JPH09501571A

JPH09501571A - モノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH09501571A
Application number: JP7507411A
Authority: JP
Inventors: フレッドボドマー，ウォルター; ダービン，ヘルガ; スネイリー，デイビッド; マリーダイエットスチュワート，ローナ; ヤング，スーザン; アランベイツ，ポール
Original assignee: インペリアルキャンサーリサーチテクノロジィリミテッド
Priority date: 1993-08-21
Filing date: 1994-08-19
Publication date: 1997-02-18
Anticipated expiration: 2019-02-03
Also published as: DE69431602T2; ATE226596T1; DK0721470T3; JP3492373B2; CA2168440A1; PT721470E; DE69431602D1; AU7390694A; WO1995006067A1; ES2187529T3; CA2168440C; US5965710A; GB9317423D0; EP0721470B1; EP0721470A1

Abstract

(57)【要約】Ｖ_H鎖の配列が、あるいはＶ_H鎖の配列が、Ｖ_HＣＤＲ１の最初のアミノ酸残基がグルタミンであること以外は上と同じであり、どちらの場合でもＶ_L鎖の配列がであるＩｇＧ₁グループＩＩＡ重鎖とκグループＶ軽鎖とを備える完全なマウスモノクローナル抗体以外の分子であって、（i）膜結合性ヒト癌胎児性抗原を結合し、（ii）ヒト癌胎児性抗原の４９０残基〜Ｃ末端に結合（Ｎ−Ｃ）したヒトの胆汁糖タンパク質の１〜３１４残基からなるハイブリッドポリペプチドを結合し、かつ（iii）ヒトの胆汁糖タンパク質に結合しない分子。好ましくは、前記分子がモノクローナル抗体である。

Description

【発明の詳細な説明】結腸直腸癌の診断および治療に使用されるモノクローナル抗体本発明は、結腸大腸癌の診断および治療に使用できる抗体に関する。抗体が、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）と反応することが知られているが、膜結合ＣＥＡと可溶型ＣＥＡの両方と反応するため、結腸大腸癌の診断には使用されていない。モノクローナル抗体ＰＲ１Ａ３は、ＮＳ１（Ｐ３／ＮＳ１／Ｉ-Ａｇ-４-１）ミエローマ細胞と正常な結腸大腸上皮細胞で免疫されたマウスの脾臓細胞とを融合することによって産生される（Richman & Bodmer 1987）。ＰＲ１Ａ３は、両方と非常に強く反応し、結腸直腸癌腫をほとんど区別せず、腫瘍に固定された抗原は見えるが、腫瘍を流出するリンパ管またはリンパ節内では見られないことから、他の結腸直腸上皮反応性抗体以上の利点を備えている（Granowska等 1989）。ＰＲ１Ａ３は、５９／６０の結腸大腸腫瘍と反応したが（Richman & Bodmer 1 987）、ＣＥＡ反応性Ｂ７２．３は７５％しか反応しなかった（Salvatore等 198 9）。胃、回腸、ｏｅｓｏｐｈａｇｕｓ、気管およびｂｒｅａｓｔの正常細胞に弱く結合することがいくつか証明されているが、ｉｎｖｉｖｏ試験により、基底膜がこれらの組織への上記抗体の接近を妨げることが示された（Granowska等 1990）。ＰＲ１Ａ３は、イムノグロブリンとして一般に普及しているが、そのハイブリドーマは利用されていない。ＰＲ１Ａ３が結合する的確なエピトープは、知られていなかった。本発明は、結腸直腸癌に対してＰＲ１Ａ３と同等以上の特異性を備えたモノクローナル抗体を含む分子を提供する。このような抗体は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、すなわち結腸直腸癌腫に提示された腫瘍マーカーの一部であることが判明した新規に見出されたＰＲ１Ａ３エピトープに対するモノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）を産生することによって調製することができる。本発明の第一の態様は、（i）膜結合性ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を結合し、（ii）完全なヒトＣＥＡの４９０残基〜Ｃ末端に結合（Ｎ−Ｃ）したヒトの胆汁糖タンパク質（ＢＧＰ）の１〜３１４残基からなるハイブリッドポリペプチドを結合し、（iii）ヒトのＢＧＰに結合しない分子であって、Ｖ_H鎖の配列が、あるいはＶ_H鎖の配列が、Ｖ_HＣＤＲ１の最初のアミノ酸残基がグルタミンであること以外は上と同じであり、どちらの場合でもＶ_L鎖の配列がであるＩｇＧ₁グループＩＩＡ重鎖とκグループＶ軽鎖とを備える完全なマウスモノクローナル抗体以外の分子を提供する。Ｖ_H鎖の配列は、以下のようにも記載できる。また、Ｖ_L鎖の配列は以下のようにも記載できる。Ｖ_HＣＤＲ１の最初のアミノ酸残基は、上記Ｖ_H配列の３１位である。前記分子は、抗体であることが好ましい。ヒトＣＥＡの（Ａ３のＣターミナルハーフ）-Ｂ３-ＧＰＩドメインに結合（Ｎ −Ｃ）したＢＧＰのＮ-Ａ１-Ｂ１-（Ａ２のＮターミナルハーフ）ドメインからなるハイブリッドポリペプチドが、実施例１に詳細に記載され、図８にキメラ１として図式的に示されている。これは、ＢＧＰの１〜３１４残基をＣＥＡの４９０残基〜ｃ末端にＮ−Ｃ型に融合したものである。完全なＣＥＡのＣ末端は、６６８残基である。 “膜結合”という用語により、例えばAmerican Type Culture Collection，12 301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852．USA カタログナンバー ATCC HTB 38の適度に良く分化したグレードIIヒト結腸アデノカルノノーマ（adenoca rcinoma）セルライン、ＨＴ−２９セルライン等の結腸癌腫細胞に見られるようなＣＥＡを意味する。 “結合”という用語は、カバーガラスで生育したアセトン固定ＣＥＡ陽性細胞単層の間接免疫蛍光法によって評価する際に、陽性ソグナルは、その後の蛍光複合抗マウス（またはヒト）ＩｇＧ抗体を用いたインキュベーションによって見ることができることを意味する。実施例７は、細胞のアセトン固定および結合の決定について記載する。抗体重鎖がＩｇＧ₁であることは、免疫拡散法ゲル（Ouchterlony technique）におけるイソタイプ血清に特異的な抗血清との反応によって、または酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定することができる。マウスＩｇＧ重鎖に反応し、診断に使用できるモノクローナル抗体は、市販のものを利用することができ、例えば９ｘ１０⁸Ｍ^-1の結合活性を備えたSerotec社、22 Bankside，Station Approach，Kidlington，Oxford OX5 IJE，UKのラットモノクローナル抗体クローンＬＯ-ＭＧ１-２を利用することができる。抗体軽鎖がκであることは、免疫拡散法ゲルにおける特異的抗血清との反応およびＥＬＩＳＡによって決定することができる。マウスκ軽鎖と反応し診断に使用できるモノクローナル抗体は、市販のものを利用することができ、例えばSero tec社のラットモノクローナル抗体クローンＭＲＣＯＸ-２０を利用することができる。ＩｇＧグループＩＩＡおよびκグループＶは、Ｖ領域のサブタイプと称され、参照として取り込んだKabatら(1991)Sequence of Proteins of Immunological I nterest，fifth edition，US Department of Health and Human Services，NIH Publication No91-3242に記載されたＶ領域フレームワークの配列によって明確にされている。上記分子は、ヒトの体内に存在し、腸に位置する自然に産生した他のヒトタンパクに実質的に結合しないことが好ましい。このようなタンパクには、コラーゲンおよび血清アルブミンが含まれる。この分子が、Ｎ-Ａ１-Ｆｃ、Ｎ-Ａ１-Ｂ１-ＦｃもしくはＮ-Ａ１-Ｂ１-Ａ２- Ｆｃに結合しないことが好ましい。ここで、Ａ１、Ｂ１およびＡ２はＣＥＡのドメインであり、ＦｃはイムノグロブリンのＦｃタンパクである。この分子が、Ｂ３ハイブリッドに結合しないことがさらに好ましい。ここでＧＰＩアンカーは除去されているか、ＧＰＩアンカーはＢＧＰトランスメンブレンセグメントで置換されている。この分子が抗体である場合には、ヒトフレームワーク領域および少なくとも請求項１記載のＶ_H鎖およびＶ_L鎖の相補性決定領域を含有することが好ましく、ここでＶ_H鎖のＣＤＲ１はＶＦＧＭＮ（ＳＥＱＩＤＮｏ３）、ＣＤＲ２はＷＩＮＴＫＴＧＥＡＴＹＶＥＥＦＫＧ（ＳＥＱＩＤＮｏ４）およびＣＤＲ３はＷＤＦＹＤＹＶＥＡＭＤＹ（ＳＥＱＩＤＮｏ５）であり、Ｖ_L鎖のＣＤＲ１はＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡ（ＳＥＱＩＤＮｏ６）、ＣＤＲ２はＳＡＳＹＲＹＳ（ＳＥＱＩＤＮｏ７）およびＣＤＲ３はＨＱＹＹＴＹＰＬＦＴ（ＳＥＱＩＤＮｏ８）である。ＰＲ１Ａ３は、ＩｇＧ１グループＩＩＡ重鎖およびκグループＶ軽鎖を有するマウスモノクローナル抗体であり、Ｖ_H鎖の配列が本発明の第一の態様から除外した上述のものもしくはＶ_HＣＤＲ１の最初のアミノ酸残基がグルタミンであるもの、並びにＶ_L鎖の配列が本発明の第一の態様から除外した上述のものである。ＣＥＡは、免疫グロブリンスーパージーンファミリー（Thompson & Zimmerman n 1988; Thompsonら1991参照）の一つである。ＣＥＡは、Ｎ-Ａ１-Ｂ１-Ａ２-Ｂ２-Ａ３-Ｂ３-ＧＰＩのドメイン構造を備えており、ＧＰＩはグリコホスファチジルイノシトール膜アンカーである。かなりの程度の配列相同性が、ＣＥＡのドメインおよびＮＣＡ等のファミリーの他のメンバーとの間に存在する。胆汁糖タンパク（ＢＧＰ）も、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの一つであり、Ｎ-Ａ１-Ｂ１-Ａ２-ＴＭのドメイン構造をとりＴＭはトランスメンブレンドメインであるが、ＢＧＰのＡ１、Ｂ１およびＡ２ドメインは、ＣＥＡのＡ１、Ｂ１およびＡ２と称されるドメインとは別である。 “抗体”という用語に、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体、抗体断片を含める。この抗体断片は、（i）ヒトＣＥＡ、（ii）ヒトＣＥＡの４９０残基〜Ｃ末端に結合（Ｎ−Ｃ）したヒトのＢＧＰの１〜３１４残基からなるハイブリッドポリペプチドに特異的かつ可逆的に結合するが、（iii）ヒトＢＧＰには結合しないものであって、ＩｇＧ₁グループＩＩＡ重鎖とκグループＶ軽鎖とを備える完全なマウスモノクローナル抗体、すなわちＶ_H鎖の配列が（図１に示されたもの）かもしくはＶ_HＣＤＲ１の最初のアミノ酸残基がグルタミンでありかつ、Ｖ_L鎖の配列が（図２に示されたもの）である抗体を除く。