WO1995014042A1

WO1995014042A1 - Antihuman tyrosinase monoclonal antibody

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Publication number: WO1995014042A1
Application number: PCT/JP1994/001728
Authority: WO
Inventors: Hiroyuki Takimoto; Satoshi Suzuki; Koushi Shibata; Shigeki Masui
Original assignee: Pola Chemical Industries Inc
Current assignee: Pola Orbis Holdings Inc
Priority date: 1993-11-16
Filing date: 1994-10-14
Publication date: 1995-05-26
Anticipated expiration: 1996-05-16
Also published as: AU7863794A; US5843674A; EP0679660A1; EP0679660A4

Description

明細書抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体技術分野本発明は、抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体とその製造法、及びこのモノクローナル抗体を用いたヒトチロシナ一ゼの検知法に関する。背景技術チ口シナーゼは生体内でメラニン色素を生合成する上で最も重要な酵素であり、粗面小胞体のリボソームで生成され、次いでゴルジ器官関連小胞体で濃縮、活生化され、ゴルジ器官より生成されるプレメラノソ一ムへ選択的に転送されると考 Lられている。

チ口シナ一ゼの生合成が阻害されると、重大な皮膚障害が起こることが知られている。例えば、色素異常症は、チロシナーゼ自身の構造の変異やその生合成過程での異常により起こることが知られており、チロシナーゼのプレメラノソ一ムへの選択的転送が関与している可能性もある。また、近年オゾンホールの増大が地表に届く紫外線量の増加をもたらし、それに伴う皮膚癌の増加が世界的に懸念されている。その中で悪性黒色腫は、メラノサイトがその機能、特にチロシナ一ゼの産生能を維持したまま癌化した皮膚癌の一種であり、非常に悪性度が強く、リンパ節に高頻度で転移することが知られている。早期であれば外科的な広範囲切除により治療できるが、その際、患者の負担をできるだけ少なくするために、切除は最小限にとどめながら、確実に病巣を除くことが必要である。しかし、この病巣の完全に判定できる診断薬は、現在のところない。

このような疾病の診断あるいは原因の究明には、生体或いは細胞に於けるチロシナ一ゼの挙動を知ることがたいへん有益であると考えられ、かかる観点から、従来よりチロシナ一ゼの挙動を知るための努力がなされてきた。特に抗原 ·抗体反応を用いた方法は、感度も高いことから種々の検討がなされてきており、チロシナーゼに対するポリクローナル抗体の作製が古くからなされてきた（例えば、 Jimenez, M. et al. , (1991) J. Biol. Chem. 266(2), 1147-1156、 Bouchard, B. et al.， (1994) J. Invest. Dermatol. 102(3), 291295) 。

しかしながらポリクロ一ナル抗体は、その都度動物を免疫してその血中より取り出して作るため、ロットごとの抗体価のバラツキが大きく、再現性に乏しいと言う大きな欠点があるため、実用的ではなく製品化には至っていない。そのため、チロシナーゼを抗原として動物を免疫した後、この動物のリンパ球とミエローマ等の培養細胞を融合させてハイプリドーマを作製し、これに抗チロシナーゼモノクローナル抗体を作らせる試みがなされてきた（Margherita Cuo-mo et al. , J. Invest. Dermatol. , 96(4), 446-451 (1991) ; Yasushi Tomita et al. , J. Inve st. Dermatol. , 85(5), 426-430 (1985)) 。

しかし、上記の報告で抗チロシナ一ゼモノクローナル抗体とされたものは、チ口シナ一ゼ関連蛋白に対するモノクローナル抗体であったことが、その後明らかにされた（Yasushi Tomita et al. , J. Invest. Dermato. , 96(4), 500-504， 19 91) 。これは、生体に於いて、アミノ酸配列及び分子量がチロシナーゼと極めて類似したチロシナーゼ関連蛋白（以下、「T R P」という）と呼ばれている蛋白が存在しているため、チロシナーゼを T R Pから完全に分離することが極めて困難であり、細胞あるいは組織より精製したチロシナ一ゼを抗原として動物を免疫するという従来技術では、混入している T R Pが抗原となり、抗 T R P抗体が生成してしまうためである。したがって、このようなモノクローナル抗体を用いてチロシナーゼを正確に検知することは困難である。

また、 McEvanらは、抗ヒトチロシナ一ゼモノクロ一ナノレ抗体について報告している（McEvan, M. et al. , Pigment Cell Res. 2, 1-7 (1989)) が、このモノクローナル抗体が認識する抗原の分子量（約 5 8 k d ) は、本発明者らが認識しているヒトチロシナーゼの分子量（約 7 5 k d ) とは異なっている。また、 McEvan らのモノクローナル抗体は、マウスチロシナーゼにも弱く交差する力^ ヒトチ口シナ一ゼに比べて結合は弱く、ェピトープも不明確である。ちなみに、 McEvanらの抗ヒトチロシナ一ゼモノクローナル抗体を用いてマウスメラノーマ細胞を免疫染色したときの染色率は 0 . 1 %であった。更に、この抗ヒトチロシナーゼモノクロ一ナル抗体は、抗原として培養細胞より精製したヒトチロシナ一ゼそのものを用いているため、モノクローナル抗体を産生する細胞を作製する上で、 T R P などの除去しにく t、夾雑物が混在する中からチロシナーゼを単離する技術が必須になり、手軽にこの抗ヒトチロシナ一ゼモノクローナル抗体を産生する細胞を得ることはできない。

ところで、前記したように、チロシナ一ゼの異常に起因する疾病の原因の究明には、生体或いは細胞に於けるチロシナーゼの挙動を知ることがたいへん有益であると考えられるカ、このような実験あるいは試験は、実験動物を用いることが好ましく、ヒト以外の動物のチロシナーゼにも結合するモノクローナル抗体が必要となる。したがって、ヒトチ口シナ一ゼ及びヒト以外の動物のチロシナーゼに結合し、かつ、 T R Pに結合しないモノクローナル抗体が望まれていた。発明の開示本発明は上記観点からなされたものであり、 T R Pを抗原として認識せず、ヒトチロシナ一ゼ及びヒト以外の動物のチロシナーゼに結合するモノクロ一ナノレ抗体、及びこのモノクローナル抗体を用いてヒトチロシナ一ゼを検知する方法を提供するものである。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ヒトチロシナーゼのアミノ酸配列のうち T R Pの配列と相同性が低い配列を有するぺプチドを抗原に用いることにより、 T R Pに結合せず、ヒトチ口シナ一ゼに結合するモノクロ一ナル抗体が得られ、これを用いるとヒトチロシナーゼを特異的に検知できることを見いだし、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、下記性質を有するモノクローナル抗体である。

( a ) ヒトチロシナーゼに結合する。

( b ) マウスチロシナ一ゼに結合する。

( c ) チロシナーゼ関連蛋白に結合しない。

また本発明は、下記工程を含む請求項 1記載のモノクローナル抗体の製造法であ。

( a ) ヒトチロシナーゼのアミノ酸配列のうち、チロシナーゼ関連蛋白のァミノ酸配列と相同性の低い領域のアミノ酸配列の少なくとも一部を有するぺプチドと担体との結合物を用、て哺乳動物を免疫した後、その動物の脾細胞を取り出し、培養細胞と融合してハイプリドーマを作製し、

