JPH02138298A - ヘビ毒ポリペプチド及び遺伝子発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は血小板凝集を阻害するポリペプチドに関する。

本発明は一般に細胞付着を調節すること、フィブリノー
ゲン及び他のタンパク質が血小板に結合することを阻害
すること、血小板の凝集を阻害することに関する。フィ
ブリノーゲンはグリコプロティンであり、血漿中に存在
し、血小板凝集及びフィブリンの生成に関与する。血小
板は無核のフラグメント様細胞であり、すべての哺乳類
に見られ、血液凝固に関与する。フィブリノーゲンとレ
セプター、血小板膜グリコプロティン複合体ｎｂ／Ｈａ
との相互作用は°正常な血小板機能に欠くことのできな
いものであることが知られている。

血管が損傷した場合、血小板は破壊した内皮下の層に付
着する。付着した血小板は、次に生物学的に有効な成分
及び凝集体を放出する。凝集はトロンビン、エビネフィ
リン又はＡＤＰのようなアゴニストが特異的血小板膜レ
セプターに結合することによって開始される。アゴニス
トによる刺激は潜在するフィブリノーゲンレセプターを
血小板表面にさらし、フィブリノーゲンのグリコプロテ
ィンＩＩｂ／Ｉ［［ａ複合体への結合が生じる。

血小板の凝集及び付着のメカニズムを研究するために天
然及び合成ペプチドを使用することが試みられた。血小
板凝集阻害剤タンパク質は種々のヘビ毒から単離されて
いる。しかしながらこれらのタンパク質による血小′ｊ
ｔ１ｉ、凝集阻害のメカニズムの研究は構造上の情報の
欠如によって妨げられている。

最近トリグラミンと呼ばれる毒液ペプチドがいくらか詳
細に特徴付けられたハング等、ジエーオプ、パイオル、
ケム（Ｈｕａｎｇ　ｅｔ、ａｌ、Ｊ、ｏｆ、旧ｏ１゜Ｃ
ｈｅＩＩ＋、）　１９８７年第２６２巻、１６１５７〜
１６１６３頁及び米国特許出願番号筒１２１，９７２号
、出願臼　１９８７年１１月１８日参照）。このペプチ
ドは血小板膜のグリコプロティンＩ［ｂ／Ｉｎａ複合体
に結合するフィブリノーゲンを競合的に阻止することが
報告されている。このペプチドは＾ｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓ
ｐ配列を含み、Ｃ０ＯＨ末端残基に近いと思われる。

ロスラティ及びピエールスクバチャー（Ｒｏｕｓｌａｈ
ｔｉａｎｄ　Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ）、サイエン
ス、１９８７年、第２３８巻、４９１〜４９７頁は、細
胞外マトリックス及び血液中に存在するフィブロネクチ
ン、ビトロネクチン、オステオボンチン、コラーゲン、
トロンポスボンジン、フィブリノーゲン及びフォンビル
プラント因子のような付着性タンパク質を記載している
。タンパク質は細胞認識部位としてトリペプチドアルキ
ニン−グリシン−アスパラギン酸を含有する。トリペプ
チドは構造上関係のあるレセプター系の少なくとも１種
インテグリンによって認識され２つの膜スパニングサブ
ユニットを有する異種２１体タンパク質である。著者は
個々のタンパク質のトリペプチド配列のコンホーメーシ
ョンが認識特異性に臨界的であることを述べている。

チャーシュ、ブロク、ナトル、アカド、サイ。

（ｃｈｅｒｅｓｈ　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ　１９　Ｂ　７年、第８４巻、６４
７１〜６４７５頁は血小板のＩＩ　ｂ　／　ｎ［ａ複合
体に構造上類似しているが抗原上機能上具なるヒト内皮
細胞によって発現された付着レセプターを示すＡｒｇ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐを記載している。

レセプターはフィブリノーゲン、フォンビルプラント因
子及びビトロネクチンへの内皮細胞付着に直接関係する
。

ロスラティ及びピエールスクバチャー、ジェーオブ、パ
イオル、ケム、１９８７年、第２６２巻、３６．１７２
９４〜１７２９８頁はトリペプチド配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ
−Ａｓｐを含むペプチドの結合特異性について配列＾ｒ
ｇ−Ｇｌｙ−＾５ｐ−Ｘａａの立体化学の影響を記載し
ている。ブロク、ナトル、アカド、サイ。

ＵＳＡ、１９８４年、第８１巻、５９８５〜５９８８頁
には同じ著者が付着−促進活性を維持するフィブロネク
チンの細胞認識部位変異体を記載している。トリペプチ
ドＡｒｇ−Ｇｌｙ−＾５ｐ−Ｓｅｒは多数の接着性グリ
コプロティンフィブロネクチン中の細胞によって認識さ
れる最小構造として記載されている。−Ａｒｇ−Ｇｌｙ
−Ａｓｐ−３ｅｒ一部分を有するペプチドは米国特許第
４．５８９．８８１号及び同第４．６１４．５１７号に
記載されている。フィブロネクチンと同じ細胞付着活性
を有するタンパク質−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｒ（Ｒ
はＴｈｒ又はＣｙｓ又は他のアミノ酸から選択される）
を有するペプチドは米国特許第４．５７８．０７９号に
記載されている。

ルゲリ等（Ｒｕｇｇｅｒｉ　ｅｔ　ａｌ、）ブロク、ナ
トル、アカド、サイ、ＵＳＡ、１９８６年、第８３巻、
５７０８〜５７１２頁は血小板に結合するフィブリノー
ゲンを阻害する配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌを
含む１６残基までの長さで示される一連の合成ペプチド
を記載している。

ゴールド等す−キュレーシ目ン（Ｇｏｌｄ　ｅｔ　ａｌ
。

Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ　）第７７巻、１９８８年３月
３日６７０〜６７７頁は冠状動脈血栓崩壊及び再閉塞に
関するヒト血小板ＧＰｕｂ／Ｉ［Ｉａレセプターに対す
る組換え体１本鎖組織型プラスミノーゲン活性化因子及
びムリンモノクローナル抗体（７Ｅ３）のＦ　（ａｂ’
　）ｚフラグメントの巨丸注射薬の作用を記載している
。ゴールド等は血小板ＧＰＩＩｂ／Ｉ［［ａレセプター
に対して示されるモノクローナル抗体７Ｅ３のＦ　（ａ
ｂ’　）ｚフラグメントの注射が組換え体１本鎖組織型
プラスミノーゲン活性化因子を用いた血栓崩壊を促進し
、再閉塞を妨げることを見い出した。

トリペプチド配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−＾ｓｐがフィブロネ
クチン及びビトロネクチンの細胞付着促進作用を重複す
るか又は阻害することができる特定のポリペプチドに存
在することが知られている一方、ポリペプチドの他のア
ミノ酸の結合特異性に関する影響はほとんどわかってい
ない。出願人は、血小板凝集阻害剤であり、ポリペプチ
ドの位置に関して特異的な位置にあるシスティン残基を
有するトリペプチド配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−＾ｓｐを含む
ポリペプチドを同定精製した。システィンアミノ酸の特
異な位置はこれらのポリペプチドの血小板凝集阻止能に
著しく影響すると思われる。

長鎖オリゴデオキシヌクレオチドの化学合成のための信
頼できる方法及び装置の出現は天然遺伝子の単離及び発
現に代わって遺伝子の合成を可能にしたカルザー（ｃａ
ｒｕｔｈｅｒ）サイエンス、第２３０巻（１９８５年）
２８１〜２８５頁、フェレッテティ等（Ｆｅｒｒｅｔｔ
ｉ　ｅｔ　ａｌ、）ブロク、ナトル、アカド、サイ、Ｕ
ＳＡ、第８３巻（１９８６年）、５９９〜６０３真、ウ
ォスニック等、ジーン（Ｗｏｓｎｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ、
　Ｇｅｎｅ）第６０巻（１９８７年）、１１５〜１２７
頁、ナサル（Ｎａｓｓａｌ）ジーン、第６６巻（１９８
８年）、２７９〜２９４頁、ベル等（Ｂｅｌｌ　ｅｔ　
ａｌ）ジーン、第６３巻（１９８８年）、１５５〜１６
１頁）。この手法は少量の天然タンパク質の発現工学に
特に有用である。しかしながら細菌宿主で発現される多
くの真核タンパク質は不安定である（タニグチ等ブロク
、ナトル、アカド、サイ、ＵＳＡ、第７７巻（１９８０
年）、５２３０〜５２３３頁、デビス等（Ｄａｖｉｓ　
ｅｔ　ａｌ、）ブロク、ナトル、アカド、サイ、ＵＳＡ
、第７８巻（１９８１年）、５３７６〜５３８０頁、ジ
エン（Ｓｈｅｎ）ブロク、ナトル、アカド、サイ、ＵＳ
＾、第８１巻（１９８４年）、４６２７〜４６３１頁及
びレニツク等（Ｌｅｎｎｉｃｋ　ｅｔ　ａｔ）ジーン、
第６１巻（１９８７年）、１０３〜１１２頁）。不安定
性を回避するためにしばしば使用される方法は細菌タン
パク質をコードしているヌクレオチド配列に興味ある遺
伝子を融合させて融合タンパク質を生産することであり
、これによって真核タンパク質が保護される。多くの化
学試薬及びプロテアーゼが融合タンパク質の様々なアミ
ノ酸部位を切断することが報告されている。臭化シアノ
ジエンはメチオニンで有効に選択的に切断するサリゲ等
、メソッズインエンザイモロジー、ヒルス及びテイマシ
エルフ（Ｓａｒｉｇｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　５Ｈｉｒｓ及びＴｉ
ｍａｓｈｅｌｆｆ）　繁、アカデミツクプレス、ニュー
ヨーク、第４７巻（１９７７年）、４５９〜４６９頁、
ナガイ等、ネイチュア、第３０９巻（１９８４年）、８
１０〜８１２頁、スゾカ（５ｚｏｋａ）等、ＤＮＡ、第
５巻（１９８６年）、１１〜２０頁及びハ７フエイ（Ｈ
ａｆｆｅｙ）等、ＤＮＡ　。

第６巻（１９８７年）、５６５〜５７１頁）。

本発明はフィブリノーゲン−血小板結合を阻害する一般
式Ｉ Ｘ−Ｃｙｓ−Ｒ−Ｒ−Ｒ−＾ｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｒ
−Ｒ−Ｒ−Ｒ−Ｒ−Ｃｙｓ−Ｙ（式中ＸはＨ又は少なく
とも１個のアミノ酸であり、ＹはＯＨ又は少なくとも１
個のアミノ酸であり、各Ｒは同一かあるいは異なりある
ゆるアミノ酸である。） を有することを特徴とするフイプリノーゲンーレセブタ
ーアンタゴニストポリペブチドを包含している。

式■の範囲内のポリペプチドは式Ｉａを包含する。

ＨＪ−（ｃｈ）−Ｃｙｓ−Ｒ−Ｒ−Ｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ
−Ａｓｐ−Ｒ−Ｒ−Ｒ−Ｒ−Ｒ−Ｃｙｓ（ｃｘ）−Ｈ（
Ｉ　ａ　） （式中ｃｈは少な（とも１個のアミノ酸を表わし、Ｃｘ
は少なくとも１個のアミノ酸を表わし、各Ｒは同一かあ
るいは異なりあらゆるアミノ酸である。） 本発明のポリペプチドは種々のヘビ類例えばトリメレス
７Ｌ／スグラミネウス（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓｇｒ
ａｗｉｎｅｕｓ）、エキスカリナツス（ｕｃｈｉｓ　ｃ
ａｒｉｎａｔｕｓ）、アグキストロドンピスシボルス（
Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ）　、ビ
チスアリエタンス（Ｂｉｔｉｓａｒｉｅｔａｎｓ）及び
エリストコフィスマクマホニイ（Ｅｒｉｓｔｏｃｏｐｈ
ｉｓ　ｍａｃｍａｈａｎｉｉ）の毒液から精製される。