抗体または抗体断片が、モノクローナル抗体から誘導されることが好ましい。モノクローナル抗体は、参照として取り込まれたZola，H．(1988)("Monoclona l Antibodies−A manual of techniques" CRC Press)の技術によって一般的に調製することができる。Ｆａｂ、（Ｆａｂ）₂、Ｆｖ、ｓｃＦｖもしくはｄＡｂ断片等の抗体断片は、これに基づいて既知の方法で調製することができる。抗体は、例えばヒトの抗体のフレームワークにマウスの抗体のＣＤＲ領域を挿入することによって既知の方法でヒューマナイズ(humanized)することができる。抗体様分子は、国際特許第８４／０３７１２号の組換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる。このタンパクに特異的な領域を、McCaffertyら（1990）Nature 348 ，552-554の技術を用いてバクテリオファージの一部として発現させることができる。本発明の抗体様分子は、細胞内で発現されたＣＥＡまたはハイブリッドタンパクを固定してファージを選別するのに使用するGriffithsら（1993）EMBO J．12, 725-734に記載された方法を用いてファージディスプレイライブラリー(phage di splay libraries)から選別することができる。また、単層で生育され、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドで固定もしくは固定されていない適切な細胞もファージを結合するのに使用することができる。関係の無いファージを洗い流して、結合したファージを回収した。ＣＥＡまたはハイブリッドタンパクへの結合を切断し、バクテリアで再度増幅(reamplifying)して回収した。この選別および増幅工程は、本発明の抗体様分子である上記分子に係るファージを増すために数回行う。また、本発明の抗体様分子にファージディスプレイライブラリーからのペプチドと同様にして、ランダムペプチドライブラリーから選別されたペプチドも含める。抗体の可変重（Ｖ_H）領域と可変軽（Ｖ_L）領域は抗原認識に関与し、これは初期のプロテアーゼ分解実験で最初に認識された事実である。げっ歯類抗体の“ヒューマナイゼーション（humanisation）”によってさらなる確証が得られた。得られた抗体が、げっ歯類を親とする抗体の抗原特異性を保有するように、げっ歯類に由来する可変領域を、ヒトに由来する定常領域に融合することができ（Morr isonら（1984）Proc．Nat．Acad．Sci．USA 81，6851-6855）、げっ歯類の抗体をヒューマナイズするために“ＣＤＲ移植”を用いることができる。追加的または選択的に、組換えモノクローナル抗体を“プリマタイズ(primatised)”、すなわち重鎖および軽鎖の可変領域またはその一部並びに定常領域を二つの異なる霊長類の種から誘導することができ、好ましくは抗体の可変領域をマカクザル、定常領域をヒトから誘導する。このような抗体の利点としては、ヒト免疫グロブリンに対する高い相同性、ヒトエフェクター機能(human effector functions)の存在、低い免疫原性およびより長い血清半減期(serum half-life)（Newmanら（199 2）Biotechnology 10，1455）が含まれる。抗原特異性が可変領域によって付与され、定常領域とは別であることは、抗体断片の細菌発現を含む実験からわかっており、全てが一つ以上の可変領域を含んでいる。これらの分子は、Ｆａｂ様分子（Betterら（1988）Science 240，1041 ）；Ｆｖ分子（Skerraら（1988）Science 240，1038）；Ｖ_HおよびＶ_Lパートナー領域が柔軟なオリゴペプチドを介して連結されたシングルチェーンＦｖ（ＳｃＦｖ）分子（Birdら（1988）Science 242，423，Hustonら（1988）Proc．Natl． Acad．Sci．USA 85，5879）および単離されたＶ領域を含有するシングルドメイン抗体（ｄＡｂｓ）（Wardら（1989）Nature 341，544）を含む。特異的結合部位を保有する抗体断片の合成に係る技術の一般的な書評は、Winter & Milstein （1991）Nature 349，293-299に見られる。 “ＳｃＦｖ分子”とは、Ｖ_HおよびＶ_Lパートナー領域が柔軟なオリゴペプチドを介して連結された分子を意味する。ある状況では、抗体全体より抗体断片を用いた方が有利である。より小さい大きさの断片は、クリアランスを早め、かつ非腫瘍に対する腫瘍の割合を改善することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体断片は、Ｅ．ｃｏｌｉで発現および分泌され、大量の前記断片を容易に産生することができる。全体の抗体およびＦ（ａｂ’）₂フラグメントは“二価”である。“二価”とは、前記抗体およびＦ（ａｂ’）₂フラグメントが二つの抗原結合部位を有することである。対照的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂフラグメントは一価であり、一つだけの抗原結合部位を有する。 Tan，L.K.およびMorrison，S.L.(1988) Adv．Drug Deliv．Rev．2: 129-142、 Williams，G.(1988) Tibtech 6: 36-42およびNeuberger，M.S.