfall festgelegt.
Im allgemeinen eignen sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens Eduktkonzentrationen von etwa 1 bis 100 g/1, bevorzugt sind Konzentrationen von etwa 3 bis 50 g/1, besonders bevorzugt sind Konzentrationen von etwa 5 bis 20 g/1.
Die Züchtungsbedingungen werden so festgelegt, daß die best¬ möglichen Ausbeuten erreicht werden. Bevorzugte Züchtungstem¬ peraturen liegen bei 15°C bis 40°C. Besonders vorteilhaft sind Temperaturen zwischen 25°C und 35°C. Vorzugsweise wird der pH-Wert in einem Bereich von 3 bis 9 festgehalten. Besonders vorteilhaft sind pH-Werte zwischen 5 und 8. Im allgemeinen ist eine Inkuba¬ tionsdauer von 15 bis 120 Stunden ausreichend. Innerhalb dieser Zeit reichert sich die maximale Menge des gewünschten Produktes im Medium an.
Der Reaktionsumsatz kann leicht durch Probenentnahme und deren Untersuchung durch beispielsweise Gaschromatographie oder mittels HPLC-Analyse verfolgt und kontrolliert werden. Die Isolierung und Reinigung der Produkte aus der Kulturflüssigkeit kann nach bekannten Methoden erfolgen. Zweckmäßigerweise trennt man die feste Biomasse vom Nährmedium ab, extrahiert den Wertstoff z.B. mit einem organischen Lösungsmittel, gegebenenfalls nach voraus¬ gegangener Ansäuerung des Mediums, und isoliert den Wertstoff aus der extrahierten Phase. Auch säulenchromatographische Verfahren sind für die Aufarbeitung zweckmäßig. Beispiele
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Für die angeführten Beispiele wurden zwei Medien benutzt:
Medium A (Komplexmedium)
10,0 g/i Hefeextrakt
20,0 g/i Glucose
0,5 g/i Magnesiumsulfat-7-hydrat
1,5 g/i Kaliumdihydrogenphosphat
3,6 g/i Dikaliumhydrogenphosphat
2 mg/1 Eisen(II) sulfat-1-hydrat
5 mg/1 ©Titriplex III
100 μg/i Zink(II)sulfat-4-hydrat
300 μg/i Borsäure
200 μg/i Cobalt(II)chlorid-6-hydrat
10 μg/i Kupfer(II)chlorid-2-hydrat
20 μg/i Nickel(II)Chlorid-6-hydrat
30 μg/i Natriummolybdat-2-hydrat
Medium B (Minimalmedium)
5,0 g/i Glucose
2,0 g/i Kaiiumdihydrogenphosphat
0,5 g/i Magnesiumsulfat-7-hydrat
0,2 g/i Calciumchlorid-7-hydrat
2,0 g/i Natriumchlorid
0,5 g/i Harnstoff
2 mg/1 Eisen(II) sulfat-1-hydrat
5 mg/1 ©Titriplex III
100 μg/i Zink(II)sulfat-4-hydrat
300 μg/i Borsäure
200 μg/i Cobalt (II)chlorid-6-hydrat
10 μg/i Kupfer(II)chlorid-2-hydrat
20 μg/i Nickel (II)Chlorid-6-hydrat
30 μg/i Natriummolybdat-2-hydrat
2 μg/i Biotin
2 μg/i Folsäure
200 μg/i p-Aminobenzoesäure
200 μg/i Riboflavin
400 μg/i Ca-Pantothenat
1400 μg/i Nicotinsäure
400 μg/i Pyridoxin/HCl
2000 μg/i Meso-Inosit
400 μg/i Thiamin/HCl Der pH-Wert des Mediums wurde mit 5 N Natronlauge bzw. Kalilauge auf 6,8 eingestellt. Glucose und Phosphat wurden jeweils getrennt bei 121°C für 20 min autoklaviert. Harnstoff, Vitamine sowie die entsprechenden Edukte wurden sterilfiltriert. Edukte, die nicht filtrierbar waren, wurden als autosteril angenommen. Das restli¬ che Medium wurde bei 121°C 20 min autoklaviert.
