WO1995007285A1

WO1995007285A1 - Novel disaccharide derivative

Info

Publication number: WO1995007285A1
Application number: PCT/JP1994/000376
Authority: WO
Inventors: Tohru Kodama; Masayuki Saitoh; Tomohiko Ogawa
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1993-09-07
Filing date: 1994-03-09
Publication date: 1995-03-16
Anticipated expiration: 1996-03-07
Also published as: CA2148824A1; AU679970B2; US5654289A; AU6219694A

Description

明細書

新規なジサッ力ライド誘導体

[技術分野]

本発明は、多様な生物活性を有し、かつ致死毒性および発熱原性が非常に弱く低毒性であるという特性を有する新規なジサッ力ライド誘導体およびその塩に関するものである。

[背景の技術]

各種グラム陰性菌の細胞壁外膜に含まれるリポボリサッカライド（L P S ) は、リピド Aと呼ばれる糖脂質に各種の糖類が結合したものであり、以前から内毒素の主成分であることが知られている。 L P Sは生体の各種免疫機能促進活性を有することが知られており、その主たる活性発現部位はリピド Aにあることが明らかにされており免疫調節作用および抗腫瘍作用の他、多様な生物活性を有することが認められている。

リピド Aの化学構造は大腸菌を初め各種グラム陰性菌において明らかにされてさた ("Structure of the lipopolysaccharide from an E. Coli Heptose - less Mutant", Marcha R. R. , Jiunn-yann T. , Israel B. , and H. Gobind Khorana, The Journal of Biological Chemistry, vol. 254, No. 13 p5906-5917(1979))_o その中で大腸菌由来リピド Aについては完全に化学合成がなされ、各種誘導体も化学合成されている。その結果一部合成されたリピド A誘導体については腫瘍壊死因子（T N F ) 誘導作用およびマイトジニン活性において大腸菌由来リピド A と同等または同等以上であることが認められている（特開昭 5 9— 4 8 4 9 7号

) o

しかしながら大腸菌由来リピド Aおよびリピド A誘導体については発熱原性、壊死毒性活性等の好ましくな t、作用が認められることから、さらに広範囲に誘導体の合成研究が行われた（特開昭 6 1— 2 2 7 5 8 6号）。またリピド A様活性を有する単糖構造を基本骨格とするものを初め種々の置換基による修飾、置換基導入部位の検討が詳細に行われ各種類縁体も合成され、生物活性、免疫活性および毒性について調べられたが（「リピド A類似体の生物活性」，小川裕示，木曾真，長谷川明， β靈，第 2 6巻， No. 5， p l 5〜2 7 , 1 9 8 9、「合成リピド Aとその誘導体」，本間遜，免疫薬理, 第 8巻， No. 4 , 1 9 9 0 , p 2 5〜 3 2 ) 、 3位， 3 ' 位および 4 ' 位の水酸基が遊離であるような化合物に言及した例はなく、未だ医薬品として実用化しうるものは開発されていない。

[発明の開示]

したがって、上記の理由からリピド A類似体のうちでより低毒性でより強い有用活性を有する化合物が強く望まれている。

本発明は、強いマイトジェン活性、アジュバント活性、非特異的感染防御活性、抗ウィルス活性、免疫陚活作用等の種々の有用な生物活性を有し、かつ発熱原性および致死毒性等の有害作用がほとんどなく、特に医薬品等として有用である新規なジサッ力ライド誘導体を提供するものである。

本発明者らは、ヒ卜の口腔内に常在しており、現在歯周病の原因と考えられている細菌の一つである Porphyromonas(Bacteroides) gingivalisの細胞壁外膜中に含まれる L P Sがマイトジン活性等を有し、同時に致死毒性および発熱原性が非常に弱いことを見いだした。さらに、 L P S中の活性発現部位を調製後精製し、構造解析を行い、鋭意研究の結果、本発明の活性化合物はダルコサミン; S ( 1—6 ) ジサッ力ライドの構造の 1位にリン酸基がエステル結合をしたものを基本骨格とし、 2位のアミノ基に 3-hydroxy-15-methylhexadecanoic acidがアミド結合しヽ 2 位のァミノ基に 3-hexadecanoyloxy - 15 - methylhexadecanoic acidがアミド結合していることを見いだした。本発明の化合物の構造は、従来のリピド A誘導体と大きく異なり 4 ' 位にリン酸基を持たず、 3位および 3 ' 位の水酸基が遊離のままである点に特徴がある。したがって本発明の化合物は下記の [式 I ] で表されるような構造を有することが推定される。