これらのポリペプチドは、ヒト血小板に結合するフィブ
リノーゲンを阻害し、ヒト血小板のフィブリノーゲン誘
発凝集を阻害することに有用である。

これらのペプチドは以下に記載される精製操作に従って
ヘビ毒から精製される。これらはシスティンが豊富であ
り、一般配列−Ｃｙｓ−Ｒ−Ｒ−Ｒ−＾ｒｇＧｌｙ−Ａ
ｓｐ−Ｒ−Ｒ−Ｒ−Ｒ−Ｒ−Ｃｙｓ−（各Ｒは同一か又
は異なり、あらゆるアミノ酸を表わす）を含む。

出願人は、結合メカニズムに関する個々の理論に結びつ
けることを望んでいないが、システィンアミノ酸の位置
はポリペプチドの三次元コンホーメーション、厳密度及
び結合特異性を決定する重要な役割を果している。

本発明はまた一般式 ％式％ （式中ＸはＨ又は少な（とも１個のアミノ酸であり、Ｙ
はＯＨ又は少なくとも１個のアミノ酸であり各Ｒは同一
かあるいは異なりあらゆるアミノ酸である。） で表わされる血小板凝集阻害剤をエンコードする遺伝子
又は変性等個物を包含している。

本発明の好ましい遺伝子は変性エキスタチンをエンコー
ドする。エキスタチンは以下の通り定義される。

Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃ
ｙｓ−Ｃｙｓ−＾ｒｇ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈ
ｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇ　１ｕ−Ｇｌ　ｙ−Ｔｈｒ−１
１ｅ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−＾ｒｇ−Ｇ　
１　ｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｍｅ　ｔ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−
Ｔｙｒ−Ｃｙｓ　−Ａｓｎ−Ｇ　ｌｙ−Ｌｙｓ　−Ｔｈ
ｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｓｎ
−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇ　１ｙ−Ｐｒｏ−Ａ　ｌ
ａ−Ｔｈｒ 化タンパク質の２８位に於けるメチオニンは、組換え体
エキスタチンではロイシンに置き換えられる。合成遺伝
子はＥ、ｃｏｌｉ　ＣｈｅＢ及びＣｈｅＹ遺伝子複合体
の一部をプラスミドｐＵｃ１３に挿入する（米国特許出
願番号第１４５．８００号、出願日１９８８年１１月５
日）ことによって構成された発現ベクターｐＪＣ２６４
を使用して大腸菌（Ｔ！、ｃｏｌｉ、ＭＢ−５３８５、
アメリカンタイプカルチュアコレクション、１２３０１
パークラウンドライブ、ロックヴイル、ＭＤ２０８５２
米国に寄託されているＡＴＣＣ受は入れ番号６７８７３
）で発現される。微生物の菌株はブタペスト条約に寄託
されており、公表の寄託微生物に対する利用性について
のあらゆる制限は特許の登録時に変更せずに取り除かれ
る。

ｒ−ｊ２ｅｕ２８−エキスタチン遺伝子の高レベルの発
現は発現ベクターのＥ、ｃｏｌｉ　ＣｈｅＹ遺伝子との
融合によって達成される。組換え体−１ｅｕ２８−エキ
スタチンは遺伝学的にＣｈｅＹタンパク質とエキスタチ
ンの間に挿入されたメチオニンに於て臭化シアノジエン
開裂によって融合タンパク質から遊離され逆相ＨＰＬＣ
により均質に精製され再び折りたたまれる。この折りた
たまれたｒ−１ｅｕ２８−エキスタチンは血小板凝集の
阻害に於て生エキスクチンと見分けがつかず、２８位の
メチオニンはこの血小板凝集阻害剤の生物活性に必須で
はないことを示唆している。

本発明はまた本発明のタンパク質及び本発明の組換え体
タンパク質の生産に有用な発現ベクターを使用する血小
板凝集を阻害するための組成物を包含する。

本発明はまた式Ｉの合成ポリペプチド及び合成方法を包
含する。

本明細書中で使用される化タンパク質は対応する遺伝子
によって生産される全長タンパク質を意味する０組換え
体タンパク質は、所望のタンパク質の遺伝子又はｃＤＮ
Ａを分離したもの及び所望のタンパク質を過剰生産する
細胞を構成するために精製遺伝子又はｃＤＮＡを使用し
たものを意味する。本明細書中で使用される微小不均質
形態は構造上変性された後翻訳されるＤＮＡの単一遺伝
子単位から生産されるタンパク質である単一遺伝子生産
物を意味する。しかしながらこれらの構造変性は、タン
パク質の活性に著しい変化を生じない。変性は、生体内
あるいは分離及び精製の過程で行なうことができる。生
体内変性はＮ末端に於てアセチル化、加水分解、グリコ
ジル化又はホスホリル化を生じるがこれに限定されない
。タンパク質の加水分解は１種以上の末端アミノ酸を連
続して酵素的に切断して元の遺伝子生産物より少ないア
ミノ酸を有する微小不均質形態が生じるエクソプロテオ
リシスを包含することができる。加水分解はまたアミノ
酸配列内の特定位置でペプチドを切断するエンドプロテ
アーゼの作用から生じるエンドブロチオリシス変性を包
含することができる。同様の変性と微小不均質形態が生
産されることになる精製過程で現われることができる。

精製中に生じる最も一般的な変性はタンパク質の加水分
解である。

組換え体ＤＮＡ技術は本明細書では異種細胞通常異種微
生物からの遺伝情報ＤＮＡのセグメントをＤＮＡが得ら
れた微生物の外側に端と端とをつないで接合させこのハ
イブリッドＤＮＡを元のＤＮＡがエンコードするタンパ
ク質を産生させることができる細胞に組込ませる技術と
して定義される。遺伝情報、ＤＮＡ又はｍＲＮＡは単離
され適当なりローニングベクターに組込まれ適当な宿主
細胞に導入される。

本明細書中で使用されるクローニングベクターは特定の
実験用の異なるＤＮＡを組込ませることができるＤＮＡ
配列として定義され、合わせたＤＮＡは安定な方法で存
在することができ、実験用ＤＮＡによって指図されたタ
°ンパク質を発現することができる宿主細胞に導入され
る。ベクターＤＮＡは組合わせた別のＤＮＡは組換え技
術から誘導される組換え体ＤＮＡ分子を構成する。クロ
ーニングベクターはプラスミド・バクテリオファージ、
ウィルス及びコスミドを包含することができる０発現ベ
クターは本明細書では遺伝子のクローンされたコピーの
転写及び適当な宿主に於けるｍＲＮＡの翻訳に必要とさ
れるＤＮＡ配列として定義される。かかるベクターは細
菌、酵母、昆虫及び哺乳類細胞のような種々の細胞に於
て原核あるいは真核遺伝子を発現させるために使用する
ことができる。タンパク質はまた多くのウィルス系で発
現させることができる。適当に構成された発現ベクター
は宿主細胞に於ける自律的複製のための複製原型、選択
マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、高コピー
数及び強力なプロモータ−を含むべきである。プロモー
ターは、ＲＮＡポリメラーゼを指示して、ＤＮＡに結合
し、ＲＮＡ合成を開始するＤＮＡ配列として定義される
０強力なプロモーターはｍＲＮＡを高頻度で開始させる
ものである。発現ベクターは、クローニングベクター、
変性クローニングベクターを包含することができ、詳細
にはプラスミド又はウィルスが示されるがこれに限定さ
れない。

本発明のタンパク質は血小板凝集阻害活性を維持するな
らば、生タンパク質の明示された遺伝子によって列挙さ
れた完全なタンパク質として又はそのあらゆるフラグメ
ント又はサブユニット又は完全なタンパク質、そのフラ
グメント又はサブユニットのハイブリッドとして存在す
ることができる０本明細書で使用される完全なタンパク
質は適当な遺伝子によって生じる完全な長さのポリペプ
チドを意味する。完全なタンパク質は、適当なヘビ毒の
精製又は遺伝子生成物から誘導される対応する組換え体
の適当な発現ベクターに於て発現によって得ることがで
きる。タンパク質断片又はサブユニットは完全なタンパ
ク質より少ないアミノ酸を含み、生タンパク質と同じ条
件で血小板凝集阻止能を維持するタンパク質のいかなる
部分をも意味する。ハイブリッドタンパク質は融合タン
パク質又は発現ベクター内の複数遺伝子の発現から生じ
るタンパク質を包含するがこれに限定されない、融合タ
ンパク質は、発現ベクターによりコードされた限られた
数のアミノ酸を発現し、発現が特定の血小板凝集阻害ペ
プチドへの付着を生じるものとして定義される。複数遺
伝子から生じるタンパク質は、血小板凝集阻害を増大さ
せる第２のポリペプチド又はペプチド結合によるペプチ
ドに結合した特定のポリペプチドを包含することができ
る。

本発明の範囲内のポリペプチドはトリメレスルスグラミ
ネウス、エキスカリナツス及びアグキストロドンピスシ
ボルス、ビチスアリエタンス及びエリストコフィスマク
マホニイのヘビ毒から単離されている。これらのポリペ
プチドの全てが有効な血小板凝集阻害剤である。

エキスカリナツス毒から単離された阻害剤の配列は以下
のものである。

Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃ
ｙｓ−Ｃｙｓ−＾ｒｇ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈ
ｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　１ｙ−Ｔｈｒ−１
１ｅ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ　ｌａ−Ａｒｇ−Ｇ
ｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−＾ｓｐ−八５ｐへＴｙ
ｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ
−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−八ｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−
Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−＾１ａ−ｈｒ 以後、この阻害剤をエキスタチン（Ｅｃｈｉｓｔａｔｉ
ｎ）と呼ぶ。

アグキストロドンピスシボルス毒から単離された阻害剤
の配列は以下のものである。

Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｃ
ｙｓ−Ｃｙｓ−＾５Ｐ＝Ａ１ａ−＾１ａ−Ｔｈｒ−Ｃｙ
ｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇ　Ｉ　ｙ−５
ｅｒ−Ｇ　１　ｎ−Ｃｙｓ−Ａ　１ａ−Ｇ　Ｉｕ−Ｇ　
ｌ　ｙ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇ　１ｎ−
Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ａ　１ａ−
Ｇ　ｌｙ？　？　？　−１１ｅ−Ｃｙｓ−？　？　？　
−Ａｒｇ−Ａｌａ−＾ｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｎ、
　、　。

特定アミノ酸の同定はこの時知られておらず、４６番目
のアミノ酸に続く配列も同定されない。

それにもかかわらず阻害剤は、本発明の範囲内にあると
考えられ、以後アゲキストロスタチン（Ａｇｋｉｓｔｒ
ｏｓｔａｔｉｎ）　とみなされる。

ビチスアリエタンス毒から単離された阻害剤の１配列は
以下のものである。

５ｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａ　１−Ｃｙｓ−Ｇ　１ｙ
−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇ　１ｕ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−＾５ｐ−Ｃｙｓ−
Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇ
　ｌｎ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａ
　ｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔ
ｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇ　１ｙ−３ｅｒ−Ｇｌ　ｎ−Ｃｙｓ−
Ａｓｎ−Ｈｌｓ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　１ｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ
−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−
Ｌｙｓ−Ａｌａ−＾ｒｇ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ａ
ｒｇ−１１ｅ−＾１ａ−＾ｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒ
ｐ−Ａｓｎ−八ｓｐ−＾ｓｐ−’Ｉ’ｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔ
ｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｃｙ
ｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−旧Ｓ以後この阻害剤はビ
チスタチン（Ｂｉｔｉｓｔａｔｉｎ）　１とみなされる
。

ビチスアリエタンス毒から単離された阻害剤の別の配列
は以下のものである。

５ｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａ　１−Ｃｙｓ−Ｇ　１　
ｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　
１ｎ−Ｇｌｙ−Ｇ　１ｕ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｃ
ｙｓ−Ｇ　Ｉｙ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａ　１ａ−Ａｓｎ−
Ｃｙｓ−Ｇｌ　ｎ−Ａｓｐ−Ｇ　１ｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ
−Ａｓｎ−Ａ　１．ａ−Ａ　１ａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌ
ｙｓ　−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌ　ｙ−５ｅｒ−
Ｇｉｎ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−旧５−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙ
ｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ
−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａ　ｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｖａ　
１−Ｃｙｓ−＾ｒｇ−Ｉ　１ｅ−Ａ　Ｉ　ａ−Ａｒｇ−
Ｇ　ｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−
Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇ　Ｉｙ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−
５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｈ
ｉｓ以後この阻害剤はビチスタチン２とみなされる。

