WO1995004831A1

WO1995004831A1 - Method of determining chloride ion

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Publication number: WO1995004831A1
Application number: PCT/JP1994/001279
Authority: WO
Inventors: Toshio Tadano; Norihiko Kayahara; Jun Umemoto
Original assignee: Kyowa Medex Co Ltd
Current assignee: Minaris Medical Co Ltd
Priority date: 1993-08-04
Filing date: 1994-08-03
Publication date: 1995-02-16
Anticipated expiration: 1996-02-04
Also published as: JPH0739397A; US5962248A; EP0712937A1; EP0712937A4

Description

明細書

塩素イオンの定量方法技術分野

本発明は、臨床検査方法に適用可能である生体中の塩素イオンの定量方法に関する。背景技術

キレ一卜剤で失活させた a —ァミラーゼカ S塩素イオンにより賦活化する現象を利用して、該 α —アミラーゼに塩素ィォンを含んだ試料と ρ—二卜口フエニルマルトシド、デンプン等の基質を反応させて、塩素イオンを定量する方法が知られている〔ョ一口ビアン ' ジャーナル'ォブ 'バイオケミストリー（Eur. J. Bioc hem. ) 、 4 1巻、 1 7 1頁、 1 9 7 4年] 。また、該定量方法において σ—アミラーゼ活性測定過程を簡便化するため、基質として 2 —クロ口— 4一二トロフエ二ルー |3— D—マル卜へプタオシドを用いる塩素イオンの定量方法が知られている〔クリニカルケミストリ一（Clin. Chem. 3 4巻、 5 5 2頁、 1 9 8 8 年] 。

α—アミラーゼの活性測定法として、ォリゴ糖を基質として用いてマルトースを生成させ、得られたマル卜ースをグルコースに変換して、得られたグルコース量を定量することにより対応する α —アミラ一ゼ活性を測定する方法が知られている〔ジャーナル · ォブ · クリニカル ·ケミストリー ' アンド ' クリニカル · バイオケミストリ一（よ Clin. Chem. Clin. Biochem. )、 1 7巻、 7 0 5頁、 1 9 7 9年] 。

試料中に共存するグルコースが試料中の物質の定量方法に影響を与えるため、へキソキナーゼ等を用いて試料中のグルコースを消去する方法が特開平 5 - 7 6 3 9 7号公報に開示されている。

塩素ィォンの定量方法のうち、 α -ァミラ一ゼ活性の測定に 2 —クロ口— 4— ニトロフヱニルー ι3— D—マル卜へプタオシド等の合成基質を用いる方法は、検量線の直線性力得難く 2点検量法によらねばならない。また、 α —アミラーゼ反応の基質にデンプンを用いて、生成物のグルコース、マルトース等の還元糖を測定する公知方法は、血液中にグルコースやマルトースが存在するため、血液を試料として用いた場合、正確に塩素イオンを定量することができない。このため、新規に α—ァミラ一ゼ反応の基質として有用なマル卜ォリゴ糖を用いる方法を用いようとしても、血液中のグルコース等の妨害により正確な定量ができないと思われる。発明の開示

本発明は、血液を試料とした場合でも正確に塩素イオンカ定できる塩素ィォンの定量方法を提供することを目的とする。

本発明の塩素イオンの定量方法は、水性媒体中、試料中の塩素イオンを、キレ -卜剤により失活させた α—アミラーゼを用いて定量する方法において、試料に予めアデノシン三リン酸及びグルコキナーゼ活性を持つ酵素を添加して試料中のグルコースを消去し、該グルコキナーゼ活性を持つ酵素を失活させ、オリゴ糖を基質とする塩素イオンにより賦活化された α —アミラーゼ反応により生成するグルコース量を測定することを特徴とするものである。