ら(1988) 8th Int ernational Biotechnology Symposium Part 2，792-799（これらの全てを参照としてここに取り込む）に記載されているように、“抗体技術”は急速に進んでおり、本発明の抗体から誘導された抗体様分子を調製するのに良く適している。抗体が特異的に結合する抗原の研究もしくは単離および精製、並びに抗原提示細胞の視認化（イメージング）および処置に係る種々の目的にこれらの抗体を使用することができる。他の実施態様では、本発明の抗体を、シンチグラフィックラジオラベル(sclntigraphic radiolabel)、細胞毒性化合物またはラジオアイソトープ、非毒性のプロドラッグを細胞毒性の薬剤に変換する酵素、得られた複合物を結腸の腫瘍に向けるために免疫系を活性化する化合物、もしくは細胞刺激性化合物に結合する。このような複合物は、本発明の抗体からなる“結合部位”と、ラジオラベル、毒素または酵素等からなる“機能部位”とを備える。この抗体は、他の化合物の結合を物理的に妨害することによって、単にＣＥＡ抗原の活性をブロックするためのみに用いることもできる。この複合体（ペプチドまたはポリペプチド）の結合部位と機能部位は、O'Sull ivanら(1979) Anal．Biochem．100，100-108に一般に記載されたような、クロスリンキングポリペプチドの何らかの通常の方法によって互いに結合することができる。例えば、ある部位にチオール基を増し、他の部位をこれらのチオール基と反応する二価性の試薬、例えばヨード酢酸のＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＩＡ）またはＮ-スクシニミジル-３-（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）と反応させる。例えば、ｍ-マレイミドベンゾイル-Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル等のアミドおよびチオエーテル結合は、一般的にジスルヒド結合よりin vivoでより安定である。結合部位が炭水化物を含有する場合、抗体またはある抗体断片の場合等では、欧州特許第００８８６９５号の結合技術を用いて機能部位を炭水化物部位を介して結合することができる。複合体の機能的部位は、例えばBagshaweとその共同者の複合体（Bagshawe（19 87）Br．J．Cancer 56，531; Bagshaweら（1988）Br．J．Cancer 58，700; 国際特許第８８／０７３７８号）またはシアニド放出システム（国際特許第９１／１１２０１号）等の非毒性のプロドラッグを毒性の薬剤に変換するための酵素とすることができる。複合体に酵素全体が存在する必要はないが、当然に触媒部位は存在しなければならない。いわゆる“アブザイム(abzymes)”を用いることができ、モノクローナル抗体は、通常は反応仲間状態である、触媒反応を望む反応に係る化合物に対して産生される。得られた抗体は、反応のための酵素として作用することができる。複合体は、サイズ排除またはアフィニティークロマトグラフィーで精製することができ、二重の生物学的活性を試験することができる。抗原免疫反応性は、固定化した抗原を用いたenzyme-linked immunosorbent assay（ＥＬＩＳＡ）および生きた細胞内におけるラジオイムノアッセイを用いて測定することができる。エンザイムアッセイは、グルコース残基が加水分解されたときに吸収に変化を与える基質、例えば遊離した２-ニトロフェノールが４０５ｎｍで分光光学的に測定されるｏＮＰＧ（ｏ-ニトロフェニル-β-Ｄ-グルコピラノシド）等を用いて、 β-グルコシダーゼに使用することができる。複合体の安定性は、血清中で３７度でインキュベートすることによって最初にｉｎｖｉｔｒｏで試験を行い、次いでサイズ排除ＦＰＬＣ分析を行った。ｉｎｖｉｔｒｏでの安定性は、複合体を注射してから様々な時間経過後に血清を分析することによってマウスにおいても同様に試験することができる。さらに、複合体形成前に¹²⁵Ｉで抗体を、また¹³¹Ｉで酵素を放射能標識することができ、マウス内における複合体、遊離した抗体および遊離した酵素の生物学的拡散（バイオディストリビューション）を測定することができる。あるいは、前記複合体を組換えＤＮＡ技術により融合化合物として産生することもでき、この技術によれば、互いに隣接した、もしくは複合体の所望の特性を壊さないリンカーペプチドをコードする領域で分けられた複合体の二つの部位をコードする各領域を一本のＤＮＡが備えている。考えられるところでは、化合物の二つの機能的部位は、完全または部分的にオーバーラップしてもよい。次いで、ＤＮＡを、既知の方法を用いて適切な宿主中で発現させる。この複合体は、例えば等張生理食塩水（静脈内投与する場合）等の、標準的な無菌の非発熱原性の希釈および輸送剤とあわせて、通常は静脈内または腹腔内（ intraperitoneally）等の非経口的に適切な方法で投与することができる。複合体が標的細胞に結合して（必要であれば）血流から除去されたら（普通は一日くらいかかる）、一般的には一回の注入量としてプロドラッグを投与するか、腫瘍を視認（イメージ）できるようにする。必要であれば、複合体が抗原性であることから、より長い間治療できるようにシクロスポリンまたは他の免疫抑制剤を投与することができるが、普通は必要としない。複合体の投与とプロドラッグの投与との間の時間は、非発明的方法で最適化することができる。複合体の腫瘍／正常組織比は（少なくとも静脈輸送が続く）、約４−６日後に最高となるが、このとき腫瘍に結合した複合体の絶対量、すなわちグラムあたりの注入量のパーセントに換算すると前に比べて低くなる。