( b ) ヒトチロシナーゼ及びマウスチロシナ一ゼに結合し、かつ、チロシナーゼ関連蛋白に結合しないモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマを選択し、

( c ) 前記ハイプリドーマを適当な培地で培養した培養上清、あるいは前記ハイプリドーマをマウス腹腔内で培養して得られる腹水から抗体蛋白を採取する。さらに本発明は、モノクローナル抗体を用 L、た免疫学的方法によりヒトチロシナ一ゼを検知する方法において、前記モノクローナル抗体を用いる方法を提供す o

尚、本願において、「ヒトチロシナーゼに特異的に結合する」とは、ヒトチ口シナーゼに結合し、かつ、チロシナーゼ関連蛋白に結合しないことをいうが、マウスチロシナ一ゼに結合しないことを意味するものではない。

以下、本発明を詳細に説明する。

ヒトチロシナーゼの c D N A配列は既に知られており（Sigeki Shibahara et al. , Tohoku J. exp. Med. , 156, 403-414(1988)) 、ヒト T R Pの c D N A配列も既に知られている（Tirza Cohen et al. , ucleic Acid Reserch, Vol. 18, No. 9, 2807-2808 (1990)) 。本発明者らはこれらの c D N A配列をアミノ酸配列に翻訳し、比較した（図 1 ) 。図 1において、上のレーンはヒトチロシナーゼのアミノ酸配列を、下のレーンは T R Pのァミノ酸配列を 1文字記号で示したものである。レーンとレーンの間に示してある（：）は、アミノ酸が完全に一致している部分であり、（：. ) は同種のアミノ酸（疎水性、親水性、塩基性等）として一致している部分である。その結果、ヒトチ口シナ一ゼのアミノ酸配列のうち、 T R Pと相同性が低 t、部分が L、くつか存在することを見 L、だした。

本発明者らは、この点に注目し、これらの部分のアミノ酸配列を有する合成べプチドを合成した（（株）ペプチド研究所に合成を依頼）。入手した 5種類のぺプチドを用いて哺乳動物を免疫した後、脾細胞を取り出し、これを培養細胞と融合することによりハイプリドーマを作製し、これらのハイプリドーマにモノクロ —ナル抗体を産生させ、ヒトチ口シナ一ゼ及びマウスチロシナーゼに結合し、力、つ、チロシナーゼ関連蛋白に結合しないモノクロ一ナル抗体を産生するハイプリドーマを検索した。その結果、配列番号 1に示す配列を有する合成ペプチド（以下、「ヒトチロシナーゼに特異的なペプチド」ともいう）で免疫した動物の脾細胞を用いて作製したハイプリドーマのみから、チロシナーゼに特異的なモノクローナル抗体を生産させるハイプリドーマを得ることに成功した。さらに、こうして得られたモノクローナル抗体を用いてヒトチロシナーゼを特異的に検知することに成功した。

< 1〉発明に用いるモノクロ一ナル抗体

はじめに、ヒトチ口シナ一ゼに特異的なモノクローナル抗体、及びその製造法を、製造の手順に沿って説明する。

( 1 ) 抗原

哺乳動物を免疫する際に用いるヒトチロシナーゼに特異的なぺプチドは、配列番号 1に示す配列又はその一部の配列を有するぺプチドが挙げられる。後記実施例に示すように、ヒトチ口シナ一ゼのアミノ酸配列のうち、チロシナーゼ関連蛋白のアミノ酸配列と相同性の低い領域のうち、配列番号 2 〜 5に示す配列を有するべプチドを用いて免疫した哺乳動物の脾細胞を用いて作製したハイプリドーマからは、ヒトチロシナーゼを検出できるモノクロ一ナノレ抗体を産生する株が得られなかったことから、抗原としては少なくとも配列番号 1に示す配列の一部を有するぺプチドが好ましいと考えられる。

しかしながら、チロシナーゼ関連蛋白のアミノ酸配列と相同性の低い他の領域を用いても、ヒトチロシナ一ゼを特異的に認識するモノクローナル抗体を得ることが可能であることは否定できない。そのような領域の配列を有するぺプチドを用いて得られるヒトチロシナ一ゼに特異的なモノクローナル抗体も、本発明のモノクローナル抗体に包含される。

上記のようなぺプチドは、例えばチロシナーゼの酵素分解物から単離することにより、部分的に得ることができるカ、常法により化学合成することが好ましい例えば、市販されているペプチドシンセサイザーを用いて、上記配列を入力すれば上記ペプチドを得ることができる。また、ペプチドの受託合成サービスを行つている会社に依託して入手してもよい。

かくして得られるペプチド（以下、「合成ペプチド」ともいう）は、そのまま抗原としても用いることができるし、キ一ホールリンペットへモシァニン（KL H： Keyhole Limpet Hemocyaninゾ、ゥシ血清ァノレフミン (B S A： Bovine Serum Albumin) 、卵白アルブミン（OVA： Ovalbumin) 等の担体と結合させて用いることもできる。このような担体を用いると、ペプチドのみでは抗原性が低い場合、あるいは抗原性がない場合でも抗原性を上げることができる。尚、この場合は担体に対する抗体もできるが、それらはハイプリドーマを選択する段階で取り除くことができる。

( 2 ) 哺乳動物の免疫

上記抗原で免疫する哺乳動物は、免疫実験に通常用いられている哺乳動物であれば特に制限がなく、マウス、ラット、ゥサギ等が例示できる。また、免疫する方法は、通常の免疫の手法に則って行えば良く、例えば、合成ペプチド或いは担体に結合させた合成ペプチドを、 0. 5mgZk g〜5 OmgZk gの用量で、フロイントの完全ァジュバントまたは不完全ァジュバントとともに 1〜 2週間毎に数回投与を繰り返し、最終投与の 2週間以上後に、合成ペプチドのみを投与して最終免疫を行う方法が挙げられる。

このときの合成べプチドあるいは担体に結合させた合成べプチドの投与量は、 1回当たり 0. 5mgZkg〜5 OmgZkg程度が適当である。投与量が 0. 5 m gZk g未満では抗体を十分に生成しないことがある。また、 50mg/k gを越えても更なる免疫効果は期待できず、さらに、生体内で免疫抑制が生じ、目的とする抗体が得られなし、恐れがある。

(3) ハイプリドーマの調製

上記のようにして免疫した動物を、最終免疫後 3〜4日後に屠殺し、脾臓を摘出し、脾細胞を取り出す。この細胞と、融合相手である培養細胞とを融合促進剤の存在下で融合し、得られた融合細胞を選別することにより脾細胞一培養細胞ハイブリドーマを得ることができる。

融合相手の培養細胞としては、脾細胞と融合するものであれば特に制限はないが、一般には、ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）が適当である。また、細胞融合の後に未融合細胞と融合細胞とを区別できるようにするために、特定の選別用の薬物マーカーを有するものが好ましい。

