WO1995007357A2 - Promotoren - Google Patents

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WO1995007357A2
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    • C12Y103/01—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.3.1)
    • C12Y103/01009—Enoyl-[acyl-carrier-protein] reductase (NADH) (1.3.1.9)
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    • C12Y103/01—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.3.1)
    • C12Y103/0101—Enoyl-[acyl-carrier-protein] reductase (NADPH, B-specific)(1.3.1.10)

Definitions

  • the present invention relates to promoters and possibly or other regulatory elements in the 5'-untranslated region of genes which code for proteins of de novo fatty acid biosynthesis, and the alleles and derivatives thereof.
  • the fatty acid and triacylglyceride biosynthesis can be regarded as separate biosynthetic pathways due to the compartmentalization, but with regard to the end product, as a biosynthetic pathway.
  • the de novo biosynthesis of fatty acids takes place in the plastids and is catalyzed by three enzymes or enzyme systems, these are (1) the acetyl-CoA carboxylase (ACCase), (2) the fatty acid synthase (FAS) and (3) the acyl - [ACP] thioesterase (TE).
  • ACCase acetyl-CoA carboxylase
  • FAS fatty acid synthase
  • TE acyl - [ACP] thioesterase
  • the end products of this reaction sequence in most organisms are either palmitic, stearic and, after desaturation, oleic acid.
  • the fatty acid synthase consists of an enzyme complex of dissociable individual enzymes with the individual enzymes acetyl- [ACP] -transacylase, malonyl- [ACP] -transacylase, ß-ketoacyl- [ACP] synthases I, II, III, ß-ketoacyl- [ACP] -Reductase,
  • HMW- Plant Cell 1, pages 569-578 (1989), V. Colot et al, Mol.Gen.Genet. 216, pages 81-90 (1989)
  • Bäumlein et. al The Plant Journal, 2, pages 233 to 239, 1992
  • Zein- Zein-
  • Lectin- Lectin- (P. Guerche et al, Mol.Gen.Genet. Pages 306-314 (1990))
  • USP- H.
  • the object of the present invention is primarily to provide promoters with which foreign genes can be expressed in plants with high efficiency or can be specifically expressed in certain tissues or cell types.
  • the object is achieved with the promoters and, if appropriate, or other regulatory elements in the 5 'untranslated region according to claim 1.
  • the invention relates to promoters and possibly or other regulatory elements in the 5 'untranslated region of genes which code for proteins of de novo fatty acid biosynthesis, and the alleles and derivatives of these promoters.
  • the invention further relates to genomic clones which contain a gene which codes for a protein of de novo fatty acid biosynthesis, and the alleles and derivatives of this gene, the gene comprising the promoter, the structural gene or at least parts thereof and other regulatory sequences.
  • the invention also relates to a process for the production of transgenic plants, plant parts and plant products, in which a promoter and possibly or other regulatory elements in the 5 'untranslated region of genes which code for proteins of de novo fatty acid biosynthesis with a desired one expressing gene is coupled and then transferred in a suitable vehicle.
  • the invention also relates to plants, parts of plants and plant products which have been produced by the above process.
  • the invention relates to the use of a promoter and, if appropriate, or other regulatory elements in the 5'-untranslated region of genes which code for proteins of de novo fatty acid biosynthesis, for the production of plants with modified gene expression.
  • Figure 1 shows the restriction maps of the genomic clones
  • Figure 2 shows the restriction map of the genomic clone
  • Figure 3 shows the restriction maps of the genomic clones
  • Figure 4 shows the restriction maps of the genomic clones
  • Figure 5 shows the restriction maps of the genomic clones
  • Figure 6 shows the restriction maps of the genomic clones
  • Figure 7 shows a Northern blot with RNAs from different
  • Plant tissues hybridized with a gene-specific probe for CITEgl
  • Figure 8 shows a Northern blot with RNAs from different
  • Plant tissues hybridized with the C1TE13 cDNA corresponding to the gene from ClTEg7;
  • Figure 9 shows a Northern blot with RNAs from different
  • Plant tissues hybridized with a specific ACP cDNA probe.
  • allelic variants and derivatives of the invention are also within the scope of the invention Promoters and other regulatory elements are detected in the 5 'untranslated area, provided that these modified units have the desired activity.
  • the allelic variants and derivatives include, for example, deletions, substitutions, insertions, inversions or additions of the promoters according to the invention. The same applies to the genomic clones that contain the above-mentioned units.
  • rapeseed Brass napus
  • lanceolate leaved quiver flower or hump flower Cincosa lanceolata
  • genes from fatty acid biosynthesis was carried out with specific hybridization probes. Based on polyA + RNA, these were prepared from approximately two to three weeks old, immature seeds from Brassica napus or from approximately two weeks old embryos from Cuphea lanceolata, after a cDNA first strand synthesis by means of polymerase chain reaction (PCR). The synthetic oligonucleotide primers required for this will be described later.
  • the promoters of the gene families of the acetyl-CoA carboxylase (ACCase) of the acyl carrier protein (ACP), the ß-ketoacyl [ACP] synthasel (KASI), the ß-ketoacyl [ACP] reductase ( KR), the enoyl [ACP] reductase (ER) and the acyl [ACP] thioesterase (TE) are isolated.
  • the promoters according to the invention and other regulatory units in the 5 'untranslated region are described as follows.
  • the DNA sequences are taken into account, which are in front of the start codon, i.e. before the start of translation of the respective structural genes.
  • the specified transcription start points describe only one of several transcription start points. It is generally known that several transcription start points can be determined for one gene.
  • the DNA sequence of the promoter region and parts of the DNA sequence of the structural gene of the ACC gene from the genomic clone BnACCaseg3 are shown as SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. This sequence comprises 2505 bp of the promoter region and approximately 700 bp of the structural gene.
  • the start codon "ATG" of the ACCase gene is located at position 2506 of the DNA sequence. The start codon in position 2506 with the neighboring nucleotides shows good agreement with the plant consensus motif for translation initiation areas (G. Heidecker and J. Messing, Annual Review Plant Physiology 3_7, pages 439-466 (1986))
  • Position 2456 If the adenine in position 2456 is assumed to be the first nucleotide of an mRNA based on 5'-RACE experiments, then there is a possible TATA box at a suitable distance of 36 nucleotides (positions 2416 to 2422). A CAAT box (positions 2283 to 2286) is further 130 nucleotides away. Thus the most important elements of a promoter and 5 'untranslated region are present.
  • the DNA fragments described below from the two other genomic clones BnACCaseglO and BnACCasegl also contain the promoter region of the ACC gene and parts of the structural gene.
  • a 4450 bp DNA fragment from the BnACCl clone contains the before the start of translation with the start codon "ATG" (position 4089) Promoter sequence and other 5 'regulatory units of the ACC gene with 4088 bp.
  • the protein-coding region of the ACC extends to position 4421.
  • the 5 'untranslated region is interrupted by an intron and, based on 5'-RACE data, begins at position 3367 (start of transcription). This intron ranges from position 3493 to 4078.
  • the promoter sequence of the ACC gene is located in a 3350 bp DNA fragment of the BnACCaseglO clone (SEQ ID NO: 3 in the sequence listing) before the start of translation with the start codon at position 2611 protein-coding sequence of the ACC goes up to position 3341 and is interrupted by an untranslated region (intron), positions 2909 to 3000.
  • genomic clone BnACCasegl and the genomic clone BnACCaseglO were deposited under number DSM 8480 and DSM 8481 on August 27, 1993 at the DSM-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig.
  • DNA sequence analysis of a 1200 bp DNA fragment of the subcloned DNA fragment from ClACPgl has shown that the promoter region of the ACP gene is contained in this fragment. It is located in front of the protein-coding sequence of the ACP gene, which begins at position 1160 with the start codon "ATG".
  • the TATA signal typical of the promoter region is located at positions 1051 to 1054.
  • the GUS gene Under the control of the ACP promoter from the genomic clone ClACPgl from Cuphea lanceolata, the GUS gene was expressed in oilseed rape. Measurements of the ⁇ -glucuronidase expression of a fusion of the ACP promoter from ClACPgl as a 1.2 kb Pstl-PvuII part. Fragment with the GUS gene showed promoter activity in the examined leaf, flower and immature seed tissues. Northern blot analyzes (see FIG. 9) showed that the corresponding ACP gene in Cuphea lanceolata is expressed in leaf, flower, root and preferably in embryonic tissue.
  • a 2450 bp partial sequence from the genomic clone ClKASIg4 (SEQ ID NO: 6 in the sequence listing) encompasses the promoter region at 1962 bp, before the putative "ATG” at position 1963 putative intron ranges from positions 2053 to 2242. The beginning of the mature protein is at position 2402.
  • Parts of the promoter region are contained in a 1350 bp partial sequence from the genomic clone ClKASIgl3 (SEQ ID NO: 8 in the sequence listing). It covers 472 bp up to the start codon "ATG" (positions 473 to 475). The start of the mature protein is at position 1075. In front of it is the transit peptide, which is interrupted by an intron that cannot be precisely defined.
  • An 1141 bp fragment from the genomic clone ClKASIgl9 (SEQ ID NO: 9 in the sequence listing) contains the promoter region in a 520 bp fragment.
  • the putative ATG is located at position 521.
  • the start of the mature protein is at position 956.
  • the transit peptide which is interrupted by an intron which cannot be precisely defined, is located in front of this.
  • the 3750 bp partial sequence from the genomic clone ClKASIg20 contains the promoter region as a 3067 bp DNA fragment.
  • the putative "ATG” is at position 3068.
  • the mature protein begins at position 3661. In front of it is the transit peptide, which is interrupted by an intron that cannot be precisely defined.
  • the sequencing of the clone ClKASIg ⁇ showed that the nucleotide sequence of the structural gene to ClKASIg4 has an identity of 98%.
  • the derived protein to ClKASIg4 also has an identity of 98%.
  • the ClKASIg2 promoter region is also very similar to ClKASIg4.
  • the close relationship between ClKASIg2, ClKASIg4 and ClKASIg ⁇ among themselves is not only clear at the sequence level, but also at the restriction map level. These three genes could be alleles, each with significant sequence differences in the promoter region.
  • the specific PCR product listed in Table 1 was initially used to isolate cDNAs from Cuphea lanceolata.
  • two types of cDNAs, C1KR10 and C1KR27, which are also different from one another at the amino acid level, were identified (B. Klein et al., Plant Lipids, pages 156-59 (1992)).
  • the cDNAs were 1295 and 1276 bp in size (with polyA residue) and each code for an open reading frame of 326 and 320 amino acids including the transit peptides of 69 and 63 amino acids.
  • the proteins derived from the DNA sequence have a molecular weight of 27 kDa.
  • cDNA C1KR27 from nucleotide 210 as a fusion with the glutathione-S-transferase in vector pGEX-KG resulted in the purification of a fusion protein of 53 kDa.
  • This fusion protein was used for enzyme determination for ß-ketoacyl- [ACP] reductase with acetoacetyl-CoA.
  • the measured values showed that the cDNA C1KR27 codes for a NADPH-dependent KR, which can be specifically inhibited by phenylglyoxal (Klein, supra).
  • the promoter region of the ClKRg2 gene is located on a 1570 bp DNA fragment (SEQ ID NO: 11 in the sequence listing). It comprises 1511 bp with a non-translatable area.
  • the protein coding sequence of the KR gene begins with the start codon "ATG" from position 1512.
  • the TATA signal is located at positions 1412 to 1429, the putative transcription start at position 1445 (see above).
  • the promoter region of the ClKRg3 gene is located on a 926 bp DNA fragment (SEQ ID NO: 12 in the sequence listing). At 915 bp, it encompasses the area in front of the start codon "ATG" at position 916.
  • the region of the TATA box is at positions 827 to 838, the putative transcription start is at position 864 (see above).
  • the complete gene is contained in ClKRgl2. It was sequenced in double strands and the exon and intron regions were determined.
  • the promoter region of this gene is located on a 1450 bp DNA fragment (SEQ ID NO: 13 in the sequence listing). It is in a range of 1420 bp before the start codon "ATG" at position 1421.
  • the range of the TATA box extends from positions 1327 to 1343 and the putative transcription start is at position 1369 (see above).
  • the promoter regions of the three KR genes show TATA box motifs which correspond to the consensus sequence for plants according to Joshi (1987), supra, TCACTATATATAG: ClKRg2 is correct in l ⁇ positions (items 1412-1429), ClKRgl2 in 16 positions (item . 1327-1343) and ClKRg3 in 12 positions (pos. 827-836).
  • the translation initiation sequence also shows high homo- on the known consensus sequence motifs (Kozak (1984), supra, Joshi (1987), supra, Lütcke et al (1987), sup ⁇ ra).
  • the promoters of the ClKRgl2 and ClKRg3 genes show very high agreement with one another, with the exception of an approximately 500 bp insertion in the ClKRgl2 promoter. This insertion has numerous "inverted repeats" with unknown function.
  • a cDNA, CLER18 is 1533 bp in length and encodes a 391 amino acid protein including 75 amino acids for a transit peptide.