それゆえ、複合体の投与とプロドラッグの投与との間の最適な間隔は、酵素のピーク腫瘍濃度と、腫瘍と正常な組織との間の最適な分散率との間の折衷となる。複合体の投与量は、通常の基準に従って医師によって選択される。少なくとも β-グルコシダーゼ等の標的化された酵素と毒性プロドラッグとしてアミグダリンの静脈内投与を用いる方法の場合には、体の表面積の平方メートルあたり０．１〜１０．０ｇの１〜５０の日々の投与、好ましくは１．０〜５．０ｇ／ｍ²が適切であろう。経口治療では、０．０５〜１０．０ｇ、好ましくは１．０〜５．０ｇの一日３回投与を１〜５０日間行うのが適切である。どの複合体の投与量も、特に腫瘍のタイプ、段階および位置並びに患者の体重を参考に通常の基準に従って同様に選択される。治療の持続期間は、複合体に対するあらゆる免疫反応の急速性および範囲に部分的に依存する。複合体を診断に使用する際には、通常はこの複合体の機能的部位が、例えばテクネチウム９９ｍ（^99mＴｃ）またはヨウ素１２３（¹²³Ｉ）等のシンチグラフィーの研究のための放射活性原子、もしくはヨウ素１２３、ヨウ素１３１、インジウム１１１、フッ素１９、炭素１３、窒素１５、酸素１７、ガドリニウム(gadol inium)、マンガンもしくは鉄等の核磁気共鳴（ｎｍｒ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ｍｒｉとしても知られる）用のスピンラベルを備える。腫瘍の選択的破壊のための化合物に用いる場合には、機能的部位は、隣接する細胞を破壊するのに十分なエネルギーを照射するヨウ素１３１、レニウム１８６、レニウム１８８、イッテリウム９０または鉛２１２等の高度に放射活性を備えた原子、あるいはメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド(v inca alkaloids)（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド(etoposide)）、ダウノルビシンもしくは他の挿入剤等の細胞毒性化学化合物を含有することができる。放射線または他の標識は、既知の方法で複合体に取り込むことができる。例えば、ペプチドは、生合成によりもしくは、例えば水素の位置にフッ素１９を含む適切なアミノ酸前駆物質を用いた化学的アミノ酸合成方法によって合成することもできる。^99mＴｃ、¹²³Ｉ、¹⁸⁶Ｒｈ、¹⁸⁸Ｒｈおよび¹¹¹Ｉｎ等の標識は、ペプチドのシステイン残基を介して取り付けることができる。イッテリウム９０はリジン残基を介して取り付けることができる。ヨードゲン方法(The IODOGEN metho d)（Frakerら（1978）Biochem．Biophys．Res．Commun．80：49-57）は、ヨウ素１２３の取り込みに使用できる。“イムノシンチグラフィーにおけるモノクローナル抗体(Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy)”（Chatal，CRC Pre ss 1989）は、詳細に他の方法を記載している。本発明の第二の態様は、医薬に用いるための本発明の第一の態様に定義したような分子、好ましくは抗体を提供する。本発明の第三の態様は、結腸のがん腫を診断または治療することに用いる医薬の製造における、本発明の第一の態様に定義した分子、好ましくは抗体の使用を提供する。本発明の第四の態様は、単一特異的な抗体を作成する方法を提供するものであって、この方法は、（i）ヒトの膜に基づくＣＥＡに結合し、（ii）ヒトＣＥＡの４９０残基〜Ｃ末端に結合（Ｎ−Ｃ）したヒトＢＧＰの１〜３１４残基からなるハイブリッドポリペプチドに結合するが、（iii）ヒトＢＧＰには結合しない単一特異的抗体を選択するために抗体のプールをスクリーニングすることを含む。単一特異的抗体がモノクローナル抗体であり、抗体のプールがモノクローナル抗体のプールであると好ましい。プール内の抗体は、組換えＤＮＡ方法によって産生された抗体を有するとさらに好ましい。好ましい態様では、スクリーニング段階で抗体が以下の条件合うものである：（１）結腸の癌腫細胞（RichmanとBondmer（1987）Int．J．Cancer 39，317-328 ）等のヒトの腫瘍細胞およびヒトの胃の癌腫セルラインＭＫＮ４５（Kojamaら（ 1990）Jpn．J．Cancer 81，967-970）に結合するもの。例えばアセトンを用いて細胞をスライドガラスまたはカバーガラスに固定し、第二の蛍光標識化抗種抗体、例えばもし最初の抗体がマウスＩｇＧであればＦＩＴＣ標識化した抗マウスＩｇＧによって抗体の結合を検出する間接的な免疫蛍光アッセイで結合を検出する。もしくは懸濁液中の細胞に結合する抗体を測定することができ、抗体結合を放射線活性標識した第二抗体、例えば¹²⁵Ｉ標識化抗マウスＩｇＧによって検出することができる。（２）ヒトＣＥＡが移入され、ヒトＣＥＡを発現する細胞に結合するもの。例えば、ベクターｐＣＤＭ８（Invitrogen）内のＣＥＡｃＤＮＡ（Beaucheminら（1 987）Mol．Cell．Biol．7，3221-3230）を用いてエレクトロポレーションによって移入されたサルウイルス４０-形質転換されたサルの繊維芽細胞ラインＣＯＳ- ７；デキサメタゾン(dexamethasone)誘発性ベクターｐＭＡＭｎｅｏ(Clontech) 内のＣＥＡｃＤＮＡを用いてエレクトロポレーションによって形質転換されたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）：プラスミドｐＳＶｎｅｏ２を用いたリポフェクションによってマウス結腸直腸の癌腫セルラインＣＭＴ９３に共形質転換（co-transfected）されたＣＥＡのコスミドクローン（Willcocks，T.C.