また本願化合物は強いマイトジン活性、アジュバント活性、多クローン性 B 細胞活性化（非特異的感染防御）活性、ナチュラルキラー活性等多様な生物活性を有する一方、従来のリピド Aおよびリピド A誘導体においてみられたマクロファ一ジからの腫瘍壊死因子（T N F ) や I L一 1等のいわゆる炎症性サイトカインの産生を誘導する活性が殆ど見られないことを見いだした。したがって従来、リピド Aおよびリピド A誘導体において問題となっていた致死毒性および発熱原性等の有害作用を示すことなく、免疫賦活剤として有用である。

さらには大腸菌のリピド Aが誘導する I L一 1の産生を抑え、' さらに I L— 1 レセプターアンタゴニスト（ I L一 1 r a ) の産生を誘導することを見いだしたが、これらの活性は、強い非特異的感染防御活性を有することと併せて、大腸菌等グラム陰性菌の感染によって引き起こされる病態、特に敗血症、あるいは敗血症性ショックの予防 '治療用剤として有用である。また、 1 ー 1の産生を抑ぇ、さらに I L一 1レセプターアンタゴニスト（ I L _ 1 r a ) の産生を誘導することは、 I L一 1自身の異常産生状態になっていると考えられるような病態、例えば慢性関節リユーマチ等の治療用剤としても有用である。

さらに、ナチュラルキラー細胞を活性化し、抗腫瘍活性を有することを見いだした上、抗ウィルス活性を有することも明らかになった。抗腫瘍活性からは、抗腫瘍剤としての有用性が考えられ、抗ウィルス活性と併せて強い非特異的感染防御活性を有することからは、抗ウィルス剤としての有用性がある。

このような特性から、本願発明化合物である新規なジサッ力ライド誘導体またはその塩は、医薬用担体およびまたは希釈剤と配合してなる医薬組成物として特に有用であると期待される。

なお、本化合物には種々の立体異性体が存在し得るが、単離されたこれらの異性体および異性体混合物は、いずれも本発明の技術的思想に包含される。本願発明の化合物は微生物源より調製し、精製して使用することができる。さらに種々の化学合成法により製造することも可能である。

以下に各製造法による具体的な製造例を示す。

( 1 ) 微生物を用いた製造例

本願化合物を微生物により製造する場合には、前記 [式 1 ] により示される本願発明の化合物を生産することができる微生物であればいずれも使用できるが、例えば Porphyromonas(Bacteroides) gingivalis ( A T C Cカタ口グ番号 3 3 2 7 7 ) 等を使用することができる。

培養に使用される培地は液状または固状でよいが、通常は液状培地による嫌気静置培養が便利である。培地は本願発明化合物生産菌が生育して本願発明化合物を生産するものであればどのようなものでもよい。培養温度、培養期間、培養の液性等の条件は、本願発明化合物の生産量が最大となるように適宜選択、調節され得るが、好ましくは嫌気的条件下に2 5 〜4 0 、好ましくは 3 7 °Cにて、 1 2〜3 6時間、好ましくは 2 6時間培養され、その培地の p Hは 6 . 0〜8. 0、好ましくは 7. 3に維持される。

上記条件で培養することにより本発明化合物が生産、蓄積される。培養物を濾過または遠心分離して菌体を回収し、目的物の分離、精製を行う。菌体からの L P Sの分離、精製には化合物の化学的特性に基づく種々の手段を用いることができる。例えば熱フニノール一水抽出法にて抽出し、各種酵素処理後に遠心して精製、溶媒分画、各種樹脂を用いたカラム法を使用し、これらを適当に組み合わせることにより L P Sを分離、精製することができる。次に精製を繰り返した L P Sまたは粗 L P Sを弱酸加水分解する。弱酸加水分解は、本願発明化合物が遊離する方法であればどのような方法でもよく、好ましくは 0. 0 5〜0. 2規定の酢酸を用い、 9 0 °C〜1 1 0 °C、 2〜3時間の反応でよい。反応物から目的物の分離、精製には本願発明化合物の化学的特性に基づく種々の手段が採用できる。すなわち、溶媒分画法、各種樹脂を使用したカラム法等が用いられ、これらを適当に組み合わせることにより本願発明に係わる物質を分離、精製することがでさる。

