WO1995009183A1 - Peptide and antithrombotic agent - Google Patents

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WO1995009183A1
WO1995009183A1 PCT/JP1994/001583 JP9401583W WO9509183A1 WO 1995009183 A1 WO1995009183 A1 WO 1995009183A1 JP 9401583 W JP9401583 W JP 9401583W WO 9509183 A1 WO9509183 A1 WO 9509183A1
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binding
platelets
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Naoyuki Fukuchi
Koichi Ishii
Kenichi Kaida
Tsuyoshi Kobayashi
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Ajinomoto Co Inc
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Ajinomoto Co Inc
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • TECHNICAL FIELD The present invention relates to a peptide having an activity of inhibiting the binding of blood von Willebrand factor to platelets and an antithrombotic agent containing the same.
  • Vipera relates to peptides obtained from snake venom from furniture (Vipera palestinae).
  • Background Art It is widely known that platelets are deeply involved in the onset of so-called thrombosis, including myocardial infarction and cerebral thrombosis ("platelets”; Yamanaka, Yamazaki, Ed .; Medical Shoin, pl58-163 (1991) )).
  • Examples of the substance having an inhibitory effect on the aggregation include, for example, Acid (Aurin tricarboxylic acid) and the like (MD Phillips et al., Blood, 72, 1989-1903 (1988)).
  • Acid Aurin tricarboxylic acid
  • This substance has been reported to exhibit antithrombotic properties in animal studies, and it has been shown that an antithrombotic effect can be obtained by inhibiting the binding of von Willebrand factor to platelets (J. Strony et al., Circulation, 81, 1106-1114 (1990)).
  • von Willebrand factor or partial fragment peptides of glycoprotein Ib have been reported as substances that inhibit the binding of both proteins (Y. Fujimura et al., J. Biol. Chem., 261). , 381-385 (1986), K. Titani et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 5610-5614 (1987)).
  • WO9208472 International Publication Pamphlet, shows a peptide that inhibits the binding of von Willebrand factor derived from snake venom derived from Crotalus horridus horridus and cerastes cerastes to platelets. ing.
  • alboaggregin obtained from snake venom from Trimeresurus albolabris has been shown to have very strong platelet aggregation activity.
  • Recent studies have revealed that the structures of these peptides are highly homologous to the amino acid sequences of the aforementioned peptides derived from Crotalus holidus horidus (W09208472, International Pamphlet) (J. Hirabayashi et al.). al., J. Biol. Chem., 266, 2320-2326 (1991), E. Yoshida et al., Biochem. Biophys. Res.Commun., 191, 1386-1392 (1993), Y. Usami et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90,
  • the present invention has been made in view of the above, and in order to obtain a drug effective as an antithrombotic agent, it inhibits the binding of von Willebrand factor to platelets at a low concentration, It is an object of the present invention to provide a peptide that does not exhibit a collection-inducing effect.
  • DISCLOSURE OF THE INVENTION the present inventor has sought to solve the above-mentioned problems by using several compounds having an activity of strongly inhibiting platelet ristocetin aggregation and an activity of inhibiting the binding of von Willebrand factor to platelets. was selected from snake venom and the active ingredient was examined.
  • the activity was present in a very wide variety of peptides in terms of molecular weight.
  • the active peptide was purified and isolated from three snake venoms containing an active peptide with a molecular weight of about 25 kilodalton, and its activity on platelets was examined.
  • the obtained peptides in addition to showing strong ristocetin aggregation-inhibiting activity, there was also a type that had an activity of inducing platelet aggregation.
  • the present inventors have found that they do not induce platelet aggregation even at a concentration, and have reached the present invention.
  • the present invention is a peptide obtained from the snake venom of Vipera palestine, which is an peptide having an activity of inhibiting the binding between von Willebrand factor and platelets. Further, the present invention provides an antithrombotic agent containing the peptide and the compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • peptide of the present invention having an activity of inhibiting the binding of fumbirbrand factor to platelets (hereinafter referred to as “peptide of the present invention”) can be obtained from Vipera palestinian snake venom.
  • Vipera Vietnamese snake venom may be collected directly from Vipera Georgia or commercially available. From these, purification is performed by combining various column chromatography such as gel filtration, ion exchange, adsorption, and reverse phase, and affinity-column chromatography, ultrafiltration, electrophoresis, and countercurrent distribution. At least two peptides that inhibit binding of von Willebrand factor to platelets Can be obtained.
  • the peptides obtained as described above show a molecular weight of about 25 kilodaltons in a non-reduced state in SDS polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the peptide of the present invention is a dimer consisting of about 15 kilodaltons of different peptide chains ( ⁇ and; 9 chains).
  • the structure of the peptide of the present invention may be determined, for example, by subjecting the present peptide to reductive pyridylethylation, separating each peptide chain using a method such as reverse phase chromatography, and separating each peptide chain or protease such as lysylendopeptidase. ⁇ After decomposition by the chemical cleavage method, the separated partial peptides can be analyzed for the amino acid sequence using an instrument such as an amino acid analyzer or a conventional sequential method for amino acid sequence analysis.
  • one of the peptides of the present invention is a double-stranded peptide having the ⁇ -terminal amino acid sequence shown in SEQ ID NOS: 1 and 2 in the Sequence Listing.
  • the other one was found to be a novel peptide consisting of a double-stranded peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NOS: 5 and 6.
  • these VP-1 and VP-2 have an activity of inhibiting platelet ristocetin aggregation and an activity of inhibiting the binding of von Willebrand factor to platelets. This activity is stronger than previously known as not causing platelet aggregation at high concentrations.
  • amino acid sequences at the N-terminal of the ⁇ chain and / 3 chain of VP-1 are as shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, and for the ⁇ chain, at least from the ⁇ -terminal to 32 amino acid residues; At least up to 30 amino acid residues from the ⁇ -terminal completely match each peptide of VP-2.
  • amino acid sequences up to the 52nd from the N-terminal for the ⁇ chain and the 43rd amino acid sequence for the / 3 chain are shown in SEQ ID NOs: 3 and 4. Further, the entire amino acid sequence of the ⁇ chain and the amino acid sequence of most of the / 3 chain are shown in SEQ ID NOs: 5 and 6.
  • VP-1 and VP-2 are considered to have similar structures, but since they can be separated by ion exchange chromatography as shown in Examples, Not the same peptide.
  • the peptide of the present invention is not limited to those having the above sequences, and a peptide having an inhibitory activity on the binding of von Willebrand factor to platelets is produced in each individual of Vipera palestine. It is easily presumed that they exist, and they are within the scope of the present invention.
  • the peptide of the present invention does not cause platelet aggregation even at a high concentration cannot be predicted from the activity detected in unpurified snake venom. It is. Furthermore, the peptide of the present invention inhibits platelet ristocetin aggregation and binding of founvirbrand factor to platelets with higher specific activity than the previously reported peptides derived from snake venom.
  • the pharmaceutical composition of the present invention utilizes the action of the peptide of the present invention as described above, and contains the peptide of the present invention and / or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. It is an antithrombotic agent.
  • the peptide or a salt thereof may be used as one kind or a mixture of two or more kinds. Further, it may contain a substance having an antithrombotic action other than the peptide of the present invention. In this case, the peptide of the present invention may not be the main component in the pharmaceutical composition. Further, other materials used in the usual preparations, for example, proteins such as serum albumin, components for buffering action, salts for adjusting osmotic pressure, carriers, excipients and the like may be added.
  • Dosage forms include tablets, capsules, fine granules, syrups, suppositories, ointments, injections, eye drops and the like.
  • the administration method may be any of intravenous administration, subcutaneous administration, oral administration, eye drop, enteral administration and the like.