本発明方法は、水性媒体中、試料中の塩素イオンを、キレート剤により失活させた α —アミラーゼを用いて定量する方法において、試料の前処理を行った後に、オリゴ糖を基質として用い、最終生成物のグルコースを定量して、塩素ィォンにより賦活化された α —アミラーゼ活性を測定すれば、塩素ィォンの定量が正確に行えるとの知見のもとになされた。特に、試料の前処理方法は、試料中のグルコースを単にグルコキナーゼ活性を持つ酵素を添加して消去するだけでなく、グルコキナーゼ活性を持つ酵素がグルコースの測定系を妨害しないように、該酵素を阻害する阻害剤を試料に添加すれば、塩素イオンの定量がより正確に行えるとの知見のもとになされた。

本発明において行う前記試料の前処理とはアデノシン三リン酸及びグルコキナ —ゼ活性を持つ酵素を試料に予め添加することにより試料中のグルコースを消去した後、該グルコキナ一ゼ活性を持つ酵素を、キレート剤等のグルコキナーゼ活性を持つ酵素の阻害剤で失活させることである。該前処理操作を行うことにより、塩素ィォンの定量を妨害する試料中のグルコースが除去される。

更に、本発明において、 α—アミラーゼの種類とその基質であるオリゴ糖を選択することにより、試料中にマル卜ースが共存する場合においても影響を受けなレ、塩素ィォンの定量方法が提供される。

本発明において、水性媒体中、試料中の塩素イオンを、キレ一卜剤により失活させた α—アミラーゼを用いて定量する方法とは、水性媒体中、キレー卜剤と混和させることにより失活させた Q—アミラーゼ力試料中の塩素イオンにより賦活化された状態で、 α—アミラーゼの基質を分解し、その分解産物量を測定することにより対応する塩素ィォン量を定量する方法をいう。

本発明において、水性媒体とは、緩衝液、生理食塩水等、水を含有する液体をし'、い、緩衝液としては、卜リス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン—硝酸緩衝液、卜リス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン一硫酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、フタル酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液、バルビタ—ル緩衝液又はグッド（GOOD) の緩衝液等があげられる。緩衝液の pHは 6〜9. 5で、濃度は 50〜50 OmMである。

塩素イオンを含む試料としては、水性媒体に混和する試料であればどのようなものでもよく、例えば、全血、細胞等、イオン電極法では測定しにくい生体中の試料があげられる。

α—アミラーゼとしては、酵素番号〔EC. 3. 2. 1. 1〗に属する酵素であればよく、ブタ降臓、ヒ卜唾液等の動物から採取した α—アミラーゼ又はそれらを遺伝子工学により改変し製造した酵素があげられるが、ブ夕鸱臓由来の α— アミラーゼは、基質であるオリゴ糖としてマル卜ヘプ夕オース、マル卜へキサォ —ス、マル卜テ卜ラオースを用いた場合、言亥基質をマル卜トリオースとグルコ一スに分解しマルトースを生産せず、マルトースの消去操作を必要としないので、本発明においてはブ夕鸱臓由来の α—アミラーゼを用いること力 s好ましい。

キレー卜剤としては、エチレンジァミン四酢酸（EDTA) 、 2—ヒドロキシェチルエチレンジァミン三酢酸（HEDTA) 、エチレングリコ一ルービス（2 —アミノエチルエーテル）四酢酸（EGTA) 、ジエチレン卜リアミン五酢酸（ DTPA) 、 1 , 2—ジアミノシクロへキサン四酢酸（DCTA) 等があげられる。

α—アミラーゼの基質として用いるオリゴ糖としては、マル卜ォクタオース、マル卜ヘプ夕オース、マル卜へキサオース、マル卜ペン夕オース、マル卜テ卜ラオース等があげられる。オリゴ糖が α—アミラーゼにより分解されグルコースの他にマル卜一スが生じる場合は、必要によりマル卜一スを基質とする酵素を加えて、マルトースをグルコースに変換してもよい。オリゴ糖のうちマル卜へプタオース、マル卜へキサオース、マルトテトラオースは、ブ夕膣臓由来の α—ァミラーゼにより選択的にグルコースに分解されるが、試料中に夾雑するヒ卜アミラーゼによってはグルコースに分解されないことから、本発明に用いることが好ましい。