  • the mature protein has a calculated molecular weight of 33.4 kDa and shows 83.3% identical amino acids with the ER from Brassica napus.
  • the cDNA C1ER7 from nucleotide 297 was fused with the glutathione S-transferase, expressed in E.
  • genomic ER clones Five genomic ER clones were isolated from a ⁇ genomic bank of Cuphea lanceolata DNA using the PCR product as a probe. 5 shows the restriction maps of the genomic clones ClERg ⁇ (12.5 kb), ClERg7 (14.4 kb), ClERg9 (16.4 kb), ClERglO (12 kb) and ClERg20 (11.8 kb). The black bars show the one hybridizing with the probe Area, the white bars the DNA sections sequenced for the promoter area.
  • the gene ClERg9 could be assigned to type B by hybridization with specific oligonucleotides that go back to cDNA C1ER8. Sequencing of the hybridizing Sall fragment of the ClERg5 gene revealed differences in the deduced amino acid sequence from the two identified classes of enoyl [ACP] reductases and thus represents the third class of E genes, type C.
  • the genomic structure of the coding region for the mature protein from ClERg5 was identified.
  • the mature protein has 11 exons.
  • a 1800 bp partial sequence of the gene from ClERg5 (SEQ ID NO: 14 in the sequence listing) shows parts of the promoter with regulatory units other than 1763 bp DNA sequence.
  • the CAAT box (1335 to 1338) and the TATA box (1362 to 1367) are located in this area.
  • the start of transcription is at position 1415, based on 5'RACE.
  • An intron in the non-coding 5 'area is located at positions 1560 to 1741. Translation begins with the start codon "ATG" at position 1764.
  • Fusions of the promoter region with the GUS gene showed marked activity in the examined tissues (leaf and flower) of transgenic oilseed rape plants.
  • Fusions of the promoter region with the GUS gene showed marked activity in the examined tissues (leaf and flower) of transgenic oilseed rape plants.
  • An approximately 870 bp DNA fragment from ClERg9 contains, as an approximately 690 bp DNA segment, other regulatory elements in the 5 'untranslated region.
  • the transcription start is assumed at position 1 after 5'RACE.
  • An incomplete intron in the untranslated area extends to position 329 (SEQ ID NO: 16b in the sequence listing).
  • the translated area begins with the start codon "ATG" at position 367 (SEQ ID NO: 16b in the sequence listing).
  • a non-sequenced area of approximately 160 bp is between SEQ ID NO: 16a and 16b.
  • Parts of the promoter and other regulatory elements are located on an approx. 2800 bp DNA fragment from ClERglO (SEQ ID NO: 17a and 17b in the sequence listing). This region comprises approximately 2709 bp and contains an intron in the 5 'untranslated region at positions 251 to 448 (SEQ ID NO: 17b in the sequence listing).
  • the translation start begins with the start codon "ATG" at position 472 (SEQ ID NO: 17b in the sequence listing).
  • a non-sequenced area of approximately 78 bp is between SEQ ID NO: 17a and 17b.
  • a part of the promoter and other regulatory elements are contained in an approx. 1060 bp DNA fragment from ClERg20 (SEQ ID NO: 18a and 18b in the sequence listing).
  • This area comprises approx. 912 bp and contains the CAAT box (items 159 to 162) (SEQ ID NO: 18a in the sequence listing) and the TATA box (positions 211 to 215) (SEQ ID NO: 18a in the sequence listing) - an intron at positions 309 (SEQ ID NO: 18a) to 567 (SEQ ID NO: 18b).
  • Translation begins with "ATG" at position 598 (SEQ ID NO: 18b in the sequence listing).
  • a short, non-sequenced range of approximately 5 bp lies between SEQ ID NO: 17a and 18b.
  • the genomic clone ClERg7 under the number DSM 8489, the genomic clone ClERg9 under the number DSM 8490, the genomic clone ClERglO under the number DSM 8491 and the genomic clone ClERg20 under the number DSM 8492 at the DSM-German Collection by microorganisms and cell cultures GmbH, Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig.
  • Corresponding cDNAs from maturing embryos from Cuphea lanceolata were used with the help of the PCR product listed in Table 1.
  • One of the cDNAs obtained, C1TE13 has a length of 1404 bp and codes for a protein with 414 amino acids including a transit peptide with 111 amino acids. The molecular weight of the mature protein is 34 kDa.
  • other but incomplete cDNAs were isolated.
  • One of these cDNAs, C1TE5 which lacks 34 amino acids of the transit peptide, has been included in the comparison of derived sequences of mature proteins from previously known plant TEs.
  • the C1TE5 also shows a greater similarity to medium-chain-specific TEs than to long-chain-specific TEs.
  • Figure 6 shows restriction maps of the genomic clones CITEgl, ClTEg4, ClTEg7 and ClTEgl6.
  • the black bars show the areas hybridizing with the probe, the white bars mark the DNA sections sequenced for the promoter area.
  • the clones presented contain the full gene of acyl [ACP] thioesterase.
  • a 3350 bp partial sequence of the gene with the promoter region from CITEgl6 shows the promoter region with other regulatory elements as a DNA sequence with 3290 bp.
  • the areas of the CAAT box and the TATA box are at positions 2914 to 2918 and 3035 to 3038, respectively.
  • the transcription start is probably at position 3068 (see above). Exon and intron areas are located at positions 3068 to 3107 (exon I), 310 ⁇ to 3280 (intron I) and 3281 to 3350 (exon II, incomplete).
  • the legumin box can be recognized at positions 3120 to 3132.
  • the translation begins at position 3291 with the start codon "ATG".
  • An 1850 bp partial sequence of the gene from CITEgl (SEQ ID NO: 19 in the sequence listing) comprises the promoter and other 5 'regulatory units of the TE gene in the untranslated region as a DNA sequence with 1796 bp.
  • the CAAT box and the TATA box are located in the promoter area at positions 1428 to 1432 and 1553 to 1556.
  • the mapped transcription start is at position 1585. This is followed by exon and intron areas at positions 1585 to 1629 (exon I ), 1630 to 1786 (intron I) and 1787 to 1850 (exon II, incomplete).
  • the legumin box is located at position 1642 to 1657.
  • the translation start begins with the start codon "ATG" at position 1797.
  • a 2750 bp partial sequence of the gene from ClTEg4 contains the promoter and other 5 'regulatory units in the untranslated region of the TE gene as a DNA sequence with 2636 bp.
  • An exon (exon I) ends at position 2193 and an intron (intron I) and another exon (exon II, incomplete) are located at positions 2194 to 2626 and 2627 to 2750.
  • the translation start begins with the start codon "ATG" at position 2637.
  • An 850 bp partial sequence of the gene from ClTEg7 shows the promoter and other 5 'regulatory units in the untranslated region of the TE gene as a DNA sequence with 782 bp. Exon and intron regions are at positions 143 to 190 (exon I, possibly incomplete), 191 to 772 (intron I) and 773 to 850 (exon II, incomplete).
  • the translation start begins with the start codon "ATG" at position 783.
  • the promoters of the genes from the clones CITEgl and CITEgl6 according to the invention are therefore suitable, for example, for the directed expression of chimeric genes in embryo-specific plant tissue, and the promoters of the genes from the clones ClTEg4 and ClTEg7 according to the invention, for example, for an extraordinarily strong expression of chimeric genes in flowers.
  • the genomic clone ClTEg4 under the number DSM 8493 and the genomic clone ClTEg7 under the number DSM 8494 was deposited with the DSM-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig.
  • the two other genomic clones CITEgl and ClTEgl6 were plasmids in which parts of these genomic clones are present under the numbers DSM 8477 (pNBM99-TEgl) and DSM 8478 (pNBM99-TEgl6) on August 27, 1993 at the DSM-Deutsche Sammlung von Microorganisms and cell cultures GmbH, Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig.
  • clonable 5 'regulatory DNA fragments can be produced from the genomic clones, which, in combination with any desired gene, specifically induce their expression in any plants.
  • the following Table 2 shows examples of clonable fragments from the investigated genomic clones with the possible fusions. Table 2
  • the cloning of regulatory important parts of the promo- tors and other regulatory elements, for example the introns in the 5 'untranslated region, can be used to construct chimeric promoter / expression units.
  • the promoters according to the invention can be transferred with any desired gene to form chimeric genes in a suitable vehicle in plants with the formation of transgenic plants by genetic engineering.
  • the genes in question can be expressed constitutively or induced.
  • the induced expression can be development-specific, externally induced (biotic / abiotic) or cell type-specific.
  • Such genes include, in particular, selectable marker genes for the transformation of plants, resistance genes (herbicide resistance, pathogen resistance), regulatory genes and genes which are used for the seed-specific expression of genes of fatty acid metabolism, carbohydrate metabolism, amino acid metabolism, secundum metabolism, such as for example polyhydroxybutyrate. Synthesis are responsible.
  • Suitable gene transfer vehicles are, for example, binary vectors of the pPCV 002 series (Konz and Schell, Mol.Gen.Genet. 204. Pages 383-396 (1986)) and vectors of the pRT series for direct DNA transfer (Töpfer et al, Methods in Enzymology ed. R. Wu, Academic Press Inc., New York 217, pages 66-78 (1993)), and viral vectors.
  • the expression of foreign genes in transgenic plants can thus be controlled with the promoters according to the invention. This means that either the gene expression can be significantly increased or inhibited (by endogenous genes) or a targeted expression can be caused in certain tissues of plants.
  • the examples serve to explain the invention.
  • Restriction endonucleases and nucleic acid modifying or synthesizing enzymes were developed by Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim), GIBCO-BRL (Eggenstein), New England Biolabs GmbH (Schwalbach), Perkin Elmer Cetus (Norwalk, USA), Pharmacia Biotech GmbH (Freiburg) and Stratagene GmbH ( Heidelberg) related.
  • kits A number of methods for cleaning, analysis or synthesis are facilitated and accelerated by prefabricated or compiled materials with specific application protocols, so-called “kits”. The following list provides an overview of the kits used, which were used according to the manufacturer's protocols:
  • Hybond N ® membrane filters and Amersham Buchler GmbH & Co. KG were used for Southern and Northern blots as well as for the screening of cDNA and genomic DNA banks.
  • X-Omat X-ray films from Kodak (Rockland, USA) for autoradiographs, Sephadex G 50 columns and NAP 25 columns from Pharmacia Biotech GmbH (Freiburg) for the cleaning of radioactively labeled hybridization probes and for cleaning synthetic oligonucleotides, Dynabeads ® 01igo (dT) 25 from Dynal (Oslo, Norway) for the polyA * insulation, films type 52 and type 55 for Polaroid flat film cassettes model 545 from Polaroid (Cambridge, USA), Quiagen-tip 100 from Diagen GmbH (Hilden) for DNA isolations and 3MM paper from Whatman (Maidstone, USA) in the screening of cDNA and genomic DNA banks.
  • Plasmid pBluescript ® II SK (-) (. No. 212206 Stratagene), pUC19, pUC18 (C. Yanisch-Perron et al, Gene 4J, pages 103-119 (1985).).
  • PKl ⁇ RD Pridmore, Gene 56, pages 309- 312 (1987)
  • pGEX-KG KL Guan et al, Anal. Biochem. 192, pages 262-267 (1991)
  • a cDNA library from C. lanceolata (wild type) was produced using the cDNA ZAP ® synthesis kit according to the manufacturer's instructions.
  • the starting material for the synthesis of the cDNAs was mRNA from isolated, immature embryos about two to three weeks old.
  • the cDNA library obtained has a size of 9.6 ⁇ 10 5 recombinant phages with a proportion of approximately 50% of clones, the insertions of which exceed 500 bp.
  • the genomic DNA libraries were created with the Lambda FIX ® II vector system from DNA of B. napus (cv AKELA) and C. lanceolata K ⁇ .
  • the size of the rapeseed genomic DNA bank is 7.5 x 10 5 recombinant phages (with Insertions of 15 kb on average) and thus represents 3.6 times the rapeseed genome (the size of the rapeseed genome is 3.1 x 10 6 kb; C. Hallden et al, J. Mol. Vol. 25, pages 318-323 (1987 )).
  • the size of the C is 7.5 x 10 5 recombinant phages (with Insertions of 15 kb on average) and thus represents 3.6 times the rapeseed genome (the size of the rapeseed genome is 3.1 x 10 6 kb; C. Hallden et al, J. Mol. Vol. 25, pages 318-323 (1987 )).
  • lanceolata genomic DNA library is 3.5 ⁇ 10 5 recombinant phages (with insertions of about 15 kb on average) and thus comprises about 17 times the genome of this plant, the genome of which is 3 ⁇ 10 5 kb owns.
  • ⁇ -glucuronidase activity was determined fluorometrically with 4-methylumbelliferylglucuronide or histochemically with 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-glucuronic acid (X-gluc, Clontech Laboratories, Palo Alto) (RA Jefferson et al., EMBO J 6, pages 3901-3907 (1987)).
  • Acetyl-CoA carboxylase Specific primers for acetyl-CoA carboxylase were compared by comparing different biotin-containing proteins, including the ACCase from chicken and the ACCase (more precisely the biotin carboxylase) from E. coli in the publication by Kondo et al, Proc. Natl.Acad.Sci. 8 . , Pages 9730-9733 (1991) derived from conserved sections of the sequences.