例えば、ヒポキサンチン ·グァニン ·ホスホリボシルトランスフヱラ一ゼ欠損したものが挙げられる。このような細胞は、ヒポキサンチン ·アミノプテリン及びチミジンを添加した培地（H A T培地）中で生育できないが、この細胞と正常細胞との融合細胞は H A T培地中でも生育できるようになり、未融合細胞と区別できる。具体的には、 P3X63Ag8. 653株、 P3/NSI/1- AG4-1株、 F0株、 SP2/0 - Agl4株等のミエ口一マ細胞の市販株が挙げられるが、これらには限定されな、。

細胞融合は通常 R P M I 1 6 4 0、 M E M等の培地中で、抗体産生細胞（脾細胞）とミエローマ細胞とを 1 0 ： 1〜2 ： 1の混合比で、融合促進剤とともに混合することにより行われる。融合促進剤としては、細胞融合実験で通常用いられている融合剤であれば特に制限はなく、具体的には、センダイウィルスや平均分子量 5 0 0〜 7 0 0 0のポリエチレングリコールが例示できる。また電気パルスによって融合させてもよい。細胞融合を終えた細胞は、例えば R P M I 1 6 4 0 ある L、は M E M培地などで希釈し、遠心分離により洗浄した細胞を H A T培地等の選択培地に浮遊させ、マルチプレート等に分注して培養を行い、ハイプリドーマのみを生育させる

( 4 ) ハイプリドーマの選別

上記のようにして得られるハイプリドーマは、抗原に用いたペプチドのうち異なる抗原決定部位に対するモノク口一ナル抗体や担体に用いた蛋白に対するモノクロ一ナル抗体を産生するハイプリドーマの混合体であるので、これらの中から前記合成べプチド、すまわちヒトチロシナ一ゼに特異的なぺプチドに特異的に結合するモノクロ一ナル抗体を産生するハイブリド一マを選別する。

この選別の方法としては、抗原に用いた合成ペプチドを使用した酵素免疫測定法（E L I S A法）が好ましい。例えば、合成ペプチドをプラスチックプレート等に固相化しておき、これにハイプリドーマの培養上清、さらに酵素、蛍光物質或は発光物質の結合量から合成べプチドに結合する抗体量を知ることができる。或は、ハイプリドーマが産生する抗体を固相化し、これに合成ペプチド、酵素等で標識第 2抗体と順次ィンキュベートしてもよい。さらに、合成ペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマから、ヒトチ口シナ一ゼ及びマウスチロシナーゼに結合し、チロシナーゼ関連蛋白に結合しないモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマを選択する。このようにして得られたハイプリドーマの 1株は、平成 5年 1 0月 2 8日より工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号 3 0 5 日本国茨城県つくば市東一丁目 1番 3号）に、 F E P M P— 1 3 9 3 7として寄託されており、平成 6 年 1 0月 6日に、この原寄託からブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管され、受託番号 F E RM B P - 4 8 2 4として寄託されている。

また、このようにして得られたハイプリドーマの他の 1株は、平成 6年 5月 2 7日より工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号 3 0 5 日本国茨城県つくば巿東一丁目 1番 3号）に、 F E P M P— 1 4 3 4 0として寄託されており、平成 6年 9月 1 4日に、この原寄託からブダぺスト条約に基づく国際寄託へ移管され、受託番号 F E RM B P - 4 8 0 1として寄託されている。

( 5 ) ヒトチロシナ一ゼに特異的に結合するモノクローナル抗体の調製

上記のようにして得られたハイブリドーマからヒトチロシナーゼに特異的に結合するモノクローナル抗体を得るには、例えば、適当な培地中で培養した抗体産生ハイプリドーマの培養上清、あるいは抗体産生ハイプリドーマをマウス腹腔内で培養して得られた腹水を常法にしたがって、硫安分画、ゲルろ過、ァフィニティ一クロマトグラフィ一等で精製すれば、ヒトチロシナーゼに特異的なモノク口ーナル抗体が得られる。

本発明の抗ヒトチロシナ一ゼモノクローナル抗体は、生体或いは細胞に於けるチロシナ一ゼの挙動調査に使用することができ、また、チロシナ一ゼが関連する疾病の診断あるいは原因の究明、例えば白髪や白皮症といった色素異常症の病態解明、さらには悪性黒色腫の病巣の検出や転移の判定等に用いる診断薬に利用することができる。また、本発明の抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体はマウスチロシナ一ゼに結合するので、有色マウスを用いたチロシナーゼ蛋白の挙動を調べる動物試験において、チロシナ一ゼ蛋白の挙動を調べる手段として本発明のモノクローナル抗体を利用することができる。く 2〉本発明のヒトチ口シナ一ゼの検知法 - 上記のようにして得られるヒトチロシナーゼに特異的に結合するモノクローナル抗体は、ヒトチロシナーゼに選択的に結合するので、通常の抗原抗体反応を用いた抗原の検知方法を適用することにより、ヒトチロシナーゼを検知することができる。例えば、ヒト由来の培養細胞、皮膚組織等の免疫染色、さらにはウェスタン ·ブロット（ェンザィムィムノブロット）あるいはミクロォ一トラジオグラフィ一における染色用抗体として使用することにより、ヒトチロシナーゼを検知できる。また、単に定性的に検知できるのみでなく、染色の度合等により、定量的にも検知することができる。

免疫組織染色による検知の方法としては、例えば、ヒト表皮組織の凍結切片、あるいはヒト由来培養細胞を P B Sにより洗浄後、抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体を用いて染色し、再び P B Sにより洗浄した後、ヒトの組織および培養細胞に結合したモノクローナル抗体を、 F I T C標識した第 2抗体を用いて検出すれば、ヒ卜の組織および培養細胞中のヒトチロシナ一ゼを検知することができる。

また、ェンザィムィムノブロットによる検知の方法としては、次の方法が挙げられる。例えば、ヒト由来培養色素細胞の抽出物をポリアクリルァミドゲル電気泳動により分離した後、泳動物をニトロセルロースメンブレン等に写し取る。次に、メンブレンを P B S等で洗浄した後、メンブレン上のヒトチロシナーゼのバンドを抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体を用いて染色する。再び P B S等で洗浄した後、市販の酵素標識した第 2抗体を用いて染色されたバンドを検出し、そのバンドの強さを測定すれば、ヒトチロシナーゼを定量的に検知することができる。

本発明のヒトチロシナーゼの検知法は、生体或いは細胞に於けるチロシナーゼの挙動調査、チロシナーゼ関連疾病の診断あるいは原因の究明、例えば白髪や白皮症といった色素異常症の病態解明、さらには悪性黒色腫の病巣の検出や転移の判定等の診断に利用することができる。チロシナーゼ関連疾病としては、白髪、シミ、ソバカス、肝斑、白皮症、老人性黒子など、メラノサイ卜が関与して起こる疾病が挙げられる。さらに、動物に試料を投与し、本発明のモノクロナル抗体を用いた免疫学的方法によりその動物におけるチロシナ一ゼ蛋白を測定し、投与前後のチロシナーゼ蛋白の量的変動を生じさせる試料を選択することにより、メラ二ン産生を抑制あるいは促進する物質を検索できることが期待される。図面の簡単な説明図 1は、ヒトチロシナ一ゼ及び T R Pのァミノ酸配列のホモロジ一及びヒトチロシナーゼ蛋白上の合成べプチドの位置を示す図である。