( 2 ) 化学合成法を用いた製造例

適当な保護基で適当な位置を保護した N—ダルコサミン誘導体を配糖体結合形成反応によってジサッ力ライド誘導体とし、これを脂肪酸による N—ァシル化、還元末端 1位のリン酸化後、脱保護する。または所望の脂肪酸によって N—ァシル化された保護 N—ダルコサミン誘導体を配糖体結合形成反応によってジサッ力ライド誘導体とし、これをリン酸化後、脱保護基を行うことによつても合成することができる。

上記の説明にしたがって得られた本発明化合物は、リン酸基部分で塩を形成しうる化合物であり、公知の方法により容易に塩に変換することができる。そのような塩の例としては、例えばナトリウムまたは力リウムのようなアル力リ金属の塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属の塩、アンモニゥム塩および薬学的に許容されるアミン塩、等が含まれる。非毒性ァミン類の塩としては、テトラメチルアンモニゥムのようなテトラアルキルアンモニゥムの塩、およびメチルァミン塩、トリェチルァミン塩、シクロペンチルァミン塩、ベンジルァミン塩、ピリジン塩、ピぺリジン塩、ジエタノールアミン塩、リジン塩、アルギニン塩のような有機アミン塩等が例として挙げられる。

このようにして得られた本発明化合物であるジサッ力ライド誘導体またはその塩は、治療または予防の目的で用いる医薬組成物として通常全身的あるいは局所的に経口または非経口で投与される。投与量としては、年齢、体重、症状、投与方法等により異なるが、通常成人ひとり当たり 1回につき 0. 0 l rag〜l 0 O mg の範囲で 1日 1回から数回、経口あるいは非経口で投与される。勿論投与量は種々の条件で異なるので、上記投与量より少な、範囲で充分効果のある場合もあるし、逆にこれらの範囲を超えて投与する必要のある場合もある。

本発明による経口投与のための固形医薬組成物には、錠剤、散剤、顆粒剤等が含まれる。このような固形組成物においては、少なくともひとつの不活性な希釈剤、例えば乳糖、ブトゥ糖、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等と混合される。組成物は、さらに不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤や、繊維素ダルコン酸カルシウムのような崩壊剤を含有していてもよい。錠剤または丸剤は、必要により白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース等の胃溶解性あるいは腸溶解性物質のフィルムで被覆してもよいし、また 2以上の層で被覆してもよい。さらにゼラチンのように吸収されうる物質のカプセルであってもよい。

経口投与のための液体医薬組成物は、薬学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤等を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤としては、例えば精製水、エタノール等を含む。不活性な希釈剤以外に、補助剤として湿潤剤、懸濁剤等、さらに甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤等を含有していてもよい。また、経口投与のための組成物には、常法により処方されるスプレー剤も含まれる。本発明による非経口投与のための注射剤組成物としては、無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤等が含まれる。水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば注射用蒸留水および生理食塩水が含まれる。非水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリ一ブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類、ポリソルベート 8 0 (登録商標）等がある。このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤のような補助剤を含んでもよい。これらは、特定の濾過や、殺菌剤の配合または照射によつて無菌化される。これらはまた、無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水または無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。非経口投与のための組成物としては、このほか公知の方法により処方される外用液剤、軟膏のような塗布剤、および座剤、ペッサリー等も含まれる。

また本願化合物は強いマイトジヱン活性、アジュバント活性、多クローン性 B 細胞活性化（非特異的感染防御）活性、ナチュラルキラー活性等多様な生物活性を有する一方、従来のリピド Aおよびリピド A誘導体においてみられたマクロファ一ジからの腫瘍壌死因子（T N F ) や I L一 1等のいわゆる炎症性サイトカインの産生を導する活性が殆ど見られないことを見いだした。したがって従来、リピド Aおよびリピド A誘導体において問題となっていた致死毒性および発熱原性等の有害作用を示すことなく、免疫賦活剤として有用である。