とCra ig，I.W.(1990)Genomics 8，492-500）；ＣＥＡ遺伝子クラスター、例えばクロモソーム１９の長い腕のｑ１３．１−ｑ１３．３領域のＩＣＲＦｙ９０００Ｃ０２４００を含有し、かつ、ｐＹＡＣ４の右腕のベクターアームを備えたプラスミドベクターｐＲＡＮ４（Ragoussisら（1992）Nucleic Acids Res．290，3135-31 38）を用いた相同的組換え(homologous recombination)によってネオマイシン耐性（ｎｅｏ^R）遺伝子を含むように修飾されたイーストの人工的染色体（yeast a rtificial chromosome）すなわちＹＡＣで形質転換したＣＨＯ細胞であって、形質転換はイーストスフェロプラスト細胞融合（Burgers，P.とPercival，K.（198 7）Anal．Biochem 163，391-397）によって成されたものとすることができる。（３）例えばハイブリッド遺伝子を有するプラスミドｐＣＤＭ８を用いたエレクトロポレーションで形質転換されたＣＯＳ-７細胞等の、ハイブリッド遺伝子ＢＧＰ-ＣＥＡＢ３-ＧＰ１が移入され、これを発現する細胞に結合するもの。エレクトロポレーションは実施例６に記載されている。（４）ＣＥＡを発現せずにＢＧＰを発現する細胞には結合しないもの。例えば、ＢＧＰのｃＤＮＡを有するプラスミドｐＣＤＭ８を用いて形質転換されたＣＯＳ -７細胞など。（５）ＣＥＡを発現せずにＮＣＡを発現する細胞には結合しないもの。例えば、ＮＣＡのｃＤＮＡを有するプラスミドｐＣＤＭ８を用いて形質転換されたＣＯＳ -７細胞など（Heftaら（1990）Cancer Res．50，2397-2403）。（６）ＧＰＩアンカーが無くハイブリッドＢＧＰ-ＣＥＡＢ３を発現する細胞には結合しないもの。これらの細胞では、正常に処理されればＧＰＩアンカーで置換されるＣＥＡＢ３配列内の疎水性テール部の最初の位置にストップコドンが取り込まれた、ＢＧＰ-ＣＥＡＢ３のハイブリッド遺伝子を有するプラスミドｐＣＤＭ８を用いて形質転換した形質転換型ＣＯＳ-７がある。ＰＣＲは、このようなストップコドンを取り込むのに使用することができる。（７）ＢＧＰ-ＣＥＡＢ３-ＢＧＰＴＭを発現する細胞には結合しないもの。例えば、ＣＥＡの処理された疎水性セグメントに代えてＣＥＡのＢ３ドメインにＢＧＰのトランスメンブレンドメインが付加されたハイブリッド遺伝子を有するｐＣＤＭ８を用いて形質転換されたＣＯＳ-７など。ＣＥＡに結合しない使用可能な対照の抗体は、例えばＴ細胞マーカーＣＤ４を認識するものである。適切な抗ＣＤ４抗体は、例えばＯＫＴ４（抗ヒトヘルパーＴ細胞サブセット；ＡＴＣＣＣＲＬ８００２）等のＡＴＣＣから利用できる。本発明の抗体の選択は、どの順序で上記工程を行ってもよい。最初のスクリーニングを、ヒト腫瘍セルラインまたはｃＤＮＡまたはコスミドのＣＥＡを発現するトランスフェクトマ（transfectoma）等のＣＥＡ発現細胞ラインで行うことが好ましい。第二のスクリーニングを、上述の遺伝子およびハイブリッド遺伝子を用いて形質転換されたセルラインで行うことが好ましい。ＮＣＡは非特異的交差反応抗原であって、Ｎ、Ａ１およびＢ１ドメインとＧＰＩアンカーを備えている（ThomsonとZimmerman（1988）Tumour Biol．9，63-83 並びにThomsonら（1991）J．Clin．Lab．Analysis 5，344-366参照）。発現に適切な親セルラインは、ＣＥＡを発現しないＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞を含む。本発明を、以下の実施例および図面を参照しながら詳細に記載する。図１は、マウスのモノクローナル抗体のＶ_H鎖の推測されるアミノ酸配列（マウスの重鎖；ＳＥＱＩＤＮｏ１）、ヒューマナイゼーション（humanisation）用のフレームワーク配列を提供するために用いたヒト抗体ＲＦ-ＴＳ３’ＣＬのＶ_H配列との比較（ＲＦ-ＴＳ３バックボーン；ＳＥＱＩＤＮｏ２７）および作成したヒューマナイズ化配列（ヒューマナイズ化重鎖；ＳＥＱＩＤＮｏ２８）を示す。ＲＦ-ＴＳ３’ＣＬの配列は、参照としてここに取り込まれたPascualら（1990）J．Clin．Invest．86，1320-1328に開示されている。図２は、マウスのモノクローナル抗体のＶ_L鎖の推測されるアミノ酸配列（マウスのκ；ＳＥＱＩＤＮｏ２）、ヒューマナイゼーション用のフレームワーク配列を提供するために用いたヒト抗体ＲＥＩのＶ_L配列との比較（ＲＥＩバックボーン；ＳＥＱＩＤＮｏ２９）および作成したヒューマナイズ化配列（ヒューマナイズ化κ；ＳＥＱＩＤＮｏ３０）を示す。図３は、ＣＥＡとＮＣＡ−５０とのアミノ酸配列の比較を示す。対応するドメインは共にグループ化されている。どちらの場合も、点は各グループの一番上の行に示されたＣＥＡドメインのアミノ酸と同一であることを示す。ダッシュは、ＣＥＡと比較した場合のアミノ酸の欠失を示す。Ｎ-グリコシル化の可能性のある位置に下線を付した。図４は、ＢＧＰのｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮｏ３１）と推測されるアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮｏ３２）とを示す。図５は、ＧＰＩの構造を示す。