図 2は、ヒトチロシナ一ゼ遺伝子導入細胞中で遺伝子が発現していることをチロシナーゼ活性染色法により調べた結果を示す写真である。

図 3は、ヒトチロシナーゼ遺伝子導入細胞を抗ヒトチロシナーゼモノクロ一ナル抗体で免疫染色した結果を示す写真である。

• 図 4は、マウスチロシナーゼ遺伝子導入細胞を抗ヒトチロシナーゼモノクロ一ナル抗体で免疫染色した結果を写真である

図 5は、遺伝子を導入していな L、細胞を抗ヒトチロシナーゼモノクロ一ナル抗体で免疫染色した結果を示す写真である。

図 6は、ヒト T R P— 1遺伝子導入細胞中で遺伝子が発現していることを抗 T R P - 1抗体を使用した免疫染色により調べた結果を示す写真である。

図 7は、ヒト T R P— 1遺伝子導入細胞を抗ヒ卜チロシナ一ゼモノクローナル抗体で免疫染色した結果を示す写真である。

図 8は、ヒト T R P— 2遺伝子導入細胞中でヒト T R P— 2が発現していることを抗ヒト T R P— 2抗体を使用した免疫染色により調べた結果を示す写真である。

図 9は、ヒト T R P— 2遺伝子導入細胞を抗ヒトチロシナ一ゼモノクローナル抗体で免疫染色した結果を示す写真である。

図 1 0は、チロシナ一ゼの活性染色及びェンザィムィムノブロットによる電気泳動の結果を示す写真である。

図 1 1は、抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体を用いて免疫組織染色したヒト皮膚を示す写真である。図 12は、ヒトのリンパ節へ悪性黒色腫が転移していることをチロシナーゼの活性染色により調べた結果を示す写真である。

図 13は、ヒトリンパ節の悪性黒色腫の転移巣を抗ヒトチロシナ一ゼモノクローナル抗体を使用して免疫染色した結果を示す写真である。

図 14は、ヒトリンパ節の悪性黒色腫の転移巣を抗ヒトチロシナ一ゼモノクロ —ナル抗体を使用しないで免疫染色した結果を示す写真である。発明を実施するための最良の形態以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。実施例 1 ヒトチロシナーゼに特異的なモノクローナル抗体の調製

< 1 >ハイプリドーマの作製

配列番号 1〜 5に示すァミノ酸配列を有するぺプチドの合成および担体（K L H) への結合は、株式会社ペプチド研究所に依頼した。

上記の 5種類の担体結合合成べプチド 100 gを生理食塩水 100 1に溶かし、完全フロイントアジュバント（S I GMA製） 100 1と混合乳化したものを、それぞれ 8週令の BALB/cマウス（日本クレア）の腹腔内に投与した。その後 1週間目と 2週間目に、上記担体結合合成べプチド一不完全フロイントアジュバント等量混合乳化液 200 ^ 1を腹腔内投与した。更に、 3回目の投与から 2週間後に、 50 ^ gの合成べプチドを溶解した生理食塩水 100 1を静脈注射した。

3日後、上記の各マウスから脾臓を摘出し、脾細胞を RPMI 1640培地に懸濁し、洗浄を行った。一方、マウスミエ口一マ細胞株 P3X63Ag8.653 (大日本製薬よから購入）を、細胞融合に合わせて対数増殖期になるように培養し、遠心分離により集めた。

10⁸個の脾細胞に対し、 2 X 10⁷個のミエ口一マを上記培地中で混合し、遠心分離により細胞をペレツトにした。上清を除いた後、 37てに保温した 50% PEG4000 (S I GMA製）を含む RPMI 1640培地 lm 1を 1分間で徐々に滴下し、 1分間穏やかに撹拌した。更に、 37ての RPM I 1640培地 2m 1を 2分間で、更に 8m 1を 3分間で撹拌しながら滴下する。

滴下終了後、遠心分離により上清を除いた後、細胞ペレツトを G I T培地（和光純薬製） 4 Om lに懸濁し、これを 4枚の 96ゥヱルプレート（住友べ一クラィト製）に、 1ゥヱルにっき 100 1ずつ分注した。翌日 25 1の HAT培地を添加し、更に 4日後 25 μ 1の HAT培地を添加した。 1週間培養した後、培養上清を半分除き、 100 ^ 1の G I T培地を添加した。

細胞融合から約 2週間後、ミエ口一マと脾細胞が融合したハイプリドーマのみがコロニーを形成したが、さらに、コロニーの直径が約 lmmになるまで培養を続けた。この時点で培養上清に分泌された抗体を、上記の合成ペプチドと市販の二次抗体（西洋ヮサビペルォキシダ一ゼ（HRP)標識ャギ抗マウス I g' s (r + L)抗体： TAGO社製）を用いたサンドウイツチ EL I SA法により検定した。このうち、抗体価の高かったゥエル中のハイプリドーマを限界希釈法によるクロ一ニングを行い、モノクローナル抗体産生ハイプリドーマ株を得た。さらに、得られたハイプリドーマ株から、ヒトチ口シナ一ゼに結合するモノク口一ナル抗体を産生する株を、ヒト皮膚を使用した免疫染色法により選択した。その結果、配列番号 1に示すアミノ酸配列を有する合成べプチドを用いて免疫した動物に由来するハイプリドーマのみから、ヒトチロシナーゼに結合するモノク口一ナル抗体を産生する株が得られた。

このようにして得られたハイプリドーマの 1株（AHT- C2- H12) は、平成 5年 1 0月 28日より工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号 305 日本国茨城県つくば市東一丁目 1番 3号）に、 FEPM P— 13937として寄託されており、平成 6年 10月 6日に、この原寄託からブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管され、受託番号 FERM BP— 4824として寄託されている。また、このようにして得られたハイプリドーマの他の 1株（AHT- C2- H31) は、平成 6年 5月 27日より工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号 305 日本国茨城県つくば市東一丁目 1番 3号）に、 FEPM P— 14340として寄託されており、平成 6年 9月 14日に、この原寄託からブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管され、受託番号 FERM BP— 4801として寄託されている。く 2 >ヒトチロシナーゼに特異的に結合するモノクローナル抗体の調製

( 1 ) 上記で得られたハイプリドーマの培養上清からの調製

上記ハイブリドーマ（FE PM P - 1 4 34 0) を 1 Lの G I T培地中で培養し、細胞密度が約 5 X 1 5⁶個ノ1111になったところで培養上清を遠心分離により回収し、これをポアサイズ 0. 22〃mのフィルターでろ過し、ろ液を氷温下で 5 0%の硫安塩折に供し、得られた沈殿物を遠心分離により回収した。沈殿物を 2 m 1の P B Sに溶解し、透析チューブ（三光純薬より購入）に移した後、 2 Lの P B S中で 4 で透析した。透析終了後、溶液をプロテイン Aカラムキット (アマシャム ·ジヤノン製）で精製した。その結果、ろ液 1 Lから 3. 5mg ( 5 0 0 g/m 1 x 7m 1 ) の抗ヒトチロシナ一ゼモノクローナル抗体溶液が得られた。