ビチスアリエタンス毒から単離された阻害剤の別の配列
は以下のものである。

Ｖａ　ｌ−５ｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａ　１−Ｃｙｓ
−Ｇ　ｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｉｆ　ｅ−Ｌｅｕ−Ｇ　
１　ｕ−Ｇｌ　ｎ−Ｇ　１ｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ
−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌ　ｙ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ
−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−
Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−八１ａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌ
ｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌ
ｎ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−旧５−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−
Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇ　１　ｎ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ
−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｖａ　１
−Ｃｙｓ　−Ａｒｇ−Ｉ　ｌｅ−Ａ　１　ａ−Ａｒｇ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｔ
ｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−３ｅ
ｒ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−＾５ｎ−Ｈｉｓ
以後この阻害剤はビチスタチン３とみなされる。

エリストコフィスマクマホニイ毒から単離された阻害剤
の別の配列は以下のものである。

Ｇｌｎ−Ｇ　１ｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａ　１ａ
−Ｔｈｒ−Ｇｌ　ｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ
−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−
Ａｌａ−Ｇｌ　ｙ−Ｌｙｓ　−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ
−Ｖａ　ｌ　−Ａ　ｌ　ａ−Ａｒｇ−Ｇｌ　ｙ−Ａｓｐ
−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−
Ｔｈｒ−Ｇ　Ｉｙ−Ｌｙｓ　−５ｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ
−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｓｎ　−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ
−Ａｓｎ−ｉｓ 以後この阻害剤はエリストスタチンＣＩ！ｒｉｓｔｏｓ
ｔａｔｉｎ）とみなされる。

ビチスアリエタンス毒から単離された阻害剤の別の配列
は以下のものである。

５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａ　１−Ｃｙｓ−Ｇ　Ｉｙ
−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｉ　ｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　
Ｉｎ　−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−＾５ｐ−Ｃ
ｙｓ−Ｇｌｙ−５ｅｒ、　、。

２０番目のアミノ酸に続く配列の同定は決定されていな
い、この配列、以後ビチスタチン４と呼ぶ、とビチスア
リエタンスから単離された他のポリペプチド間の構造相
信性のためにビチスタチン４は式Ｉの範囲内にあると考
えられる。

上記で確認した配列は式Ｉで定義した配列の範囲内にあ
るポリペプチドの特定の具体例であり、本発明の範囲を
限定するものとして解釈されるべきではない、これらは
°アミノ酸配列によって定義されている。自然対立遺伝
子変異が存在することは理解されるであろう。これらの
変異は全配列に於けるアミノ酸の差異又は該配列に於け
るアミノ酸の削除、置換、挿入、逆転又は付加によって
示されることができる。

スＩＬＬ 皿 ■料−エキスカリナツスの毒液をマイアミサーペンタリ
ウムラボラトリース、ツルトレイクシティ　　（Ｍｉａ
ｍｉ　　５ｅｒｐｅｎｔａｒｉｕｎ＋　　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ　　５ａｌｔ　　ＬａｋｅＣｉｔｙ）　Ｕ
Ｔから購入した。低分子量ペプチドスタンダード、セフ
ァデックスＧ−５０及びモノ５ＦＰＬＣカラムはファー
マシア社から購入した。

セルパライトプレコート等電点分画電気泳動ゲルはセル
バファインバイオケミカルス社から、等電点分画電気泳
動マーカープロティンはＢＤＨケミカルス社から購入し
た。Ｃｌ８ＨＰＬＣカラムはＶｙｄａｃ生成物である。

鬼上板鬼貝袈 ウサギ全血をニュージランド白ウサギから集めた。血液
を２００ｘｇで１０分間遠心分離した。血小板に富む血
漿の上澄み液をアビラーゼ（２０μｇ／Ｉｄ、）及びＰ
　Ｇ　Ｅ　ｔ　　（５ｎｇ／　ｄ　）の存在下で８００
ｘｇに於て１５分間遠心分離した。沈降物を洗浄緩衝液
（１３８ｍＭ　ＮａＣ１，２，９ｍＭＫＣｊ！、０．３
１＋ａＭＮａｚｌｌＰＯａ　、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２．５
ｍＭ　ＩＩＩ！Ｐｕｓ、　ｐＨ６，５，５ｍＭ　グルコ
ース、０．１％ＮａＨＣＯ１，１ｍＭ　ＥＧＴＡ及び０
．３５％ウシ血清アルブミン）１０ｄに再懸濁した。ア
ビラーゼを最終濃度２０μｇ／−まで添加した。再懸濁
した沈降物を８００ｘｇで遠心分離した後、同じ緩衝液
で２回洗浄した。次いで洗浄した沈降物をＥＧＴＡを省
いた洗浄緩衝液ｐＨ７，４に２〜５×ｌＯ＠細胞／−の
濃度で懸濁した。

皇土仮藍隻槍定 血小板凝集はアブレボメーターで３７℃に於て測定した
。反応混合液は、洗浄した血小板（２〜５Ｘ１０＠細胞
／Ｗ１１）、フィブリノーゲン（１００１１ｇ／ｄ）　
、Ｃａ”（１ａ＋Ｍ）　、ＡＤＰ（１０＃Ｍ）、エピネ
フリン（２μｇ／−）及び試験される血小板凝集阻害剤
画分を含有する。他の成分を添加した１抜法ＡＤＴとエ
ピネフリンを添加することによって凝集を開始した０反
応は少な（とも２分間進行させておいた。凝集の阻害程
度は阻害剤不在で観察される凝集の百分率として表わし
た。

エキスタチンの　＋１ ウサギ血小板凝集検定を精製中の活性を監視するために
使用した。エキスカリナツス凍結乾燥毒（１ｇ）を２０
ｍＭ　ＤＴＴを含む１０ｍＭ重炭酸アンモニウム、ｐＨ
７，７，１２ｄに溶解した。室温で１５分後この溶液を
４５．０００ｘｇで４５分間遠心分離した。沈降物を捨
て上澄み液を平衡にしたセファデックスＧ−５０の２．
５Ｘ１２５ｃｍカラムに装填し、１０ｍＭ　ＭＢＳ、　
ｐＨ５，３で４°に於て溶離した。

血小板凝集阻害活性を含む両分をプールし、真空濃縮し
た。セファデックスＧ−１５のカラムで脱塩した後、タ
ンパク質１０〜１３■を１０ｍＭ　ＭＢＳ。

ＧＩＨ５，３で平衡にしたモノＳ　ＦＰＬＣカラムに装
填した。

結合したタンパク質を０〜０．３ＭＮａＣ１から１０ｍ
Ｍ　ＮＩＥＳ、　ｐＨ５，３までの直線勾配で４°に於
て分画した。流速は０．６Ｍ１／分とした。阻害活性は
約０、１７Ｍ　ＮａＣ１で１本のピークとして溶離した
。

プールした活性を水中０．１％（ｖ／ｖ）　）リフルオ
ロ酢酸で平衡にしたＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムに直接装
填した。カラムを流速０．７ｍ／分で０．１％水性ＴＦ
Ａ中多相アセトニトリル勾配で室温に於て展開した。阻
害活性はアセトニトリル濃度１７％に於て１本のピーク
として溶離した。。揮発性物質を真空遠心分離によって
除去した後凍結乾燥した。

得られたタンパク質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動法、等電点分画電気泳動法、逆相ＨＰＬＣによ
る再クロマトグラフィ及びＮ末端配列決定法によって判
断した場合均質であった。我々がエキスタチンと名付け
た精製タンパク質の収量は出発物質１ｇから２．２■で
あった。

ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法我々はラエム
リ系の変法を使用した（ネイチュア、１９７０年、第２
２７巻、６８０〜６８５頁を引用する）。積み重ね、分
離ゲル（１，５ｍ）には８％、２０％ポリアクリルアミ
ドを各々含有した。尿素（８Ｍ）を分離ゲルに添加した
。ゲルを８５ボルトで１．５時間次に９０ボルトで１７
時間泳動させた。タンパク質をクーマシーブリリアント
プルーＲ−２５０染色によって検出した。

牟占　　　′°　法 セルパライトプレコート等電点分画電気泳動ゲルを使用
した。試料をＬＫＢウルトラフォア装置でＩＷの一定パ
ワ〒で泳動させた。ゲルをセルバブル−Ｗで染色した。

還元カルボキシメチル化エキスクチン エキスクチン（０，７５■プロテイン）を０．２８Ｍト
リス及び６．７Ｍグアニジン塩酸塩の容量０．６−の存
在下２０ｍＭ　ＤＴＴを用いて室温で１時間還元した。

次いでヨード酢酸（０，０６ｄ）を添加して最終濃度０
．１３６Ｍを得、室温で２０分間アルキル化した。還元
カルボキシメチル化エキスクチンをＣ１８逆相ＨＰＬＣ
により試薬から単離した。

エキスタチンのキモトリプシン開裂 エキスタチンをプロテアーゼに対する基質の比４０　：
　ｌ　　（ｗ／ｗ）でキモストリプシンで消化した。

加水分解反応を０．２Ｍ重炭酸アンモニウムｐＨ７，８
中３７℃で４時間行なった。次いで反応混合液を凍結乾
燥し、キモトリプシンペプチドを逆相ＨＰＬＣにより単
離した。

ヱｌム筐■舅犬定 精製エキスタチン及選択キモトリプシンフラグメントを
シークエンサーブログラムを使用してアプライドバイオ
システムス４７０Ａシークエンサ−（Ａｐｐｌｉｅｄ　
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４７０Ａ　５ｅｑｕｅｎｃｅｒ
）で自動タンパク質配列分析にかけ、試薬は製造業者に
より供給した。放出したアミノ酸誘導体をオンラインＨ
ＰＬＣ系助剤で同定した。

又Ｚバえ買火定 タンパク質はウシ血清アルブミンを標準として使用する
ローリ−等（ジェー、オブ、パイオル。

ケム、１９５１年、第１９３巻、２６５〜２７５頁を引
用する）の方法によって決定した。

エキスタチンをクロマトグラフィ３段階でエキスカリナ
ツスの凍結乾燥前の可溶性タンパク質から均質性に精製
した。粗毒液中の血小板凝集刺激活性の存在のために阻
害剤はこの両分で信頼できる検出ができなかった。しか
しながらセファデックスＧ−５０によりゲル濾過を行な
い阻害活性の１本のピークを観察した。この活性を更に
モノＳによるカオチン交換ＦＰＬＣ最後にＣ１８逆相）
ＩＰＬＣによって精製した。

凍結乾燥前１ｇは精製エキスタチン２．２■を生成した
。この物質は８Ｍ尿素の存在下ＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動及び等電点分画電気泳動によりシングル
バンドを示した。逆相ＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃによる再クロマ
トグラフィは１本の対称吸収度ピークを生じ、これは血
小板凝集阻害活性と正確に対応した。更にエキスタチン
製剤の均質性の確認は生の又は還元カルボキシメチル化
タンパク質のアミノ酸配列中に得た。最初のシークエン
サーサイクル中に観察されたアミノ酸残基だけがグルタ
ミン酸であった。

分ｍαと１１点 ８Ｍ尿素の存在下２０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
による電気泳動中還元エキスクチンの見掛けの分子量は
５．８００ダルトンだった。これはアミノ酸配列から計
算された数値と偵ている（以下参照）、非還元条件下タ
ンパク質は幾分ゆっ（りと移動し、見掛けの分子量７．
０００ダルトンに相当した。天然エキスタチンをヒドロ
キシエチルジスルフィドで処理した場合見掛けの分子量
はわずか約４，０００ダルトンであることは驚くべきこ
とであった。恐ら（は不完全誘導体から生じる小さい方
のバンドはヒドロキシエチルジスルフィド処理エキスタ
チンに見られた。