  • FIG. 1 shows ion exchange chromatograms of VP-1 and VP-2 using a TSKgel-CM-5PW column. is there. The shaded portions indicate VP-1 and VP-2, respectively.
  • FIG. 2 is an ion exchange chromatogram of VP-1 using TSKge DEAE-5PW.
  • FIG. 3 is an ion exchange chromatogram of VP-2 using TSKgel-DEAE-5PW.
  • FIG. 4 shows ion-exchange chromatograms of EC-1, EC-2, EC-3, and EC-4 using TSKge CM-5PW.
  • FIG. 5 is an ion-exchange chromatogram of TA-3 using TSKge CM-5PW.
  • FIG. 6 is an ion exchange chromatogram of TA-1 and TA-2 using TSKge CM-5PW.
  • FIG. 7 is a graph showing platelet aggregation-inducing activity of TA-1, TA_2, TA-3, EC-3, VP-1, and VP-2.
  • FIG. 8 shows the amino acid sequence of the VP-2 chain and the enzymatic digestion fragment.
  • FIG. 9 shows the amino acid sequence of the; 8 chain of VP-2 and an enzyme-digested fragment. Where underlined, there may be one to three additional amino acid residues.
  • FIG. 10 shows the inhibition of ristocetin aggregation by VP-1.
  • FIG. 11 is a diagram showing the inhibition of ristocetin aggregation by VP-2.
  • FIG. 12 is a graph showing the activity of VP-1 and VP-2 to inhibit the binding of von Willebrand factor to platelets.
  • the measurement sample was added to the suspension of formalin-fixed platelets thus prepared, and human plasma (final concentration 0.12%), ristocetin sulfate (Sigma) (final concentration 0.5 mg / ml) Were sequentially added, and after shaking and stirring, the presence or absence of inhibitory activity on platelet aggregation was visually observed.
  • the reaction solution is layered on a 20% sucrose solution, and the immobilized platelet fraction is collected by centrifugation at 12000 rpm for 5 minutes, and the radioactivity is measured by an anti-counter (ARC301B, manufactured by Aroca).
  • the combined von Willebrand factor amount was determined by Binding when an excess amount of unlabeled von Willebrand factor was added was defined as non-specific binding, and binding when no sample was added was defined as maximum binding.
  • the activity was measured using the same method as described in ⁇ 1>, and Table 1 shows the elution position (elution volume) and estimated molecular weight of the activity.
  • Vipera Vietnamese snake venom 50 mg, 20 mM Tris-HCl buffer After dissolving in a 0.15 M aqueous sodium chloride solution (2.8 ml) containing (pH 7.4), the insoluble matter was centrifuged off (000 rpm, 5 minutes), and gel using Sephadex G-75 (Pharmacia) was used. Filtration chromatography (2.6 cm in diameter, 90 cm in length) was performed at a flow rate of 0.5 ml / min using the same buffer as above.
  • the inhibitory activity shown in ⁇ 1> was measured.
  • the fraction containing the active substance (elution volume: 390-430 ml) was concentrated by ultrafiltration using YM10 (manufactured by Amicon), and then concentrated to 50 mM.
  • the solvent was replaced with ammonium hydroxide buffer (pH 4.5).
  • the obtained concentrated solution was subjected to ion exchange chromatography using TSK-gel CM-5PW (Tosoichi Co., Ltd., 7.5 min in diameter, 75 strokes) in two portions, and the activity peak was observed.
  • the peaks with the earlier elution time were designated as VP-1 and the latter with VP-2 (Fig. 1).
  • the elution conditions were as follows: A solvent: 50 mM ammonium acetate buffer (pH 4.5), B solvent: 0.5 M ammonium acetate buffer (pH 6.4), and the ratio of (A: B) was (60:40). A linear gradient elution was performed so that (30:70) was achieved in 20 minutes.
  • fractions collected from each sample were concentrated using Centricon-10 (manufactured by Amicon), and TSK-gel DEAE-5PW (manufactured by Tosoh I., diameter 7.5 mm, length 7 mm) Further purification was carried out by ion exchange chromatography using 5mni).
  • the elution conditions were as follows: A solvent: 50 mM ammonium acetate buffer (pH 9.0), B solvent: 0.5 M ammonium acetate buffer (PH6.4), and the ratio of (A: B) was (100: 0). Elution was performed with a concentration gradient (50:50) in 20 minutes (FIGS. 2 and 3).
  • EC-1 There are four types of activity peaks, and they are designated as EC-1, EC-2, EC-3, and EC-4 in order from the peak with the earliest elution time (Fig. 4).
  • the four active fractions were further concentrated using Centricon-10 (manufactured by Amicon), and the sodium chloride concentration gradient (1.5M-0M / 20%) containing 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) as an elution solvent was used. (20 min) using TSK-gel Phenyl-5PW (Tosoh Corporation, 4.6 min in diameter, 75 mni in length) to obtain a single active peptide. .
  • Echicetin Echicetin (.
  • a test for inhibiting the binding of von Willebrand factor to platelets was carried out in the same manner as in Example 1, and the two active fractions (elution volumes 300-350 ml and 390-440 ml) were used with Centriprep-10 (manufactured by Amicon), respectively. After concentration by ultrafiltration, the solvent was replaced with 50 mM ammonium acetate buffer (pH 4.5).
  • each active peptide may be a peptide consisting of two different peptide chains (TA-3 has four different chains) with a molecular weight of about 14 to 17 kilodaltons as shown in Table 2. all right.
  • Table 2
  • Figure 7 shows the peptide concentration and the maximum aggregation rate for 10 minutes.
  • TA-1 and TA-2 have very strong agglutinating activity at low concentrations
  • TA-3 and EC-1, EC-2, EC-3, EC-4 showed platelet aggregation-inducing activity at higher concentrations.
  • VP-1 and VP-2 did not show platelet aggregation-inducing activity even at high concentrations.
  • the active peptides VP-1 and VP-2 obtained from Vipera palestine by the method shown in Example 1 were found by isoelectric focusing to have pi values of 7.0 and 7.2, respectively. I got it. Further, the amino acid sequence of VP-2 was determined as follows.
  • VP-2100 ⁇ was dissolved in a 7M aqueous solution of guanidine hydrochloride 1001 containing 0.511 Tris-HCl buffer (pH 8.5) and 10 mM ninatrium ethylenediaminetetraacetate (EDTA * Na2), and then 4-vinylviridine (11 ) And tri-n-butylphosphine (2-1) were added and reacted at room temperature for reductive pyridylethylation.
  • the above reaction mixture was subjected to liquid chromatography using a column of TSKgel_Phenyl-5PW-RP (manufactured by Tosoichi Co., Ltd., diameter 4.6 mm, length 75 mm), and the two peptide chains constituting VP-2 were removed. separated.
  • the elution was performed with a flow rate of lral / min and a gradient elution from 31% to 52% of acetate nitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid (for 20 minutes).
  • the earlier elution time was named VP-2 ⁇ chain, and the later elution time was named VP-2) 9 chain. After lyophilization, these were dissolved in 30% acetonitrile, and the amino acid sequence from the amino terminal was analyzed using Protein Sequencer-470A (manufactured by Applied Biosystems).
  • the reduced pyridylethylated peptide obtained as described above was dissolved in 7M guanidine hydrochloride (251) containing 0.5M tris-hydrochloric acid (PH8.5) and lOn ethylenediaminetetraacetic acid disodium, and Lysyl endopeptidase (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in a reaction mixture containing 2M guanidine hydrochloride, 0.1M Tris-HCl buffer (pH 8.5), and 2 mM disodium ethylenediaminetetraacetate. ) Digestion reaction with 2 ⁇ g was performed at 37 for 2 hours.