Beispiel 1
Jeweils 20 ml des entsprechenden Mediums wurden in sterile 100 ml Erlenmeyerkolben gefüllt, die mit einem sterilen Watteverschluß versehen waren. Die Kulturbrühe wurde jeweils mit einer Impföse von DSM 8316 angeimpft. Die in der Tabelle 1 aufgeführten Edukte wurden in einer Konzentration von 5 g/1 im Medium B eingesetzt. Die Kolben wurden bei 28°C und 150 Umdrehungen pro min (UpM) für drei bis zehn Tage schüttelnd inkubiert.
Anschließend wurden die Kulturbrühen (siehe Tabelle 1 und 3) aufgearbeitet und analysiert (vgl. Beispiel 4) . Die Produkte wur- den mit GC, GC/MS und IH-NMR identifiziert. Als Referenz dienten authentische, chemisch synthetisierte Proben.
Tabelle 1
Biotransformation mit DSM 8316 - Edukte und analysierte Produkte
Edukt Produkt 1
4-Isopropyltoluol 4-Isopropylbenzoesäure
2- (4-Methylphenoxy-)propan 4-Isopropoxybenzoesäure
4-Methylanisol 4-Methoxybenzoesäure
4-Methylacetophenon 4-Acetylbenzoesäure
4-Cyanotoluol 4-Cyanobenzoesäure
4-Chlortoluol 4-Chlorbenzoesäure
4-Vinyltoluol 4-Vinylbenzoesäure
4-Nitrotoluol 4-Nitrobenzoesäure
2,3-Dimethyl-4-nitrobenzol 2-Methyl-4-nitrobenzoesäure
2-Chlor-4-methylnitrobenzol 2-Chlor-4-nitrobenzoesäure
2,4-Dimethylbenzophenon 2-Methyl-4-benzoylbenzoesäure
2-Methylnaphthalin 2-Naphthoesäure
2,6-Dimethylnaphthalin 6-Methyl-2-naphthoesäure
6-Methylchinolin 6-Chinolincarbonsäure
2, 6-Dimethylchinolin 2-Methyl-6-chinolincarbonsäure
6-Methylisochinolin 6-Isochinolincarbonsäure Edukt Produkt
p-Xylol p-Tolylsäure
4-tert-Butyltoluol 4-tert-Butylbenzoesäure
2-Methylindol 2-Indolylcarbonsäure
2-Methylbenzoxazol 2-Benzoxazolcarbonsäure
2-Methylbenzofuran Benzofuran-2-carbonsäure
4- (Methyl-1-propenyl-)anisol 4-Methoxy-α-methylzimtsäure
Limonen Perillasäure
2- (2-Methyl-1-propenyl)- 3-Formyl-2-methyl-2-propen- 5,5-dimethyl-l,3-dioxan säure(2,2-dimethyl- propylen)acetal
Das 3-Formyl-2-methyl-2-propensäure(2,2-dimethylpropylen)acetal (Formel III) ist eine neue Verbindung, die sich gut zur Herstel¬ lung von Polyenen und Carotinoiden eignet.
Figure imgf000014_0001
Beispiel 2
Analog Beispiel 1 wurden die in Tabelle 2 aufgeführten Mikroorga¬ nismen in Medium A angezogen. Dem Medium waren jeweils 5 g/1 der in Tabelle 3 genannten Edukte zugesetzt worden. Tabelle 3 sind ebenfalls die analog Beispiel 1 nachgewiesenen Produkte zu ent¬ nehmen.