生の及びジスルフィド処理両エキスクチンはｐ１８．３
を示した。ジチオスレイトール処理時にｐ１８．３の主
バンドの他にｐ１７．５の副バンドを検出した。

７Ｓ／［１戊 還元カルボキシメチル化タンパク質の加水分解の２０時
間後に得たエキスタチンのアミノ酸組成を表Ｉに示す、
この分析によって得た組成を配列から予想したものと比
較した（以下参照）。これら２方法によって得られたほ
とんどの数値は密接に一致した。アミノ酸組成によって
見い出されたシステイニル残基の含有量（６，７’）は
配列によって予想したちの（８）より低かった。これは
エキスタチンの不完全カルボキメチル化によるものとす
ることができる。

システィン アスパラギン酸ｌ トレオニン セリン グルタミン酸２ プロリン グリシン アラニン メチオニン イソロイシン ロイシン チロシン フェニルアラニン ヒスチジン リシン アルギニン 全量 ６．５ ８．４ ２．８ １．２ ３．３ ４．２ ５．３ １．８ ０．６ １．０ １．１ １．０ １．０ １．２ ５．２ ４、１ ４８．７ １、数値はアスパラギンを含む。

２、数値はグルタミンを含む。

験管内血ノ　凝集に関するエキスタチンの作用血小板凝
集研究はエキスタチンが０．１　Ｍ■／−フィブリノー
ゲンの存在下ＡＤＴによって誘発されたヒトゲル濾過血
小板凝集の阻止に於てトリグラミンより有効であること
を示す（ＩＣ５゜−３０ｎＭ対１５０ｎＭ）。

エキスタチンはＡＤＰコラーゲン、血小板活性化因子又
はエピネフリンによって誘発されたヒト血小板凝集を投
与量３０〜３００ｎＭで阻害する。

ヒト血小板に富む血漿 正常なヒト志願者から静脈穿刺による血液を０、１容量
の３．８％クエン酸ナトリウムに取った。

血小板に富む血５１（ＰＲＰ）を４００ｘｇで１２分間
遠心分離により調製した。ＡＤＰコラーゲン血小板活性
化因子又はエピネフリンをＰＲＰに添加することによっ
て凝集を行ないシエンコ（Ｓｉｅｎｃｏ）アブレボメー
ターで測定した。

ヒトゲル゛′１、過血ハ手 正常なヒト志願者から静脈穿刺による血液を０．１容ｉ
１の酸−クエン酸塩−デキストロース（８５ｍＭクエン
酸ナトリウム、６４ｍＭクエン酸、１１０ｍＭデキスト
ロース）に取った。血小板に富む血漿を４００ｘｇｌＺ
分間遠心分離によって調製した。ＰＧＥ、（５μｇ／−
）を添加し、血小板を８００ｘｇで１２分間遠心分離に
よって集めた。

血小板沈降物をヒト血小板緩衝液（１４０ｍＭ　ＮａＣ
ｊ！、７．９ｍ？ＩＫ（Ｊ、３．２　ｍＭ　ＮａＪＰＯ
４，６ｍＭ　ＩＩＥＰＥｓ、　２％ウシ血清アルブミン
、０．１％デキストロース、ｐＨ７，２）に再懸濁し、
ヒト血小板緩衝液で予め平衡にしたセファロース２Ｂに
より濾過した。血小板を計数しヒト血小板緩衝液で２Ｘ
１０”／ｙｆｆｉに調整した。

１」ノ」訂吐剋 エキスタチンのアミノ酸配列を還元カルボキシメチル化
タンパク質の自動エドマン分解によって得た。タンパク
質はＮ末端グルタミン酸残基及びＣ末端トレオニンを有
する４９個のアミノ酸を有し上記で示されている。シス
ティンは８個の残基又はエキスタチンのアミノ酸合計の
１６％以上を包含する。配列は同じ結果で２回繰り返さ
れた。

生エキスクチンが配列される場合ＰＴ）Ｉ−アミノ酸ピ
ークはシークエンサーサイクル中に見られずシステイニ
ル残基が予想され更にこれらの残基に於てその指示を確
認した。これらのシステイニル残基のジスルフィド状態
はわからない。

更に還元カルボキシメチル化タンパク質から単離された
キモトリプトペプチドの分析により配列を確認した。

（）内の数値は配列により決定されたアミノ酸残基の数
である。

＾ｓｘ　　　　　１．３　（１）　　　　　　　　２．
７　（３）　　　　　　　　２．９　（３）Ｔｈｒ　　
　　　　　　　　　１．　Ｏ（１）　　　１．０　（１
）　　　１．０　（１）　　　１．４　（２）Ｓｅｔ　
　　　　１．１　（１） Ｇｌｕ　　　　　２．０　（２）　　　１．１　（１１
ｃｔｙ　　　　　１．２（１）　　　１．４（１）八１
ａ １１ｅ　　　　　　　　　　　Ｏ，６（１）Ｌｅｕ　　
　　　　　　　　　Ｏ，９（１）１ｓ Ｐｈｅ　　　Ｏ，９（１） Ｌｙｓ　　　１．Ｈｌ）　　１．９（２）Ａｒｇ　　　
　１．２（１）　　０．７（１）Ｐｒｏ　　　１．３　
（１） １、９　（１）　　　１．２　（１）　　　２．２　（
２）１、０　（１）　　　０．８　（１） １、２　（１） １、３　（１） １、７　（１）　　　１．０（１）　　２．２　（２１
１、１（１１１，１（１） １、４　（２）　　　１．０　（１）　　　２．５　（
３）エキスタチンは血小板表面でグリコプロティン１１
ｂ／ｕｌａ複合体に結合する特定タンパク質に共通ずる
配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを残基２４〜２６に於て含
有する。この配列はフィブリノーゲン分子の推定血小板
結合部位の部分である。

エキスタチンは８Ｍ尿素の存在下ＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動中異常な動きを示した。

生タンパク質は見掛けの分子量７．０００ダルトンで移
動し、配列分析で得た５、　４００ダルトンの数値と比
較した。非還元条件下で連鎖内ジスルフィド結合を有す
るタンパク質は一般にＳＤＳの予想された量より結合せ
ず、一方還元前は連鎖内ジスルフィド結合のないタンパ
ク質で見られるレベルまでＳＤＳ結合を増大する（ピッ
トリバース等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　１９６８年第１
０９巻８２５〜８３０頁）、従ってＳＯＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動中還元エキスクチンの移動度増加は
このタンパク質が生コンホーメーションに１種以上の連
鎖内ジスルフィド結合を含むことを示唆する。

エキスタチンを８０ｍＭジチオトレイトールと室温で２
０分間処理して血小板凝集に対する阻害活性を完全に破
壊した。同様の条件で８０ｍＭヒドロキシエチルジスル
フィド処理して阻害活性を５０％下げた。これらの結果
はＳＤＳゲル電気泳動研究と同様に１種以上の連鎖内ジ
スルフィド結合が阻害活性に必要なエキスタチンのコン
ホーメーション維持に重要な役割を果すことを示唆する
。

１搬ｆｌｕ 実施例１で使用したタンパク質精製及び決定方法をアゲ
キストロトンとスジポルス毒液に存在する血小板凝集阻
害剤を分離精製するために使用した。アミノ酸配列を上
記で同定しているこのタンパク質は血小板凝集阻害剤の
特徴を示した。

爽立皿主 実施例１で使用したタンパク質精製及び決定方法をビチ
スアリエタンス毒液に存在する血小板凝集阻害剤を分離
同定するために使用した。アミノ酸配列を上記で同定し
ているこのタンパク質は血小板凝集阻害剤の特徴を示し
た。

叉隻燃工 実施例１で使用したタンパク質精製及び決定方法をビチ
スアリエタンス毒液に存在する第２の血小板凝集阻害剤
を分離同定するために使用した。

アミノ酸配列を上記で同定しているこのタンパク質は血
小板凝集阻害剤の特徴を示した。

尖践週ｌ 実施例１で使用したタンパク質精製及び決定方法をビチ
スアリエタンス毒液に存在する第３の血小板凝集阻害剤
を分離同定するために使用した。

アミノ酸配列を上記で同定しているこのタンパク質は血
小板凝集阻害剤の特徴を示した。

去施■工 実施例１で使用したタンパク質精製及び決定方法をエリ
ストコフィスマクマホニイ毒液に存在する血小板凝集阻
害剤を分離同定するために使用した。アミノ酸配列を上
記で同定しているこのタンパク質は血小板凝集阻害剤の
特徴を示した。

本発明により式Ｉの範囲内の種々のポリペプチドを化学
均質性に精製して分子のアミノ酸配列が可能になった。

式■に示されるアミノ酸配列に基づき、開示されている
アミノ酸配列に相当する合成遺伝子を有利に製造するこ
とができこの遺伝子を適当なりローニングベクターによ
って適当な宿主に有利に導入することができる。他方、
自然遺伝子を毒液産生細胞から得、次に組換え、クロー
ニングによって純粋なポリペプチドを製造することがで
きることが企図される。従って発明の範囲は本明細書で
開示されたクロマトグラフィ操作を行なうことにより単
離されたポリペプチド又は式■の範囲内にあるポリペプ
チドに限定されるばかりでなく遺伝子工学手法によって
製造することができるポリペプチドを包含することは理
解される。

酵素及びＤＮＡ分子量マーカーは全てニューイングラン
ドバイオラブズ（Ｂｉｏｌａｂｓ）から入手した。

ジデオキシＤＮＡ配列装置は米国バイオケミカルコーポ
レーション社から購入した。コンピテントＥ、ｃｏｌｉ
、　Ｊｍ　１０９はストラタジェン（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）から購入した。他の試薬は全て分析用又は電気泳
動グレードである。

全てのオリゴデオキシヌクレオチドをメチルホスホルア
ミダイトを使用してアブライドバイオシステムス３ＢＯ
ＢＤＮＡシンセサイザーにより合成した。濃アンモニア
で脱保護した後、オリゴデオキシヌクレオチドをファー
マシアＮＡＰ−１０ゲル濾過カラムにより脱塩した。

両鎖の５′末端に延びている２個のオリゴデオキシヌク
レオチドを除いて全てのオリゴデオキシヌクレオチドを
ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによってホス
ホリル化した。キナーゼ化相補性オリゴデオキシヌクレ
オチドを９５°Ｃに加熱した後、室温に徐冷することに
よってアニーリングした。３つの２本鎖の連結反応は各
２本鎖０．５ナノモル、５０ｍＭ）リス−１１Ｃｊ２、
ｐＨ７，８，１０ｍＷ　ｋ’１ｇｃｌｚ　、２０ｍＭジ
チオトレイトール、１ｓＭ　ＡＴＰ、　５０μｇ／ｒｒ
ｄｌウシ血清アルブミン及びＴ４ＤＮＡリガーゼ４，０
００単位を含む反応混合液全量１３０μ２中１４°Ｃで
１５時間行なった。

連結混合液を１０％生ポリアクリルアミドゲル電気泳動
によって分画した。集合した１ｅｕ２Ｂ−エキスタチン
遺伝子をポリアクリルアミドゲルからカットし、電気溶
離した。溶離した１ｅｕ２Ｂ−エキスタチン遺伝子をキ
ナーゼ化しフェノール／クロロホルムによって抽出し、
エタールで沈殿させた後発現ベクターに挿入した。