  • the digested fragments obtained by the above digestion reaction were further subjected to high-performance liquid chromatography using a reversed-phase column (SSC-VP-318, manufactured by Sensyu Kagaku Co., Ltd., 4.6 dia in diameter, 250 MI in length) Separation, fractionation and analysis of each amino acid sequence were performed using Protein Sequencer-47 OA (Applied Biosystems).
  • SSC-VP-318 manufactured by Sensyu Kagaku Co., Ltd., 4.6 dia in diameter, 250 MI in length
  • FIG. 8 shows the enzyme digested fragment of the VP-2 chain and its amino acid sequence
  • FIG. 9 shows the enzyme digested fragment of VP-2; 9 chain and its amino acid sequence.
  • K indicates a part of the fragment by lysyl endopeptidase digestion
  • E indicates a part of the fragment by proteinase Glu-C digestion.
  • SEQ ID NO: 3 shows the sequence of the portion of the amino acid sequence of the VP-2 ⁇ chain which is considered to have higher certainty (52 amino acid residues from the ⁇ -terminal).
  • the VP-2 chain may have one to three unknown amino acids between the lysine at position 60 and the tyrosine at position 61 in SEQ ID NO: 6. There may be 1-3 unknown amino acids between the 0th lysine and the 101th threonine.
  • SEQ ID NO: 4 shows the sequence of the amino acid sequence of the VP-2 / 9 chain that is considered to have higher certainty (43 amino acid residues from the N-terminal).
  • VP-1 was similarly subjected to reductive pyridylethylation, and the amino acid sequence at the amino terminus was analyzed. The results are shown in SEQ ID NOS: 1 and 2. From the above results, it is clear that VP-1 has the same amino acid sequence as VP-2 at least at the N-terminal part.
  • the peptide derived from each chain of VP-1 obtained by pyridyl ethenolation was digested with lysylendopeptidase, and the resulting digested fragment and VP-2 derived The elution positions of the digested fragments were compared with those of the digested fragments in reversed-phase high-performance liquid chromatography. As a result, a difference was observed in one fragment derived from the ⁇ chain.As a result of amino acid sequence analysis, in VP-1, 110th glycine of VP-2 was found to be glutamic acid, and 122th lysine was found to be asparagine. It turned out that it was replacing.
  • VP-1 and VP-2 obtained from Vipera palestine platelet rich plasma was obtained using Hematracer-801 (manufactured by Nikko Bioscience) in the same manner as described in ⁇ 1>.
  • the inhibitory activity against various aggregations was measured.
  • Aggregogens include ristocetin (final concentration 1.2 fflg / ml), botrocetin (l // g / ml), ADP (3 uM), collagen (10 tg / inl), and each peptide in platelet-rich plasma.
  • the agglutinogen was added to the mixture after stirring at 37 for 3 minutes, and the agglutination inhibition rate was measured for the control group without the addition of the sample.
  • VP-1 and VP-2 both inhibited ristocetin aggregation by more than 90% at 2.5 / g / ml, and the peptides CHH- B (about 30% inhibition at 3 // g / nil) was found to have stronger inhibitory activity. Both peptides also showed inhibitory activity against botrocetin aggregation at almost the same concentration.
  • both VP-1 and VP-2 showed no harm to ADP and collagen aggregation even at a concentration of 20 ⁇ g / ml, and von Willebrand factor and glycoprotein I such as ristocetin and botrocetin aggregation. It was shown to specifically inhibit aggregation dependent on the binding of b (Glycoprote in lb). Furthermore, to clarify the inhibitory effect on the binding of the two proteins, use the method described in Example 1 Te, measuring the binding inhibition of 1 2 5 1 labeled with von Willebrand factor blood into platelet did. As a result, as shown in FIG. 12, both VP-1 and VP-2 inhibited the binding of von Willebrand factor to platelets in a concentration-dependent manner.