Tabelle 2 Mikroorganismen
Rhodococcus ruber DSM 43250, DSM 43251, DSM 43252, DSM 43232, DSM 43335 und DSM 43338
Rhodococcus ruber IMET 7308, IMET 7337, IMET 7437 und IMET 7477
Rhodococcus ruber LMG 5366
Micrococcus roseus ATCC 178, ATCC 186, ATCC 516, ATCC 534 und ATCC 9815
Tabelle 3 Biotransfprmation mit unter Tabelle 2 aufgeführten Mikroorganis¬ men - Edukte und analysierte Produkte
Edukt Produkt
2- (4-Methylphenoxy-)propan 4-lsopropoxybenzoesäure
4-Cyanotoluol 4-Cyanobenzoesäure
4-Chlortoluol 4-Chlorbenzoesäure
2-Methylbenzofur n Benzofuran-2-carbonsäure
Limonen Perillasäure
2- (2-Methyl-l-propenyl)- 3-Formyl-2-methyl-2-propen- 5,5-dimethyl-l,3-dioxan säure- (2,2-dimethyl- propylen) -acetal
Beispiel 3
Analog Beispiel 1 wurde DSM 8316 in einen 500 ml Erlenmeyerkolben in 100 ml Medium A gezüchtet. Dem Medium wurde 5 g/1 2-(4-Methyl- phenoxy-)propan zugegeben. Nach 24 h und 48 h Inkubation wurden nochmals 2,5 g/1 Edukt zugegeben. Nach 120 h Inkubation wurde die Kulturbrühe aufgearbeitet. Als Produkte ließen sich neben 4-Iso- propoxybenzoesäure als Hauptprodukt in geringen Mengen 4-Isopro- poxybenzaldehyd und 4-Isopropoxybenzylalkohol identifizieren. Die Identifizierung der Produkte erfolgte wie unter Beispiel 1 be¬ schrieben.
Beispiel 4
a) Herstellung von Blockmutanten
Ausgehend von DSM 8316 wurden, wie in Biochem. Biophys. Res. Commun. 18, 788 (1965) beschrieben, Mutanten selektioniert. Dazu wurde DSM 8316 in 20 ml Medium B über Nacht (30°C, 120 Upm, 16 h) gezüchtet. Anschließend wurden die Zellen geerntet (Zentri- fugation: 10. min, 4°C, 5000 g) und zweimal mit 100 mM Tris/HCl- Puffer (pH 7,2) gewaschen. Die so gewonnenen Zellen wurden mit dem Puffer auf eine optische Dichte bei 600 nm von 0,75 einge¬ stellt. 0,5 ml dieser ZeilSuspension wurden durch Zugabe von 1 % N-Methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin in DMF in Gegenwart von 100 mM Trismaleinsäurepuffer (pH 6,0) mutagenisiert (30 min, Raumtempe¬ ratur, 120 Upm). Das Volumen des Ansatzes betrug 5 ml.
Nach Mutagenese wurden die Zellen zweimal mit 100 M Tris/HCl- Puffer (pH 7,2) gewaschen und eine Verdünnungsreihe in 10er Schritten bis auf 10"7 auf Medium B-Agrar (= Medium B + 20 g/1 Agar) ausplattiert (= Masterplatten) . Nach 4 Tagen Inkubation bei RT wurden die entstandenen Kolonien zur Selektion auf Medium B- Agar-Platten (= "replica-Platten") ohne Glucose mit den entspre¬ chenden Edukten und Produkten als einziger C-Quelle (0,5 g/1), wie in Microbiology, Third Edition, Harper International Edition, 1980 beschrieben, gestempelt. Durch Vergleich der replica-Platten mit den Masterplatten konnten Blockmutanten identifiziert werden. Selektionskriterium für die Blockmutanten war das mangelnde Wachstum auf den Edukten und Produkten als einziger C-Quelle.
Eine der so gewonnenen Blockmutanten (= (4al) wurde in 100 ml Me- dium A in Gegenwart von 5 g/1 2- (4-Methylphenoxy)-propan, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet. Nach 7 Tagen Inkubation wurden 1000 μl Fermentationsbrühe entnommen und mit 100 μl 1 N HC1 und 500 μl MTB (Methyltertiärbutylether) versetzt und 1 min kräftig durchmischt. 400 μl der organischen Phase wurden vorsichtig abge- nommen und unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in
100 μl MTB aufgenommen und quantitativ in ein Probengläschen für die Gaschromatographie überführt. Zur Probe wurden 50 μl N-Methyl- N-trimethylsilyltrifluoracetamid gegeben. Als einziges Produkt wurde gaschromatographisch 4-Isopropoxybenzoesäure nachgewiesen. Dies wurde durch GC/MS, IH-NMR und Vergleich mit einer authenti¬ schen Referenzprobe bestätigt.