ＪＣ２６４ベクターの構成 ＣｈｅＢ遺伝子３’−４３６ｂｐ及びＣｈｅＹ遺伝子５
′−２６３ｂｐ（マツムラ等、Ｊ、Ｂａｃｔ、第１６０
巻（１９８４年）３６〜４１頁）を含むｐＬＣｌ−２８
の旧ｎｄＩ［［−Ｐｓｔｌフラグメント７１４ｂｐ（Ｂ
、ＢａｃｈＩＩＩａｎｎ、Ｅ、ｃｏｌｉジエネテインク
ストックセンターから得た）をｐ　ＵＣ１３Ｈｉｎｄｌ
ｌ及びＰｓｔＩ部位にクローンした。ＣｈｅＹ遺伝子に
隣接したｐＵｃ１３のポリリンカー配列に於ける特有の
ＥｃｏＲＩを移動するためにＰｓｔＩとＥｃｏＲＩ部位
間のポリリンカー配列を欠失した。生じた発現ベクター
１）ＪＣ２６４はＣｈｅＹ遺伝子と融合する興味ある遺
伝子である特有のＥｃｏＲＩ部位を含む（第２図）。

別の目的のためにｐＵｃ１３及びＣｈｅＢ遺伝子を連結
する旧ｎｄＩ［［部位はＥ、ｃｏｌｉ　Ｄ　Ｎ　Ａポリ
メラーゼ■のフレノウフラグメントを挿入し合成りａｍ
ＨＩリンカ−と連結させることによってＢａｗ＋旧に変
換した。

合成組換え体１ｅｕ２Ｂ−エキスクチン遺伝子を以下の
条件下５０ｍＭ）リス−〇ｅＩｌ、　ｐＨ７，８，１０
ｍＭ　ＭｇＣｊ！ｚ　、　２０ｎ＋Ｍジチオスレイトー
ル、１ｎ＋Ｍ　ＡＴＰ、　５０Ｍｇ／−ウシ血清アルブ
ミン及びＴ４ＤＮＡリガーゼ８００単位全量２　Ｑ　ｐ
　（ｌテ０、１　／ｊ　ｇ　ｔＥｃｏＲＩカットｐＪＣ
２６４と上記で調製した合成１ｅｕ２８−エキスタチン
遺伝子の３分の１を結紮することによってｐＪＣ２６４
のＩ！ｃｏＲＩに挿入した（第１図）。結紮は１４℃で
１５時間行なった。

容　　　　の　　　転　　び　　　クローンの標準条件
下でＪＭ１０９コンピテント細胞５０ｄを形質転換する
ために挿入したｒ−１ｅｕ２Ｂ−エキスタチン遺伝子（
７μｌ）を含むｐ　Ｊ　Ｃ２６４発現ベクターの３分の
１を使用した。ｒ　−１ｅｕ　２Ｂ−エキスタチン遺伝
子を含むクローンを制限マツピングによって選択した。

エキスタチンのコーディング配列の存在をジデオキシ配
列分析によって検定した。

細胞　　　び融入タンパク　降　の 培養菌に一夜種培養（１％ｖ／ｖ）を接種し、アンピシ
リン／１１１１１００μｇを含むＬＢ培地で生育した。

細胞密度がＯＤ６００表示０．２〜０．３に達した時Ｉ
　ＰＴＧを添加し最終濃度１ｍＭを得た。別に１０時間
生育させた後、遠心分離によって細胞を回収した。培養
液３０００ｄからの細胞沈降物を最終容量５０Ｍ＆まで
水に懸濁し、フィシャーソニックディスメンプレークー
、モデル３００を使用し、最大パワーで大きなチップを
用い４℃で１０分間超音波処理した。超音波処理した混
合液を２０．０００ｇで１５分間遠心分離した。沈降物
を水Ｂｙｔｒｘに再懸濁し１５ｍＭ）リス−１１Ｃｆｆ
ｉ　、　ｐＨ７，４及び０．１５Ｍ　ＮａＣ１中５０中
入０ロースに重ねて層にした。６℃に於てＳＷ２８ベッ
クマンローター中１３．０００ｒｐｎ＋で３０分間遠心
分離して不溶性ｃｈｅＹ−Ｌｅｕ　２８−エキスタチン
融合タンパク賞を含む沈降物を水６ｍに再懸濁した。

融合タンパク質の　断 培養液１０００−からの融合タンパク質含有沈降物を７
０％ギ酸中６０ｍＭ臭化シアノジエン全１１３−で切断
した。反応を室温で１５時間続けた。試薬を広範囲透析
により除去し凍結乾燥した。

切断した融合タンパク質をまず８Ｍグアニジン−ＨＣｆ
で６０℃に於て５分間変性した後、０．３５Ｍトリス−
塩基及び６Ｍグアニジン−ＨＣｌの存在下０．１５Ｍジ
チオトレイトールで室温に於て１０分間還元した。還元
した１ｅｕ２８−エキスタチンをＣ１８逆相ＨＰＬＣで
０．１％トリフルオロ酢酸の存在下０〜６５％アセトニ
トリル勾配を用いて精製した。）（ＰＬＣ精製ｒ−１ｅ
ｕ２Ｂ−エキスタチンをタンパク質濃度０．２■／ＩＩ
ｄで０．１Ｍ酢酸アンモニウム中で酸化的に再び折りた
たんだ。再び折りたたむ反応を１２時間毎に１回渦混合
しながら室温で７２時間続けた。

嵐土板員集抜足 血小板凝集を光透過の増加により測定した。簡単に言え
ばゲル濾過ヒト血小板（２ｘ１０＠細胞／−）、フィブ
リノーゲン（１００μｇ／−）及びＣａ”　（１ｍＭ）
を含む反応混合液にｒ　−１ｅｕ２８−エキスタチンを
添加した。ＡＤＰ　（最終濃度１０μＭ）を他の成分を
添加した１分後に添加して血小板凝集を開始した。凝集
の割合又は程度はエキスタチン不在下で得られる最大光
透過の百分率として表わした。

Ｅ、Ｃｏ１１　（プラスミドｐＪｃ２６４−エキスクチ
ン潜在）Ｗ／ＩＰＴＧを導入 細胞回収 細胞溶解 遠心分離 融合タンパク質沈降物 臭化シアノジエン ＣｎＢｒｎＢｒ切断融合タンバク物 変性（グアニジン−ＨＣｌ１） 還元（ジチオトレイトール） 完全還元切断融合タンパク質沈降物 Ｃ１８逆相）（ＰＬＯ 完全還元ｒ−１ｅｕ２８−エキスクチン再酸化／再折り
たたみ Ｃ１８逆相ＨＰＬＣ 精製酸化ｒ−１ｅｕ２＄−エキスクチン八　゛　云　の
配置　び構成 生エキスクチンはｐｌＢ、３を有する４９個のアミノ酸
残基の１本鎖ポリペプチドである。合成ｒｌｅｕ２８−
エキスクチン遺伝子を配列し、Ｅ、ｃｏｌｉＣｈｅＹ遺
伝子と融合した。ヘビ毒の他の種類から単離した血小板
凝集阻害剤の一次構造は、メチオニン２８がこの阻害剤
系に保存されたアミノ酸でないことを表わしている。（
Ｈｕａｎｇ等、（１９８７年）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、第２６２巻、１６１５７〜１６１６３頁）。

従ってエキスタチンのメチオニン２８はロイシンに置き
換えられメチオニンはＣｈｅＹタンパク質と組換え体−
１ｅｕ２８−エキスタチンの間に挿入されて臭化シアノ
ジエン切断部位を生じる（第１図）。

２つのＥｃｏＲＩ付着端は発現ベクターに連結させるた
めに側端に示した。３′〜側端ＥｃｏＲ１部位のすぐ前
の停止コドンを挿入した。合成ｒ−１ｅｕ２Ｂ−エキス
クチン遺伝子を連結部位にＫｐｎｌ及びＡｖａＩ制限部
位を含む３つの二本鎖フラグメントから組立てた。制限
部位を故意に創製する場合を除いて好ましいＥ、ｃｏｌ
ｉコドンを構造遺伝子に使用した。

構成された遺伝子を制限マツピング及びＤＮＡ配列分析
によって検定した。

衾里さλｌ二皇盪底 Ｅ、ｃｏｌｉ中でｒ−１ｅｕ２８−エキスタチンを発現
させるために発現ベクターｐ　ＪＣ２６４を使用した。

ベクター（第２図）は前にＥ、ｃｏｌｉで豊富に安定し
て発現されることを示したＥ、ｃｏｌｉ　ＣｈｅＹタン
パク質のアミノ末端８８アミノ酸をエンコードする遺伝
子を含有する（マツムラ等（１９８４年）Ｊ、Ｂａｃｔ
、第１６０巻、３６〜４１頁）。このベクターに於ける
ＣｈｅＹ遺伝子発現はｐＵｃ１３からのｔ！、ｃｏｌｉ
　ｌａｃプロモーター−オペレーターによって制御され
る（Ｍｅｓｓｉｎｇ、メソッズインエンチモロジー、Ｗ
ｕ等出版アカデミツクプレス、ニューヨーク、第１０１
巻、２０〜７８頁（１９８３年））。

ｐＪＣ２６４中ＣｈｅＹ遺伝子に続く、特有のＰｓｔＩ
及びＥｃｏＲ１部位は新しい未決定の読み取り枠のクロ
ーニング及びＣｈｅＹ融合タンパク質として誘導される
発現を促進する。合成ｒ−１ｅｕ２Ｂ−エキスタチン遺
伝子をｐＪＣ２６４のＢｃｏＲ１０部位に挿入した。Ｃ
ｈｅＹ−エキスタチン発現ベクターの構造を第２図に示
す。

このベクターは存在する発現系でいくつかの利点を有す
る。　ＣｈｅＹ融合はしばしば高レベルで発現される（
以下参照、ベイレイ等（１９８７年）ジュー。インダス
ト、マイクロ、　（Ｊ、Ｉｎｄｕｓｔ、Ｍｉｃｒｏ、）
第２巻、４７〜５２頁）。ベクターは高コピー数プラス
ミドｐＵｃ１３から誘導され（メシング。

メソッズインエンチモロジー、ら等出版アカデミツクプ
レス、ニューヨーク、第１０１巻（１９８３年）、２０
〜７８頁）、有効な複製は観察される高レベルの発現に
寄与することができる。ＣｈｅＹ融合タンパク質はしば
しば不溶性封入体として見い出される。この不溶性は融
合タンパク質の精製に利用することができる。タンパク
質の不溶性はまた細胞内プロテアーゼによる分解を防止
することができる。ＣｈｅＹが小さなサイズであるため
、興味あるタンパク質の重量比は大量に更に一般的に使
用されるβ−ガラクトシダーゼへの融合によって達成さ
れるよりも高い、結局ＣｈｅＹタンパク質巾システイン
残基の欠如は融合タンパク質に於て穏当でないジスルフ
ィド結合生成の保有する問題点を回避する。

え　−１ｅｕ２８−エキスタチンの Ｂ、ｃｏｌｉＪ　Ｍ　１０９中組換え体−１ｅｕ２Ｂ−
エキスタチンの発現は前述のようにＩ　ＰＴＧにより誘
発される。誘発後種々の時間に発現生成物を１４％ＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。

誘発２時間後、ＣｈｅＹ−エキスタチン融合タンパク質
の予想された分子量のポリペプチド（１４，５ｋＤａ）
が全細胞溶解物中で検出された（第３図）。誘発６時間
後、全細胞タンパク質の少なくとも２０％を占める最大
レベルまでこのタンパク質をためた。細胞を超音波処理
した後、発現タンパク質は不溶性であり封入体が発現中
に生成したことを示唆している。超音波処理沈降物を組
換え体−１ｅｕ２８−エキスタチンの分離のために臭化
シアノジエン開裂に委ねた。

え　−１ｅｕ２８−エキス　チンの　　　び生 臭化シアノジエン切断タンパク質を精製前に６Ｍグアニ
ジン−ＨＣｌの存在下で過剰のジチオトレイトールによ
って還元した。逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃによる還元タンパク質
の分画は還元性エキスタチンと同じ保持時間を有してい
るピークを表わした（第４Ａ及びＢ図）。このピークか
らタンパク質のアミノ酸配列分析は９０％以上の純度で
組換え体−１ｅｕ２８−エキスタチンを含んでいること
を示した。

還元エキスタチンがＨＰＬＣ中の０．１％トリフルオロ
酢酸（約ｐＨ２）中にあるため、組換え体−１ｅｕ２８
−エキスタチン内のチオール−ジスルフィド交換反応は
非常に緩慢であることが予想される。