  • oligonucleotide primers are based on the amino acids of the regions 304 to 311 and 383 to 390 based on the amino acid sequence of the rat ACCase (Kondo et. Al, supra).
  • Acyl Carrier Protein Degenerate oligonucleotides for the N-terminus of the C. lanceolata acyl carrier protein were derived from N-terminal amino acid sequence data, kindly provided by F. Spener (Munster) prior to publication (Kopka ⁇ t al, Planta 191, pages 102 -111 (1993)). This amino acid sequence together with the conserved VMGLEEEF motif from acyl carrier proteins (e.g. Souciet and Weil 1992, Kopka et al 1993) were used to synthesize the primers listed in Table 2 (3098 and 3240).
  • ⁇ -ketoacyl [ACP] synthase I A comparison of ⁇ -ketoacyl [ACP] synthase I from barley with that from E. coli shows only a few areas with greater homology (Siggaard-Anderson et al, Proc.Ntl. Acad. Sci .88., Pages 4114-4118 (1991)). A was used to synthesize a specific pair of primers (Table 2) Sequence section located at the N-terminal (item 13 to 21 for primer 2763) and the region around the cysteine binding the inhibitor cerulenin (item 71 to 79 for primer 2762) (Siggaard-Anderson et aj-, supra). The KAS sequence from barley was kindly provided by P. von Wettstein-Knowles prior to publication (Siggaard-Anderson e_t al, supra).
  • ⁇ -Ketoacyl [ACP] reductase A sequence comparison of two typical fragments of the ⁇ -ketoacyl [ACP] reductase from avocado with the sequence of the nodG protein from Rhizobium meliloti in the publication by Sheldon et al, Biochem.J. 271, pages 713-729 (1990) has short areas of high homology between the two proteins.
  • the two oligonucleotide primers 2189 and 2187 were synthesized based on the fragmentary sequences of the ⁇ -ketoacyl- [ACP] reductase from avocado and the homology to nodG given in this publication (Table 2).
  • Enoyl [ACP] reductase To obtain a specific primer pair (Table 2), amino acid sequence sections of the enoyl [ACP] reductase from rapeseed (Kater et al. Plant. Mol. Biol. 37, pages 895-909 (1991)) selected with a relatively little degenerate genetic code. The selected sequences correspond to amino acid positions 101 to 108 (primer 3389) and 153 to 160 (primer 3391). (Table 2)
  • Acyl- [ACP] thioesterase The publication by Voelker et al, Science 257, pages 72-74 (1992) shows the first sequence of a plant acyl- [ACP] thioesterase. Since it is also the sequence of a medium-chain-specific enzyme, some areas of the sequence whose derived DNA sequence is as little as possible degenerate. Oligonucleotide primers derived and synthesized.
  • the primer 3532 (Table 2), which is the amino acids 277 to 264 of the acyl [ACP] thioesterase from Umbellularia California, was found to be suitable for amplification in PCR reactions in connection with primer number 2740 (a modified oligo-dT primer with interfaces for the restriction endonucleases BstBI, BamHI, Hindlll and Sall) a specific hybridization probe.
  • reverse transcriptase (Boehringer Mannheim GmbH) from Avian Myeloblastosis Virus (AMV) was used to carry out a cDNA synthesis at 37 ° C. for 30 minutes.
  • AMV Avian Myeloblastosis Virus
  • the 3'-oligonucleotide primers shown in Table 3 were used for the synthesis of a specific hybridization probe.
  • Ampli Taq ® polymerase (Perkin Elmer Cetus) was dissolved in the same reaction mixture, the PCR reaction with 50 pmol final concentration each primer (3 see Table) is performed.
  • the reactions were carried out under the following conditions: a) Buffer conditions: 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 50 mM KC1; 1.5 mM MgCl 2 ; 0.01% gelatin and 5 mM dNTPs, b) reaction time and temperatures: 3 minutes at 92 ° C for the first denaturation, then 25 to 30 temperature cycles with: 2 minutes at 92 ° C for the denaturation, 2 minutes for the in Table 4 specified temperature for annealing the oligonucleotides and 2.5 minutes at 72 ° C for amplification of the DNA and finally 7 minutes at 72 ° C to achieve a complete synthesis of the last synthesis products.
  • Buffer conditions 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 50 mM KC1; 1.5 mM MgCl 2 ; 0.01% gelatin and 5 mM dNTPs
  • reaction time and temperatures 3 minutes at 92 ° C for the first denaturation, then 25 to 30 temperature cycles with:
  • the PCR products described in Example 1 were used for the isolation of the genomic clones. This was done either directly by using the PCR product as a probe for searching a bank of genomic DNA or via a cDNA as a probe, which was used by using the PCR product as a suitable probe for searching cDNA banks.
  • the genomic clones found were sequenced in a conventional manner and characterized with regard to the promoter regions.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Promotoren und ggf. oder andere regulatorische Elemente im 5'-nicht translatierten Bereich von Genen, die für Proteine der de novo Fettsäurebiosynthese kodieren, und die Allele sowie Derivate dieser Promotoren. Diese Promotoren und ggf. oder andere regulatorische Elemente im 5'-nicht translatierten Bereich können beispielsweise unter Bildung chimärer Gene mit fremden Genen gekoppelt werden und in geeigneten Vehikelsystemen in Pflanzen übertragen werden.

Description

Beschreibung
PROMOTOREN
Die vorliegende Erfindung betrifft Promotoren und ggf. oder andere regulatorische Elemente im 5'-nicht translatierten Bereich von Genen, die für Proteine der de novo Fettsäure¬ biosynthese kodieren, und die Allele sowie Derivate davon.
Die Fettsäure- und Triacylglyceridbiosynthese lassen sich aufgrund der Kompartimentierung als getrennte Biosynthesewege, jedoch im Hinblick auf das Endprodukt, als ein Biosyntheseweg ansehen. Die de novo Biosynthese von Fettsäuren erfolgt in den Piastiden und wird von drei Enzymen bzw. Enzymsystemen kata¬ lysiert, das sind (1) der Acetyl-CoA Carboxylase (ACCase) , (2) der Fettsäuresynthase (FAS) und (3) der Acyl- [ACP] -Thioeste- rase (TE) . Die Endprodukte dieser Reaktionsfolge sind in den meisten Organismen entweder Palmitin-, Stearin- und, nach einer Desaturierung, Ölsäure.
Die Fettsäuresynthase besteht aus einem Enzymkomplex dissoziierbarer Einzelenzyme mit den einzelnen Enzymen Acetyl- [ACP] -Transacylase, Malonyl- [ACP] -Transacylase, ß-Ketoacyl- [ACP] -Synthasen I, II, III, ß-Ketoacyl- [ACP] -Reduktase,
Hydroxyacyl- [ACP] -Dehydratase, Enoyl- [ACP] -Reduktase und ACP =
Acyl Carrier Protein.
Im sogenannten "Kennedy Pathway" erfolgt dann im Cytoplasma am Endoplasmatischen Retikulum die Triacylglyceridbiosynthese aus Glycerin-3-Phosphat und Fettsäuren, die als Acyl-CoA-Substrate vorliegen. Die Expression von Genen der Fettsäurebiosynthese wird durch ihre vorgeschalteten Promotoren maßgeblich reguliert. Sie kontrollieren die gewebespezifische, entwicklungsspezifische oder die durch äußere Reize induzierte Expressionsstärke der ihnen nachgeschalteten Gene.
Eine Vielzahl von pflanzlichen Promotoren, auch samenspezi¬ fische Promotoren, ist in den letzten Jahren isoliert und charakterisiert worden. Einige Beispiele sind der HMW- ( .S. Robert et al, Plant Cell 1, Seiten 569-578 (1989), V. Colot et al, Mol.Gen.Genet. 216, Seiten 81-90 (1989)), Bäumlein et. al, The Plant Journal, 2 , Seiten 233 bis 239, 1992, Zein- (A.J.M. Matzke et al, Plant.Mol.Biol. 14./ Seiten 323-332 (1990)), Lectin- (P. Guerche et al, Mol.Gen.Genet. Seiten 306- 314 (1990)), USP- (H. Bäumlein et al, Mol.Gen.Genet. 225. Seiten 459-467 (1991)), Napin- (M. Stayton et al, Aust.J.Plant. Physiol. 1£, Seiten 507-517 (1991)), Oleosin- (J.S. Keddie et al, Plant.Mol.Biol. ,19, Seiten 443-453 (1992)) oder der ACP-Promotor (J. de Silva et. al, Plant.Mol.Biol. 18, Seiten 1163-1172 (1992)). Inwieweit sie für die Expression eines bestimmten Gens geeignet sind, und welche Unterschiede sie in Bezug auf den gewünschten Phänotyp aufweisen, kann nicht vorausgesagt werden. Oftmals sind die Untersuchungen zu ihrer Spezifität an anderen Pflanzenarten als der jeweils interessanten Kulturpflanze durchgeführt worden. In Raps untersucht und für Änderungen des Fettsäurestoffwechsels als geeignet erwiesen haben sich ein Napin- (J.C. Kridl e_t al, Seed Sci.Res. 1 , Seiten 209-219 (1991), D.S. Knutzon et al, Proc.Natl.Acad.Sci. 19, Seiten 2624-2628 (1992)) und ein ACP- Promotor (Knutzon et al, D.E. Scherer e_t al, Plant.Mol.Biol. 9., Seiten 127-134 (1987)).
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, in erster Linie Promotoren zur Verfügung zu stellen, mit denen man fremde Gene in Pflanzen mit hoher Effizienz exprimieren oder gezielt in bestimmten Geweben oder Zelltypen zur Ausprägung bringen kann. Die Aufgabe wird mit den Promotoren und ggf. oder anderen regulatorischen Elementen im 5'-nicht translatierten Bereich gemäß Patentanspruch 1 gelöst.
Die Erfindung betrifft Promotoren und ggf. oder andere regulatorische Elemente im 5' -nicht translatierten Bereich von Genen, die für Proteine der de novo Fettsäurebiosynthese kodieren, und die Allele sowie Derivate dieser Promotoren.
Die Erfindung betrifft weiterhin genomische Klone, die ein Gen enthalten, das für ein Protein der de novo Fettsäurebio¬ synthese kodiert, und die Allele sowie Derivate dieses Gens, wobei das Gen den Promotor, das Strukturgen oder zumindest Teile davon sowie andere Regulatorsequenzen umfaßt.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen, Pflanzenteilen und Pflanzenprodukten, bei dem ein Promotor und ggf. oder andere regulatorische Elemente im 5' -nicht translatierten Bereich von Genen, die für Proteine der de novo Fettsäurebiosynthese kodieren, mit einem gewünschten zu exprimierenden Gen gekoppelt wird und dann in einem geeigneten Vehikel übertragen wird.
Die Erfindung betrifft außerdem Pflanzen, Pflanzenteile und Pflanzenprodukte, die nach dem obigen Verfahren hergestellt worden sind.
Die Erfindung betrifft schließlich die Verwendung eines Promotors und ggf. oder anderer regulatorischer Elemente im 5'-nicht translatierten Bereich von Genen, die für Proteine der de novo Fettsäurebiosynthese kodieren, zur Herstellung von Pflanzen mit veränderter Genexpression.
Die Unteransprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung. Die Figuren dienen zur Erläuterung der Erfindung. Es zeigen:
Figur 1 die Restriktionskarten der genomischen Klone
BnACCaseg3, BnACCaseglO und BnACCasegl;
Figur 2 die Restriktionskarte des genomischen Klons
ClACPgl;
Figur 3 die Restriktionskarten der genomischen Klone
ClKASIg2, ClKASIgβ, ClKASIg4, ClKASIgl3, ClKASIgl9 und ClKASIg20;
Figur 4 die Restriktionskarten der genomischen Klone
ClKRg2, ClKRgl2 und ClKRg3;
Figur 5 die Restriktionskarten der genomischen Klone
ClERg5, ClERg7, ClERg9, ClERglO und ClERg20;
Figur 6 die Restriktionskarten der genomischen Klone
CITEgl, ClTEg4, ClTEg7 und ClTEglδ;
Figur 7 einen Northern-Blot mit RNAs aus verschiedenen
Pflanzengeweben, hybridisiert mit einer genspezifischen Sonde für CITEgl;
Figur 8 einen Northern-Blot mit RNAs aus verschiedenen
Pflanzengeweben, hybridisiert mit der dem Gen aus ClTEg7 entprechenden cDNA C1TE13; und
Figur 9 einen Northern-Blot mit RNAs aus verschiedenen
Pflanzengeweben, hybridisiert mit einer spezifischen ACP cDNA-Sonde.
Es ist selbstverständlich, daß im Rahmen der Erfindung auch allelische Varianten und Derivate der erfindungsgemäßen Promotoren und anderen regulatorischen Elemente im 5' -nicht translatierten Bereich erfaßt sind, unter der Voraussetzung, daß diese modifizierten Einheiten die gewünschte Aktivität aufweisen. Zu den allelischen Varianten und Derivaten zählen beispielsweise Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen oder Additionen der erfindungsgemäßen Promotoren. Dasselbe gilt auch für die genomischen Klone, die die oben genannten Einheiten enthalten.