Wiederholt man die Inkubation mit einer anderen Blockmutanten (4a2 und 4a3), so kann man im Fall der Mutante (4a2) 4-Isopropo- xybenzylalkohol und im Fall der Mutante (4a3) 4-Isopropoxybenzal- dehyd als einziges Produkt nachweisen.
Beispiel 5
b) Herstellung von 4-Isopropoxy-benzoesäure.
100 ml Medium A wurden mit einer Impföse der Blockmutante 4al an¬ geimpft und 48 h inkubiert. Mit 50 ml dieser Kultur wurde ein La- borfermenter mit 1 1 Medium A und 5 g 2- (4-Methylphenoxy-)propan als Edukt beimpft. Nach 24 h und 48 h Inkubation wurden nochmals je 2,5 g 2- (4-Methylphenoxy-)propan zugegeben. Nach 168 h Inkuba¬ tion wurde die Fermentation abgebrochen. Zunächst wurde die Bio¬ masse durch Zentrifugation (30 min, 4°C, 10.000 g) entfernt und die restlichen Zellen durch Filtration abgetrennt. Anschließend wurde die Kulturbrühe mit konzentrierter H2SO4 auf pH 1,0 einge¬ stellt und zweimal mit je 250 ml MTB extrahiert. Die organische Phase wurde abgenommen und im Rotationsverdampfer eingeengt. In chemisch reiner Form konnten 7,1 g 4-Isopropoxy-benzoesäure iso¬ liert werden. Dies entspricht einer Ausbeute von etwa 60 %. Beispiel 6
c) Herstellung von 4-Isopropoxybenzylalkohol
5 100 ml Medium A wurden mit einer Impföse der Blockmutante 4a2 an¬ geimpft und 48 h bei 30°C und 120 Upm inkubiert. Mit 50 ml dieser Kultur wurde ein 1 1 Laborfermenter mit Medium A und 5 g 2- (4-Methylphenoxy-)propan als Edukt beimpft. Nach 168 h Inkuba¬ tion wurde die Fermentation abgebrochen. Zunächst wurde die Bio- 0 masse durch Zentrifugation (30 min, 4°C, 10000 x g) entfernt und die restlichen Zellen durch Filtration abgetrennt. Anschließend wurde die Kulturbrühe zweimal mit je 250 ml MTB extrahiert. Die organische Phase wurde abgenommen (MTB-Phase 1) . Nach Zugabe von konzentrierter H2SO4 bis zu einem pH von 1,0 wurde nochmals zwei- 5 mal mit je 250 ml MTB nachextrahiert. Die organische Phase wurde wieder abgenommen (MTB-Phase 2) . Die organischen Phasen wurden vereinigt und im Rotationsverdampfer eingeengt und analysiert (siehe Beispiel 1) . In chemisch reiner Form konnten 942 g 4-Iso- propoxybenzylalkohol als einziges Produkt isoliert werden. Dies 0 entspricht einer Ausbeute von etwa 20 %.
Beschreibung des Mikroorganismus DSM 8316:
Der Stamm DSM 8316 wurde bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mi- 5 kroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig) als Rhodococ¬ cus ruber identifiziert. Das Bestimmungsprotokoll lautet wie folgt:
1. Farbtyp: 70 pastellorange bis reinorange 0 2. Peptidoglycan: meso-Diaminopimelinsäure
3. Mycolsäuren: Kettenlänge von C30-C50
4. FettSäuremuster: unverzweigte gesättigte und ungesättigte Fettsäuren plus Tuberculostearinsäure. Diess FettSäuremuster ist diagnostisch für Rhodococcen und ihre Verwandten. 5 5. Menachinone: MK-8 (H2)
6. Test 35 weiterer Substrate
Name Gesamt P Willcox P Tax Distanz Std.Fehler 0 Rh. ruber 3.0E-0014 78.05 % 0.495860003 -4.451097
Rh. marinonascens 7.5E-0015 19.69 % 0.442831797 1.096741 43752T
Rh. rhodochrous 4.7E-0016 1.22 % 0.509506764 -4.942624
Rh. coprophilus 4.0E-0016 1.03 % 0.477056451 -2.850872 5 Testergebnisse : nag 1 gal 40 gct 1 - got 20 - gat 1 rha 60 rib 1 - suc 40 - tur 1 cap 1 ara 99 + ino 20 - cit 80 + o2V 1 o2g 20 + pim 99 - sat 80 ala 20 a4b 80 - asp 6 - leu 80 pro 1 ser 1 - val 80 - put 99 tyr 1 ata 99 - ben 80 - o3b 99 + o4b 99 + phe 1 + qui 99 + cxy 1 cch 99 + cdp 99 +