(2) マウス腹水からの調製

マウスへの投与の前日、上記で得られたハイプリドーマ（対数増殖期）を 2 x 1 0⁵個ノ1111の細胞密度で培養フラスコに播種し、 G I T培地で培養した。 1日後、細胞を遠心分離により回収し、再び G I T培地に 1 O SZm 1の細胞密度で懸濁した。この懸濁液を、 S P F区域で飼育した 8週齢の BALBZcヌードマウス（クレアより購入） 1匹に対して l m lを腹腔内に投与した後、引続き S P F区域でマウスを飼育することにより腹腔内でハイプリドーマを生育させた。 3 週間後、復部が十分肥大（出産直前の妊娠マウス程度の大きさ）し、腹水の貯留が認められた。そこで 1 Om I容のシリンジ（テルモ製）を使用し腹水を回収した。さらに、マウス 1匹当り約 3m lの PB Sで腹腔内の洗浄を行い、洗浄液も同時に回収した。得られた腹水および洗浄液を混合し（1匹当り 6m lになった。）、ポア一サイズ 0. 2 2〃mのフィルタ一でろ過し、ろ液を抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体含有腹水（以後、抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体含有腹水を、簡単に「モノクローナル抗体含有腹水」という。）とした。さらに得られたモノクローナル抗体含有腹水を上記のプロティン Aカラムキットにより精製した。その結果、モノクローナル抗体含有腹水 l m lから約 1. 2mgZm l の濃度の抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体溶液が得られた。実施例 2 抗ヒトチロシナ一ゼモノクローナル抗体の解析及び評価

< 1 >抗ヒトチロシナ一ゼモノクローナル抗体の特異性の評価

上記で得られたモノクローナル抗体の特異性を評価するために、マウス色素非産生メラノーマ： K 1735細胞（チロシナ一ゼおよび TRP— 1非生産： Yasu shi Tomita et. al. , J. Invest. Dermatol. , 96(4), 500- 504, 1991；東北大学医学部より供与）にヒトチロシナーゼ、マウスチロシナ一ゼ、ヒト TRP— 1およびヒト TRP— 2遺伝子を導入し、発現した細胞を用いて、上記で得られたモノクロ一ナル抗体による免疫染色を行つた。

(1) ヒトチロシナーゼ、マウスチロシナ一ゼ、ヒト TRP— 1およびヒト TR P - 2導入細胞の作製

K 1735細胞を直径 6 cmの培養用シャーレ（FALCON社製）に約 5 x 10⁵個の細胞（シャーレに対して約 75%コンフルェント）を播種し、 10%F B Sを含む DME培地 (Dulbecco' s Modified Eagle's Medium： S I GMA社より購入）中で一晩培養した後、培地を交換し、さらに 2時間培養した。一方、 1 0倍に希釈した TE緩衝液（10mM T r i s : lmM EDTA : pH7. 5) に導入する遺伝子発現用プラスミド（pRH0HT2、 pRHOHTa及び pCMVDTS：下記参照）を 50 g/m 1の濃度で溶解し、プラスミド溶液とした。 2倍濃度の HB S緩衝液（1 OmM KC 1 ； 1 OmM D—グルコース； 1. 5mM Na 2HP04 ； 50 mM HEPES ： pH7. 1) 175. と 2Mの C a C 1 2 22.

05 ^ 1を混合し氷冷したものを、あらかじめ氷冷した上記プラスミド溶液 15 2. 95 1中へ徐々に滴下混合し、プラスミドを沈殿させた。さらに 10分間氷冷した後、上記の 1735細胞の培地中へ添加し培養を続けた（なお、ここで使用する全ての溶液は、ポア一サイズ 0. 22〃mのフィルターであらかじめ滅菌を行った）。 5時間後、培地を除き、 TB S緩衝液（137mM Na C 1 ； 2. 7mM KC 1 ； 25mMT r i s ： pH7. 4) を使用して細胞を 1回洗浄した。そして、 5m 1の 10%グリセリンを含む TBS緩衝液を添加し 5分間室温に放置した。溶液を除き再び TBS緩衝液で 2回洗浄した後、 10%FBSを含む DME培地中で培養した。 20時間後、導入した遺伝子を発現させるため、細胞を 42 ^で 1時間熱ショック処理（なお、 pCMVDTSを導入する場合には熱ショック処理を行わない。）を行った。さらに 16時間培養を行い、これを遺伝子導入細胞とした。

尚、上記で用いた遺伝子発現用プラスミドとしては、ヒトチロシナーゼ遺伝子発現用には PRH0HT2 (Takeda A. et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. , 162， 9 84-990(1989)) 、ヒト TRP 1遺伝子発現用には pRHOHTa、及びヒト TRP 2遺伝子発現用には pCMVDTS (Kouji Yokoyama et al. , Biochim. Biophis. Acta, 1217, 317-321(1994)) を各々使用した。これらの遺伝子発現用プラスミドは、全て東北大学医学部より供与されたものである。

(2) ヒトチロシナーゼおよびマウスチロシナーゼ遺伝子の発現の確認

(1) で作製したヒトチロシナーゼ遺伝子導入細胞およびマウスチロシナ一ゼ遺伝子導入細胞中でヒトチ口シナーゼ遺伝子およびマウスチロシナーゼ遺伝子が発現していることを確認するため、ヒトチロシナーゼ遺伝子導入細胞およびマウスチロシナーゼ遺伝子導入細胞を使用してチロシナーゼ活性染色（D 0 P A染色）を行った。方法を以下に示す。

遺伝子導入細胞を PBSで洗浄した後、 10%ホルマリンを含む PB Sを添加し、 30分間氷冷した。さらに、 pH6. 8の PB Sに 10分間 3回浸し、 0. 1 %L— DOP Aを含む pH6. 8の PBSを添加し、 37 で 3時間反応させた。反応終了後 PB Sで 3回洗浄し、再び 10%ホルマリンを含む PB Sを添加し、室温で 30分間インキュベートした後、顕微鏡下で観察した。その結果を図 2に示す。

この図からわかるように、ヒトチロシナーゼ遺伝子を導入した細胞は活性染色により黒色に染色された（写真は示していないが、マウスチロシナーゼ遺伝子を導入した細胞も活性染色により黒色に染色された。）。一方、遺伝子を導入していない細胞は染色されなかった。すなわちヒトチロシナーゼおよびマウスチロシナーゼ遺伝子導入細胞がヒトチロシナーゼおよびマウスチロシナーゼ遺伝子を発現していることが明らかとなった。 (3)抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体のヒトチロシナ一ゼおよびマウスチロシナーゼとの反応性

(2) で発現を確認したヒトチロシナーゼ遺伝子導入細胞およびマウスチロシナーゼ遺伝子導入細胞を使用し、抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体とヒトチロシナーゼおよびマウスチロシナーゼとの反応性を免疫染色により調べた。方法を以下に示す。