図６は、ヒューマナイズ化した重鎖の構成を示す。ＦＲは、フレームワーク領域（framework regions）を示す；ＣＤＲは、相補性決定部位を示す；＝はヒト重鎖をコードする二本鎖ＤＮＡを示す；→は、オーバーラッピングＰＣＲ(overl aping PCR)のためのプライマーとして用いられた５’−３’の方向を示す合成オリゴヌクレオチドを示す。図７は、ヒューマナイズ化した軽鎖の構造を示す。ＦＲは、フラグメント領域を示す；ＣＤＲは相補性決定領域を示す；＝ヒューマナイズ化した重鎖をコードする二本鎖ＤＮＡを示す；→は、オーバーラップＰＣＲのためのプライマーとして用いられた５’−３’の方向を示す合成オリゴヌクレオチドを示す。図８は、ＢＧＰ−ＣＥＡキメラ構造物を示す。図９は、ヒューマナイズ化抗体のＶドメインのモデルを示す。軽鎖（Ｌ）および重鎖（Ｈ）の相補性決定部位（ＣＤＲｓ）１〜３の位置を示す。抗原認識に関係する二つのグルタミン酸残基、Ｅ（Ｈ：１０６）−重鎖の１０６位およびＥ（Ｈ：５７）−重鎖の５７位にしるしを付した。図１０は、ＣＥＡのＢ３ドメインのモデルを示す。リジンとアルギニン残基の位置にしるしを付した。ＫＧ３６（６３６位がリジン）とＲ５９４（５９４位がアルギニン）のｉｎｖｉｔｒｏ変異は、抗原へのＰＲ１Ａ３結合を破壊する。図１１は、ＮＣＡのｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮｏ３３）および推測されるアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮｏ３４）を示す。図１２は、ＣＥＡのｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮｏ３５）および推測されるアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮｏ３６）を示す。図１３は、ＰＲ１Ａ３κ軽鎖のｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮｏ３７）および推測されるアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮｏ３８）を示す。図１４は、ＰＲ１Ａ３重鎖のｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮｏ３９）および推測されるアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮｏ４０）を示す。実施例１：ＰＲ１Ａ３によって認識されるエピトープの同定ＹＡＣ（イーストの人工的クロモソーム）およびコスミドの研究は、ＰＲ１Ａ３抗原をコードする遺伝子を、ＣＥＡ遺伝子が位置する染色体の領域にマッピングし、ＣＥＡ様のＰＲ１Ａ３エピトープがγ-インターフェロンによってアップレギュレートされることが示された。ＣＥＡのｃＤＮＡの種々の細胞への移入により、これらの細胞上にＰＲ１Ａ３が出現し、モノクローナル抗体ＰＲ１Ａ３はＣＥＡのエピトープを認識することが示唆された。ＣＥＡのドメインは、Ｎ-Ａ１-ＦＣ、Ｎ-Ａ１-Ｂ１-ＦｃおよびＮ-Ａ１-Ｂ１- Ａ２-ＦｃとしてイムノグロブリンのＦｃ部位への融合物としてＣＯＳ細胞内に発現した。これらのどの構造物もＰＲ１Ａ３と反応するタンパク質を産生しなかったことから、前記エピトープはＮ-Ａ１-Ｂ１-Ａ２領域に位置していない。ＢＧＰとＣＥＡのハイブリッド構造物は、ＣＥＡの（Ａ３のＣ末端ハーフ）- Ｂ３-ＧＰＩドメインが、ＢＧＰのＮ-Ａ１-Ｂ１-（Ａ２のＮ末端ハーフ）ドメインに融合するように調製された。ＣＥＡとＢＧＰのアミノ酸配列は、図３および４に示されている。このハイブリッド構造物ナンバー１は、ＢＧＰのシステイン３１４までとＣＥＡのグルタミン酸４９０〜Ｃ末端までを含む（図８参照）。このハイブリッド構造物は、発現プラスミドｐＣＤＭ８からＣＯＳ細胞内に発現された。免疫蛍光アッセイで分析すると、形質転換されたＣＯＳ細胞は、マウスＰＲ１Ａ３抗体とヒト／マウスキメラ抗体との両方で正のシグナルを与えた（以下を参照）。これは、ＰＲ１Ａ３エピトープがＢ３-ＧＰＩ領域の領域内にあることを確証する。プラスミドｐＣＤＭ８は、SeedとAruffo（1987）Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA 84，3365-3369に記載されている。ＧＰＩアンカーがタンパク質に添加されないように、ハイブリッド構造物ナンバー１にストップコドンを導入した。ＣＥＡ部は、もはや膜結合型ではないが、可溶化され分泌される。ストップコドンは、ＣＥＡの６４４残基の位置に導入され、（Ｎ-Ａ１-Ｂ１-（Ａ２のＮ末端ハーフ））ＢＧＰ−（（Ａ３のＣ末端ハーフ）-Ｂ３）ＣＥＡが形成された（構造物ナンバー２；図８）。ベクターｐＣＤＭ８を用いたこの構造物のＣＯＳ細胞への移入（トランスフェクション）により、ＢＧＰと交差反応する抗体３Ｂ１０を用いた免疫蛍光的研究で陽性であるが、ＰＲ１Ａ３に陰性な細胞を得た。これは、ハイブリッドタンパクが発現したが、ハイブリッドが膜結合型でないときにはＰＲ１Ａ３エピトープが欠如していることを確証する。キメラ構造物３ａおよび３ｂを作成した。これらは、図８に示すような構造である。発現構造物の作成に用いたＰＣＲ法ＢＧＰのクローニングに以下のプライマーを用いた：ＣＥＡのクローニングに以下のプライマーを用いた：キメラ１用にＢＧＰとＣＥＡフラグメントを親分子からＰＣＲで増幅した。生産物をＣｌａＩで切断し、連結した。