グルコースの定量法は、グルコースの定量法であればどのような方法を用いてもよく、例えば、グルコースをビラノースォキシダ一ゼ又はグルコースォキシダ一ゼにより、それぞれグルコソン又はグルコノラクトンに変換し、発生する過酸化水素をペルォキシダーゼと呈色試薬により定量する方法（Ann. Clin. Bioche .、 6巻、 2 4頁、 1 9 6 9年）又はグルコースデヒドロゲナーゼによりグルコノラクトンに変換し N A D ( P ) から N A D ( P ) Hへの変換量を測定する方法（Z. Kin. Chem. Klin. Biochem.、 1 3巻、 1 0 1頁、 1 9 7 5年）等により測定することができる。

呈色言式薬としては、例えば 4一ァミノアンチピリンと 1\:ーェチルー N— ( 3— メチルフエニル） — N ' —ァセチルエチレンジァミン（E M S A ) の組み合わせ等があげられる。

該グルコースの定量法において、試料中に内因性のグルコース又はマルト一スが共存すると、塩素イオンの定量値に影響を与えるため、該定量法の前処理法として、予めアデノシン三リン酸及びグルコキナーゼ活性を持つ酵素、必要により前記のマルトースを基質とする酵素を試料に添加して試料中のグルコース又はマル卜一スを消去した後、共存するグルコキナーゼ活性を持つ酵素が塩素イオンの定量過程を阻害しないよう、キレー卜剤を添加してグルコキナーゼ活性を持つ酵素を失活させる。

グルコキナーゼ活性を持つ酵素としては、グルコースをグルコース一 6—リン酸に変換する活性を有する酵素であればどのようなものでもよく、赤血球、肝臓等の動物又は微生物由来のへキソキナーゼ〔EC. 2. 7. 1. 1 ] 、肝臓等の動物又は細菌、酵母等の微生物由来のへキソキナーゼタイプ IV [E C. 2. 7. 1. 2] 等があげられる。

グルコキナーゼ活性を持つ酵素を失活させるために用いるキレート剤としては、 α—アミラーゼを失活させるために用いるキレー卜剤と同様のものを用いることができる。該キレー卜剤としては、 EDTA、 HEDTA、 EGTA、 DTPA、 DCTA等があげられる。

マルトースを基質とする酵素は、マルトースホスホリラーゼ [EC. 2. 4. 1. 8] 又は α—グルコシダ一ゼ〔EC. 3. 2. 1. 20] 等、マル卜一スをグルコースに変換し得る酵素であればよく、マルトースホスホリラ一ゼを用いる場合、リン酸緩衝液を用いないときはリン酸イオンを該酵素と共に反応液に加える。リン酸イオンの供給源としては、無機リン酸、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸ニナトリウム等があげられる。なお、マルトースを基質とする酵素は、ブタ鸱臓由来の α—アミラーゼとその基質としてマル卜へプタオ一ス、マルトへキサオース又はマル卜テトラオースを用いる場合は、マルトースが発生しないので、加える'必要がない。

以下に本発明の塩素イオンの定量方法の好ましい態様について説明する。水性媒体（ Ρ Ηは 6〜 9. 5) に、グルコキナーゼ活性を持つ酵素 U〜 4 U /ml ) 、アデノシン三リン酸（ATP) (5〜20mM) 、マグネシウムィォン（2~25mM) 、必要によりマルトースを基質とする酵素〔マルトースホスホリラーゼを用いる場合は、マルト一ス 1 gZd 1に対して該酵素 4〜20 \]/ m l、リン酸 300 mM以上； α—グルコシダーゼを用いる場合は、マル卜一ス 1 g/d 1に対して該酵素 100〜30 OUZm 1 ] を加え前処理液を調製する。該前処理液に塩素イオンを含む試料を加え、 25〜40°C、好ましくは 37 °Cで、 1~30分間、好ましくは 3〜5分間反応させる。