従って凍結乾燥エキスタチンは、変性及び還元せずに０
．１Ｍ酢酸アンモニウムの存在下で直接再び折りたため
られた。不活性タンパク質の再変性はチオール／ジスル
フィド混合物を再生溶液に添加することによって促進す
ることが提案されている（タム等、ネイチュア第３０９
巻（１９８４年）３７６〜３７８頁）、我々は、６Ｍグ
アニジン−ＨＣｌの存在下０．５ｍＭジチオトレイトー
ルと１ｍＭ酸化ジチオトレイトールで組換え体−１ｅｕ
２８−エキスタチンを再生した。しかしながら再び折り
たたまれたエキスタチンの収量はかかる条件下で増加し
なかった。正しく折りたたまれたエキスタチンを逆相Ｈ
Ｐ　Ｌ　Ｃによって折りたたまれていないものから分離
した。第４Ｃ図に示されるＨＰＬＣプロフィルは、３０
％以上の還元エキスタチンが一定の条件下で正しく折り
重ねられていることを示した。精製操作によって得られ
た正しく折りたたまれた純粋なエキスタチンの量は、細
胞培養１１当り約１．５■と予想される０組換え体−１
ｅｕ　２Ｂエキスクチンを生エキスクチンよりわずかに
高い濃度のアセトニトリルでＣＩ８カラムから溶離した
（第４０及び４Ｄ図）、これは生エキスクチンのメチオ
ニン２８を組換え体−１ｅｕ２８−エキスタチンではロ
イシンに置き換えている結果であることができる。組換
え体−１ｅｕ２Ｂ−エキスタチンのＮ末端アミノ酸配列
は自動エドマン分解によって決定した。Ｎ末端から残基
３２までの配列は残基２８に於てロイシンのメチオニン
置換以外生のものと一致していることがわかった。

組　え　−１ｅｕ２Ｂ−エキスタチンの止紐換え体−１
ｅｕ２８−と化エキスタチンの生物活性の比較を第５図
に示す。エキスタチンによる血小板凝集の阻害をＡＤＴ
を添加した後ヒトフィブリノーゲン及びＣａＣｌ　ｚの
存在下で測定した。

生エキスクチンと同様に組換え体タンパク質はＡＤＴ添
加後の光透過の最初の減少に影響せず（第５図）阻害剤
が血小板活性化に影響しなかったことを示唆している０
組換え体−１ｅｕ２８−エキスタチン及び生エキスクチ
ンは凝集の割合あるいは程度として測定した同じＩＣ，
。で血小板′ａ集を阻害した（第５Ｂ図）。従って組換
え体−１ｅｕ２８−エキスタチンは血小板凝集に影響す
る能力に於て、生エキスクチンと一致すると思われる。

結果は生エキスクチン内の２８位に於けるメチオニンの
存在がこの血小板凝集阻害剤の穏当な折りたたみ及び生
物活性に必須でないことを示唆する。

組み換え体ＤＮＡ技術の使用で、結果として生じる１個
又は複数のアミノ酸置換、欠失、付加又は復位例えば隠
れたＤＮＡの部位が指定された突然変異によって様々に
変性された誘導体ポリペプチドの製造に可能性が存在す
る。誘導体ポリペプチドを生じるかかる対立遺伝子の変
異及び変性の全ては実質的な特徴ある血小板凝集阻害活
性が本質的に影響しないものであれば本発明の範囲内に
包含される。ポリペプチドは（１）最初のアミノ酸とし
てメチオニンを有して（構造遺伝子の前にＡＴＧ開始シ
グナルコドン挿入によって存在する）又は（２）メチオ
ニンを細胞内又は外で切断する場合通常の最初のアミノ
酸を有して又は（３）シグナルポリペプチド又は結合体
が細胞内又は外の環境で特異的に切断することができる
シグナルペプチドあるいは通常のシグナルペプチド以外
の結合タンパク質と一緒に（英国特許出願公告番号第２
．００７，６７６Ａ号）又は（４）異質な余分のポリペ
プチドと離して切断する必要がなく成熟形態の直接発現
によって製造される。後者は特に重要であり一定の宿主
はシグナルペプチドを除去することが全く又は有効にで
きず、発現伝播体はシグナルペプチドと共にタンパク質
を発現することになる。いずれにしてもこうして製造さ
れた種々の形態の血小板凝集阻害剤を回収し、種々の血
管症状又は疾患の治療に使用するのに適合するレベルに
精製される。

工Ｉの合成ポリペプチド 本発明のポリペプチドはメリフィールド、ジェー、アム
、ケム、ツク、　（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ、＾１１
．ｃｈｅａ＋。

Ｓｏｃ、）　、第８５巻、２１４９頁（１９６４年）に
記載されるような固相合成を使用して製造することがで
きるがホウテン（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ）、ブロク、ナトル
、アカド、サイ、第８２巻、５１３２頁（１９８５年）
の合成のような当業界で既知の他の相当する化学合成も
使用することができる。固和合或はリビア−（Ｒｉｖｉ
ｅｒ）等に１９８２年１月２１日登録された米国特許第
４．２４４，９４６号に一般に言及されるように保護ア
ミノ酸を適当な樹脂に結合することによってペプチドの
Ｃ末端から始められこの開示を本明細書に引用する。こ
の一般タイブの合成の具体例は米国特許第４．３０５．
８７２号及び同第４．３１６．８９１号に言及される。

、４１残基ポリペプチドの固相合成の検討はＶａｌｅ等
による論文、サイエンス、第２１３巻、１３９４〜１３
９７頁（１９８１年９月）に言及され、これは合成の更
に詳細な検討に関係するマーク（Ｍａｒｋｅ）等による
ジェー、アム、ケム、ツク、第１０３巻、３１７８頁（
１９８１年）の論文に出ている。

ポリペプチドを合成するには適当に保護されたα−アミ
ノ基を有するカルボキシル末端アミノ酸をクロロメチル
化ポリスチレン樹脂などに結合する。塩化メチレン中ト
リフルオロ酢酸を使用するようにα−アミノ酸保護基を
除去した後火の合成工程に移す。特定のアミノ保ａｔ基
を除去するために他の標準切断試薬及び条件を公開され
た文献に記載されるように使用することができる。

次いで残存するα−アミノ−及び側鎖保護アミノ酸は、
樹脂に結合した中間体化合物を得るために所望の順序で
段階的に結合される。各アミノ酸を別々に添加する合成
に代わるものとして伸長する固相鎖に添加する前にいく
つかを互に結合してもよい。適当な結合試薬の選択は当
業界の範囲内にある。

種々のアミノ酸部分の不安定な側鎖基を連鎖が完全に組
立られた後この基を厳密に除去するまで適当な保護基で
保護することはペプチドの化学合成に共通である。また
アミノ酸はフラグメントのα−アミノ基を保護すること
も共通であるが、方この部分はカルボキシル基に於て反
応し、この位置で次の反応を起こさせるためにα−アミ
ノ−保護基を選択除去する。従って合成１工程として側
鎖保護基を有する種々の残基を持つペプチド鎖中所望の
配列にあるアミノ酸残基の各々を包含する中間体化合物
を生成することが共通である。次いでこれらの保護基は
精製後生じた所望の生成物を製造すると実質的に同時に
除去されるのが一般的である。

所望のアミノ酸配列が完了した後中間体ペプチドは樹脂
からペプチドを切断するばかりでなく残りの側鎖保護基
を全て切断する液体ＨＦのような試薬で処理して樹脂支
持体から除去する。次いでポリペプチドをリビアー等ペ
プチド・ストラクチュアアンドバイオロジカルファンク
ション（１９７９年）１２５〜１２８真に記載されるよ
うにゲル透過後半分取用ＨＰＬＣによって精製すること
ができる。少なくとも９３％又はこれ以上の純度（存在
する全ペプチドに基づく）がかなり得ることができ、臨
床試験及び／又は用途に好ましい。純度９８％が実用的
であるが、ある種の試験管内適用に対しては低い純度も
使用することができる。従ってポリペプチドはこの応用
に対して存在する全ペプチドに基づき少なくとも約５０
重量％を意味する実質的に純粋な形態にある場合有用と
みなされる。

本発明の種々のポリペプチドの具体例及び合成方法を以
下に示す。

叉施桝斐 アプライドバイオシステムス４３０Ａ　（ＡＢ　Ｉ）ペ
プチドシンセサイザーによる合成に必要とされるＢｏｃ
−０−ベンジルトレオニン−ｐＡＭｍＭｕ、Ｂｏｃ保護
アミノ酸及び他の全ての試薬を製造業者から入手した。

側鎖保護Ａｓｐ、Ｇｌｕ及び旧Ｓはバケム社で供給され
た。溶媒ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及び塩化メチ
レン（ｃ１１□ＣＺＺ）をプルデイック及びジャクマン
から入手した。ジチオトレイトール（ＤＴＴ）はベテス
ダｌ？ｅｓ、Ｌａｂｓ、から購入した。ジチオエリスリ
トール（ＤＴＴ）はケミカルダイナミックスから入手し
た。ｐ−クレゾール及びｐ−チオクレゾールをアルドリ
ッヒケミカル社から入手した。

王４λ３蓋Ｌ４色戊 ０．５０ｍＭ　（０，６９ｇ）のＢｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚ
ｌ）０−Ｐａｍ−樹脂（０，７２ｍＭのＴｈｒ／ｇの樹
脂で置換）で開始する合成をＡＢＩ自動ペプチドシンセ
サイザーを使用して段階的方法で行なった。ケント及び
クラーク−ルイス（１９８５）シンセティックペプチド
スインバイオロジーアンドメディシン、Ｐｒｏｃ。

ラブシステムスＲｅｓ、Ｓｙｍｐ、ｋＨ集アリタロ等、
エルセビエル、オランダ２９〜５７頁。アミノ酸を製造
業者が予め充填したカートリッジ（各々２ｍＭ）を使用
して導入した。側鎖保護はＡｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ（
ＯｃＨｘ）、Ｃｙｓ　（Ｍｅｂ）、Ｇｌｕ　（ＯｃＨｘ
）　、ｌ１ｉｓ　（ＢｏｆｌＩ）、Ｌｙｓ（Ｚ（ｃｊ？
）　　）　、　　５ｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）
、Ｔｙｒ　（Ｚ（Ｂｒ））、（Ｔｏｓ　ｓ　　）シル、
　ＣＨＸ　、シクロ−ヘキシル、Ｍｅｂ　％４−メチル
ベンジル、Ｚ（ｃＩ）　、２−クロロベンジルオキシカ
ルボニル、　Ｂｏｗベンジルオキシメチル、Ｂｚｌ、ベ
ンジル、Ｚ　（Ｂｒ）、２−ブロモベンジルオキシカル
ボニル〕である。対称無水物との二重カップリング（ｃ
Ｈ，Ｃｌ　、中で行なった後ＤＭＦと溶媒交換）をＡｒ
ｇ　（Ｔｏｓ）、Ａｓｎ及び旧ｓ　（Ｂｏｗ）を除く全
てのＢｏｃ保護アミノ酸に対して使用し、ＤＭＦ中ヒ中
口ドロキシベンゾトリアゾールエステル重カップリング
プロトコールで使用した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）
脱閉塞中　Ｃｙｓ及びＮｅｔの望ましくない酸触媒酸化
に対して保護するために（Ｄｒａｐｅｒ等、（１９７３
年）Ｊ、Ｍｅｄ、　Ｃｈｅｗ、第１６巻、１３２６〜１
３２９頁）、０．１％（鍔ｔ／ｖ）ＤＴＥをスカベンジ
ャーとして添加した。Ｎ−末端Ｇｌｕのカップリングに
続き、ＴＦＡを使用してＢｏｃ基を除去し、ペプチドを
乾燥した。Ｎ末端脱閉塞ペプチド−樹脂の最終重量は４
．１５　ｇであった。