Die Isolation der Promotoren und ggf. oder der anderen regulatorischen Elemente im 5' -nicht translatierten Bereich erfolgt über die Isolation der ihnen nachgeschalteten Gene. Die Gene für die Proteine der Fettsäurebiosynthese sind in allen Pflanzen vorhanden und daher auch aus diesen isolierbar. Als besonders geeignetes Pflanzenmaterial hat sich in der vorliegenden Erfindung der Raps (Brassica napus) und das lanzettblättrige Köcherblümchen oder Höckerblümchen (Cuphea lanceolata) erwiesen.
Die Isolation von Genen der Fettsäurebiosynthese wurde mit spezifischen Hybridisierungssonden durchgeführt. Diese wurden, ausgehend von polyA+-RNA aus etwa zwei bis drei Wochen alten, unreifen Samen von Brassica napus bzw. aus etwa zwei Wochen alten Embryonen von Cuphea lanceolata, nach einer cDNA- Erststrangsynthese mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) hergestellt. Die dazu erforderlichen synthetischen Oligonukleotidprimer werden später beschrieben. Auf diese Weise konnten die Promotoren der Genfamilien der Acetyl-CoA- Carboxylase (ACCase) des Acyl Carrier Proteins (ACP) , der ß- Ketoacyl- [ACP] -Synthasel (KASI) , der ß-Ketoacyl- [ACP] - Reduktase (KR) , der Enoyl- [ACP] -Reduktase (ER) und der Acyl- [ACP] -Thioesterase (TE) isoliert werden.
Die Größen (in bp) der PCR-Produkte zur Isolation für die obengenannten Genfamilien sind in der nachfolgenden Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1
Figure imgf000008_0001
Die erfindungsgemäßen Promotoren und andere regulatorische Einheiten im 5' -nicht translatierten Bereich werden wie folgt beschrieben. Als Basis für die Promotor- und andere Regula¬ tionssequenzen im nicht translatierten 5' -Bereich werden die DNA-Sequenzen berücksichtigt, die sich vor dem Startkodon, d.h. vor dem Translationsstart der jeweiligen Strukturgene befinden. Die angegebenen Transkriptionsstartpunkte beschreiben nur einen von mehreren Transkriptionsstartpunkten. Daß mehrere Transkriptionsstartpunkte für ein Gen bestimmt werden können, ist allgemein bekannt.
Promotoren der Gene der Genfamilie Acetyl-CoA- Carboxylase (ACC)
Unter Verwendung des in Tabelle 1 gezeigten PCR-Produkts wurden aus einer Bank von genomischer DNA von Brassica napus 15 genomische Klone isoliert. Die Restriktionskartierung von neun Klonen ergab drei unterschiedliche Klassen von Genen, die durch die Klone BnACCaseg3 (ca. 20 kb) , BnACCaseglO (15 kb) lind BnACCasegl (15 kb) repräsentiert sind. Die Restriktions- karten dieser genomischen Klone sind in Figur 1 gezeigt. Die schwarzen Balken zeigen die mit dem PCR-Produkt hybridisie¬ renden Bereiche, während dessen die weißen Balken die DNA- Fragmente umfassen, die sequenziert wurden.
Als SEQ ID NO:l im Sequenzprotokoll ist die DNA-Sequenz der Promotorregion und Teile der DNA-Sequenz des Strukturgens des ACC-Gens aus dem genomischen Klon BnACCaseg3 gezeigt. Diese Sequenz umfaßt 2505 bp des Promotorbereichs und etwa 700 bp des Strukturgens. Das Startkodon "ATG" des ACCase-Gens befin¬ det sich an Position 2506 der DNA-Sequenz. Das Startkodon in Position 2506 mit den benachbarten Nukleotiden zeigt eine gute Übereinstimmung mit dem pflanzlichen Konsensusmotiv für Translations-Initiationsbereiche (G. Heidecker und J. Messing, Annual Review Plant Physiology 3_7, Seiten 439-466 (1986))
(H.A. Lütcke et al, EMBO J. £, Seiten 43-48 (1987), C.P. Joshi et al, Nucl. Acids Res. 15., Seiten 6643-6653, (1987)) . Im Abstand von 41 Nukleotiden stromaufwärts befindet sich ein Motiv, das als Transkriptionsstart fungiert, da es dem Konsen¬ susmotiv (CTCATCA) nach Joshi, supra, sehr nahe kommt
(Position 2456) . Nimmt man das Adenin in Position 2456 basierend auf 5'-RACE Experimenten als erstes Nukleotid einer mRNA an, dann befindet sich in passendem Abstand von 36 Nukleotiden eine mögliche TATA-Box (Positionen 2416 bis 2422) . Des weiteren liegt weitere 130 Nukleotide entfernt eine CAAT- Box (Positionen 2283 bis 2286) . Somit sind die wichtigsten Elemente eines Promotor- und 5' -nichttranslatierten Bereichs vorhanden.
So enthalten die nachfolgend beschriebenen DNA-Fragmente aus den beiden anderen genomischen Klone BnACCaseglO und BnACCasegl ebenfalls die Promotorregion des ACC-Gens sowie Teile des Strukturgens. Ein 4450 bp DNA-Fragment aus dem BnACCl-Klon (SEQ ID NO:2 im Sequenzprotokoll) enthält vor dem Translationsstart mit dem Startkodon "ATG" (Position 4089) die Promotorsequenz und andere 5' -regulatorische Einheiten des ACC-Gens mit 4088 bp. Der proteinkodierende Bereich der ACC erstreckt sich bis Position 4421. Der 5' -nicht translatierte Bereich wird durch ein Intron unterbrochen und beginnt aufgrund von 5'-RACE Daten an Position 3367 (Transkriptions- Start) . Dieses Intron reicht von Position 3493 bis 4078. Die Promotorsequenz des ACC-Gens befindet sich in einem 3350 bp DNA-Fragment des BnACCaseglO-Klons (SEQ ID NO:3 im Sequenz¬ protokoll) vor dem Translationsstart mit dem Startkodon an Position 2611. Die proteinkodierende Sequenz der ACC geht bis zu Position 3341 und wird durch einen nicht translatierten Bereich (Intron) , Positionen 2909 bis 3000, unterbrochen.
Der genomische Klon BnACCasegl und der genomische Klon BnACCaseglO sind unter der Nummer DSM 8480 bzw. DSM 8481 am 27.08.1993 bei der DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig hinterlegt worden.
2. Promotoren der Gene der Genfamilie Acyl-Carrier-Protein (ACP)
Unter Verwendung des in Tabelle 1 aufgeführten PCR-Produkts wurde eine Bank aus genomischer DNA von Cuphea lanceolata nach Genen für das Acyl-Carrier-Protein untersucht. Auf diesem Weg wurden 20 genomische Klone isoliert. Diese Klone konnten mit bereits vorhandenen klassenspezifischen cDNAs als Hybridi- sierungssonden in drei Klassen eingeteilt werden. Man unter¬ scheidet die Klassen C1ACP1-1, C1ACP1-2 und C1ACP1-3. Von der Klasse C1ACP1-1 wurde der genomische Klon ClACPgl kartiert. Die Restriktionskarte des genomischen Klons ClACPgl ist aus Figur 2 zu ersehen. Die Größe der Insertion beträgt 15,8 kb für ClACPgl. Innerhalb der genannten Insertion konnte der Promotorbereich identifiziert und das entsprechende Restriktionsfragment subkloniert werden. So wurde von ClACPgl ein 8 kb großes BamHI/SacI-Fragment in pUC19 subkloniert, dessen Ansequenzierung die Orientierung des Gens ergab. Dieser Klon enthält neben dem Strukturgen des ACP den Promotor für dieses Gen. Der schwarze Balken in Figur 2 zeigt das subklo- nierte DNA-Fragment des ClACPgl-Klons und der weiße Balken den DNA-Abschnitt, der sequenziert wurde.
Die DNA-Sequenzanalyse eines 1200 bp DNA-Fragments des subklonierten DNA-Fragments aus ClACPgl (SEQ ID NO:4 im Sequenzprotokoll) hat ergeben, daß in diesem Fragment der Promotorbereich des ACP-Gens enthalten ist. Er befindet sich vor der proteinkodierenden Sequenz des ACP-Gens, die an Position 1160 mit dem Startkodon "ATG" beginnt. Das für den Promotorbereich typische TATA-Signal ist an den Positionen 1051 bis 1054 lokalisiert.
Unter der Kontrolle des ACP-Promotors aus dem genomischen Klon ClACPgl aus Cuphea lanceolata wurde das GUS-Gen in Raps zur Expression gebracht. Messungen der ß-Glucuronidase-Expression einer Fusion des ACP-Promotors aus ClACPgl als 1,2 kb großes Pstl-PvuII-part. Fragment mit dem GUS-Gen zeigte Promotor¬ aktivität in den untersuchten Geweben Blatt, Blüte und unreife Samen. Northern-Blot-Analysen (siehe Figur 9) zeigten, daß das entsprechende ACP-Gen in Cuphea lanceolata in Blatt, Blüte, Wurzel und bevorzugt im embryonalen Gewebe zur Expression kommt.
Der genomische Klon ClACPgl wurde unter der Nummer DSM 8482 am 27.08.1993 bei der DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig hinterlegt. 3. Promotoren der Gene der Genfamilie ß-Ketoacyl- [ACP] - Svnthasel (KASI)
Mit Hilfe des in Tabelle 1 aufgeführten PCR-Produkts wurden aus einer genomischen DNA-Bank von Cuphea lanceolata neun genomische Klone isoliert und anschließend kartiert. Aufgrund der Restriktionskartierung konnten diese neun Klone in sechs verschiedene Typen eingeteilt werden. Eine Southern-Blot- Analyse zeigte, daß in Cuphea lanceolata die ß-Ketoacyl- [ACP] - Synthase durch eine aus wahrscheinlich vier Klassen bestehende Genfamilie kodiert wird.
Von den isolierten genomischen Klonen wurden die Klone ClKASIg2 (12,8 kb) , ClKASIgβ (14 leb), ClKASIg4 (12,3 kb) , ClKASIgl3 (12 kb) , ClKASIgl9 (19,5 kb) und ClKASIg20 (11,8 lb) kartiert. Die Restriktionskarten sind in Figur 3 gezeigt. Die schwarzen Balken kennzeichnen die mit der Sonde hybridisieren¬ den Fragmente, die weißen Balken die für den Promotorbereich sequenzierten Fragmente, die aus geeigneten Subklonen stammen.
Die Analyse der den Promotorbereich betreffenden DNA-Frag¬ mente der 6 genomischen Klone hat ergeben, daß die Klone ins¬ gesamt den Promotorbereich neben dem Strukturgen oder zumin¬ dest Teilen des Strukturgens aufweisen.
Eine etwa 2870 bp Teilsequenz aus dem genomischen Klon ClKASIg2 (SEQ ID NO:5a, 5b, 5c und 5d im Sequenzprotokoll) zeigt den Promotorbereich des KASI-Gens, der an Position 1142 (SEQ ID NO:5d im Sequenzprotokoll) endet, wonach das Startkodon "ATG" an Position 1143 folgt. Etwa 90 bp dieser Sequenz sind nicht sequenziert worden (3 Lücken) .
Eine 2450 bp Teilsequenz aus dem genomischen Klon ClKASIg4 (SEQ ID NO:6 im Sequenzprotokoll) umfaßt den Promotorbereich auf 1962 bp, vor dem mutmaßlichen "ATG" an Position 1963. Ein mutmaßliches Intron reicht von den Positionen 2053 bis 2242. Der Beginn des reifen Proteins ist an Position 2402.
Eine etwa 2894 bp Teilsequenz aus dem genomischen Klon ClKASIgδ (SEQ ID NO: 7a, b, c, d, e, f und g im Sequenz¬ protokoll) , die durch 6 nicht sequenzierte kleinere Lücken insgesamt ca. 150 bp unterbrochen ist, enthält den Promotorbereich bis zu Position 65 (SEQ ID NO: 7g im Sequenzprotokoll) . Das mutmaßliche ATG befindet sich an Position 66. Daran schließt sich ein unvollständiges Transitpeptid an.
In einer 1350 bp Teilsequenz aus dem genomischen Klon ClKASIgl3 (SEQ ID NO:8 im Sequenzprotokoll) sind Teile der Promotorregion enthalten. Sie umfaßt 472 bp bis zum Startkodon "ATG" (Position 473 bis 475) . Der Beginn des reifen Proteins ist bei Position 1075. Davor liegt das Transitpeptid, das von einem nicht genau zu definierenden Intron unterbrochen ist.
Ein 1141 bp Fragment aus dem genomischen Klon ClKASIgl9 (SEQ ID NO:9 im Sequenzprotokoll) enthält die Promotorregion in einem 520 bp Fragment. Das mutmaßliche ATG liegt an Position 521. Der Beginn des reifen Proteins ist an Position 956. Davor ist das Transitpeptid lokalisiert, das von einem nicht genau zu definierenden Intron unterbrochen ist.