オリゴ糖（反応液中 2〜10mM) は、前記の前処理液に添加しておいてもよいが、前処理反応終了後に加えてもよい。更に、キレート剤（反応液中 10〜 5 OmM) 及びキレート剤により失活させた α—アミラーゼ（反応液中 20~ 1 00 U/m 1 ) を添加し 8〜 50 °Cで反応させる。 α—アミラ一ゼ反応により基質のオリゴ糖は、マル卜ース、グルコース、マル卜トリオースに分解される力;'、マルトースが生じた場合は、前記のマル卜一スを基質とする酵素により、グルコースに分解される。得られたグルコースを前記のグルコースの定量法により定量することにより、対応する塩素イオン量を定量することができる。なお、グルコキナーゼ活性を阻害するキレー卜斉 IIは、 α—アミラーゼも失活させるので、キレ一卜剤（反応液中 1 0〜 50 m Μ ) を含む水性媒体に α -アミラーゼ（反応液中 20〜 1 00 U/m 1 ) 及びグルコースォキシダーゼ、 EMSA等グルコ一スの定量に用いる試薬を加えたものを予め調製し、前記試料の前処理液に加えれば、簡便に塩素イオンの定量を行うことができる。

なお、本反応液中には、アルブミン、ビラノースォキシダーゼの補酵素であるフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD) 、グリセロール、ポリエチレングリコールモノ一 P—イソォクチルフユ二ルエーテル、ポリォキシエチレンポリォキシプロピレン縮合物等の塩素イオンを含まない界面活性剤、硝酸ナトリウム、硫酸ナ卜リゥム等の可溶化剤、硝酸力リゥム、硫酸力リゥム等の安定化剤を添加することができる。また前処理液にグルコース（0. 08〜0. 2 m g/m 1 ) を添加しておくことにより、ブランクの吸収を消去することができる。

本発明に使用する酵素、マル卜一スホスホリラ一ゼ（EC. 2. 4. 1. 8)、 a -グルコシダーゼ（EC. 3. 2. 1. 20) 、グルコキナーゼ活性を持つ酵素としてのへキソキナーゼ（EC. 2. 7. 1. 1 ) 又はへキソキナーゼタイプ IV 〔グルコキナ一ゼ（E 2. 7. 1. 2 ) ] 等は、各酵素とも市販品が容易に入手可能である。図面の簡単な説明

図 1は、マル卜ペンタオースを基質に用いた場合の検量線を示す図である。図 2は、マルトテトラオースを基質に闬いた場合の検量線を示す図である。発明を実施するための最良の形態

以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する力本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。

(実施例 1 ) ブ夕滕臓 α—アミラーゼとマル卜ペン夕オースを用いる方法

( 1 ) 塩素イオン検量線闬標準液の調製

塩化ナトリウム（和光純薬工業製）を蒸留水で希釈し、反応液中 60、 100、 14 OmMの塩素イオン検量線用標準液を調製した。

(2) 塩素イオンの定量

試験管に塩素イオン検量線用標準液 0. 10m l、グルコース水溶液（l gZ d 1 ) 0. 1 Om 1、マル卜一ス水溶液（ 1 g/d i ) 0. 10mlを添加し、ついで、これにマルトースホスホリラ一ゼ（協和メデックス製） 7U/m l、へキソキナーゼ（オリエンタル酵母製） 2. 4U/ml、マル卜ペン夕オース（協和メデックス製） 10mM、 4-ァミノアンチピリン 0. 5 mM、硫酸マグネシゥム 2. 5mM、 ATP (オリエンタル酵母製） 1 OmMを含む 35 OmMリン酸緩衝液（PH6. 8、 25°C) 2. Omlを加えた。該試験管を 37 °Cの恒温水槽につけ、 5分間インキュベーションし、マルトース及びグルコースを消去した。