上記で得られた培養中のヒトチロシナーゼおよびマウスチロシナ一ゼ遺伝子導入細胞から培地を除いた後、 10%ホルマリンを含む PB Sを添加し、室温で 2 0分間処理した。 PBSで 3回洗浄後、さらに 0. 5%T r i t on X- 10 0を含む PB Sを添加し室温で 5分間処理し、？83で1回洗浄した。次に一次抗体として PB Sで 10 g/m 1の濃度に希釈した上記の抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体溶液（培養上清から調製した抗体溶液あるいは、抗体含有腹水から調製した抗体溶液のどちらでもよい）を細胞表面に滴下した後、 37 で 30分間インキュベートした。再び PBSで 3回洗浄後、二次抗体として PBS で 50倍に希釈した市販のピオチン結合抗マウス I gG (CHEMI CON社製）を細胞表面に滴下し、 37 で 30分間処理し、 PBSで 3回洗浄した。次に P B Sで 100倍に希釈した市販の F I TC結合アビジン（B I OMED A社製）を添加し 37てで 30分間インキュベートし、 PBSで 3回洗浄した。最後に 5 0%グリセリン含有 PB Sを添加しカバ一グラスを静かに置いて封入した後、蛍光顕微鏡（オリンパス製 . BH2— RFCA) 下で観察および写真撮影を行った。その結果を図 3、 4および 5に示す。

この図からわかるようにヒトチ口シナーゼ遺伝子およびマウスチロシナーゼ遺伝子を導入した細胞は抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体により、強く染色されていることがわかる。すなわち、本モノクローナル抗体はヒトチロシナーゼだけでなくマウスチロシナーゼとも結合することが明らかとなった。従って、本モノクローナル抗体はヒトだけでなくマウス（実験動物）での試験に利用可能である。一方、遺伝子を導入していない細胞は全く染色されないことから、本モノクローナル抗体は元の K 1735細胞とは反応しないことがわかった。さらに、マウス及びヒト由来の培養細胞（メラノ一マ細胞）に対する染色性を比較することにより、本抗体のヒトチロシナーゼおよびマウスチロシナ一ゼとの反応性を比較した。

ヒト由来のメラノ一マ細胞 Me Wo、 HMVH (RCB777: RIKEN Tsukuba Cell Bank, Japan)、 G361 (ATCC CRL1424) 及びマウス由来のメラノーマ細胞 B 16 (ATCC CRL6233) 及び S 91 (ATCC CLL 53.1) を各々シャーレで培養した後、培養上清を除き、 PBSで数回洗浄した。それぞれのシャーレにブロッキング溶液（5%FB Sと 1%B SAを含んだ PB S) を注ぎ、室温で 20分間インキュペートした。さらに、シャーレを湿箱中に入れ、ブロッキング溶液で 10 ^ m 1に希釈した上記モノクローナル抗体溶液をシャーレに加え、室温でインキュペートした。 1時間後、シャーレを PB Sで 5分間 3回洗浄した。これらのシャーレにブロッキング溶液で 50倍に希釈した市販のピオチン結合抗マウス I gG ャギ抗体（Ch em i c o n社製）溶液を注ぎ、室温でインキュベートした。 1 時間後、シャーレを前述のように PB Sで洗浄し、ブロッキング溶液で 100倍に希釈した F I TC結合アビジン（B I OMEDA社製）溶液を注ぎ、暗所、室温で 1時間インキュベートした。再びシャーレを前述のように PBSで洗浄した後、シャーレが乾かないうちに、 50%グリセリンを含んだ PB Sでプレート表面を覆い、カバーグラスを乗せた。各々のシャーレを蛍光顕微鏡（ォリンパス社製： BH2— RFCA) を使用して観察し、染色された細胞の割合を調べた。結果を表 1に示す。表 1 細胞種（メラノーマ）染色された細胞の割合（％) ヒト由来

MeWo 98

HMVH 95

G 361 97

マウス由来

B 16 96 この結果から、本抗体はヒトチロシナ一ゼおよびマウスチロシナ一ゼに対して同等の反応性を有することがわかる。

(4) ヒト T R P— 1遺伝子の発現の確認

(1) で作製したヒト TRP— 1遺伝子導入細胞中でヒト TRP— 1遺伝子が発現しているかどうかを調べるために、抗 TRP— 1抗体（秋田大学医学部より供与）を使用してヒト TRP— 1導入細胞の免疫染色を行った。なお、免疫染色は（3) に記載の方法とほぼ同じである。ただし、一次抗体としては上記抗ヒト TRP— 1抗体を使用し、二次抗体としては PB Sで 50倍に希釈した市販のテキサスレツド結合抗ラット I gGャギ抗体（CALTAG社製）を使用した。また、 F I T.C結合アビジン処理およびその後の PBSによる洗浄の操作は除いた。結果を図 6に示す。

図からわかるように、ヒト TRP— 1遺伝子を導入した細胞は抗 TRP— 1抗体で染色された。一方、遺伝子を導入していない細胞は抗 TRP— 1抗体で染色されなかった（写真は示さない）。このことからヒト TRP— 1遺伝子導入細胞がヒト TRP— 1を発現していることが明らかとなった。

(5)抗ヒトチロシナ一ゼモノクローナル抗体とヒト TRP— 1との反応性

( 4 ) で遺伝子の発現を確認したヒト T R P— 1遺伝子導入細胞を使用し、抗ヒトチロシナ一ゼモノクローナル抗体とヒト TRP— 1との反応性を免疫染色により調べた。なお、免疫染色は（3) に記載した方法で行った。その結果を図 7 に示す。

図からわかるように、抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体はヒト TRP— 1遺伝子を導入した細胞を全く染色しないことから、本モノクローナル抗体はヒト TRP— 1と反応しないことが明らかとなった。

(6) ヒト TRP— 2遺伝子の発現の確認

(1) で作製したヒト TRP— 2遺伝子導入細胞中でヒト TRP— 2が発現しているかどうかを調べるために、抗 TRP— 2抗体（東北大学医学部より供与）を使用して、ヒト TRP— 2遺伝子導入細胞を免疫染色を行った。なお、免疫染色は（3) 記載の方法とほぼ同じである。ただし、一次抗体には PB Sで 100 倍に希釈した上記の抗 T RP-2抗体を、また二次抗体には P B Sで 50倍に希釈した市販のピオチン結合抗ラビット I gGャギ抗体（TAGO社製）を使用した。結果を図 8に示す。

図からわかるようにヒト TRP— 2遺伝子を導入した細胞は抗ヒト T R P— 2 抗体により染色された。一方、遺伝子を導入していない細胞は抗ヒト TRP— 2 抗体により染色されなかった（写真は示していない。）。このことからヒト TR P 2導入細胞がヒト T R P— 2遺伝子を発現していることが明らかとなつた。

(7) 抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体とヒト TRP— 2との反応性

( 6 ) で遺伝子の発現を確認したヒト TRP— 2遺伝子導入細胞を使用し、抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体とヒト TRP— 2との反応性を免疫染色により調べた。免疫染色は（3) に記載した方法で行った。その結果を図 9に示す。図からわかるように、抗ヒトチロシナ一ゼモノクローナル抗体はヒト TRP— 2遺伝子を導入した細胞を全く染色しないことから、本モノクロ一ナル抗体はヒト TRP— 2と反応しないことが明らかとなった。