  • the 503 ⁇ 4 binding inhibition concentration (ICso) is 0.008-0.016 ⁇ for all peptides, which is lower than CHH-B (ICso: 0.1-0.2) described in WO9208472 Internationally Published Pamphlet It may be a peptide that inhibits the binding of fonvir brand factor to glycoprotein Ib at concentrations Indicated.
  • the peptides obtained according to the present invention inhibit the binding of von Willebrand factor, which is deeply involved in the development of thrombosis, to platelets. This activity is expressed at lower concentrations than previously known substances. In addition, since this peptide does not induce platelet aggregation even at a high concentration, it is useful as an antithrombotic agent.
  • Lys Tyr His Ala Trp lie Gly Leu Arg Asp Gin Ser Glu Arg Gin Gin 65 70 75 80
  • Trp lie Gly Leu Ser Asn Phe Trp Arg Asp Cys His Trp Gly Trp Ser

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Description

明細書 ぺプチド及び抗血栓剤 技術分野 本発明は、 血中のフォンビルブランド因子 （von Willebrand factor) と血小板 との結合を阻害する活性を有するペプチド及びそれを含有する抗血栓剤に関し、 詳しくは、 ビペラ 'パレスチナ （Vipera palestinae) 由来の蛇毒中から得たぺプ チドに関する。 背景技術 心筋梗塞、 脳血栓を始めとするいわゆる血栓症の発症には、 血小板が深く関与 していることが広く知られている （ 「血小板」 ；山中、 山崎編；医学書院、 pl58 -163(1991)) 。 近年、 このような血栓症に至る初期反応と考えられる血小板の血 管内皮下組織への粘着に、 血中タンパク質の 1つであるフォンビルブランド因子 (von Willebrand factor) と血小板表面上の糖タンパク質 I b (glycoprotein lb) との結合が重要であることが示されている （J. P. Cean et al.， J. Lab. Cli n. Med. , 87, 586-596 (1976)) 。
これらの 2種のタンパク質の結合は、 通常の状態では起こらず、 生体内で高い ずり応力のかかった状態にのみ起こることが知られている （T. T. Vincent et al. , Blood, 65, 823-831 (1985)) 。 さらにこの結合を生体外で観察する方法として、 抗生物質であるリストセチン （ristocetin) (M. A. Howard, B. G. Firkin, Thromb. Haemostasis, 26, 362-369 (1971)) 、 蛇毒由来のタンパク質であるボトロセチ ン （botrocetin) (M. S. Read et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 75, 45 14-4518 (1978)) 等の物質を用いた方法が広く用いられている。 これらの物質を 血小板浮遊液に添加することにより血小板の凝集が起こるが、 この凝集はフォン ビルブランド因子と糖タンパク質 I bの結合に依存するものである （前記 M. A. Ho ward, B. G. Firkin、 M. S. Read et al) 。
前記の凝集に対する阻害作用を示す物質としては、 例えばォ一リントリカルボ ン酸 (Aurin tricarboxylic acid) 等がある (M. D. Phillips et al.， Blood, 72, 1989-1903 (1988)) 。 本物質は、 動物実験において抗血栓性を示すことが報告さ れており、 フォンビルブランド因子の血小板への結合を阻害することにより、 抗 血栓作用が得られることが示されている （J. Strony et al.， Circulation, 81, 1106-1114 (1990)) 。 また、 両タンパク質の結合を阻害する物質としてはフォン ビルブランド因子あるいは糖タンパク質 I bの部分フラグメントぺプチド等が報 告されている (Y. Fuj imura et al. , J. Biol. Chem.， 261, 381-385 (1986)、 K. Titani et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 84， 5610-5614 (1987)) 。
さらに、 蛇毒中より単離されたぺプチドに同様の活性を持つものがあることは、 WO9208472号国際公開パンフレツ ト、 Pengら (M. Peng et al. , Blood, 81, 2321- 2328 (1993)) により示されている。
WO9208472号国際公開パンフレツトでは、 クロ夕ルス ·ホリダス ·ホリダス （C rotalus horridus horridusリ 、 セラステス ·セラステス (Cerastes cerastes) 由来の蛇毒より得られるフォンビルブランド因子の血小板への結合を阻害するべ プチドを示している。
しかし動物実験におけるデータは示されておらず、 ぺプチド性物質の血中半減 期の短さを考えれば、 インビト口においてさらに活性の高いものが、 動物実験に おいての有効性が高いと考えられる。 さらに WO9208472号国際公開パンフレツ卜に よれば、 前記 2種の蛇毒より得たペプチドの他、 ビペラ 'ルセリ 'ルセリ （Vipe ra russeli russeli) 、 シユー セラステス，ノヽーシカス (Pseudocerastes per sicus) からも同様の活性を指標として活性ペプチドを得ているが、 比活性につい ては明らかでない。 さらに同パンフレツ卜ではこの他数種の蛇毒中に、 血小板凝 集を阻害する活性があることを示しているが、 蛇毒中の血小板凝集阻害活性はす でに多くの報文に示されており (C- . Teng, T-F. Hung, Platelet, 2， 77-87 (19 91)、 B. H. Chao et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 86, 8050-8054 (1989)) 、 さらにこれら毒素の示す血小板凝集阻害が、 フォンビルブランド因子の血小板 への結合阻害を介したものかどうかの根拠が示されていな 、。
Pengら (M. Peng et al. , Blood, 81, 2321-2328 (1993)) により報告されてい るエキス .力リナタス （Echis carinatus) 由来のぺプチドについては、 本明細書 の実施例 2に示した通り、 低濃度ではフォンビルブランド因子の血小板への結合 阻害を介した血小板凝集阻害が起こるが、 高濃度では血小板凝集惹起作用が観察 された。 Pengらのデータに示されている、 動物実験での血小板減少は、 この高濃 度での血小板凝集惹起作用が引金となり、 血栓が生じることがその一因であるこ とが推定される。
前記のように報告された蛇毒由来の、 フォンビルブランド因子の血小板への結 合阻害活性を示すぺプチドの他、 以前より同様の分子量を示し血小板への作用を 有するペプチドがいくつか報告されている。 ラットルスネークレクチン （rattle sanke lectin) は、 血小板、 赤血球の凝集を引き起こすことが示されており （丄 Hirabayashi et al. , J. Biol. Chem. , 266, 2320-2326 (1991)) 、 またボトロセ チンは血小板には結合せずフォンビルブランド因子に結合することが示されてい る （Y. Fuj imura et al. , Biochemistry, 30, 1957-1964 (1991)) 。 また、 トリメ レスラス ·アルボラブリス （Trimeresurus albolabris) 由来の蛇毒より得られた アルボアダレギン （alboaggregin) は、 非常に強い血小板凝集活性を持つことが 示されている OL Peng et al. , Biochemistry, 30， 11529-11537 (1991)) 。 最近 の研究により、 これらのぺプチドの構造は前述のクロタルス ·ホリダス ·ホリダ ス由来のペプチド （W09208472号国際公開パンフレツト） と、 アミノ酸配列に高い 相同性があることが明らかである （J. Hirabayashi et al. , J. Biol. Chem. , 26 6, 2320-2326 (1991)、 E. Yoshida et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. , 1 91, 1386-1392 (1993)、 Y. Usami et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 90，