ＨＦ開裂及び酸化 組立てられたペプチド−樹脂（２，０ｇ）をＨＦ装置（
ペニヌスラＬａｂｓ、　Ｉｎｃ、　Ｉ　Ｂ型）で１　：
　１　（ｖ：ｖ）のｐ−チオクレゾール／ｐ−クレゾー
ル３−の混合液に懸濁した。この系を機械的真空ポンプ
で排気し、ＨＦを液体窒素冷却を使用して凝縮した（３
０ｄ）。０〜５℃で１１７２時間撹拌した後、反応混合
液を液体窒素トラップを使用して真空中で蒸発させた（
２０〜３０分）。残留物をエーテルで粉砕し、濾過し、
更にエーテルで３回洗浄した。濾過した残留物を直ちに
希酢酸の撹拌溶液（０，４％／１ｌｚＯ）４４！に移し
た。数分間撹拌した後、混合液を水酸化アンモニウムｐ
Ｈ８，０に調整した。

濾過を行ない樹脂を除去して粗酸化生成物を５℃（１８
時間）で撹拌せずに次に室温（１９〜２０℃）で３日間
維持した。分析用ＨＰ　Ｌ　Ｃを使用して酸化の進行を
監視した。エルマン定性試験（ｔｌａｂｅｅｂ、メソッ
ズインエンチモロジ−（１９７２年）、編集ハース及び
チアシェフ、アカデミツクプレスニューヨーク４５７〜
４６４頁）を使用してスルフヒドリル遊離基の消失を監
視した後精製を続けた。この試験をｌ　ｍｌ試料で行な
い、残留ｐ−チオクレゾールを除去するために凍結乾燥
した。

粗酸化エキスタチンのネ製 粗酸化溶液（４１）を酢酸（１０ｄ）を添加して酸性に
し、Ｃ１８−シリカ（５Ｘ　３０ｃｍ、１５ｍ、３ＱＯ
Ａ）カートリッジ（ウォーターズアソシエーテス）に直
接注入した。生成物を分取用ＨＰＬＣ（セパレーション
ズテクノロジー社）を使用して精製した。段階勾配（１
００ｍｊ！加量）を移動相の連続増加濃縮物の各々１７
！から生成した。

流速７０Ｗ１１／分を使用して生成物を溶離した。

ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ　Ｃ１８，２１８ＴＰ　５
４１５）で定量した均質（〉９５％）画分をプールし、
凍結乾燥して生成物７２■を得た。半純粋の生成物を生
成物ピークに対する肩のような極性の小さい方の成分と
混合した。更に生成物を上述した同じ方法で）（ＰＬＣ
に再び通過させて精製してエキスタチン（５４■）を生
成した。出発樹脂０．２５　ｍＭに基づき、この重量は
全体の４％収率を表わす。

均質性を分析用ＨＰ　Ｌ　Ｃで証明した０合成生成物と
生材料との同時注入は１本のピークを示した。

更に６ＮＨ（Ｊで加水分解した後のアミノ酸分解（表３
）及び自動エドマン分解（ＡＢＩ４７０Ａプロテインシ
ークエンサー）によって生成物を特徴付けた。

しｙＳ ｌｉｓ ｒｇ ５ｐ Ｔｈｒゝ ｅｒｂ ｌｕ 犬」− 合成エキスタチンのアミノ酸分析３ （括弧内の数字は理論値） ５、ＯＱ　（５）　　ｃｔｙ １．００　（１）　　Ａｌａ ３．８７　（４）　　Ｃｙｓ’ ８．１３　（８）　　Ｎｅｔ’ ２．９９　（３）　　Ｌｅｕ １．０４　（１）　　Ｐｈｅ ３．０７　（３）　　Ｔｙｒ ５．０３ ２．１０ ７．６７ ０．８４ ０．９８ ０．９５ １．００ ３６ＮＨＣｊ２と１００℃で７０時間加水分解した後ｂ
　加水分解中分解のため補正 Ｃ補正せず ｄ　過ギ酸酸化後システィン酸として定量最高１．９％
予告（ｐｒｅｖｉｅｗ）が観察された。また第１工程か
らのＰ　Ｔ　［１アミノ酸の高収量はＣ末端Ｇｌｕのピ
ローＧｌｕへの環化が起らなかったことを証明した。

合成エキスタチンの還元及び再折りたたみ合成エキスタ
チン（０，５０■）を０．０７Ｍ　ｐＨ８，０酢酸アン
モニウム（１０ｍＭ　ＤＴＴ）　　１　ｄに溶解し、還
元の過程を分析用ＨＰＬＣで処理した。１時間後、出発
物質は単独の還元生成物に量的に転化された。０．０７
　Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ８，０）（４Ｎ）に
対して直径１２ｍｍ、カットオフ分子量１０１００Ｏセ
ルロース管（スペクトルメジカル社）を使用する還元生
成物の透析（２４時間）はエキスタチンのみを生成した
。エキスタチンが再酸化の前に完全に還元された形態に
あることを示すために合成エキスタチンのＤＴＴ還元を
６Ｍグアニジン塩酸塩を存在させたほかは記載した通り
繰り返した。分析用ＨＰＬＣは還元生成物が同一時間を
有することを確認した。半分成用ＨＰＬＣ１次に定量エ
ルマン分析（ｌｉａｂｅｅｂ、同書）による還元エキス
タチンの分離は生成物がオクタヒドロ形態にあることを
示した。

皇Ｗ月九定 血小板凝集をクロノログアブレボメーター（ｃｈｒｏｎ
ｏｌｏｇ　ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒ）で３７℃に於て
測定した。反応混合液は洗浄血小板（２ｘ　１０”　／
ｍｔｔ＞、フィブリノーゲン（１００ｍｇ／　ｍｆｆ１
）　、Ｃａ”（１ｍＭ）及び試験する血小板凝集阻害剤
画分を含有した。

１０ｎ＋Ｍ　ＡＤＰを他の成分を添加した１分後に添加
して凝集を開始した。反応を少なくとも２分間続けた。

凝集の阻害程度は阻害剤を存在させずに観察した凝集速
度の百分率として表わした。合成エキスタチンは天然エ
キスタチンと区別できない化学及び生物特性を有する（
表４）。

紅 ヒト血小板凝集の阻害に関する天然エキスフチン及び合
成エキスタチンの作用 ＩＣｓ。（μＭ） ペプチド　　　　　」償皿ｌ界工ｌｈＬ生エキスクチン
　　　　０．０３２　（０，０２６−０，０３９）合成
エキスタチン　　　　０．０３３　（０，０２６−０，
０４１）ヒト血小板凝集率５０％（ＩＣｓ。）で阻害す
るのに必要なペプチドの濃度を２〜４人の志願者の血小
板を使用して定量した。各志願者に対して２回定量を行
なった。

大施桝エニｌ工 実施例８で記載したエキスタチン製造の一般合成操作に
従い、エキスタチンと同じ配列を有し、−最大１の範囲
内にある多数のペプチドを製造した。

紅 合成手段により製造したエキスタチン類似物及びヒト血
小板凝集に関する作用 ９ｐｈｅ２７−エキスタチン　、０１３　（，０１０−
，０１６）１１　　ｔｒｐ　２７−エキスタチン　、０
１７　（，０１４−，０１９）１３　１ｅｕ　２８−エ
キスタチン　、０３４　（，０２６−，０４３）１４　
　ｐｈｅ　２Ｂ−エキスタチン　、０３８　（，０２６
−，０５８）１８　　ｍｅｔ　ＳＯ２８−エキスタチ、
０８８　（，０３３−，１５４）ン ２０　　（１−３９）−エキス・タチン　、８００　（
，５８０−１，１）上記の略語は種々の合成ポリペプチ
ドを定義する。実施例９〜１５及び１８では配列位置を
置き換え、天然残基に置き換わる残基を示す（例えば実
施例９では天然エキスタチンに現われる２７位置の残基
ＡｓｐをＰｈｅに置き換える）。残基１〜２６及び２８
〜４９は天然エキスタチンと一致する。実施例１６．１
７．１９及び２０は、省略したカルボキシル末端に対す
る残基を有する配列である（例えば実施例２０では、残
基４２〜４９を省略した）。実施例１８のｍｅｔ　Ｓｏ
はメチオニンスルホキシドを表わす。

血遼１里比 本発明のポリペプチドをヒト又は哺乳類血小板凝集又は
付着の阻止が望まれるあらゆる状況で投与することがで
きる。

本発明のポリペプチドは速かに循環から除去され、短時
間有効な強力な抗血栓を必要とする状況で血小板凝集を
阻害するのに特に有用である。従って動脈及び器官の処
置及び／又は血小板と人工面との相互作用が血小板凝集
及び消費に導く末梢動脈（動脈移植、頚動脈内容除去）
に関係している外科及び心臓外科で有Ｆ性を見い出すこ
とができる。凝集した血小板は血栓及び血栓塞栓を形成
することができる。本発明のポリペプチドは血栓及び血
栓塞栓の形成を防止するためにこれらの外科の患者に投
与することができる。

体外循環は血液を酸素飽和するために心臓外科が日常的
に使用している。血小板は体外回路の表面に付着する。

付着は血小板膜のＧＰＩＩｂ／ｌ１ｌｂ間の相互作用に
依存し、フィブリノーゲンが回路の表面に吸着する。（
Ｇｌｕｓｚｋｏ等Ａｍｅｒ、Ｊ、Ｐｈｙｓｉｏｌ。

１９８７年、第２５２巻Ｈ１６１５〜６２１頁）。

人工表面から放出された血小板は凝血作用がそこなわれ
ている０本発明のポリペプチド（よ付着を防止するため
に投与することができる。

これらのペプチドの他の応用には血栓崩壊治療中及び治
療後の血小板血栓、血栓塞栓及び閉塞の予防、冠状及び
他の動脈の血管形成術後及び冠状動脈バイパス法後の血
小板血栓、血栓塞栓及び閉塞の予防を包含する。多くの
臨床センターではこれらの方法にかけられる患者は本発
明のポリペプチドと比較すると血小板凝集の弱い阻害剤
である抗血小板剤を既に受けている。また本発明は心筋
梗塞の予防に使用することができる。

これらのポリペプチドは、実質的す量で血流に供給する
ことになるいかなる便利な手段で投与してもよい。これ
らは血小板凝集を阻止するためにプラスミノーゲン活性
化因子又はストレプトキナーゼのような血栓崩壊剤と混
合することができる。

これらはまたヘパリン、アスピリン又はワルファリンの
ような抗凝固剤と混合することができる。

静脈投与は現在好ましい投与経路として企図される。こ
れらは水に可溶性であり従って溶液として効果的に投与
することができる。

１つの具体的な応用例では、エキスタチンの適量を血管
形成術を受ける心臓発作患者に静脈投与される。投与は
血管形成術中又は数分前にし、血小板凝集を十分阻止す
る量、例えば約０．０５〜２μＭの一定状態の濃度を得
る量である。患者がバイパス手術を受ける必要があるな
らば、エキスタチン投与は直ちに停止することができ投
与の中止後まで作用が持続するアスピリン又はモノクロ
ーナル抗体（例えば７Ｅ３、ゴールド等参照）°のよう
な他の物質によって引き起される手術中に複雑さが生じ
ない。

また本発明は組換え体１本鎖組織型プラスミノーゲン活
性化因子又はストレプトキナーゼ及び配列１１ｇＮ−（
ｃｈ）−Ｃｙｓ−Ｒ−Ｒ−Ｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ
−Ｒ−Ｒ−Ｒ−Ｒ−ＲＣｙｓ−（ｃｘ）−Ｈ（各Ｒは同
一あるいは異なり、あらゆるアミノ酸を表わす）を有す
るポリペプチドを包含している組成物を包含する。本発
明はまた組換え体１本鎖組織型プラスミノーゲン活性化
因子の用量及び配列ＨｚＮ−（ｃＭ）−Ｃｙｓ−Ｒ−Ｒ
−Ｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｒ−Ｒ−Ｒ−Ｒ−Ｒ−
Ｃｙｓ−（ｃｘ）−Ｈ（各Ｒは同一あるいは異なり、あ
らゆるアミノ酸を表わす）を有するポリペプチドの用量
を患者に投与することを特徴とする血栓崩壊を促進し、
再閉塞を予防する方法を包含する。