さらには大腸菌のリピド Aが誘導する I L— 1の産生を抑え、さらに I L— 1 レセプターアンタゴニスト（I L— 1 r a ) の産生を誘導することを見いだした力これらの活性は、強い非特異的感染防御活性を有することと併せて、大腸菌等グラム陰性菌の感染によって引き起こされる病態、特に敗血症、あるいは敗血症性ショックの予防 ·治療用剤として有用である。また、 1 1^ー1の産生を抑ぇ、さらに I L一 1レセプターアンタゴニスト（ I L一 1 r a ) の産生を誘導することは、 I L一 1自身の異常産生状態になっていると考えられるような病態、例えば慢性関節リユーマチ等の治療用剤としても有用である。さらに、ナチュラルキラー細胞を活性化し、抗腫瘍活性を有することを見いだした上、抗ウィルス活性を有することも明らかになった。抗腫瘍活性からは、抗腫瘍剤としての有用性が考えられ、抗ウィルス活性と併せて強い非特異的感染防御活性を有することからは、抗ウィルス剤としての有用性がある。

以下、本願発明に関する化合物について実施例に基づき詳細に説明するが、本発明を以下に記載する特別な態様に限定することを意図するものではない。実施例 1 ：微生物源からの製造

Porphyromonas (Bacteroides) gingivalisを 160リツ卜ノレの GAMブイョン (曰水製薬株式会社製）培地（pH7. 3) で嫌気的に 37°Cで 26時間培養した。培養完了後培養液の遠心を行い菌体を回収し、凍結乾燥により乾燥菌体 10 0 gを得た。この乾燥菌体を熱フユノール一水抽出法にて抽出処理して粗 LPS を得た。すなわち 100 gの乾燥菌体に 3. 5リットルの蒸留水を加え 68 に加熱し、別に 68°Cに加熱した 90%フエノールを加え 68°Cにて 20分間撹拌し、氷冷後遠心して水層を分取後、再度 3. 5リツトルの蒸留水を加え抽出操作を操り返した。得られた水層を合わせ、蒸留水に対して十分透析後、濃縮し凍結乾燥を行い粗抽出物 12. 47 gを得た。粗抽出物 10 gを 1リットルの蒸留水に懸濁し超遠心沈渣をヌクレアーゼ P 1 (ャマサ醤油株式会社製）およびプロナーゼ（カルビォケミカル製；米国）酵素処理を二度づっ繰り返し、蒸留水で超遠心沈渣の洗浄を二度繰り返し、凍結乾燥を行い粗 LPS画分 25 Omgを得た。粗 LPS画分 250mgを 50mMトリス塩酸緩衝液（pH7. 4) に懸濁後、セファロース 4Bカラムクロクトグラフィー（内径 1. 5cm、長さ 90 cm) に供し、排除体積画分を分取後、エタノール沈殿を行い、蒸留水で二度洗浄後凍結乾燥を行った。 LPS画分 11 Omgを得た。 1^?5画分を0. 1規定の酢酸で 105°C 、 2. 5時間弱酸加水分解を行い、反応物を遠心後、遠心沈渣を得た。この画分をシリカゲル力ラムクロマトグラフィー（クロ口ホルム Zメタノ一ルノ水ノトリェチルァミン =30 12Z1. 5/0. 1) で精製を行い、 4. 5mgの本発明化合物を得た。

実施例 2 ：構造解析

上記、実施例 1で得られた化合物の物理化学的性質を検討したところ、以下の結果が得られた。

(1) 糖分析および脂肪酸分析；

ァ. ダルコサミン； β (1-6) ジサッカライド構造の 1位にリン酸基がエステル結合したものを基本骨格とし、

ィ. 2位のァミノ基に 3 - hydroxy-15- methylhexadecanoic acidがァミド結合しヽゥ · 2 位のアミノに 3_hexadecanoyloxy - 15 - methylhexadecanoic acidがアミド結合し、

ェ. 4' 位にリン酸基を持たず、

ォ. 3位， 3' 位および 4' 位の水酸基が^離のままである。

(2) 分子式； C_e2H₁₁₉ 0₁₇N₂ P

(3) 呈色反応；硫酸反応に陽性、ディットマー · レスター反応に陽性、ニンヒドリン反応に陰性、 TTC反応に陰性である。

(4) 物質の色、形状；白色粉末

(5) 質量スぺクトル；ネガティブ FAB— MS— MS、 M/Z 1193 (M-H ) ，-937(M—2H— C₁₅H₃₁COO)