928-932 (1993)) 。
以上の知見から、 これらのぺプチドとァミノ酸配列の相同性の高いぺプチドが 蛇毒中に広く存在していることが推定されるが、 その作用は多種多様である。 そ の中で特にフォンビルブランド因子の血小板への結合をより低濃度で阻害し、 高 濃度において血小板凝集惹起作用を示さないものを発見することが大きな課題で あり、 生体内で著効を示す、 血小板の内皮下組織への粘着阻害を特徴とする抗血 栓薬を提供するためには不可欠である。
本発明は上記観点からなされたものであり、 抗血栓薬として有効な薬剤を得る ために、 フォンビルブランド因子の血小板への結合を低濃度で阻害し、 血小板凝 集惹起作用を示さないぺプチドを提供することを課題とする。 発明の開示 本発明者は、 上記課題を解決するために、 血小板のリストセチン凝集を強く阻 害する活性、 およびフォンビルブランド因子 （von Willebrand factor) の血小板 への結合を阻害する活性のあるもの数点を、 蛇毒から選びだし、 活性成分につい ての検討を行なったところ、 分子量的に非常に多様なぺプチドに活性が存在する ことが示された。 このうち分子量約 25キロダルトンの活性べプチドを含む 3点の 蛇毒から活性ペプチドの精製、 単離を行い、 血小板に対する活性を検討した。 得 られたペプチドの中には、 強いリストセチン凝集阻害活性を示す他に、 血小板凝 集を惹起する活性を併せ持つタイプのものも存在したが、 ビペラ，パレスチナ (Vipera palestinae) 由来のぺプチドは、 高濃度においても血小板凝集惹起を示 さないことを見いだし、 本発明に至った。
すなわち本発明は、 ビペラ ·パレスチナの蛇毒より得られるペプチドであって、 フオンビルブランド因子と血小板との結合を阻害する活性を有するぺプチドであ る。 さらに本発明は、 このペプチド及びノ又はその薬学的に許容される塩を有効 成分として含有する抗血栓剤を提供する。
以下に、 本発明を詳細に説明する。
< 1 〉フォンビルブランド因子と血小板との結合を阻害する活性を有するぺプチ K
本発明のフオンビルブランド因子と血小板との結合を阻害する活性を有するぺ プチド （以下、 「本発明のペプチド」 という） は、 ビペラ ·パレスチナの蛇毒よ り得られる。
ビペラ 'パレスチナの蛇毒は、 ビペラ 'パレスチナから直接採取してもよく、 市販のものを用いてもよい。 これらから、 ゲル濾過、 イオン交換、 吸着、 逆相等 の各種カラムクロマトグラフィーや、 ァフィ二ティ一カラムクロマトグラフィー、 限外濾過、 電気泳動、 向流分配等の方法を組み合わせて精製することにより、 フ ォンビルブランド因子の血小板への結合を阻害する少なくとも 2種類のぺプチド を得ることが出来る。
上記のようにして得られるペプチドは、 いずれも SDSポリアクリルアミ ドゲル電 気泳動において、 非還元状態では約 25キロダルトンの分子量を示す。 一方、 還元 状態、 例えば 1%メルカプトエタノール存在下で加熱したものでは、 SDSポリアクリ ルァミ ドゲル電気泳動において、 約 15キロダルトンの分子量の位置に、 異なる 2 本のペプチドのバンドが観察される。 このことから、 本発明のペプチドは、 約 15 キロダルトンの異なるペプチド鎖 （α鎖および; 9鎖） よりなる二量体である。 本発明のペプチドの構造は、 例えば本ペプチドを還元ピリジルェチル化し、 逆 相クロマトグラフィ一等の方法を用いてそれぞれのぺプチド鎖を分離し、 それぞ れのぺプチド鎖、 あるいはリジルェンドぺプチダーゼ等のプロテアーゼゃ化学的 な切断法により分解後、 分離した部分べプチドを、 ァミノ酸分析装置等の機器、 あるいは常法のァミノ酸配列逐次分析法を用いてァミノ酸配列の分析が出来る。 後記実施例に示したように、 上記のようにして、 本発明のペプチドのうちの 1 つ （VP-1) は、 配列表配列番号 1、 2に示した Ν末端アミノ酸配列を有する 2本 鎖ペプチドからなり、 他の 1つ （VP- 2) は、 配列番号 5、 6に示したアミノ酸配 列を有する 2本鎖べプチドからなる新規べプチドであることがわかった。
さらに、 これら VP- 1および VP-2は、 血小板のリストセチン凝集阻害活性、 およ び、 フォンビルブランド因子の血小板への結合に対する阻害活性を有する。 この 活性は、 高濃度でも血小板凝集を引き起こさないものとしては、 これまで知られ ているもの以上に強い。
VP- 1の α鎖と /3鎖の N—末端のアミノ酸配列は、 配列番号 1、 2に示したとお りであり、 α鎖については少なくとも Ν末端から 32アミノ酸残基まで、 ；3鎖につ いては少なくとも Ν末端から 30アミノ酸残基までは、 VP- 2の各々のペプチドと完 全に一致する。 尚、 VP-2に関しては、 α鎖については N—末端から 5 2番目まで のアミノ酸配列、 /3鎖については 4 3番目までのアミノ酸配列を、 配列番号 3、 4に示した。 さらに、 α鎖の全アミノ酸配列及び /3鎖の大部分のアミノ酸配列を 配列番号 5、 6に示した。
このように、 VP- 1及び VP-2は類似の構造を有していると考えられるが、 実施例 に示したようにィォン交換ク口マトグラフィ一で分離することができることから、 同一のペプチドではない。 いずれにしても、 本発明のペプチドは上記の配列を有 するものに限定されるものではなく、 フォンビルブランド因子の血小板への結合 に対する阻害活性を有するペプチドが、 ビペラ ·パレスチナの各々の個体に存在 することが容易に推定され、 それらは本発明の範囲に含まれるものである。
以上の知見は、 本発明により初めて明らかになつたものであり、 本発明のぺプ チドが高濃度でも血小板凝集を引き起こさないことは、 未精製の蛇毒中に検出さ れる活性からは予測できないものである。 さらに、 本発明のペプチドは、 これま で報告されている蛇毒由来べプチド以上に、 高い比活性で血小板のリストセチン 凝集、 およびフオンビルブランド因子の血小板への結合を阻害する。
< 2〉本発明の医薬組成物
本発明の医薬組成物は、 上述したような本発明のぺプチドの有する作用を利用 したものであり、 本発明のぺプチド及び/ /又はその薬学的に許容される塩を有効 成分として含有する抗血栓剤である。
ペプチド又はその塩は、 1種又は 2種以上の混合物として使用してもよい。 ま た、 本発明のペプチド以外の抗血栓作用を有する物質を含有していてもよい。 こ の場合、 本発明のペプチドがその医薬組成物中の主成分でなくてもよい。 さらに、 通常製剤に用いるその他の材料、 例えば血清アルブミン等のタンパク質、 緩衝作 用、 浸透圧調整のための塩、 担体、 賦型剤などの成分を配合してもよい。
剤型としては、 錠剤、 カプセル剤、 細粒剤、 シロップ剤、 座薬、 軟膏剤、 注射 剤、 点眼剤等を挙げることができる。 投与方法は、 静脈内投与、 皮下投与、 経口 投与の他、 点眼、 経腸等のいずれであってもよい。
動物あるいはヒトに投与する場合の投与量は、 本発明のぺプチド及びノ又はそ の薬学上許容される塩の量として、通常 0 . 1 / £ノ1^ £〜1 0 0 111 £ノ¾： 2の 範囲で所期の効果が期待でき、 この範囲のうち、 もっとも優れた薬効が得られる 量を選択できる。 図面の簡単な説明 図 1は、 TSKgel- CM- 5PWカラムを用いた VP- 1、 VP-2のイオン交換クロマトグラムで ある。 斜線で示した部分は、 それぞれ VP- 1、 VP- 2を示す。
図 2は、 TSKge DEAE-5PWを用いた VP- 1のイオン交換クロマトグラムである。
図 3は、 TSKgel- DEAE- 5PWを用いた VP- 2のイオン交換クロマトグラムである。
図 4は、 TSKge CM- 5PWを用いた EC-1、 EC- 2、 EC- 3、 EC- 4のイオン交換クロマトグ ラムである。
図 5は、 TSKge CM- 5PWを用いた TA-3のイオン交換クロマトグラムである。
図 6は、 TSKge卜 CM-5PWを用いた TA- 1、 TA-2のイオン交換クロマトグラムである。 図 7は、 TA- 1、 TA_2、 TA- 3、 EC- 3、 VP- 1、 VP- 2それぞれの血小板凝集惹起活性を 示す図である。
図 8は、 VP- 2の 鎖のァミノ酸配列及び酵素消化断片を表わす。