In einer 3750 bp Teilsequenz aus dem genomischen Klon ClKASIg20 befindet sich der Promotorbereich als 3067 bp DNA- Fragment. Das mutmaßliche "ATG" ist an Position 3068. Das reife Protein beginnt an Position 3661. Davor liegt das Transitpeptid, das von einem nicht genau zu definierenden Intron unterbrochen ist.
Für das Gen aus ClKASIg4 wurden bisher sieben Exons identi¬ fiziert, die für das reife Protein kodieren. Sie wurden aufgrund der hohen Homologie zur ß-Ketoacyl- [ACP] -Synthasel der Gerste abgeleitet. Das reife Protein zeigte eine Homologie von 86,4% (bei einem Identitätsgrad von 77,4%) . Bedingt durch die geringe Homologie im Bereich des Transitpeptids können dessen Exon/Intron-Grenzen angenommen werden. Das Strukturgen erstreckt sich über eine Länge von etwa 2,3 kb ohne regula¬ torische Elemente. Im Vergleich zur Sequenz des genomischen Klons aus Gerste (S. Kauppinen, J.Biol.Chem. 267, Seiten 23999-24006 (1992)), ist die Verteilung der Exons und Introns sehr ähnlich. Das erste Exon der KASI wird im Unterschied zur Gerste wahrscheinlich durch ein weiteres Intron unterbrochen.
Die Sequenzierung des Klons ClKASIgδ zeigte, daß die Nukleotidsequenz des Strukturgens zu ClKASIg4 eine Identität von 98% aufweist. Auch das abgeleitete Protein zu ClKASIg4 hat eine Identität von 98%. Ebenfalls sehr ähnlich zu ClKASIg4 ist die Promotorregion von ClKASIg2. Die enge Verwandtschaft von ClKASIg2, ClKASIg4 und ClKASIgδ untereinander wird nicht nur auf Sequenzebene deutlich, sondern auch auf Ebene der Restrik¬ tionskarten. Es könnte sich bei diesen drei Genen um Allele handeln, die jeweils signifikante Sequenzunterschiede in der Promotorregion aufweisen.
Am 27.08.1993 wurde der genomische Klon ClKASg2 unter der Nummer DSM 8484, der genomische Klon ClKASgδ unter der Nummer DSM 8485, der genomische Klon ClKASgl3 unter der Nummer DSM 8486, der genomische Klon ClKASgl9 unter der Nummer DSM 8487 und der genomische Klon ClKASg20 unter der Nummer DSM 8488 bei der DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig hinterlegt. Hierbei handelt es sich um die eingangs mit jeweils zusätzlich mit "I" bezeichneten genomischen Klone.
4. Promotoren der Gene der Genfamilie ß-Ketoacyl- [ACP] Reduktase (KR)
Das in Tabelle 1 aufgeführte spezifische PCR-Produkt wurde zunächst zur Isolation von cDNAs aus Cuphea lanceolata eingesetzt. Unter anderem wurden zwei Typen von cDNAs, C1KR10 und C1KR27, die auch auf Aminosäureebene voneinander unter¬ schiedlich sind, identifiziert (B. Klein e_t al, Plant Lipids, Seiten 156-59 (1992)) . Die cDNAs hatten eine Größe von 1295 und 1276 bp (mit polyA-Rest) und kodieren je für ein offenes Leseraster von 326 bzw. 320 Aminsoäuren einschließlich der Transitpeptide von 69 und 63 Aminosäuren. Die von der DNA- Sequenz abgeleiteten Proteine haben ein Molekulargewicht von 27 kDa.
Die Expression der cDNA C1KR27 ab Nukleotid 210 als Fusion mit der Glutathion-S-Transferase in Vektor pGEX-KG ergab die Reinigung eines Fusionsproteins von 53 kDa. Dieses Fusions- protein wurde zu einer Enzymbestimmung für ß-Ketoacyl- [ACP] - Reduktase mit Acetoacetyl-CoA eingesetzt. Die Meßwerte zeigten, daß die cDNA C1KR27 für eine NADPH-abhängige KR kodiert, die spezifisch durch Phenylglyoxal gehemmt werden kann (Klein, supra) .
Eine Southern-Blot-Analyse ergab, daß in Cuphea lanceolata eine Genfamilie mit wahrscheinlich drei Klassen von ß-Keto¬ acyl- [ACP] -Reduktase-Genen existiert. Mit der cDNA C1KR27 als Sonde wurden aus einer Genbank von genomischer DNA aus Cuphea lanceolata acht genomische Klone isoliert, die in drei Klassen eingeteilt werden konnten. Jeweils ein Vertreter aus einer Klasse ist anhand der Restriktionskarten in Figur 4 gezeigt. Es handelt sich dabei um die Restriktionskarten der genomi¬ schen Klone ClKRg2 (13,4 kb) , ClKRgl2 (13,1 kb) und ClKRg3 (14 kb) . Die schwarzen Balken geben die mit der cDNA C1KR27 hybridisierenden Bereiche an. Die weißen Balken repräsentieren subklonierte Fragmente. Aus ClKRg2 wurde ein 4,0 kb Kpnl/Smal- Fragment, aus ClKRgl2 ein 8,5 kb Sall/Xbal-Fragment und aus ClKRg3 ein 6,7 kb Sall/Xbal-Fragment subkloniert und anschließend zu ihrer Identifizierung sequenziert.
Der Promotorbereich des Gens aus ClKRg2 ist auf einem 1570 bp DNA-Fragment (SEQ ID NO:11 im Sequenzprotokoll) lokalisiert. Er umfaßt mit nicht translatierem Bereich 1511 bp. Mit dem Startkodon "ATG" ab Position 1512 beginnt die protein¬ kodierende Sequenz des KR-Gens. Das TATA-Signal befindet sich an den Positionen 1412 bis 1429, der mutmaßliche Transkrip¬ tionsstart an Position 1445 (siehe oben) .
Der Promotorbereich des Gens aus ClKRg3 ist auf einem 926 bp DNA-Fragment (SEQ ID NO:12 im Sequenzprotokoll) lokalisiert. Er umfaßt mit 915 bp den Bereich vor dem Startkodon "ATG" an Position 916. Die Region der TATA-Box liegt an den Positionen 827 bis 838, der mutmaßliche Transkriptionsstart ist an Position 864 (siehe oben) .
Das vollständige Gen ist in ClKRgl2 enthalten. Es wurde doppeisträngig sequenziert und die Exon- und Intronbereiche bestimmt. Der Promotorbereich dieses Gens ist auf einem 1450 bp DNA-Fragment (SEQ ID NO:13 im Sequenzprotokoll) lokali¬ siert. Er befindet sich in einem Bereich von 1420 bp vor dem Startkodon "ATG" an Position 1421. Der Bereich der TATA-Box erstreckt sich von den Positionen 1327 bis 1343 und der mut¬ maßliche TranskriptionsStart liegt bei Position 1369 (siehe oben) .
Die Promotorregionen der drei KR-Gene zeigen TATA-Box-Motive, die der Konsensussequenz für Pflanzen nach Joshi (1987) , supra, TCACTATATATAG, entsprechen: ClKRg2 stimmt in lδ Positionen (Pos. 1412-1429), ClKRgl2 in 16 Positionen (Pos. 1327-1343) und ClKRg3 in 12 Positionen (Pos. 827-836) überein. Die Translationsinitiationssequenz weist ebenfalls hohe Homo- logie zu den bekannten Konsensussequenzmotiven auf (Kozak (1984), supra, Joshi (1987), supra, Lütcke et al (1987), sup¬ ra) . Untereinander zeigen die Promotoren der Gene ClKRgl2 und ClKRg3 mit Ausnahme einer ca. 500 bp großen Insertion im Pro¬ motor ClKRgl2 sehr hohe Übereinstimmung. Diese Insertion be¬ sitzt zahlreiche "inverted repeats" mit unbekannter Funktion.
5. Promotoren der Gene der Genfamilie Enoyl- [ACP] -Reduktase (ER)
Unter Verwendung des in Tabelle 1 aufgeführten PCR-Produkts als Sonde wurden acht cDNAs aus Cuphea lanceolata isoliert, die sich aufgrund größerer Unterschiede in zwei Klassen einteilen lassen. Eine cDNA, CLER18, hat eine Länge von 1533 bp und kodiert für ein Protein einer Länge von 391 Aminosäuren einschließlich 75 Aminosäuren für ein Transitpeptid. Das reife Protein hat ein errechnetes Molekulargewicht von 33,4 kDa und zeigt 83,3% identische Aminosäuren mit der ER von Brassica napus. Zur Bestimmung der Kosubstratspezifität wurde die cDNA C1ER7 ab Nukleotid 297 mit der Glutathion S-Transferase fusioniert, in E.Coli exprimiert und das geeignete Fusionsprotein einer Bestimmung der Enzymaktivität mit Crotonyl-CoA als Substrat sowie NADH bzw. NADPH als Kosubstrat unterzogen. Aufgrund der höherer Aktivität mit NADH als Kosubstrat konnte nachgewiesen werden, daß die cDNA C1ER7 (= Typ A) für eine NADH-abhängige Enoyl- [ACP] -Reduktase kodiert.
Mit dem PCR-Produkt als Sonde wurden fünf genomische ER-Klone aus einer λ-genomischen Bank von Cuphea lanceolata-DNA isoliert. In Figur 5 sind die Restriktionskarten der genomi¬ schen Klone ClERgδ (12,5 kb) , ClERg7 (14,4 kb) , ClERg9 (16,4 kb) , ClERglO (12 kb) und ClERg20 (11,8 kb) angegeben. Die schwarzen Balken zeigen den mit der Sonde hybridisierenden Bereich, die weißen Balken die für den Promotorbereich sequenzierten DNA-Abschnitte.
Durch Hybridisierung mit spezifischen Oligonukleotiden, die auf die cDNA C1ER8 zurückgehen, konnte das Gen ClERg9 dem Typ B zugeordnet werden. Die Sequenzierung des hybridisierenden Sall-Fragments des Gens aus ClERg5 ergab Unterschiede in der abgeleiteten Aminosäuresequenz zu den beiden identifizierten Klassen der Enoyl- [ACP] -Reduktasen und stellt somit die dritte Klasse von E -Genen dar, Typ C.
Die genomische Struktur des kodierenden Bereichs für das reife Protein aus ClERg5 wurde identifiziert. Das reife Protein weist 11 Exons auf. Eine 1800 bp Teilsequenz des Gens aus ClERg5 (SEQ ID NO:14 im Sequenzprotokoll) zeigt Teile des Promotors mit anderen regulatorischen Einheiten als 1763 bp DNA-Sequenz. In diesem Bereich befinden sich die CAAT-Box (1335 bis 1338) und die TATA-Box (1362 bis 1367) . Der Transkriptionsstart ist an Position 1415, basierend auf 5'RACE. Ein Intron im nicht kodierenden 5' -Bereich befindet sich an den Positionen 1560 bis 1741. Die Translation beginnt mit dem Startkodon "ATG" an Position 1764.
Fusionen der Promotorregion mit dem GUS-Gen zeigten deutliche Aktivität in den untersuchten Geweben (Blatt und Blüte) transgener Rapspflanzen.
Weitere Analysen von im 5 -Bereich der ER-Gene liegenden DNA- Sequenzbereichen der genomischen Klone ClERg7, ClERg9, ClERglO und ClERg20 haben gezeigt, daß diese Teilbereiche oder den gesamten Bereich der Promotorsequenzen und Sequenzen anderer regulatorischer Elemente aufweisen. Ein 890 bp DNA-Fragment aus ClERg7 (SEQ ID NO:15a und 15b im Sequenzprotokoll) enthält die CAAT-Box und TATA-Box an den Positionen 199 bis 202 bzw. 236 bis 241 (SEQ ID NO:15b im Sequenzprotokoll) . Der mut- maßliche Transkriptionsstart liegt an Position 279 (siehe oben) . Zwischen SEQ ID NO:15a und SEQ ID NO:15b befindet sich eine nicht sequenzierte Lücke von etwa 1200 bp. An Position 418 ist der Beginn eines Introns in 5' -nicht translatierten Bereich.
Fusionen der Promotorregion mit dem GUS-Gen zeigten deutliche Aktivität in den untersuchten Geweben (Blatt und Blüte) transgener Rapspflanzen.
Ein ca. 870 bp DNA-Fragment aus ClERg9 (SEQ ID NO:16a und 16b im Sequenzprotokoll) enthält als ca. 690 bp DNA-Abschnitt andere regulatorische Elemente im 5' -nicht translatierten Bereich. Der Transkriptionsstart wird an Position 1 nach 5'RACE angenommen. Ein unvollständiges Intron im nicht translatierten Bereich erstreckt sich bis zur Position 329 (SEQ ID NO:16b im Sequenzprotokoll) . Der translatierte Bereich beginnt mit dem Startkodon "ATG" an Position 367 (SEQ ID NO:16b im Sequenzprotokoll) . Ein nicht sequenzierter Bereich von ca. 160 bp befindet sich zwischen SEQ ID NO:16a und 16b.