すなわち上記で得られたモノクローナル抗体は、従来技術の抗チロシナ一ゼモノクロ一ナル抗体（抗 TRP— 1抗体）とは全く異なった抗体であり、 TRP— 1さらには、 TRP— 2と結合しないことがわかった。

< 2〉抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体のアイソタイプ

上記で得られたモノクローナル抗体のァイソタイプをァイソタイピングキット (アマシャム ·ジャパン製）を使用して調べたところ、ィムノグロプリン G 1 ( I gG 1 ) であり、 L鎖は k a p p a ( ) であった。

< 3 >抗ヒトチロシナ一ゼモノクローナル抗体のェピトープの解析

実施例 1で得られた抗ヒトチロシナ一ゼモノクローナル抗体のェピトープを、ェピトープ決定キット（SPOT sキット：フナコシ（株）製）を使用して調べた。その結果、本抗体のェピトープは Glu Asp Tyr His (配列番号 6) であり、特に Asp Tyr Hisが本抗体による認識に必須であることがわかった。このェピトープは、ヒトチロシナーゼに含まれる配列と完全に一致している（配列番号 1においてアミノ酸番号 4〜 7に相当）。

一方、マウスチロシナ一ゼのアミノ酸配列中にも Asp Asp Tyr His (配列番号 7) なる配列がカルボキシル末端に存在しており、 Gluおよび Aspがどちらもカルボキシル基を側鎖に有する非常によく似たアミノ酸であることから、この配列を本抗体がェピトープとして認識し得ることは十分理解できる。実施例 3 ヒトチロシナーゼの検知（ I ) 実施例 1で得られたモノクローナル抗体について、 MeWo細胞（ヒト悪性黒色腫由来培養細胞）および He La細胞（ヒト子宮頸ガン由来培養細胞）の抽出物を用いて、特異性の評価をェンザィムィムノブロット法により行った。以下に方法を詳述する。

培養フラスコで培養した MeWoおよび H e L a細胞の培養上清を除き、 PB Sで数回洗浄した後、細胞をラバーポリスマンを用いて回収した。回収した細胞を、再び、 PB Sで数回洗浄し、細胞溶解懸濁液（Tr i t on X— 100を 0. 5%含んだ 0. 1Mリン酸ナトリウム緩衝液， pH8. 9) を懸濁した。

この細胞を、超音波細胞破砕装置（東湘電気製）で 30秒破砕し、 16, 00 06で10分間遠心分離を行った。得られた上清に含まれる蛋白濃度を測定し、細胞抽出液とした。これを 4 で、 5〜20%の密度勾配ポリアクリルアミドゲル（パジヱル： ATTO製）電気泳動に供した（アプライ量は 1レーン当り蛋白量として 20 gである。）。なお、電気泳動は常法に従って行った。電気泳動終了後、ゲルを取り出し、トランスファ一バッファ一（100mM， Tr i s ; 192mM, g 1 y c i n) に浸漬した後、プロッティング装置（セミドライブロッティング装置： ATTO製）を用い、その泳動物を、予めトランスファーバッファーに浸漬したメンブレン（Immob i 1 on：ミリポア製）へ 4 で 1 6時間転写した（転写の際の電流はメンブレン 1 cm²当り 0. 25 mAである。）。泳動物を転写したメンブレンの一部（電気泳動の際の 1レーンに相当する部分）を切りとり、 0. 3Mリン酸緩衝液（pH6. 6)で 5分間 2回洗浄後、 0. 1 %L— DOPAを含む 0. 1Mリン酸緩衝液（ϋΗ 6. 8) 中で 37 で 3時間反応する事によりヒトチロシナーゼの活性染色（DOPA染色）を行い、メンブレン上のヒトチロシナーゼの位置を検出した。

一方、メンブレンの残りを TB S緩衝液（2 OmM, T r i s ； 5 0 0 mM， N a C 1 pH 7. 5 ) に 1 5分間浸漬した後、ブロッキングバッファー（ 5 % スキムミルクあるいは 1 %B SA、及び 0. l %Twe e n 2 OZTB S緩衝液）に浸し、室温で 1時間緩やかに振とうした。

その後、メンブレンを 0. 1 %Twe e n 20/TB S緩衝液（TTB S緩衝液）を用いて洗浄（1 5分間 1回、 5分間 2回）し、製造例で得られたモノクローナル抗体溶液の希釈液（TTB S緩衝液で 2. 5 g/ 1に希釈した溶液約 2m l ) に浸潰し、室温で約 1時間緩やかに振とうした。メンブレンを TTB S 緩衝液で上記のように洗浄した後、さらに市販の二次抗体溶液（西洋ヮサビペルォキシダーゼ（HRP) 標識抗マウス I g' s (7 +L) ャギ抗体： TAGO社製、 1 5， 0 0 0倍希釈を約 2m 1 ) に浸漬し、室温で約 1時間緩やかに振とうした。

メンブレンを TTB Sバッファ一で洗浄（1 5分 1回， 5分 4回）した後、市販の HRP検出キット（アマシャム製 E C Lキット）を使用して、抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体が結合した泳動物のバンドを検出した。尚、 HRPの結合したバンドの検出は、 4—クロ口— 1一ナフト一ルを基質として使用しても検出する事ができる。

前記活性染色の結果及びェンザィムィムノブロット法の結果を図 1 0に示す。この結果から明らかなように、上記で得られたモノクローナル抗体は、ヒトチ口シナ一ゼ活性を有する蛋白のバンド、すなわちヒトチロシナーゼに結合する。さらにこのモノクローナル抗体は、 H e L a細胞の抽出物には結合しない。したがつて、本発明により、ヒトチ口シナ一ゼを検知できることが明かである。実施例 4 ヒトチ口シナーゼの検知（Π) 実施例 1で得られたモノクローナル抗体を使用してヒト表皮組織の免疫染色を行った。詳細を以下に示す。

あらかじめ一 8 0 に凍結したヒト表皮組織（東北大学医学部より供与）を包埋剤 (Tissue- Tek 0. C. T. Compound：マイルズ社製）を用いて包埋し、？東結切片作製装置（クリオスタツト：ブライト社製）を使用して、厚さ約 5〜1 O ^mの凍結組織切片（一辺は約 5mm) にした後、 1%ゼラチンでコーティングしたスライドグラス（以後、ヒト表皮組織切片を置いたスライドグラスを簡単に「スラィドグラス」という。）上に置いた。このスライドグラスを 37 で 1時間インキュベ一トした後、？85に1回浸した。次にブロッキング溶液（5%FBSと 1 %B S Aを含んだ PB S) を組織切片上に滴下し、室温で 20分間インキュべ —卜した。さらに、スライドグラスを湿箱中に入れ、組織切片上にブロッキング溶液で 10 g/m 1に希釈した上記モノクローナル抗体を滴下し、室温でインキュペートした。 1時間後、スライドグラスを湿箱より取り出し、 PB Sで 5分間 3回洗浄した。再び、スライドグラスを湿箱中に入れブロッキング溶液で 50 倍に希釈した市販のピオチン結合抗マウス I gGャギ抗体（Ch em i c o n社製）を切片上に滴下し、室温でインキュベートした。 1時間後、スライドグラスを前述のように PBSで洗浄し、湿箱中に入れ、組織切片上にブロッキング溶液で 100倍に希釈した F I TC結合アビジン（B I OMED A社製）を滴下し、暗所、室温で 1時間インキュベートした。再びスライドグラスを取り出し、前述のように PB Sで洗浄した後、組織切片が乾かないうちに、 50%グリセリンを含んだ PBSを組織切片上に滴下し、カバーグラスを乗せ、蛍光顕微鏡（ォリンパス社製： BH2-RFCA) を使用して観察及び写真撮影を行った。その結果を図 1 1に示す。