図 9は、 VP- 2の ;8鎖のアミノ酸配列及び酵素消化断片を表わす。 下線を付した箇 所は、 さらなる 1〜3個のァミノ酸残基が存在する可能性がある。
図 1 0は、 VP- 1によるリストセチン凝集阻害を示す図である。
図 1 1は、 VP- 2によるリストセチン凝集阻害を示す図である。
図 1 2は、 VP- 1、 VP- 2によるフォンビルブランド因子の血小板に対する結合阻害 活性を示す図である。 発明を実施するための最良の形態 以下に、 本発明の実施例を説明する。 実施例 1
< 1 >蛇毒中からのフォンビルブランド因子の血小板への結合阻害活性の検出 フォンビルブランド因子の血小板への結合阻害を測定するために、 下記 （1 ) に示したリストセチン凝集法阻害試験、 および下記 （2 ) に示した放射性同位体 ( 1 2 51) 標識したフォンビルブランド因子を用いた血小板への結合阻害試験を行 なつた。
( 1 )健常人より採血した新鮮血液に 1/10容の 3. 8%クェン酸ナトリゥムを添加し、 これを 900rpmで 15分間遠心して得たヒト多血小板血漿 (platelet rich plasma： PRP) に、 2 %パラホルムアルデヒドを溶解した 20mMリン酸緩衝液 （pH7. 4) を含 む 0. 15M塩化ナトリウム水溶液を同容加え、 4 で一晚静置保存し、 固定化血小板 を得た。 保存後、 遠心分離により血小板を回収し、 20mMリン酸緩衝液 （pH7. 4) を 含む 0. 15M塩化ナトリゥム水溶液で 2回洗浄した。 洗浄後、 同溶液に固定化血小板 を懸濁し、 保存した。
このように調製したホルマリン固定化血小板懸濁液に測定サンプルを加え、 こ れにヒト血漿 （終濃度 0. 12%) 、 リストセチン硫酸塩 （シグマ社製） （終濃度 0. 5 mg/ml) を順次加え、 振盪撹拌後血小板の凝集に対する阻害活性の有無を肉眼で観 察した。
( 2 ) 1 2 Ί標識化フォンビルブランド因子の固定化血小板への結合阻害試験を、 Chopekらの方法 (M. W. Chopek et al. , Biochemistry, 25, 3146-3155 (1986)) を 踏襲して行なった。 すなわち、 上記 （1 ) の方法により調製した固定化血小板懸 濁液に、 測定サンプル、 リストセチン硫酸塩 （シグマ社製） および1 2 51標識化フ オンビルブランド因子を加え、 室温にて 30分間反応させた。
その後、 反応液を 20%蔗糖溶液に重層した後、 12000rpm、 5分間の遠心分離によ り固定化血小板画分を捕集し、 ァカウンター （ARC301B、 ァロカ社製） により放射 能を測定することにより、 結合したフォンビルブランド因子量を求めた。 過剰量 の非標識フォンビルブランド因子添加時の結合を非特異的結合とし、 サンプル無 添加時の結合を最大結合とした。
上記の方法により、 市販の蛇毒凍結乾燥品 （シグマ社製） 中から求める阻害活 性を持ち、 入手が容易であった以下の 7点を選びだし、 活性物質の特定化を行な つ 7 .o
①ビペラ 'ノ レスチナ (Vipera palest inae
②エキス ·力リナタス （Echis carinatus)
③トリメレスラス ·アルボラブリス （Trimeresurus albolabris)
④トリメレスラス ·フラホビリテイス (Triraeresurus flaboviridis)
⑤ナジャ *ハジェ (Naja haje)
⑥ナジャ ·二ベア （Naja nivea) ⑦クロタノレス ·ァドマンテウス （Crotarus admanteus)
< 2 >蛇毒中の活性物質の分子量の測定
上記く 1 >で選択した各々の蛇毒凍結乾燥品 10mgを、 1. 5mlの 0. 9%の塩化ナトリ ゥムを含む 20mMトリス塩酸緩衝液 （pH7, 4) 1. 5mlに溶解し、 同緩衝液を溶媒とし たセフアデックス G- 75ゲル濾過クロマトグラフィー （セフアデックス G-75、 ファ ルマシア社製、 直径 26ππη、 長さ 90誦） で分離した。 流速は 0. 5ml/分とし、 5mlずつ フラクションチューブを用いて分取した。
活性はく 1〉に示したものと同様の方法を用いて測定し、 表 1に活性の溶出位 置 （溶出体積） 及び推定される分子量を示した。
Figure imgf000011_0001
以上の結果から、 これまでに報告されている （W09208472号国際公開パンフレツ ト、 M. Peng et al. ， Blood, 81, 2321-2328 (1993))分子量約 25キロダルトンの ペプチド以外にも、 非常に多種多様な、 フォンビルブランド因子の血小板への結 合阻害を示すぺプチドが存在することが明らかとなつた。
< 3 >ビペラ · ノ、レスチナからの活性べプチドの単離
ビペラ ·パレスチナ由来の蛇毒 （シグマ社製） 50mgを、 20mMトリス塩酸緩衝液 (pH7. 4) を含む 0. 15M塩化ナトリウム水溶液 （2. 8ml) に溶解後、 不溶物を遠心除 去 （ 000rpm、 5分） し、 セフアデックス G- 75 (フアルマシア社製） を用いたゲル 濾過クロマトグラフィー （直径 2. 6cm、 長さ 90cm) を、 上記と同一の緩衝液を用い、 流速 0. 5ml/分で行なった。
各フラクションについて、 く 1〉に示した阻害活性の測定を行い、 活性物質の 含まれる画分 （溶出容量 390-430ml) を YM10 (アミコン社製） を用いた限外濾過に より濃縮後、 50mM酌酸アンモニゥム緩衝液 （pH4. 5) に溶媒置換した。 得られた濃 縮液を、 TSK- gel CM-5PW (東ソ一社製、 直径 7. 5min、 長さ 75画） を用いたイオン交 換クロマトグラフィーを 2回に分けて行ない、 活性ピークをそれぞれ分取し、 溶 出時間の早いピークを VP-1、 遅いピークを VP- 2とした （図 1 ) 。 溶出条件は A溶 媒： 50mM酢酸アンモニゥム緩衝液 （pH4. 5) 、 B溶媒： 0. 5M酢酸アンモニゥム緩衝 液 （pH6. 4) を用い、 （A ： B ) の比が （60 :40) から 20分間で （30: 70) になるよ うに直線濃度勾配溶出を行なつた。
さらに、 それぞれのサンプルについて分取した画分を、 セントリコン- 10 (アミ コン社製） を用いて濃縮し、 TSK-gel DEAE-5PW (東ソ一社製、 直径 7. 5麵、 長さ 7 5mni) を用いたイオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製を行なった。 溶出 条件は A溶媒： 50mM酢酸アンモニゥム緩衝液 （pH9. 0) 、 B溶媒： 0. 5M酢酸アンモ ニゥム緩衝液 （PH6. 4) を用い、 （A： B ) の比が （100: 0) から 20分間で （50 :5 0) になるように濃度勾配溶出を行なった （図 2、 図 3 ) 。
以上のようにして単離された VP- 1、 VP-2はそれぞれ最終的にセントリコン- 10 (ァミコン社製） を用いて濃縮し、 生理的食塩水溶液とした。 比較例 1 エキス ·力リナタスからの活性べプチドの単離 エキス ·力リナタス由来の蛇毒 （シグマ社製） 25mgを、 20mMトリス塩酸緩衝液 (pH7. 4) を含む 0. 15M塩化ナトリウム水溶液 （1ml) に溶解後、 不溶物を遠心除去 (15000rpm、 5分） した後、 セフアデックス G-75を用いたゲル濾過クロマトグラフ ィー （直径 2. 6cin、 長さ 90cm) を、 上記と同一の緩衝液を用い、 流速 0. 5ml/分で行 ァょつた
実施例 1と同様にフォンビルブランド因子の血小板への結合阻害試験を行い、 活性画分 （溶出容量 390-410ml) をセントリブレップ- 10 (アミコン社製） を用い た限外濾過により濃縮後、 50mM酢酸アンモニゥム緩衝液 （pH4. 5) に溶媒置換した ( 濃縮液について、 TSK- gel CM-5PW (東ソ一社製、 直径 7. 5讓、 長さ 75mm) を用いた ィォン交換ク口マトグラフィーを 2回に分けて行な L、、 活性ピークをそれぞれ分 取した。
活性ピークは 4種類存在し、 溶出時間の早いピークから順に EC- 1、 EC-2、 EC- 3、 EC-4とした （図 4 ) 。 さらにこの 4つの活性画分を、 セントリコン- 10 (アミコン 社製） を用いて濃縮し、 溶出溶媒として 20mMトリス塩酸緩衝液 （pH7. 4) を含む塩 化ナトリウム濃度勾配 (1. 5M- 0M/20分間) を用いた、 TSK-gel Phenyl- 5PW (東ソ 一社製、 直径 4. 6min、 長さ 75mni) による吸着クロマトグラフィーによりさらに精製 し、 4種類それぞれを単一な活性ペプチドとして得た。 ここで得た活性ペプチド のうちの 1つが； そのク口マトグラフィ一上の挙動及び活性から Pengらが報告し ているェキセチン （Echicetin) ( . Peng et al. , Blood, 81, 2321-2328 (1993)) であると考えられる。 比較例 2 トリメレスラス ·アルボラプリスからの活性べプチドの単離 トリメレスラス ·アルボラプリス由来の蛇毒 （シグマ社製） 50mgを、 20mM卜リ ス塩酸緩衝液 （PH7. 4) を含む 0. 15M塩化ナトリウム水溶液 （1. 4ml) に溶解後、 不 溶物を遠心除去 （15000rpm、 3分） した後、 セフアデックス G- 75を用いたゲル濾過 クロマトグラフィー （直径 2. 6cm、 長さ 90cm) を、 上記と同一の緩衝液を用い、 流 速 0. 5ml/分で行なった。