Teile des Promotors und andere regulatorische Elemente befinden sich auf einem ca. 2800 bp DNA-Fragment aus ClERglO (SEQ ID NO:17a und 17b im Sequenzprotokoll) . Dieser Bereich umfaßt ca. 2709 bp und enthält ein Intron im 5' -nicht translatierten Bereich an den Positionen 251 bis 448 (SEQ ID NO:17b im Sequenzprotokoll) . Der Translationsstart beginnt mit dem Startkodon "ATG" an Position 472 (SEQ ID NO:17b im Sequenzprotokoll) . Ein nicht sequenzierter Bereich von ca 78 bp befindet sich zwischen SEQ ID NO: 17a und 17b.
Ein Teil des Promotors und andere regulatorische Elemente sind in einem ca 1060 bp DNA-Fragment aus ClERg20 (SEQ ID NO:18a und 18b im Sequenzprotokoll) enthalten. Dieser Bereich umfaßt ca. 912 bp und enthält neben der CAAT-Box (Positionen 159 bis 162) (SEQ ID NO:18a im Sequenzprotokoll) und der TATA-Box (Positionen 211 bis 215) (SEQ ID NO:18a im Sequenzprotokoll) -ein Intron an den Positionen 309 (SEQ ID NO:18a) bis 567 (SEQ ID NO:18b) . Die Translation beginnt mit "ATG" an Position 598 (SEQ ID NO:18b im Sequenzprotokoll) . Ein kurzer nicht sequenzierter Bereich von etwa 5 bp liegt zwischen SEQ ID NO:17a und 18b.
Am 27.08.1993 wurde der genomische Klon ClERg7 unter der Nummer DSM 8489, der genomische Klon ClERg9 unter der Nummer DSM 8490, der genomische Klon ClERglO unter der Nummer DSM 8491 und der genomische Klon ClERg20 unter der Nummer DSM 8492 bei der DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig hinterlegt.
6. Promotoren für Gene der Acyl- [ACP] -Thioesterase (TE)
Mit Hilfe des in Tabelle 1 aufgeführten PCR-Produkts wurden korrespondierende cDNAs aus reifenden Embryonen aus Cuphea lanceolata eingesetzt. Eine der erhaltenen cDNAs, C1TE13, hat eine Länge von 1404 bp und kodiert für ein Protein mit 414 Aminosäuren einschließlich eines Transitpeptids mit 111 Aminosäuren. Das Molekulargewicht des reifen Proteins beträgt 34 kDa. Neben der cDNA C1TE13 wurden weitere, jedoch unvoll¬ ständige cDNAs isoliert. Eine dieser cDNAs, C1TE5, welcher 34 Aminosäuren des Transitpeptids fehlen, ist in den Vergleich abgeleiteter Sequenzen reifer Proteine der bisher bekannten pflanzlichen TEs einbezogen worden. Auch die C1TE5 weist eine größere Ähnlichkeit zu mittelkettenspezifischen TEs auf als zu langkettenspezifischen TEs.
Beim Durchsuchen einer genomischen DNA-Bank von Cuphea lanceolata mit C1TE5 als Sonde konnten 23 genomische Klone isoliert werden. Die Restriktionskartierung ergab vier verschiedene Klassen von Genen.
Abbildung 6 zeigt Restriktionskarten der genomischen Klone CITEgl, ClTEg4, ClTEg7 und ClTEgl6. Die schwarzen Balken zeigen die mit der Sonde hybridisierenden Bereiche, die weißen Balken markieren die für den Promotorbereich sequenzierten DNA-Abschnitte.
Die präsentierten Klone enthalten das vollständige Gen der Acyl- [ACP] -Thioesterase. Eine 3350bp Teilsequenz des Gens mit der Promotorregion aus CITEgl6 (SEQ ID NO:22 im Sequenz- Protokoll) zeigt den Promotorbereich mit anderen regulatorischen Elementen als DNA-Sequenz mit 3290 bp. Die Bereiche der CAAT-Box und der TATA-Box befinden sich an den Positionen 2914 bis 2918 bzw. 3035 bis 3038. Der TranskriptionsStart ist wahrscheinlich an Position 3068 (siehe oben) . Exon- bzw. Intronbereiche befinden sich an den Positionen 3068 bis 3107 (Exon I), 310δ bis 3280 (Intron I) lind 3281 bis 3350 (Exon II, unvollständig) . Die Legumin-Box ist an Position 3120 bis 3132 zu erkennen. Die Translation beginnt an Position 3291 mit dem Startkodon "ATG".
Eine 1850 bp Teilsequenz des Gens aus CITEgl (SEQ ID NO:19 im Sequenzprotokoll) umfaßt den Promotor sowie andere 5'- regulatorische Einheiten des TE-Gens im nicht translatierten Bereich als DNA-Sequenz mit 1796 bp. Die CAAT-Box und die TATA-Box befinden sich im Promotorbereich an den Positionen 1428 bis 1432 bzw. 1553 bis 1556. Der kartierte Transkrip¬ tionsstart liegt an Position 1585. Danach folgen Exon- und Intronbereiche an den Positionen 1585 bis 1629 (Exon I) , 1630 bis 1786 (Intron I) und 1787 bis 1850 (Exon II, unvoll¬ ständig) . Die Leguminbox befindet sich an Position 1642 bis 1657. Der Translationsstart beginnt mit dem Startkodon "ATG" an Position 1797. Eine 2750 bp Teilsequenz des Gens aus ClTEg4 (SEQ ID NO:20 im Sequenzprotokoll) enthält den Promotor und andere 5' -regula¬ torische Einheiten im nicht translatierten Bereich des TE-Gens als DNA-Sequenz mit 2636 bp. Ein Exon (Exon I) endet an Position 2193 und ein Intron (Intron I) sowie ein weiteres Exon (Exon II, unvollständig) befinden sich an den Positionen 2194 bis 2626 bzw. 2627 bis 2750. Der Translationsstart beginnt mit dem Startkodon "ATG" an Position 2637.
Eine 850 bp Teilsequenz des Gens aus ClTEg7 (SEQ ID NO:21 im Sequenzprotokoll) zeigt den Promotor und andere 5' -regulato¬ rische Einheiten im nicht translatierten Bereich des TE-Gens als DNA-Sequenz mit 782 bp. Exon- wie auch Intronbereiche befinden sich an Position 143 bis 190 (Exon I, möglicherweise unvollständig) , 191 bis 772 (Intron I) und 773 bis 850 (Exon II, unvollständig) . Der Translationsstart beginnt mit dem Startkodon "ATG" an Position 783.
Im Gegensatz zu den 5'-nicht translatierten Bereichen von CITEgl und CITEgl6 fehlt die Leguminbox für samenspezifische Expression (Bäumlein et al. supra 1992) in den entsprechenden Regionen von ClTEg4 und ClTEg7. Aufgrund experimenteller Daten ist im Hinblick auf die Spezifität der Promotoren anzunehmen, daß die Promotoren der Gene aus den genomischen Klonen CITEgl und CLTEglδ samenspezifisch sind, während die Promotoren der Gene aus den genomischen Klonen ClTEg4 und ClTEg7 im Embryo wenig aktiv sind, um so mehr in den übrigen untersuchten Geweben mit einem Maximum in den Blüten und jeweils mindestens zwei unterschiedlich langen Transkriptsspezies.
Eine Northern-Blot-Analyse mit polyA+-RNA aus verschiedenen Geweben von Cuphea lanceolata zeigt sehr große Mengen spezifischer RNA in Embryonen mit einer spezifischen Sonde für das Gen aus CITEgl (siehe Figur 7, entsprechendes gilt für ClTEgl6, nicht gezeigt), während kein spezifisches Transkript in Wurzeln, Blättern und Blüten nachgewiesen wurde. Dagegen wurde im gleichen experimentellen Ansatz sehr große Mengen spezifischer RNA in Blüten und jeweils weniger RNA in Blättern, Wurzeln, Embryonen und Samen mit der dem Gen aus ClTEg7 entsprechenden cDNA C1TE13 als Sonde nachgewiesen (siehe Figur 8, entsprechendes gilt für ClTEg4, nicht gezeigt) .
Daher eignen sich die Promotoren insbesondere der Gene aus den erfindungsgemäßen Klonen CITEgl und CITEgl6 beispielsweise für eine gerichtete Expression chimärer Gene in embryospezifischem Pflanzengewebe und die Promotoren der Gene aus den erfindungs- gemäßen Klonen ClTEg4 und ClTEg7 beispielsweise für eine außerordentlich starke Expression chimärer Gene in Blüten.
Am 27.08.1993 wurde der genomische Klon ClTEg4 unter der Nummer DSM 8493 und der genomische Klon ClTEg7 unter der Nummer DSM 8494 bei der DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, D- 38124 Braunschweig hinterlegt. Die beiden anderen genomischen Klone CITEgl und ClTEgl6 wurden als Plasmide, in denen Teile dieser genomischen Klone vorhanden sind, unter den Nummern DSM 8477 (pNBM99-TEgl) und DSM 8478 (pNBM99-TEgl6) am 27.08.1993 bei der DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig hinterlegt.
Anhand dieser umfangreichen Analysen lassen sich klonierbare 5' -regulatorische DNA-Fragmente aus den genomischen Klonen herstellen, die in Kombination mit jedem gewünschten Gen deren Expression in beliebigen Pflanzen gezielt herbeiführen. Die folgende Tabelle 2 zeigt Beispiele für klonierbaren Fragmente aus den untersuchten genomischen Klonen mit den möglichen Fusionen. Tabelle 2
genomi- klonierbares Größe transla- transkrip¬ scher Klon 5' -regulatori¬ kb tionale tioneile sches Fragment Fusion Fusion
BnACCl Clal/BamHI 5,6 +
BnACC3 Sall/Smal 3,2 +
BnACCl0 Sall/Smal 3,3 +
ClACPgl Pstl/PvuII 1/2 +
ClKASg2 BamHI/NcoI 3,4 +
ClKASg4 Smal/Ncol 2,4 +
ClKASgδ BamHI/NcoI 3,6 +
ClKASgl3 Ncol/Ncol 3,4 +
ClKASgl9 Spel/Ncol 4,4 +
ClKASg20 Ncol/Ncol 3,3 +
ClKRg2 Sall/Ncol 1,5 +
ClKRg3 Pstl/Ncol 0,9 +
ClKRgl2 Pεtl/Ncol 1,4 +
ClERg5 Sall/BamHI 3,2 +
ClERg7 EcoRI/Sall 4,0 +
ClERg9 EcoRI/Hindlll 4,4 +
ClERglO Sall/BamHI 4,4 +
ClERg20 BamHI/HindiII 3,2 +
CITEgl EcoRI/BbvI 2,8 +
ClTEg4 BamHI/Bbvl 3,7 +
ClTEg7 Sall/Bbvl 0,8 +
CITEgl6 Sall/Bbvl 3,0 +
Es liegt im Bereich des Fachwissens des auf diesem Gebiet tätigen Fachmanns, die in Tabelle 2 gezeigten klonierbaren 5'- regulatorischen Elemente durch geeignete enzymatische Manipulationen zur Herstellung von transkriptionellen Promotor-Gen-Fusionen zu verwenden. Beispielsweise erlaubt ein Abschneiden der sticky ends der Ncol-Schnittstelle der Fragmente der KR-Klone, z. B. mit Sl-Nuklease, die Herstellung von transkriptioneilen Fusionen.
Die Klonierung von regulatorisch wichtigen Teilen der Promo- toren und anderen regulatorischen Elementen, beispielsweise der Introns im 5'-nicht translatierten Bereich, kann zu Konstruktionen chimärer Promotor/Expressionseinheiten genutzt werden.
Die erfindungsgemäßen Promotoren können mit jedem gewünschten Gen unter Bildung chimärer Gene in einem geeigneten Vehikel in Pflanzen unter Bildung transgener Pflanzen auf gentech¬ nologischem Weg übertragen werden. Die in Frage kommenden Gene können konstitutiv oder induziert exprimiert werden. Die induzierte Expression kann entwicklungsspezifisch, von außen induziert (biotisch/abiotisch) oder zelltypenspezifisch sein. Zu solchen Genen zählen insbesondere selektierbare Markergene für die Transformation von Pflanzen, Resistenzgene (Herbizidresistenz, Pathogenresistenz) , regulatorische Gene und Gene, die für die samenspezifische Expression von Genen des Fettsäurestoffwechsels, des Kohlehydratstoffwechseis, des Aminosäurestoff echsels, des Säkundierstoffwechseis, wie beispielsweise die Polyhydroxybutyrat-Synthese verantwortlich sind.
Geeignete Gentransfervehikel sind beispielsweise binäre Vektoren der pPCV 002-Serie (Konz und Schell, Mol.Gen.Genet. 204. Seiten 383-396 (1986)) und Vektoren der pRT-Serie für direkten DNA-Transfer (Töpfer et al, Methods in Enzymology ed. R. Wu, Academic Press Inc., New York 217, Seiten 66-78 (1993)), sowie virale Vektoren.