(6) NMRスペクトル； iH— NMR (300MHz, CD C 1₃ +Me OD + D₂ O) δ : 0.81 (12H, d) 、 0.82C3H, t) 、 1.1-1.6C72H, m， CH₂ , CH ) 、 2.2-2.5 (6H, m, CO— CH₂ ) 、 3.1-4.3C13H, m) 、 4.46C1H, d) 、 5.15(1H, m) 、 5.45(1H, m)

以上の結果より、本発明化合物の構造は [式 I] で表されるものと推定された o

実施例 3 ：活性測定

次に本願発明の化合物について試験した生理活性の結果を示す。

(1) マイトジン活性

マイトジェン活性は、例えば単離されたマウスリンパ系培養細胞中に取り込まれた ³H—チミジンの量を測定することにより行った。すなわち BALBZcマウスの脾臓を檑り潰し、 5 X 10⁵ 個 Zwell (200 ^ 1 ) に調製した脾細胞に所定濃度の本願発明化合物、あるいは比較化合物を添加、または培地のみを添加して培養した。培養終了 6時間前に 37kBq/well ( 10 / 1 ) の ³H—チミジンを加え、培養終了後細胞に取り込まれた ³H—チミジンの量（放射線量）を定量した結果は下式で示す Stimulation Index で表した ₀

Stimulation Index =化合物の添加群（cpm) 培地のみ添加群（cpm) 本発明化合物は、表 1に示されるようにマイトジニン活性を有することを示した。比較化合物としては、合成リピド Aである 506を用いた。 506は、 6— 0— 〔2—デォキシー 2— （3—ドテカノィルォキシテトラデカノィルァミノ） -3-0- (3—テトラデカノィルォキシテトラデカノィル）一 4一 0—ホスホノー^ー D—ダルコピラノシル〕一 2—デォキシー 2— (3—ヒドロキシテトラデカノィルアミノ）一 3— 0—テトラデカノィルー 1—0—ホスホノ一一 D— ダルコビラノースである。

【表 1】マイトジヱン活性

(2) NK (ナチュラルキラー）活性

本試験は以下の方法により検討した。すなわち、 B ALBZcマウスを用い 1 00 n gの本発明化合物、あるいは比較化合物を 0日目および 7日目に静脈内に注射し、 14日目に脾細胞を採取した。調製した脾細胞（1 X 10^β 個 Z0. 1 ml) に⁵¹ C rで標識した標的細胞（Moloneyウィルス誘発リンパ腫 YAC— 1 ： 2 X 10⁴ 個ノ 0. lml) を加え、 4時間培養した。なお、最小遊離対照群には脾細胞を含まない培養液のみを加え、最大遊離対照群には 0. IN NaOHを加えた。培養終了後、培養上清 0. 1mlを採取し、標的細胞が障害を受けることにより遊離した⁵¹ C rの量（放射線量）を測定した。活性は各価を以下の式に代入し、 K Activity(%) を求めた。

NK Activity(¾)= { (実験群—最小遊離対照群）（cpm)Z

(最大遊離対照群一最小遊離対照群）（cpm)} X100 本発明化合物は、上式で算出した結果 50. 1の NK Activity(%) という値を示し、合成リピド Aである 506と同等の活性を有することが明らかとなった。

(3) 抗腫瘍活性

本試験はメチルコラントレン誘発線維肉腫（Me t h A) に対する増殖抑制活性により検討した。すなわち、 BALB/cマウスより取り出した脾細胞より付着細胞（マクロファージ）を採取した。調製したマクロファージ（2x 10⁵ 個 Z0. 1ml) と標的細胞（Me t h 八： 2 < 10⁴ 個 0. 1ml) に所定濃度の本発明化合物あるいは比較化合物を加え、 18時間培養した後、 14. 8kB q/well (10^ 1) の ³H—チミジンを加えてさらに 6時間培養した。培養終了後細胞に取り込まれた ³H—チミジンの量（放射線量）を定量した。結果は得られた値を次式に代入して ³H—チミジンの取り込み抑制率を計算し、マクロファージの腫瘍細胞増殖抑制活性として表した。