実施例 1と同様にフォンビルブランド因子の血小板への結合阻害試験を行い、 2つの活性画分 （溶出容量 300- 350mlと 390- 440ml) をそれぞれセン卜リプレップ -10 (アミコン社製） を用いた限外濾過により濃縮後、 50mM酢酸アンモニゥム緩衝 液 （pH4. 5) に溶媒置換した。
それぞれの活性画分の濃縮液について、 TSK-gel C -5PW (東ソ一社製、 直径 7. 5mra, 長さ 75πιηι) を用いたイオン交換クロマトグラフィーを行ない、 前半の活性画 分からは活性ペプチド ΤΑ-3を （図 5 ) 、 後半の活性画分からは活性ペプチド ΤΑ_1、 ΤΑ-2 (図 6 ) をそれぞれ単一なペプチドとして得た。 溶出条件は Α溶媒： 50mM酢 酸アンモニゥム緩衝液 （pH4. 5) 、 B溶媒： 0. 5M酢酸アンモニゥム緩衝液 （pH6. 4) を用い、 （A： B ) の比を （100 : 0) から 20分間で （0 : 100) になるように濃度勾 配溶出を行なった。 実施例 2 活性べプチドの諸性質
< 1 >蛇毒べプチドのリストセチン凝集阻害作用と血小板凝集惹起活性の検討 実施例 1及び比較例 1、 2で単離した活性べプチドの SDSポリアクリルァミ ドゲ ル電気泳動を常法に従って行なった。 その結果、 それぞれの活性ペプチドは、 表 2に示した通り分子量約 1 4〜1 7キロダルトンの異なる 2本の （TA- 3は異なる 4本の） ぺプチド鎖よりなるぺプチドであることがわかった。 表 2
Figure imgf000014_0001
上記のペプチドは、 いずれも 5 ^ g/mlの濃度以下で、 実施例 1に示した固定化血 小板のリストセチン凝集を阻害した。 そこで、 実施例 1と同様の方法で調製した 多血小板血漿 (platelet rich plasma) にこれらのペプチドを加えたときの作用 を観察した。 測定は Hematracer- 801 (二光バイオサイエンス社製） を用い、 キュ べット中に 100 / 1の多血小板血漿を入れ、 スターラーバーを用いて 37 で 3分間 撹拌後、 11. 1 1のペプチド溶液を加え、 透過光を観察することにより凝集の経時 変化を観察した。
図 7にペプチドの濃度と 10分間の最大凝集率を示した。 図 7に示した通り、 TA - 1、 TA- 2は低濃度で非常に強い凝集活性を、 また TA- 3および EC- 1、 EC- 2、 EC- 3、 EC-4 (EC- 3のみ図示、 EC- 1、 EC- 2、 EC- 4も同様の活性を有する） は、 より高濃度 で血小板凝集惹起活性を示した。 一方、 VP- 1、 VP-2は、 高濃度においても血小板 凝集惹起活性を示さなかった。 これらの事実から、 分子量、 固定化血小板のリス トセチン凝集阻害活性という点で類似しているこれらのぺプチドが、 血小板凝集 惹起活性という点で異なる挙動を示すことが明らかになつた。
< 2〉本発明のぺプチドの構造
ビペラ ·パレスチナから実施例 1に示した方法で得られた活性べプチド VP- 1、 VP- 2は、 等電点電気泳動により pi値がそれぞれ 7. 0、 7 . 2であることが分か つた。 さらに、 VP- 2のアミノ酸配列の決定を次のようにして行なった。 まず、 VP - 2 100 ^を0. 511トリス塩酸緩衝液 （pH8. 5)、 10mMエチレンジァミン四酢酸ニナ トリウム （EDTA * Na2) を含む 7M塩酸グァニジン水溶液 100 1に溶解後、 4ービニ ルビリジン （1 1) 、 トリ- n-ブチルフォスフィン （2〃1) を加え、 室温でー晚反 応させて還元ピリジルェチル化を行なった。
上記反応液を、 TSKgel_Phenyl-5PW- RP (東ソ一社製、 直径 4. 6mm、 長さ 75mm) の カラムを用いた液体クロマトグラフィ一に供し、 VP- 2を構成する 2本のべプチド 鎖を分離した。 溶出は、 流速を lral/minとし、 0. 1%トリフルォロ酢酸を含むァセト 二トリル 31%から 52% (20分間） までの濃度勾配溶出により行なった。 溶出時間の 早い方を VP-2 α鎖、 遅い方を VP- 2 )9鎖と名付けた。 これらを凍結乾燥後、 30%ァ セトニトリルに溶解し、 プロテインシークェンサ一 470A (アプライドバイオシス テム社製） を用いてァミノ末端からのァミノ酸配列の解析を行なった。
また、 上記のようにして得られた還元ピリジルェチル化ペプチドを、 0. 5Mトリ ス塩酸 （PH8. 5)、 lOn エチレンジァミン四酢酸ニナトリウムを含む 7M塩酸グァニ ジン （25 1) に溶解後、 37てで 1時間放置した後、 終濃度が 2M塩酸グァニジン、 0. 1Mトリス塩酸緩衝液 (pH8. 5)、 2mMェチレンジアミン四酢酸ニナトリウムとな る反応液中で、 リジルエンドべプチダーゼ （和光純薬社製） 2 ^ gによる消化反応 を、 37 で 2時間行なった。
上記消化反応による消化断片を、 さらに逆相カラム （SSC- VP- 318、 センシユー 科学社製、 直径 4. 6讓、 長さ 250MI) を用いた高速液体クロマトグラフィーにより 分離、 分取し、 それぞれのアミノ酸配列の解析を、 プロテインシークェンサ一 47 OA (アプライドバイオシステム社製） を用いて行なった。
また、 プロティナ一ゼ Glu- C (ベ一リンガーマンハイム社製） によるペプチドの 断片化、 アミノ酸配列の解析も、 上記と同様の方法により行なった。
上記のようにして明らかにした VP- 2 α鎖のアミノ酸配列を配列番号 5に、 VP- 2 3鎖のアミノ酸配列を配列番号 6に示した。 さらに、 VP- 2 な鎖の酵素消化断片 とそのァミノ酸配列を図 8に、 VP- 2 ;9鎖の酵素消化断片とそのァミノ酸配列を図 9に示した。 図 8、 9において、 Kはリジルエンドべプチダ一ゼ消化によるフラ グメントの一部を、 Eはプロティナーゼ Glu-C消化によるフラグメン卜の一部を示 した。
ところで、 通常行われているァミノ酸配列決定法の精度は完全なものではなく、 ある程度アミノ酸残基の欠失や他のアミノ酸残基との混同等の読み誤りが生じや すく、 本明細書に示したアミノ酸配列中にもこのような読み誤りが含まれている 可能性は否定しがたい。 しかしながら、 そのような読み誤りが含まれていたとし ても、 配列番号 3〜 6に示した配列は、 生理活性や分子量などの性質と併せて本 発明のぺプチドを特定するには十分であると考えられる。
尚、 VP- 2 α鎖のアミノ酸配列において確実性がより高いと考えられる部分の配 列 （ Ν末端から 5 2ァミノ酸残基） を配列番号 3に示す。
—方、 VP-2 鎖は、 配列番号 6において、 6 0番目のリジンと 6 1番目のチロ シンとの間に 1〜 3個の不明なアミノ酸が存在する可能性があり、 また、 1 0 0 番目のリジンと 1 0 1番目のスレオニンとの間も 1〜 3個の不明なァミノ酸が存 在する可能性がある。 VP- 2 /9鎖のアミノ酸配列において確実性がより高いと考え られる部分の配列 （N末端から 4 3アミノ酸残基） を配列番号 4に示す。
VP- 1についても同様に還元ピリジルェチル化後、 ァミノ末端のアミノ酸配列の 解析を行なった。 その結果を、 配列番号 1、 2に示す。 以上の結果から、 VP- 1は、 少なくとも N—末端部分においては VP- 2と同一のァミノ酸配列を有することがわ 力、つ ?*-o
さらに、 ピリジルェチノレ化して得た VP- 1の各々の鎖由来のぺプチドについて、 リジルェンドぺプチダーゼ消化を行い、 得られた消化フラグメントと、 VP-2由来 の消化フラグメントとの逆相高速液体クロマトグラフィーにおける溶出位置の比 較を行った。 その結果、 α鎖由来の 1つのフラグメントに違いがみられ、 ァミノ 酸配列分析の結果、 VP- 1では VP- 2の 1 1 0番目のグリシンがグルタミン酸に、 1 2 2番目のリジンがァスパラギンに置換していることが分かった。
< 3〉本発明べプチドの血小板に対する活性
ビペラ ·パレスチナから得られた VP- 1、 VP- 2について、 く 1 >に示した方法と 同様に Hematracer- 801 (二光バイオサイエンス社製） を用いて、 多血小板血漿 (platelet rich plasma) の種々の凝集に対する阻害活性を測定した。 凝集原と しては、 リストセチン （終濃度 1. 2fflg/ml) 、 ボトロセチン （l // g/ml) 、 ADP (3u M) 、 コラーゲン（10 t g/inl) を用い、 多血小板血漿に各ペプチドを添加後、 3分 間 37 で撹拌後上記の凝集原を加え、 サンプノレを加えないコントローノレ群に対す る凝集阻害率を測定した。