本発明は、その精神又は実質的な特質から逸脱すること
なく別の特定の形態で具体化することができる。従って
上述した特定の実施例は本発明の範囲を限定するものと
して解釈するべきではない。

【図面の簡単な説明】

第１図−組換え体−１ｅｕ２８−エキスタチンのヌクレ
オチド　びアミノ酸配 個々の合成オリゴデオキシヌクレオチドを実線で印をつ
け、括弧内に番号をつけた。Ｎ末端タンパク賞配列に於
て最初のアミノ酸、メチオニンを臭化シアノジエン切断
のために示した。タンパク質のＣ末端の停止コドンを＊
印で示した。　ＥｃｏＲ１部位は発現ベクターへの挿入
のために５′および３′両端に位置する。 第２図−ＪＣ２６４ベクターの　造 ｐＪＣ２６４発現ベクターの構成およびｒ−１ｅｕ２８
−エキスタチン遺伝子のベクターへの挿入は本発明の詳
細な説明で述べている。Ａ　ｐＪＣ２６４の構造ｐＵｃ
１３由来の配列は矢印で示される。 ｐＵｃ１３のＥ、ｃｏｌｉ　ｌａｃプロモーター−オペ
レーターはＣｈｅＢ遺伝子に続き、転写の方向は矢印で
示される。ＣｈｅＢ遺伝子（４５０ｂｐ）及びＣｈｅＹ
遺伝子（２６３ｂｐ）は各々２重線及び陰をつけたわ（
として示される。ｒ−１ｅｕ２Ｂ−エキスタチン遺伝子
が挿入されるＩ！ｃｏＲ１部位を示す。Ｂ、エンコード
したアミノ酸を示すＣｈｅＹ　Ｐｓｔ１部位とＥｃｏＲ
Ｉクローニング部位間のＤＮＡ配列 第３図−細菌産生の組換え体−１ｅｕ２Ｂ−エキスタチ
ン融合タンパク質のＳＤＳ　ＰＡＧＥ分析ｐＪＣ２６４
−エキスタチン発現ベクターを含むＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ
　１０９を１００μｇ／ｍｅアンピシリンを有するＬＢ
培地で生育した。細胞密度がＯＤ＆。。 表示０．２に達した時、Ｉ　ＰＴＧを培地に最終濃度１
ｍＭまで添加して発現の誘発を開始した。培養液のアリ
コートを取り、誘発後種々の時間でエッペンドルフ遠心
機で遠心分離した。沈降物を５０ｍＭ）リス−ＨＣｆ　
、、ｐＨ６，８，０，２％ＳＤＳ、７５ｍＭジチオトレ
イトール、１０％グリセロール及び０．０５％ブロムフ
ェノールブルーを含むＳＯＳ　ＰＡＧＥ試料緩衝液に懸
濁した。試料を１００°Ｃで１５分間加熱し、次にエッ
ペンドルフ遠心機にか番）た後、１４％ＳＤＳポリアク
リルアミド勾配ゲルに装填した。飽和した培養液（ＯＤ
、。。＝１．８）１００μｌに等量の溶解物をゲルで分
解した。タンパク質をクーマシーブルー染色によって検
出した。レーンＥ−Ｊ：培養液からの溶解物を各々０．
２時間、４時間、６時間及び１６時時間光した。レーン
Ｅ：誘発１６時間後約１５０μｌ培養液からの超音波処
理沈降物、レーン［）：ｒ−１ｅｕ２８−エキスタチン
遺伝子のない対照ｐＪＣ２６４発現ベクターで形質転換
した細胞の飽和壇養液１００μｌからの溶解物、レーン
Ｂ：生エキスタチン８μｇル−ンＣ：精製組換え体−１
ｅｕ２Ｂ−エキスクチン８μｇル−ンＡ：ファーマシア
低分子量マーカー（分子量は図面で示した）、レーンＫ
　：Ｂｉｏ−Ｒａｄ低分子量スタンダード、上部から下
部までの分子量は各々９２．５．６６．２．４５．０．
３１．０．２１．０及び１４．４ｋＤａに相当する。 第４図−組換え体−１ｅｕ２８−エキスタチンの精製の
ＨＰＬＣプロフィル及び生エキスクチンとの 精製及びＨＰＬＣ条件は、本発明の詳細な説明に記載さ
れる。Ａ：還元臭化シアノジエン切断混合物、Ｂ：臭化
シアノジエン切断混合物に使用した同じ条件で還元した
生エキスクチン、Ｃ：Ａからの精製組換え体−１ｅｕ２
８−エキスタチンの変性混合物、Ｄ：生エキスクチン、
パネルＡ及びＢの矢印は各々還元組換え体−１ｅｕ２８
−及び生エキスクチンを示す。折りたたまれた組換え体
用ｅｕ２８−エキスクチン及び生エキスクチンの位置を
各々パネルＣ及びＤの矢印で示す。 第５図−組換え体（ｒ−１ｅｕ２Ｂ−エキスタチン）及
び生（ｎ−エキスタチン）エキスフチンによる証　　凝
集比 血小板凝集の検定条件は、本発明の詳細な説明に記載さ
れる。Ａ：１．５μＭ、ｍ換え体−１ｅｕ　２８又は生
エキスクチンの不在下及び存在下で監視した。血小板の
形の変化を示す光透過に於て最初の減少が影響しなかっ
たことに注意。Ｂ：凝集の開始速度は精製組換え体（ｌ
ｅｕ　２Ｂ）　　（４角）エキスタチン及び生（円）エ
キスタチンの存在下でＡＤＰを添加した後測定した。 図面の浄書（内容に変更なし） 合　　成 エキスタチン 遺伝子 上部令 Ａ 」 分 ＦＩＧ、　５Ａ 手続補正書（方句 平成１年８月２３日 （１）別紙の通り。 （２）別紙の通り、 明細書 １通を提出致します。 正式図面１通を提出致します。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次のアミノ酸配列を有するポリペプチド。 【遺伝子配列があります】 （式中ＸはＨ又は少なくとも１個のアミノ酸であり、Ｙ
   はＯＨ又は少なくとも１個のアミノ酸であり各Ｒは同一
   かあるいは異なりあらゆるアミノ酸である。） ２、次のアミノ酸配列を有する請求項１記載のポリペプ
   チド。 【遺伝子配列があります】 （式中Ｃｈは少なくとも１個のアミノ酸を表わし、Ｃｘ
   は少なくとも１個のアミノ酸を表わし、各Ｒは同一かあ
   るいは異なりアミノ酸を表わす。） ３、次のアミノ酸配列を有する“エキスタチン”と呼ば
   れる請求項１記載の実質的に純粋なポリペプチド。 【遺伝子配列があります】 ４、次のアミノ酸配列を有する“アグキストロスタチン
   ”と呼ばれる請求項１記載の実質的に純粋なポリペプチ
   ド。 【遺伝子配列があります】 （式中Ｙ及びＲは請求項１と同じ意味である。）５、次
   の配列を有する“ビチスタチン１”と呼ばれる請求項１
   記載の実質的に純粋なポリペプチド。 【遺伝子配列があります】 ６、次の配列を有する“ビチスタチン２”と呼ばれる請
   求項１記載の実質的に純粋なポリペプチド。 【遺伝子配列があります】 ７、次の配列を有する“ビチスタチン３”と呼ばれる請
   求項１記載の実質的に純粋なポリペプチド。 【遺伝子配列があります】 ８、次のアミノ酸配列を有する“エリストスタチン”と
   呼ばれる請求項１記載の実質的に純粋なポリペプチド。 【遺伝子配列があります】 ９、次のアミノ酸配列を有する請求項１記載のポリペプ
   チド。 【遺伝子配列があります】 １０、次のアミノ酸配列を有する請求項１記載のポリペ
   プチド。 【遺伝子配列があります】 １１、次のアミノ酸配列を有する請求項１記載のポリペ
   プチド。 【遺伝子配列があります】 １２、次のアミノ酸配列を有する請求項１記載のポリペ
   プチド。 【遺伝子配列があります】 １３、次のアミノ酸配列を有する請求項１記載のポリペ
   プチド。 【遺伝子配列があります】 １４、次のアミノ酸配列を有する請求項１記載のポリペ
   プチド。 【遺伝子配列があります】 １５、次のアミノ酸配列を有する請求項１記載のポリペ
   プチド。 【遺伝子配列があります】 １６、哺乳類の血小板を請求項１記載のポリペプチドと
   インキューベートすることを特徴とする哺乳類の血小板
   に結合しているフィブリノーゲン又は凝集誘発フィブリ
   ノーゲンを阻害する方法。 １７、血流中の血小板凝集の発生を阻害するために請求
   項１記載のポリペプチドを哺乳類に投与することを特徴
   とする哺乳類の血小板の凝集を阻害する方法。 １８、（ａ）わずかに塩基性の溶液に凍結乾燥エキスカ
   リナツス毒を溶解し、 （ｂ）この溶液を遠心分離して上澄み液を得、 （ｃ）上澄み液をカラムに装填し、 （ｄ）血小板凝集阻害活性を含む画分を定量し、真空濃
   縮する ことを特徴とする次の配列を有するポリペプチドの精製
   方法。 【遺伝子配列があります】 １９、次のアミノ酸配列を有するポリペプチドが血小板
   凝集を阻害する該ペプチドをエンコードする組換え体Ｄ
   ＮＡ分子を包含している遺伝子。 【遺伝子配列があります】 （式中Ｃｈは少なくとも１個のアミノ酸を表わし、Ｃｘ
   は少なくとも１個のアミノ酸を表わし、各Ｒは同一かあ
   るいは異なり、アミノ酸である。） ２０、アミノ酸配列が次の通りである請求項１９記載の
   遺伝子。 【遺伝子配列があります】 ２１、形質転換微生物に於けるアミノ酸配列【遺伝子配
   列があります】 （式中Ｃｈは少なくとも１個のアミノ酸を表わし、Ｃｘ
   は少なくとも１個のアミノ酸を表わし、各Ｒは同一かあ
   るいは異なり、アミノ酸を表わす。）を有する血小板凝
   集阻害剤をエンコードするＤＮＡの転写がプロモーター
   −オペレーターの制御下にある、微生物中の異種タンパ
   ク質従って該ＤＮＡを発現することができるプロモータ
   ー−オペレーター配列を包含している複製される微生物
   発現ベクター。 ２２、アミノ酸配列が次のアミノ酸配列を有する請求項
   ２１記載の発現ベクター。 【遺伝子配列があります】 ２３、請求項２２記載の発現ベクターで形質転換された
   細胞を包含している生存細胞培養。 ２４、ａ）配列の最初のＣ末端アミノ酸を固体の架橋ポ
   リスチレン樹脂に付着させてアミノアシル重合体を生成
   し、最初のＣ末端アミノ酸閉塞基をアミノアシル重合体
   から除去し、その次の２番目のアミノ酸をＣ末端アミノ
   酸残基に結合させ順次アミノ酸を段階方式で結合させて
   ポリペプチド配列を生成し、Ｎ−末端アミノ酸を保護し
   ているＮ−末端Ｂｏｃ基を除去し、 ｂ）ポリペプチド配列をＨＦ及び１種以上のチオ含有ス
   カベンジャーで処理し、 ｃ）処理配列を洗浄し、カラムから多量の希酢酸に移し
   て望ましくない架橋を最小限にし ｄ）段階（ｃ）で得た溶液をｐＨ約８．０に調整して撹
   拌する ことを特徴とする次の配列を含有するシステインに富む
   ポリペプチドの調製方法。 （式中Ｃｈは少なくとも１個のアミノ酸を表わし、Ｃｘ
   は少なくとも１個のアミノ酸を表わし、各Ｒは同一かあ
   るいは異なり、アミノ酸を表わす。）