Cytostatic Activity(¾)= { 1 - (マクロファージおよび標的細胞

—マクロファージのみ）（cpm)/標的細胞のみ（cpm)}

X100

本発明化合物は表 2で示されるような値を示し、合成リピド Aである 506とほぼ同等の腫瘍増殖抑制活性を示した。

【表 2】抗腫瘍活性

化合物 C y t o s t a t i c A c t i v i t y 本癸明化合物 1 0 Qlig/mi 64. 0

本発明化合物 10yg/ml 58. 6 (4)了ジュバント活性

本試験は 1群 6匹の雄性 BALBZcマウスを用い、 0曰目と 28曰目に牛血清アルブミン（B S A) 100 gに本発明化合物あるいは比較化合物 100 gを添加あるいは無添加にて、フロイン卜の不完全アジュバント（F IA) を用いて油中水型乳剤として皮下注射し、追加免疫後 5曰目に血清中に産生した抗 B S A I gG抗体量を EL I S A法により測定した。結果は、次式で示す Stimulat ion Indexで表しナこ。

Stimulation Index =F I Aに化合物と B S Aの添加群（^g/ml) ノ

F I Aに BS Aのみの添加群（^g/ml)

本発明化合物は、表 3に示されるように合成リピド Aである 506より強いァジュバント活性を有することが明らかとなつた。

【表 3】ァジント活性

(5)抗ウィルス活性

本試験は、水疱性口内炎ウィルス（VSV ; Ve s i cu l a r s t oma t i t i s v i ru s) のマウス線維芽細胞株 L 929に対する作用の抑制を指標にした。すなわち、各ゥヱルに L929細胞を 4x 10⁴ 個 Z0. 1mlに入れ 24時間培養後、本発明化合物あるいは比較化合物（lmgZml) の希釈系列より各希釈試料液を 0. 1mlずつ加えさらに 24時間培養した。培養上清除去後、 100TC I Dso/O. 1mlに調製した VSVを加え 24時間培養後、培養液を除去し、 5%ホルムアルデヒド溶液により 20分間固定し、続いて 0. 5%クリスタルバイオレット染色液にて 20分間染色した。水洗後乾燥し、吸光度 600 nraで測定を行った。活性は L 929細胞が 50 %生存する試料液の元の試料濃度 ( 1 mg/nil) に対する希釈倍数の逆数で表した。

本発明化合物は表 4に示すように合成リピド Aである 506より強い抗ウィルス活性を有することが明らかとなった。

【表 4】抗ウィルス活性

(6) 多クローン性 B細胞活性化活性

本試験はエリスポット（Enzyme-Linked Immunospot; ELISP0T)法を用いて検討した。 B ALBZcマウスの脾細胞（2. 5x10⁶ 個）に所定量の本発明化合- 物あるいは比較化合物の添加あるいは無添加の条件下で 5 %の牛胎児血清（ F B S) を含む RPMI 1640培地にて、 37°C、 72時間培養した。洗浄後、抗体産生細胞は EL I SPOT法にて測定した。

すなわち、ャギ抗マウスィムノグロブリンをコートし、 5%FBS処理したプレー卜の各ゥエルに上述した脾細胞を加え 4時間培養した。細胞を洗浄除去後、プレートをピオチン標識したャギ抗マウス；鎖特異抗血清と 25°Cで一晚反応し、生理緩衝食塩水（PBS) で洗浄後、ペルォキシダーゼ標識ストレブトァビジンにて処理した。活性は抗体産生細胞により生じるスポット数（細胞数）を実体顕微鏡下で計測し、供試化合物添加の細胞数に対する供試化合物無添加の細胞数をコントロールしたときの Stimulation Inde にて表した。なお、供試化合物の用量は、細胞 2. 5 X 10⁶ 個当たりの/ z gで表した。

本発明化合物は、表 5に示されるように合成リピド Aである 506と同等もしくはそれ以上の多クローン性 B細胞活性化活性を有することが明らかとなり、従つて強い非特異的感染防御活性を有するものと考えられる。

【表 5】多クローン性 B細胞活性化活性

(7) サイトカイン産生誘導活性

サイトカイン産生誘導活性試験は、 TNF— α測定用 EL I S Αシステム（ァマーシャム · ジャパン株式会社製）および I L— 1 /3測定用 EL I SAシステム (大塚製薬株式会社製）を用いて検討した。すなわち、ヒト末梢血単球（5X1 0⁵ 個）に所定濃度の本発明化合物あるいは比較化合物を加え、 24時間培養後、培養上清中のサイトカイン量を EL I S A法により定量した。