このうちリストセチン凝集に対する VP- 1、 VP- 2の阻害活性をそれぞれ図 1 0、 図 1 1に示した。 VP- 1、 VP- 2はリストセチン凝集に対し、 ともに 2. 5 /g/mlで 90¾ 以上の阻害を示し、 WO9208472号国際公開パンフレツ卜に記載されたクロタルス · ホリダス ·ホリダス由来のぺプチド CHH- B (3// g/nilで約 30¾阻害） より強い阻害活 性を持つことがわかった。 また、 ボトロセチン凝集に対しても、 両ペプチドとも にほぼ同様の濃度において阻害活性を示した。 一方、 VP- 1、 VP- 2とも ADP、 コラー ゲン凝集に対しては 20 β g/mlの濃度においても P且害を示さず、 リストセチン凝集、 ボトロセチン凝集等、 フォンビルブランド因子と糖タンパク質 I b (Glycoprote in lb) の結合に依存する凝集を特異的に阻害するものであることが示された。 さらに、 上記 2つのタンパク質の結合に対する阻害作用を明らかにするため、 実施例 1に述べた方法を用 、て、 1 2 51ラベル化したフォンビルブランド因子の血 小板への結合阻害を測定した。 この結果、 図 1 2に示した通り、 VP-1、 VP-2とも に、 濃度依存的にフォンビルブランド因子の血小板への結合を阻害した。 50¾結合 阻害濃度 (ICso) はいずれのペプチドとも 0. 008- 0. 016 ζΐίであり、 WO9208472号国 際公開パンフレツト記載の CHH-B (ICso : 0. 1-0. 2 ) に比べ、 より低濃度でフォ ンビルブランド因子と糖タンパク質 I bの結合を阻害するべプチドであることが 示された。 産業上の利用可能性
本発明により得られるぺプチドは、 血栓症の発症に深く関与するフォンビルブ ランド因子の血小板への結合を阻害する。 この活性は、 従来知られている物質よ りも、 より低い濃度で発現する。 また、 このペプチドは、 高濃度でも血小板凝集 を惹起しないので、 抗血栓薬として有用である。
配列表 配列番号： 1
配列の長さ ： 32
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列
Asp Gin Asp Cys Pro Ser Asp Trp Ser Ser His Glu Gly His Cys Tyr
1 5 10 15
Lys Val Phe Arg Leu Phe Lys Thr Trp Glu Glu Ala Glu Lys Phe Cys
20 25 30 配列番号： 2
配列の長さ ： 30
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列
Asp Cys Pro Ser Asp Trp Ser Ser His Glu Gly His Cys Tyr Lys Val
1 5 10 15
Phe Asn Leu Asp Lys Thr Trp Ala Asp Ala Glu Lys Phe Cys
20 25 30 配列番号： 3
配列の長さ： 52
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド 配列
Asp Gin Asp Cys Pro Ser Asp Trp Ser Ser His Glu Gly His Cys Tyr
1 5 10 15
Lys Val Phe Arg Leu Phe Lys Thr Trp Glu Glu Ala Glu Lys Phe Cys
20 25 30
Met Gin Gin Val Asn Gly Trp His Leu Ala Ser lie Glu Ser Val Glu
35 40 45
Glu Ala Asn Phe
50 配列番号： 4
配列の長さ： 43
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列
Asp Cys Pro Ser Asp Trp Ser Ser His Glu Gly His Cys Tyr Lys Val
1 5 10 15
Phe Asn Leu Asp Lys Thr Trp Ala Asp Ala Glu Lys Phe Cys Thr Glu
20 25 30 -
Gin Val Ser Gly Gly His Leu Leu Ser Leu Lys
35 40 配列番号： 5
配列の長さ ： 132
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列 Asp Gin Asp Cys Pro Ser Asp Trp Ser Ser His Glu Gly His Cys Tyr
1 5 10 15
Lys Val Phe Arg Leu Phe Lys Thr Trp Glu Glu Ala Glu Lys Phe Cys
20 25 30
Met Gin Gin Val Asn Gly Trp His Leu Ala Ser lie Glu Ser Val Glu
35 40 45
Glu Ala Asn Phe Val Ala Glu Leu Val Ser Lys Thr Leu lie Lys Ser
50 55 60
Lys Tyr His Ala Trp lie Gly Leu Arg Asp Gin Ser Glu Arg Gin Gin 65 70 75 80
Cys Ser Ser His Trp Thr Asp Gly Ser Ala Val Ser Tyr Glu Thr Val
85 90 95
Thr Lys Tyr Thr Lys Cys Phe Gly Leu Asn Lys Asp Lys Gly Tyr Leu
100 105 110
Glu Trp Val Thr Leu Pro Cys Glu Asp Lys lie Pro Phe lie Cys Lys
115 120 125
Ser Trp Val Pro
130 配列番号： 6
配列の長さ ： 125
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列
Asp Cys Pro Ser Asp Trp Ser Ser His Glu Gly His Cys Tyr Lys Val
1 5 10 15
Phe Asn Leu Asp Lys Thr Trp Ala Asp Ala Glu Lys Phe Cys Thr Glu Gin Val Ser Gly Gly His Leu Leu Ser Leu Lys Ser Thr Glu Glu Val
35 40 45
Asp Phe Met lie Lys Leu Val Phe Pro lie Leu Lys Tyr Asp Leu lie
50 55 60
Trp lie Gly Leu Ser Asn Phe Trp Arg Asp Cys His Trp Gly Trp Ser
65 70 75 80
Asp Gly Val Lys Leu Asp Tyr Lys Ala Trp Ser Asp lie Pro Asp Cys
85 90 95
Tyr Val Ala Lys Thr Val Asp Tyr Gin Trp Leu Leu Arg Asp Cys Ser
100 105 110
Arg Thr Tyr Lys Phe lie Cys Lys Ser Arg Val Pro Arg Arg Arg
115 120 125

Claims

請求の範囲
1 . ビペラ，パレスチナの蛇毒より得られるペプチドであって、 フォンビルブ ランド因子と血小板との結合を阻害する活性を有するぺプチド。
2. 異なる 2本のべプチド鎖からなり、 S D Sポリアクリルアミ ドゲル電気泳 動における分子量が、 非還元条件では約 2 5キロダルトンであり、 還元条件では 約 1 5キロダルトンである請求項 1記載のペプチド。
3 . 前記 2本のべプチド鎖のうち、 一方は配列表配列番号 1に示すァミノ酸配 列を N末端に有し、 他方は配列番号 2に示すァミノ酸配列を N末端に有する請求 項 2記載のペプチド。
4 . 前記 2本のべプチド鎖のうち、 一方は配列表配列番号 3に示すァミノ酸配 列を N末端に有し、 他方は配列番号 4に示すァミノ酸配列を N末端に有する請求 項 2記載のぺプチド。
5 . 前記 2本のべプチド鎖のうち、 一方は配列表配列番号 5に示すァミノ酸配 列を有し、 他方は配列番号 6に示すァミノ酸配列を有する請求項 2記載のぺプチ
6 . 請求項 1〜 5のいずれか一項に記載のぺプチド及び Ζ又はその薬学的に許 容される塩を有効成分として含有する抗血栓剤。
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