次に、リン酸一カリウム 20 g/L、 EDTA 18 gZLを含み水酸化ナトリゥムで pHを 6. 8とした溶液（25°C) に、ブタ鸱臓 α—アミラーゼ（ベーリンガ一マンハイム山之内製） 50U/ml、グルコースォキシダーゼ（和光純薬工業製） 30UZm i、 EMSA2. 2mM、硝酸カリウム 1 mMを含む発色液を加えて、 37°Cでインキュベート後、その 1 m lを前記溶液に添加し、攪拌した後、 555nmにおける吸光度変化量を分光光度計（日立製 UV3400) で測定した。得られた検量線を図 1に示した。

(実施例 2) ブタ睦臓 α—アミラーゼとマル卜テ卜ラオースを用いる方法

( 1 ) 塩素イオン検量線闬標準液の調製

塩化ナトリウム（和光純薬工業製）を蒸留水で希釈し、反応液中 50、 100、 150 mMの塩素ィ才ン検量線用標準液を調製した。

(2) 塩素イオンの定量

試験管に塩素イオン検量線闬標準液 0. 05m 1、グルコース水溶液（ 1 gZ d 1 ) 0. 05m l, マル卜ース水溶液（2 g/d 1 ) 0. 05m lを添加し、ついで、これにへキソキナーゼ（オリエンタル酵母製） 2. 4U/m l、マル卜テ卜ラオース（和光純薬製） 7. 5mM、 4ーァミノアンチピリン 0. 5mM、硫酸マグネシウム 5mM、 ATP (オリエンタル酵母製） ] 0mMを含む 100 m リン酸緩衝液（pH6. 6、 25°C) 2. Ora lを加え、 37 °Cで 5分間ィンキュベーションし、グルコースを消去した。

次に、リン酸一カリウム 20 gZL、 EDTA36 g/Lを含み水酸化ナ卜リゥムで pHを 6· 6とした溶液（25°C) に、ブ夕鸱臓 α—アミラーゼ（ベーリンガーマンハイム山之内製） 70UZm l、グルコースォキシダーゼ（和光純薬工業製） 30UZml、 EMSA2. 2 mM、硝酸カリウム 1 mMを含む発色液を加えて、 37°Cでインキュべ一卜後、その lm 1を前記溶液に添加し、攪神した後、 555nmにおける吸光度変化量を分光光度計（日立製 UV 3400) で測定した。得られた検量線を図 2に示した。更に、電量滴定で塩素イオン濃度が 105mMの血清の塩素イオン濃度を前記方法により測定したところ 104mM であった。

図 2によれば、本測定法では検量線が原点を通り一点検量が可能である。またブランクの吸収がほとんどなく、試料中のマル卜ースゃ内因性の唾液腺由来又は膣臓由来のアミラーゼの影響も受けない優れた測定法であることが示された。産業上の利闬分野

本発明により、試料中に共存するグルコースやマルトースの影響を受けず、測定精度も高い塩素ィォンの測定法が提供される。本発明の塩素ィォンの定量方法は、臨床検査方法として有用である。

Claims

請求の範囲

1 . 水性媒体中、料中の塩素イオンを、キレー卜剤により失活させた α—アミラーゼを用いて定量する方法において、試料に予めアデノシン三リン酸及びグルコキナーゼ活性を持つ酵素を添加して試料中のグルコースを消去し、該グルコキナーゼ活性を持つ酵素を失活させ、オリゴ糖を基質とする塩素イオンにより賦活化された α —アミラーゼ反応により生成するグルコ一ス量を測定することを特徴とする塩素ィォンの定量方法。

2 . α—アミラーゼがブタ滕臓由来の α—アミラーゼで、オリゴ糖がマル卜テ卜ラオース、マル卜へキサオース又はマル卜へブ夕オースである請求の範囲第 1項記載の定量方法。