Mit den erfindungsgemäßen Promotoren kann somit die Expression fremder Gene in transgenen Pflanzen gesteuert werden. Das bedeutet, daß entweder die Genexpression entscheidend erhöht oder gehemmt werden kann (von endogenen Genen) oder auch eine gezielte Expression in bestimmten Geweben von Pflanzen hervorgerufen werden kann. Die Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung.
Zunächst seien die verwendeten Materialien und Methoden aufgeführt.
1. Chemikalien und Enzyme
Chemikalien und Feinchemikalien wurden, soweit nicht aus¬ drücklich spezifiziert, von Merck AG (Darmstadt) , Serva Feinbiochemika GmbH & Co KG (Heidelberg) und Sigma Chemie GmbH (Deisenhofen) in pro analysi oder höherer Qualität bezogen. Darüber hinaus lieferte Amersham Buchler GmbH & Co. KG (Braunschweig) Radiochemikalien, Difco Laboratories (Detroit, USA) Hefe-Extrakt und Bacto-Trypton sowie Biozym Diagnostik GmbH (Hameln) FMC Seakem-Agarose. Reεtriktionsendonukleasen und nukleinsäuremodifizierende bzw. synthetisierende Enzyme wurden von Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim) , GIBCO-BRL (Eggenstein) , New England Biolabs GmbH (Schwalbach) , Perkin Eimer Cetus (Norwalk, USA) , Pharmacia Biotech GmbH (Freiburg) und Stratagene GmbH (Heidelberg) bezogen.
2. Reiniσunqs-, Analyse- und Svnthesekits
Eine Reihe von Methoden zur Reinigung, Analyse oder Synthese werden durch vorgefertigte bzw. zusammengestellte Materialien mit spezifischen Anwendungsprotokollen, sogenannten "Kits", erleichtert und beschleunigt. Die folgende Aufstellung gibt eine Übersicht über die verwendeten Kits, die gemäß Protokollen der Hersteller eingesetzt wurden:
mRNA-Isolation Oligotex dT mRNA Kit (Diagen) cDNA-Synthese cDNA-ZAP®II Synthesis Kit
(Stratagene)
Plasmidreinigung Quiagen Plasmid Kit (Diagen) DNA-Fraαment Elution Geneclean II®Kit (Bio 101 Inc.,
USA, La Jolla) DNA-Sequenzierung τ7Sequencing Kit® (Pharmacia)
Herstellung von Deletions- ExoIII/Mung Deletion Kit klonen (Stratagene) radioaktive DNA-Markierung Multiprime DNA labeling System
(Amersha ) nichtradioaktive DIG-Luminescent Detection Kit DNA-Markierung (Boehringer)
3. Labormaterialien
Hybond N®-Membranfilter und Amersham Buchler GmbH & Co. KG (Braunschweig) wurden für Southern- und Northern-Blots sowie für das Screening von cDNA- und genomischen DNA-Banken eingesetzt. Des weiteren wurden X-Omat Röntgenfilme von Kodak (Rockland, USA) für Autoradiographien, Sephadex G 50-Säulen bzw. NAP 25-Säulen von Pharmacia Biotech GmbH (Freiburg) für die Reinigung von radioaktiv markierten Hybridisierungssonden bzw. zur Reinigung von synthetischen Oligonukleotiden, Dynabeads® 01igo(dT)25 von Dynal (Oslo, Norwegen) für die polyA*-Isolationen, Filme Typ 52 und Typ 55 für Polaroid- Planfilm-Kassetten Modell 545 von Polaroid (Cambridge, USA) , Quiagen-tip 100 von Diagen GmbH (Hilden) für DNA-Isolationen sowie 3MM-Papier von Whatman (Maidstone, USA) beim Screening von cDNA- und genomischen DNA-Banken eingesetzt.
4. Pflanzenmaterial
Die Untersuchungen erfolgten mit Pflanzenmaterial der Arten Brassica napus (Cruciferae) (Raps) und Cuphea lanceolata (Lythraceae) (lanzettblättriges Köcherblümchen oder Höckerblümchen) . Es wurde die Rapssorte AKELA (Winterraps, ++Qualität) , und an C. lanceolata-Material wurde neben dem Wildtyp die Mutante C. lanceolata K" (Hirsinger et al, Züchtungsforsch. j35_, Seiten 275-286 (1980)) eingesetzt. Plasmid- und Vektorsvsteme
Plasmide pBluescript®II SK(-) (Stratagene Nr. 212206) pUC18, pUC19 (C. Yanisch-Perron et. al, Gene 4J., Seiten 103-119 (1985)) pKlδ (R.D. Pridmore, Gene 56, Seiten 309-312 (1987)) pGEX-KG (K.L. Guan et al, Anal. Biochem. 192, Seiten 262-267 (1991))
Lambda- ZAP®II (Stratagene) Phagenvektor FIX®II (Stratagene)
Helferphagen R408, ExAssist ® (Stratagene)
binäre PGSC1706A (Van Rompaey, Vektoren unveröffentlicht) pREl, pRE9 (modifiziert in vor¬ liegender Erfindung aus pGSC1706A)
6. Bakterienstämme a) Escherichia coli für Klonierungen
XLl-Blue (Stratagene) endAl,hsdR17,supE44,thi-1, recAl,gyrA96,relAl,lac, [F'pro AB,laclqZΔM15,TnlO (tetr) ]
DH5α (Hanahan, J.Mol.Biol. supE44, ΔlacU/69, (801acZ
166, Seiten 557-580 M15) ,hsdR17,recAl,endAl,
(1983)) gyrA96,thi-1,relAl Sure® (Stratagene) el4 (mσrA) , Δ(mcrCB-hsdSMR- mrr)171,end AI,supE44,thi-1, gyrA96,relAl,lac,recB,recJ, sbcC,umuC:Tn5 (kanr) ,uvrC, [F'proAB,laclq ZΔM15, Tnl0(tetr)]
b) Escherichia coli für die Lambda-Phaσen-Vermehrung
K803 (H.G.Wood, Ann.Rev. rk",mk",gal",met" Biochem. 46, Seiten 385-413 (1977)) PLKF (Stratagene) recA,hsdR,hsdM+,rk",mk", mcrA,mcrB,gal,supE,lac, [F'proAB,laclq,lacZΔM15] XLl-Blue (s.o.)
Die molekularbiologischen Arbeiten wurden nach Standard¬ methoden, wie sie bei J. Sambrook et. al., A laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989) beschrieben werden, durchgeführt.
7. cDNA- und enomische DNA-Banken
Die Herstellung einer cDNA-Bank aus C. lanceolata (Wildtyp) erfolgte mit Hilfe des cDNA ZAP® Synthesekits gemäß Angaben des Herstellers. Ausgangsmaterial zur Synthese der cDNAs war mRNA aus isolierten, etwa zwei bis drei Wochen alten, unreifen Embryonen. Die gewonnene cDNA-Bank hat eine Größe von 9,6 x 105 rekombinanten Phagen mit einem Anteil von etwa 50% an Klonen, deren Insertionen 500 bp übersteigen.
In analoger Weise wurden die genomischen DNA-Banken mit dem Lambda-FIX®II Vektorsystem aus DNA von B. napus (Sorte AKELA) und C. lanceolata K~ angelegt. Die Größe der genomischen DNA- Bank von Raps beträgt 7,5 x 105 rekombinante Phagen (mit Insertionen von durchschnittlich 15 kb) und repräsentiert damit 3,6-mal das Rapsgenom (die Größe des Rapsgenoms beträgt 3,1 x 106 kb; C. Hallden et al, J.Mol.Evol. 25, Seiten 318-323 (1987)) . Die Größe der genomischen DNA-Bank aus C. lanceolata beträgt 3,5 x 105 rekombinate Phagen (mit Insertionen von etwa 15 kb durchschnittlich) und umfaßt damit etwa 17-mal das Genom dieser Pflanze, deren Genom eine Größe von 3 x 105 kb besitzt.
8. DNA Sequenzierung
Zur Bestimmung der Sequenz eines DNA-Fragments wurden durch Klonierung in pBluescript®, pK18 order pUClδ geeignete Subklone und von diesen ausgehend Deletionsklone mittels Exonnuklease III hergestellt (Stratagene) , die nach der Methode von F. Sanger et al, Proc.Natl.Acad.Sci. 74., Seiten 5463-5467 (1977) sequenziert wurden. Die DNA-Sequenzierung erfolgte teilweise radioaktiv mit Hilfe des τ7Sequencing Kits bzw. mit Hilfe eines "Pharmacia Automated Laser Fluorescent A.L.F.®" DNA-Sequenziergerätes. Die Sequenzen wurden mit Hilfe der Computer Software der University of Wisconsin Genetics Computer Group (J. Devereux et al, Nucl.Acids Res. .12., Seiten 367-395 (1984)) analysiert.
9. Bestimmung von Enzvmaktivitäten
Die ß-Glucuronidase-Aktivität wurde fluorimetrisch mit 4- Methylumbelliferylglucuronid oder histochemisch mit 5-Brom-4- chlor-3-indolyl-ß-D-Glucuronsäure (X-gluc, Clontech Laboratories, Palo Alto) bestimmt (R.A. Jefferson et al, EMBO J 6, Seiten 3901-3907 (1987)) .
Beispiel 1
Herstellung von spezifischen Hybridisierungssonden a) Ableitung von degenerierten Oligonukleotiden Polymerase Kettenreaktionen (PCR) wurden mit verschiedenen synthetischen Oligonukleotiden (kurz Primer genannt) durchgeführt. Sie wurden, wie im folgenden spezifiziert ist, aufgrund von Sequenzvergleichen abgeleitet und auf einem Applied Biosystems DNA-Synthesizer (Model 380B) synthetisiert, Eine Zusammenstellung der erfolgreich eingesetzten Primer- kombinationen ist in der nachfolgenden Tabelle 3 wiederge¬ geben.
Tabel l e 3
a) Acetyl-CoA Carboxylase
5' Primer Nummer 3455 3- Primer Nummer 3464
G Y P V l/M 1 K A H 0 K V/1 V/1 E E A
5' GGI TAT CCI GTI ATI ATA AAA GC 3" GTA GTT TTT TAI TAI CTT CTT CG C C G G C C C C C C
T
b) Acyl Carrier Protein
5' Primer Nummer 1488 3- Primer 1489
5' TCTAGACGTGAGTAACGACC ATG GCG 3- GTCTTACTTAATACTTAAGAGCTC
5" Primer Nummer 3098 3~ Primer Nummer 3240
Q A K P E T V A V M G L E E E F
5' CAA GCI AAA CCI GAA ACl GTI GC 3' CAC TAC CCA AAI CTT CTT CTT AA G G G G G C C C
c) ß-Ketoacyl-[ACP] Synthase I
5 ' Primer Nummer 2763 3* Primer Nummer 2762
K R V V 1 T G M G N Y S 1 S T A C A
5 AAA AGI GTI GTI ATA ACl GGI ATG GG 3' TTA ATA AGI TAA AGI TGI CGI ACA CG G C C G G TC G TC G T T
d) ß-Ketoacyl-[ACP] Reduktase
5' Primer Nummer 2189 3- Primer Nummer 2187
T A V D A W G N 1 N V N A / A
5- ACl GCI GTI GAC GCI TGG GG 3' TTA TAA TTA CAI TTA CGI TAA CG
T G G G G G
T T
e) Enoyl-[ACP] Reduktase
5' Primer Nummer 3389 3* Primer Nummer 3391
D D N A/G Y G W A M E t K K V Y P
5' GAC GAC AAC GCI TAC GGI TGG GC 3" C CTC TAA TTC TTC CAI ATA GG T T T G T T G T T G
T
f ) Acyl [ACP]-Thioesterase
5' Primer Nummer 3532 3' Primer Nummer 2740
W N D L D V N 0
5' TGG AAC GAC CTI GAC GTI AAC GA 3" T CGAAGGATCCAAGCTTGTCGACT T T T T T 18 Acetyl-CoA Carboxylase: Spezifische Primer für Acetyl-CoA Carboxylase wurden anhand eines Vergleiches verschiedener biotinhaltiger Proteine u.a. der ACCase aus Huhn und der ACCase (genauer der Biotincarboxylase) aus E.coli in der Publikation von Kondo et al, Proc. Natl.Acad.Sci. 8., Seiten 9730-9733 (1991) von konservierten Abschnitten der Sequenzen abgeleitet. Aufgrund des degenerierten genetischen Codes und der möglichen Variabilität in der Aminosäuresequenz an einzelnen Positionen wurden degenerierte Oligonukleotide hergesellt, d.h. an einzelnen Positionen im Oligonukleotid- primer wurden unterschiedliche Basen eingebaut z.B. C oder T bzw. A oder G im Primer 3464. Darüber hinaus wurde Inosin (I) eingefügt, das eine Wechselwirkung mit allen Nukleotiden eingehen kann und damit als unspezifische Base zu betrachten ist. Die Sequenz der synthetisierten Oligonukleotidprimer (3455 und 3464) basiert auf den Aminosäuren der Bereiche 304 bis 311 und 383 bis 390 bezogen auf die Aminosäuresequenz der ACCase der Ratte (Kondo et. al, supra) .