その結果、ヒト末梢血単球からの TNF— αや I L一 1 )Sの産生を誘導する活性は、本発明化合物には殆ど認められなかった。さらに、合成リピド Aである化合物 506あるいは大腸菌由来の LPSと本発明化合物（50倍量）を同時に加えて培養することによって、化合物 506あるいは大腸菌由来の LP Sによって誘導される Γ L一 1 ^の産生を抑制することが明らかとなった。

さらに、 I L一 1レセプターアンタゴニスト（ I L一 1 r a) 測定用 E L I S Aシステム（R&D社製）により、本発明化合物はヒト末梢血単球の培養上清中に I L一 1 r aを合成リピド Aである化合物 506より多量に産生することも明らかとなつた。

( 8 ) ガラクトサミン負荷致死毒性

ガラクトサミン負荷致死毒性は以下の実験系を用いて求めた。

C57BLマウス（雄性、 8週齢）に、 16mgの D—ガラクトサミン ZHC 1 を腹腔内投与し、その直後に本願発明化合物を静脈注射し、 24時間後に状態観察を行った。

本願発明化合物は、以下の表 6に示されるような活性を示し、低毒性であることが明らかになった。【表 6】ガラクトサミン負荷致死毒性

(9) その他の毒性

①局所シュワルツマン反応

本試験は以下の方法により検討した。即ち雄のゥサギの皮内に 0. 2mlの生理食塩水で所定濃度に調製した供試化合物を注射し、 24時間後、 l O O ^ gZml Zkgの Salmonella minnesota サルモネラミネソタ 9700LPS -W (ディフコ社製）を静脈より惹起注射して 4時間後の皮内の出血反応を観察した。その結果、本発明化合物は 100 gZsiteで出血反応は見られなかった。

②発熱原性試験

本試験はゥサギを用い、供試化合物を 5 ml/kgの生理食塩水に所定濃度に調製したものを静脈注射し、直腸温度の測定を実施した。注射後 4時間の間に、 0. 6°C以上の体温上昇が認められたものについて発熱作用ありと判定した。その結果、.合成リピド Aである 506は 0. 01 gで発熱作用が認められるのに対して、本発明化合物は 1 Ο z gZkgの用量においても発熱作用が認められなかった ③リムルス試験

本試験はエンドトキシン測定試薬であるプレゲル（生化学工業株式会社製）を使用して検定した。即ち日本産カブトガ二のライセートより調製した凍結乾燥品を用いて、ゲル形成能の有無を判定した。その結果、本発明化合物の最小有効量は、合成リピド Aである 506の 1000倍であり、非常に低毒性であった。本願発明化合物は、リムルス活性、局所シュワルツマン反応および発熱性等の諸試験において低毒性であった。

Claims

請求の範囲

1. (1) 呈色反応として、硫酸反応に陽性、ディットマ一 · レスター反応に陽性、ニンヒドリン反応に陰性、 TTC反応に陰性であって、

(2) NMRスペクトルとして、 — NMR(300MHz, CDC 1₃ +Me OD +D₂ O) <5： 0.81 (12H, d) 、 0.82(3H, t ) 、 1.1-1.6(72H, m, CH₂

, CH)、 2.2-2.5 (6H, m, CO— CH₂ )、 3.1-4.3C13H, m) 、 4.46(1H , d)、 5.15C1H, m)、 5.45(1H, m) の物性値をもち、"

(3)質量スぺクトルとして、ネガティブ FAB— MS— MS、 MZZ 1193 (M-H)、 937(M-2H-C₁₅H₃₁COO) の物性値を持つ、新規ジサッカラィド誘導体、またはその塩。

2. (1) ダルコサミン (1-6) ジサッカライド構造の 1位にリン酸基がェステル結合したものを基本骨格とし、

(2) 2位のアミノ基に 3-hydroxy-15 - methylhexadecanoic acidがアミド結合し、

( ) 2 位のァノ基に 3 - hexadecanoyl - 15 - methylhexadecanoic acid がァミド結合し、

(4) 4' 位にリン酸基を持たず、 '

(5) 3位， 3' 位が遊離のままである、新規ジサッカライド誘導体またはその塩。

3. 請求項 1または 2に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を、医薬用担体およびまたは希釈剤と配合してなる医薬組成物。