この結果から、ヒト組織では成熟型チロシナーゼが存在しているメラノサイトが強く染色されており、表皮中のケラチノサイトゃ真皮中の繊維芽細胞は全く染色されていないことがわかる。以上より、抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体がヒトチロシナーゼに対して優れた特異性を有しており、それによりヒ卜チロシナーゼを検知できることが明かである。実施例 5 ヒトチ口シナーゼの検知（PI) —悪性黒色腫の転移巣の免疫染色実施例 1で得られたモノクローナル抗体を使用してヒトのリンパ節への悪性黒色腫の転移巣の免疫染色を行った。詳細を以下に示す。悪性黒色腫の転移したヒトのリンパ節の凍結組織あるいはパラフィン包埋組織を実施例 4に記載した方法により抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体により染色した。なお、抗ヒトチロシナ一ゼモノクローナル抗体で処理しない組織を対象区とした。なお、リンパ節に悪性黒色腫が転移していることを確認するために組織の D 0 P A染色を実施例 1で示した方法により行った。これらの結果を図 1 2、 1 3および 1 4に示す。

図 1 2力、ら、 D O P A染色よりリンパ節組織が染色されており、使用したリンパ節には確かに悪性黒色腫が転移していることがわかる。一方、図 1 3および 1 4より、抗ヒトチロシナーゼモノク口一ナル抗体で処理しなかつた組織は全く染色されなかったが、抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体で処理した組織は D O P A染色より、高感度で染色された。従って、抗ヒトチロシナーゼモノクロ一ナル抗体は、正常なリンパ節内にはなく、悪性黒色腫が転移したリンパ節内にだけ存在しているチロシナ一ゼを検出することができる。すなわち、抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体はヒトのリンパ節への悪性黒色腫の転移を判定するための診断薬として使用できることが明らかである。この他、悪性黒色腫の原発巣においても染色が可能であり、その染色像は健常人の皮膚とは全く異なることから悪性黒色腫の切除の範囲を決定するための診断薬としても使用できる。さらに、これらの病巣のサンプルはパラフィン包埋されたものでよいため、一般的な臨床の場面での使用が可能である。産業上の利用可能性本発明は、ヒ卜のチロシナーゼに対して優れた特異性を有するモノクローナル抗体を使用するので、ヒトチロシナーゼを特異的に検知することができる。また、本抗体はマウスチロシナーゼとも結合するので、実験動物のチ口シナーゼも検知することができる。さらに、白髪、白皮症等の色素異常症の病態解明、あるいは悪性黒色腫の原発巣および転移巣の診断に使用することができる。配列表配列番号： 1

配列の長さ： 14

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Met Glu Lys Glu Asp Tyr His Ser Leu Tyr Gin Ser His Leu

1 5 10 配列番号： 2

配列の長さ： 17

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

His Phe Pro Arg Ala Cys Val Ser Ser Lys Asn Leu Met Glu Lys Glu

5 10 15

Cys 配列番号： 3

配列の長さ： 19

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Pro Glu Gly Pro Leu Arg Arg Asn Pro Gly Asn His Asp Lys Ser Arg

5 10 15 Thr Pro Arg 配列番号： 4

配列の長さ： 19

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

lie Ser Ser Lys Asp Leu Gly Tyr Asp Tyr Ser Tyr Leu Gin Asp Ser

5 10 15

Asp Pro Asp 配列番号： 5

配列の長さ： 25

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Val Leu Thr Ala Leu Leu Ala Gly Leu Val Ser Leu Leu Cys Arg His

5 10 15

Lys Arg Lys Gin Leu Pro Glu Glu Lys

20 25 配列番号： 6

配列の長さ： 4

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列 Glu Asp Tyr His 配列番号： 7 配列の長さ： 4 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ぺプチド配列

Asp Asp Tyr His

Claims

請求の範囲 ·

1. 下記性質を有するモノクローナル抗体。

(a) ヒトチロシナーゼに結合する。

(b) マウスチロシナーゼに結合する。

(c) チロシナーゼ関連蛋白に結合しない。

2. ヒトチ口シナ一ゼのアミノ酸配列のうち、チロシナ一ゼ関連蛋白のァミノ酸配列と相同性の低い領域を抗原として認識する請求項 1記載のモノクローナルす几体。

3. 前記領域が、配列表配列番号 1に示すァミノ酸配列の少なくとも一部であることを特徴とする請求項 1記載の抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体。

4. アイソタイプが I gG 1である請求項 1記載のモノクローナル抗体。

5. 下記工程を含む請求項 1記載のモノク口一ナル抗体の製造法、

(a) ヒトチロシナーゼのアミノ酸配列のうち、チロシナーゼ関連蛋白のアミノ酸配列と相同性の低い領域のァミノ酸配列の少なくとも一部を有するぺプチドと担体との結合物を用いて哺乳動物を免疫した後、その動物の脾細胞を取り出し、培養細胞と融合してハイプリドーマを作製し、

(b) ヒトチロシナーゼ及びマウスチロシナーゼに結合し、かつ、チロシナーゼ関連蛋白に結合しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択し、

( c) 前記ハイプリドーマを適当な培地で培養した培養上清、あるいは前記ハイブリドーマをマウス腹腔内で培養して得られる腹水から抗体蛋白を採取する。

6. モノクローナル抗体を用いた免疫学的方法によりヒトチロシナーゼを検知する方法において、請求項 1記載のモノクローナル抗体を用いる方法。

7. 請求項 6記載の方法によりヒトチロシナーゼを検知することを特徴とする色素関連疾病の診断法。

8 . 有色マウスを用いたチロシナーゼ蛋白の挙動'を調べる動物試験において、チ口シナ一ゼ蛋白の挙動を請求項 1記載のモノク口一ナル抗体を用し、た免疫学的方法により調べることを特徴とする方法。

9 . 請求項 1記載のモノクローナル抗体を有効成分とする悪性黒色腫の診断薬 c

1 0 . 請求項 1記載のモノクローナル抗体を用いた免疫学的方法によりチロシナ一ゼを検知することを特徴とする動物の悪性黒色種の検出法。

1 1 . 動物に試料を投与し、請求項 1記載のモノクローナル抗体を用いた免疫学的方法によりその動物におけるチロシナ一ゼ蛋白を測定し、投与前後のチロシナーゼ蛋白の量的変動を生じさせる試料を選択することを特徴とするメラニン産生を抑制あるいは促進する物質を検索する方法。