Acyl Carrier Protein: Degenerierte Oligonukleotide für den N- Terminus des Acyl Carrier Proteins aus C. lanceolata wurden von N-terminalen Aminosäuresequenzdaten abgeleitet, die freundlicherweise von F. Spener (Münster) vor einer Veröffentlichung (Kopka ^t al, Planta 191, Seiten 102-111 (1993)) zur Verfügung gestellt worden waren. Diese Aminosäure¬ sequenz zusammen mit dem konservierten VMGLEEEF Motiv aus Acyl Carrier-Proteinen (z.B. Souciet und Weil 1992, Kopka et al 1993) wurden zur Synthese der in Tabelle 2 genannten Primer (3098 und 3240) verwendet.
ß-Ketoacyl- [ACP] -Synthase I: Ein Vergleich des ß-Ketoacyl- [ACP] -Synthase I aus Gerste mit der aus E.coli zeigt nur wenige Bereiche mit größerere Homologie (Siggaard-Anderson et al, Proc.Ntl.Acad.Sci. .88., Seiten 4114-4118 (1991)) . Zur Synthese eines spezifischen Primerpaares (Tabelle 2) wurde ein N-terminal gelegener Sequenzabschnitt ausgewählt (Pos. 13 bis 21 für Primer 2763) und der Bereich um das den Hemmstoff Cerulenin bindende Cystein (Pos. 71 bis 79 für Primer 2762) (Siggaard-Anderson et aj-, supra) . Die Sequenz der KAS aus Gerste wurde freundlicherweise von P. von Wettstein-Knowles vor der Veröffentlichung zur Verfügung gestellt (Siggaard- Anderson e_t al, supra) .
ß-Ketoacyl- [ACP] -Reduktase: Ein Sequenzvergleich zweier typischer Fragmente der ß-Ketoacyl- [ACP] -Reduktase aus Avocado mit der Sequenz des nodG-Proteins aus Rhizobium meliloti in der Publikation von Sheldon et al, Biochem.J. 271, Seiten 713- 729 (1990) weist kurze Bereiche hoher Homolgie zwischen beiden Proteinen auf. Basierend auf den in dieser Veröffentlichung angegebenen fragmenthaften Sequenzen der ß-Ketoacyl- [ACP] - Reduktase aus Avocado und der Homologie zu nodG wurden die beiden Oligonukleotidprimer 2189 und 2187 synthetisiert (Tabelle 2) .
Enoyl- [ACP] -Reduktase: Zur Gewinnung eines spezifischen Primerpaares (Tabelle 2) wurden Aminosäuresequenzabschnitte der Enoyl- [ACP] -Reduktase aus Raps (Kater et al. Plant.Mol. Biol. 37, Seiten 895-909 (1991)) mit einem relativ wenig degenerierten genetischen Code ausgewählt. Die ausgewählten Sequenzen entsprechen den Aminosäurepositionen 101 bis 108 (Primer 3389) und 153 bis 160 (Primer 3391) . (Tabelle 2)
Acyl- [ACP] -Thioesterase: In der Publikation von Voelker et al, Science 257, Seiten 72-74 (1992) ist die erste Sequenz einer pflanzlichen Acyl- [ACP] -Thioesterase wiedergegeben. Da es sich zudem noch um die Sequenz eines mittelkettenspezifischen Enzyms handelt, wurden von einigen Bereichen der Sequenz, deren abgeleitete DNA-Sequenz möglichst wenig degeneriert ist. Oligonukleotidprimer abgeleitet und synthetisiert. Der Primer 3532 (Tabelle 2) , der den Aminosäuren 277 bis 264 der Acyl- [ACP] -Thioesterase von Umbellularia California entspricht, erwies sich in PCR-Reaktionen in Verbindung mit dem Primer Nummer 2740 (ein modifizierter oligo-dT Primer mit Schnitt¬ stellen für die Restriktionsendonukleasen BstBI, BamHI, Hindlll und Sall) als geeignet zur A plifikation einer spezifischen Hybridisierungssonde.
b) Polymerase Kettenreaktion (PCR)
Ausgehend von 1 μg polyA+-RNA wurde mit Reverser Transkriptase (Boehringer Mannheim GmbH) aus Avian Myeloblastosis Virus (AMV) für 30 Minuten bei 37°C eine cDNA Synthese durchgeführt. Dazu wurden jeweils die in Tabelle 3 gezeigten 3'- Oligonukleotidprimer zur Synthese einer spezifischen Hybridisierungssonde eingesetzt. Nach Inaktivierung der Reversen Transkriptase durch 5-minütiges Erhitzen bei 95°C wurde in demselben Reaktionsansatz die PCR-Reaktion mit 50 pMol Endkonzentration je Primer (siehe Tabelle 3) und vier Einheiten Ampli-Taq® Polymerase (Perkin Eimer Cetus) durchgeführt. Die Reaktionen erfolgten unter folgenden Bedingungen: a) Pufferbedingungen: 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 50 mM KC1; 1,5 mM MgCl2; 0,01% Gelatine und 5 mM dNTPs, b) Reaktionsdauer und -temperaturen: 3 Minuten bei 92°C zum erstmaligen Denaturieren, dann 25 bis 30 Temperaturzyklen mit: 2 Minuten bei 92°C zum Denaturieren, 2 Minuten bei der in Tabelle 4 angegebenen Temperatur zum Annealen der Oligonukleotide und 2,5 Minuten bei 72°C zur Amplifikation der DNA sowie abschließend 7 Minuten bei 72°C, um eine vollständige Synthese der letzten Syntheseprodukte zu erreichen. Tabelle 4
J Oligonukleotid spezifisch für 5' Primer Nr. 3' Primer Nr. Annealing bei
Acetyl-CoA Carboxylase (ACC) ' 3455 3464 51 °C
Acyl Carrier Protein, Raps (ACP) 1488 1489 48 °C
Acyl Carrier Protein, Cuphea (ACP) ι 3098 3240 48 °C ! ß-Ketoacyl [ACP] Synthase 1 (KAS 1) j 2763 2762 48 °C | ß-Ketoacyl [ACP] Reduktase (KR) 2189 2187 48 UC
Enoyl [ACP] Reduktase (ER) ' 3389 3391 49 °C
Thioesterase (TE) ' 3532 2740 50 UC
c) Klonierung der Amplifikationsprodukte
Überstehende einzelsträngige DNA der PCR-Produkte wurde mittels Klenow-Polymerase aufgefüllt und anschließend mittels Polynukleotidkinase phosphoryliert (Sambrook et al, supra) . Die Aufreinigung der PCR-Produkte erfolgte gemäß Standardprotokollen nach Sambrook et al, supra, durch Agarose- Gelelektrophorese, Gelelution, Extraktion mit Phenol/Chloroform und der abschließenden Fällung mit
Isopropanol. Die auf diese Weise gereinigte DNA wurde in Smal gespaltene pBluescript®-Vektor-DNA ligiert und sequenziert. Beispiel 2
Herstellung der Promotoren
Die in Beispiel 1 beschriebenen PCR-Produkte wurden eingesetzt für die Isolierung der genomischen Klone. Dies erfolgte ent¬ weder direkt durch Verwendung des PCR-Produkts als Sonde zum Durchsuchen einer Bank aus genomischer DNA oder über eine cDNA als Sonde, die durch Verwendung des PCR-Produkts als geeignete Sonde zum Durchsuchen von cDNA-Banken angewandt wurde. Die gefundenen genomischen Klone wurden in üblicher Weise sequenziert und im Hinblick auf die Promotorregionen charakterisiert.
Sollten in irgendeiner Weise molekularbiologische Arbeiten nicht hinreichend beschrieben worden sein, so wurden diese nach Standardmethoden, wie bei Sambrook et al, A Laboratory Manual, 2nd edn. (1989) beschrieben, durchgeführt.

Claims

Patentansprüche
1. Promotoren und ggf. oder andere regulatorische Elemente im 5' -nicht translatierten Bereich von Genen, die für Proteine der de novo Fettsäurebiosynthese kodieren, und die Allele sowie Derivate dieser Promotoren und anderen regulatorischen Elemente im 5' -nicht translatierten Bereich.
2. Promotoren und ggf. oder andere regulatorische Elemente im 5' -nicht translatierten Bereich nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Pflanzen isoliert sind.
3. Promotoren und ggf. oder andere regulatorische Elemente im 5'-nicht translatierten Bereich nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Brassica napus und/oder Cuphea lanceolata stammen.
4. Promotoren und ggf. oder andere regulatorische Elemente im 5'-nicht translatierten Bereich nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Gene zur Genfamilie der Acetyl-CoA-Carboxylase gehören.
5. Promotoren und ggf. oder andere regulatorische Elemente im 5'-nicht translatierten Bereich nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Gene zur Genfamilie des Acyl Carrier Proteins gehören.
6. Promotoren und ggf. oder andere regulatorische Elemente im 5' -nicht translatierten Bereich nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Gene zur Genfamilie der ß-Ketoacyl- [ACP] -Synthase I gehören.
7. Promotoren und ggf. oder andere regulatorische Elemente im 5'-nicht translatierten Bereich nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Gene zur Genfamilie der ß-Ketoacyl- [ACP] -Reduktase gehören. δ. Promotoren und ggf. oder andere regulatorische Elemente im 5' -nicht translatierten Bereich nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Gene zur Genfamilie der Enoyl- [ACP] -Reduktase gehören.
9. Promotoren und ggf. oder andere regulatorische Elemente im 5' -nicht translatierten Bereich nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Gene zur Genfamilie der Acyl- [ACP] -Thioesterase gehören.
10. Genomische Klone, die ein Gen enthalten, das für ein Protein der de novo Fettsäurebiosynthese kodiert, und die Allele sowie Derivate dieses Gens, wobei das Gen den Promotor, das Strukturgen oder zumindest Teile davon, sowie andere regulatorische Elemente umfaßt.
11. Genomische Klone nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Pflanzen isoliert sind.
12. Genomische Klone nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Brassica napus und/oder Cuphea lanceolata stammen.
13. Genomische Klone nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie den Promotor und ggf. oder andere regulatorische Elemente im 5' -nicht translatierten Bereich für die Expression einer Acetyl- CoA-Carboxylase enthalten.
14. Genomische Klone nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie den Promotor und ggf. oder andere regulatorische Elemente im 5' -nicht translatierten Bereich für die Expression eines Acyl Carrier Proteins enthalten. 15. Genomische Klone nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie den Promotor und ggf. oder andere regulatorische Elemente im 5' -nicht translatierten Bereich für die Expression einer ß-Keto¬ acyl- [ACP] -Synthase I enthalten.
16. Genomische Klone nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie den Promotor und ggf. oder andere regulatorische Elemente im 5' -nicht translatierten Bereich für die Expression einer ß-Keto¬ acyl- [ACP] -Reduktase enthalten.
17. Genomische Klone nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie den Promotor und ggf. oder andere regulatorische Elemente im 5'-nicht translatierten Bereich für die Expression einer Enoyl- [ACP] -Reduktase enthalten.
18. Genomische Klone nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie den Promotor und ggf. oder andere regulatorische Elemente im 5' -nicht translatierten Bereich für die Expression einer Acyl- [ACP] -Thioesterase enthalten.
19. Genomische Klone BnACCasegl (DSM 8480), BnACCaseglO (DSM 8481), ClACPgl (DSM 8482), ClKASg2 (DSM 8484), ClKASgβ (DSM 6485), ClKASgl3 (DSM 8466), ClKASgl9 (DSM 6487), ClKASg20 (DSM 8488) , ClERg7 (DSM 8489) , ClERg9 (DSM 8490), ClERglO (DSM 8491), ClERg20 (DSM 8492), ClTEg4 (DSM 8493), ClTEg7 (DSM 8494) .
20. Plasmide pNBM99-TEgl (DSM 8477) und pNBM99-TEgl6 (DSM 8478) . 21. Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen, Pflanzenteilen und Pflanzenprodukten, bei dem ein Promotor und ggf. oder andere regulatorische Elemente im 5' -nicht translatierten Bereich nach einem der Ansprüche 4 bis 9 oder ein aus den genomischen Klonen bzw. Plasmiden stammender Promotor und ggf. oder andere regulatorische Elemente im 5' -nicht translatierten Bereich nach einem der Ansprüche 13 bis 20 mit einem gewünschten zu exprimierenden Gen gekoppelt wird und dann in einem geeigneten Vehikel übertragen wird.
22. Pflanzen, Pflanzenteile und Pflanzenprodukte hergestellt nach einem Verfahren nach Anspruch 21.
23. Verwendung eines Promotors und ggf. oder anderer regulatorischer Elemente im 5'-nicht translatierten Bereich nach einem der Ansprüche 4 bis 9 oder eines aus den genomischen Klonen bzw. Plasmiden stammenden Promotors und ggf. oder andere regulatorische Elemente im 5'-nicht translatierten Bereich nach einem der Ansprüche 13 bis 20 zur Herstellung von Pflanzen mit veränderter Genexpression.
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