Testanzahl: 35/35 Berechnungs-Funktion: 99/1 Cluster aus 16 getesteten Stämmen
DSM 8316 ist ein Rhodococcus ruber Stamm mit einer Willcox Propability von 90 %.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I
Ri R4
II R2^ R3
worin
R1 ein Wasserstoffatom, eine Cι-4-Alkyl-, C2-4-Alkenyl- oder eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe ist
R2 ein Wasserstoffatom, eine Cι-4-Alkyl-, C2-4-Alkenyl- oder eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe darstellt oder
R1 und R2 zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie ge¬ bunden sind a) einen 6-Ring darstellen, der 1 oder 2 weitere Doppelbindungen enthalten und/oder durch 1, 2 oder 3 Halogenatome, Cι_4-Alkyl-,
C2-4-Alkenyl-, Cι-4-Acyl-, Cι-4-Alkoxygruppen und/ oder 1 oder 2 Cyano-, Amino-, Cι-4-Alkylamino- oder Di-Cι_4-al ylaminogruppen und/oder eine Nitrogruppe substituiert sein kann und/oder an den ein weiterer aromatischer oder heteroaromatischer 6-Ring zu einem Ringsystem ankondensiert sein kann, das durch ein bis vier Cι_4-Alkoxy-, Cι-4-Alkyl-, C2-4-Alkenyl-, Nitril-, Nitro-, Carboxyl-, Cι-4-Alkoxycarbonyl-, Amino-, Cι-4-Alkylamino-, Di-Cι-4-alkylamino- und/oder eine gegebenenfalls substituierte Benzoylgruppe und/oder ein bis vier Halogenatome substituiert sein kann, oder b) einen heterocyclischen 5-Ring darstellen, der 1, 2 oder 3 Heteroatome enthält und/oder eine weitere Doppel- bindungen enthalten kann und an den ein weiterer aromatischer oder heteroaromatischer Ring ankonden¬ siert sein kann, der durch ein bis vier Cι-4-Alkoxy-, Cι-4-Alkyl-, C2-4-Alkenyl-, Nitril-, Nitro-, Carboxyl-, Cι-4-Al oxycarbonyl-, Amino-, Cι_4-Alkylamino-, Di-Cι_4-alkylamino- und/oder eine gegebenenfalls substituierte Benzoylgruppe und/oder ein bis vier Halogenatome substituiert sein kann,
R3 ein Wasserstoff- oder Halogenatom, eine Cι-4-Al yl- oder C2-4-Alkenylgruppe, oder eine gegebenenfalls halogensubstituierte Aryloxy- oder Benzoylgruppe darstellt und
R4 eine -CH2OH-, oder -CHO- oder -COOH-Gruppe be¬ deutet,
dadurch gekennzeichnet, daß man in Verbindungen der Formel II
Figure imgf000020_0001
,c. R2^ ^R3
worin Ri-R3 die oben angegebene Bedeutung besitzen, mit Hilfe eines Bakteriums selektiv die Methylgruppe oxidiert.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien der Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacte- rium, Corynebacterium, Caseobacter, Gordona, Micrococcus, My¬ cobacterium, Nocardia, Planococcus, Proactinomyces, Rhodococ¬ cus, Staphylococcus, Serratia oder Tsukamurella verwendet.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterium eines aus der Gattung und der Art Micrococcus roseus oder daraus selektionierte Blockmutanten verwendet.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterium eines aus der Gattung und der Art Rhodoccus ru¬ ber oder daraus selektionierte Blockmutanten verwendet.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterium Rhodococcus ruber DSM 8316 oder daraus selektionierte Blockmutanten verwendet.
6. 3-Formyl-2-methyl-2-propensäure(2,2-dimethylpropylen)acetal
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