アニールした産物の５’と３’末端を、ＣＯＳ-７細胞内における一過性の発現のためのｐＣＤＭ８ベクターのＨｉｎｄIII -ＸｂａＩ部位に連結するために、ＨｉｎｄIIIとＸｂａＩで切断した。以下のプライマーを用いた：キメラ２は、キメラ１から増幅して、ｐＣＤＭ８への連結のためにＨｉｎｄII IとＸｂａＩで切断した。以下のプライマーを用いた：キメラ３ａと３ｂを作成するために、分子の５’部位を、ＢＧＰ５’プライマーと必要な継ぎ目に相補的なアンチセンスオーバーラッピングプライマーとを用いてキメラ１の鋳型から増幅した。このＢＧＰトランスメンブレンドメインを、センスオーバーラッピングプライマー(sense overlapping primer)とＢＧＰ３’ プライマーとを用いたＢＧＰから増幅した。アニール化した分子を集めるために、“プライマー-ダイマー”を形成するために二つの相補的フラグメントを１８ＰＣＲサイクルにかけ、１２の更なるＰＣＲサイクル用のＢＧＰ５’および３’アウトサイド(outside)プライマーを添加した。構造物３ａ用に以下のプライマーを用いた：以下のプライマーを構造物３ｂ用に用いた：アンカーの構造は、Ferguson(1992)に記載されており、哺乳類のＧＰＩの遺伝子構造は図５に示されている。ＧＰＩアンカーから脂質の尾部（テール）を切断して可溶生産物を与えるホスホリパーゼでインキュベートすることによってＭＫＮ４５細胞から放出されたＣＥＡを用いた研究により、ＰＲ１Ａ３エピトープを含有するＣＥＡを生産される。ＳＤＳＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングで試験する際に、ジスルフィド結合を切断する還元剤ジチオトレイトールを含む２％ＳＤＳサンプルバッファーでこの抗原を煮沸した場合に、弱いシグナルが得られる。還元剤がジスルフィド結合を完全には維持しないことを除いては同様の方法で、この抗原を試験した場合には、強いシグナルが得られた。このことから、このエピトープが少なくとも部分的に配座的（コンホメーショナル）であることが示唆される。さらに、ＮＣＡは高度の配列相同性を備えた点でＣＥＡと関係しており、ＧＰＩアンカーを備えているが、ＰＲ１Ａ３と反応しない。従って、ＧＰＩは、このエピトープに十分なものではない。実施例２：分子モデルおよびｉｎｖｉｔｒｏ変異抗体ＰＲ１Ａ３の分子モデルは、抗体のＣＤＲ領域に通常のものではない二つの不対のネガティブチャージがあることを示している。これらのチャージは、抗体によって認識されたエピトープに相補的なチャージが存在することを示唆しているのだろう（図９および１０参照）。ＣＥＡのＢ３ドメインの分析および他のファミリーメンバーであるＮＣＡとの比較により、抗原-抗体反応で重要な役割を演ずるポジティブチャージを有する３つの残基があることが示唆された。この残基は、ＣＥＡＢ３ドメインの６１０位および６３６位のリジンと５１４位のアルギニンであった。抗体ＰＲ１Ａ３によって認識されるエピトープにおける個々のチャージの役割を調べるために、これらの残基をリジンまたはアルギニンからアラニンに変えた。ＤＮＡ配列を変えることによりアミノ酸を変更することが可能である。ポリメラーゼチェーン反応は、増幅プライマーの一つに取り込まれる部分変異（ポイントミューテーション）を導入するために使用することができる。このフラグメントを、クレノウフラグメントを備えた平滑末端とするか制限エンドヌクレアーゼで切断し、産物を配列決定するために適切なベクターに連結する。あるいは、配列の中部に変異を導入するために、ミューテーションを包括する二つのフラグメントを互いにアニールし、相互に開始される合成法（mutually primed synthesis）によって延長する。次いで、このフラグメントを切断し、配列決定するのに適した適切なベクターに連結する。ＴａｑポリメラーゼおよびＴａｑリガーゼで増幅する際に、リン酸化オリゴヌクレオチドを取り込むためにＰＣＲを使用することもできる（Michel，BioTechn iques 16(3)，410-412）。変異は、全体的に合成された遺伝子もしくは遺伝子の一部の調製によっても導入することができる。配列に変化を導入するのに使用した方法は、ＫｕｎＫｅｌの方法（1985 Proc. Natl．Acad．Sci．USA 82，488-492）によるオリゴヌクレオチド向け変異誘発(o ligonucleotide directed mutagenesis)である。ＣＥＡの反復特性は、変異誘発を行うためにＣＥＡのＢ３ドメインおよび下流配列が類似の上流配列から単離される必要があることを意味する。この領域を、 ClaI５’部位とXbaI３’部位を導入するプライマーを用いて増幅し、このフラグメントをｐBluescriptII KS-にクローン化した。このプラスミドを、チミジンの代わりに多量のウラシル残基を含むプラスミドを産生するＥ．ｃｏｌｉのｄｕｔ^- ｕｎｇ^-Ｆ’株（ＣＪ２３６）に形質転換した。一本鎖鋳型をヘルパーファージＭ１３Ｋ０７を用いたスーパーインフェクション（superinfection）で産生した。変異配列を含有するリン酸化オリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニールし、二本鎖環状分子を産生するためにＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびリガーゼの存在下で伸長した。このヘテロ二本鎖分子を野生株（ｄｕｔ⁺ｕｎｇ⁺）に導入することにより、ウラシル含有野生型鎖の分離および変異鎖の複製を引き起こした。コロニーを単離し、変異遺伝子型が存在することを確かめるためにＤＮＡの配列を決定した。変異変異構造物の配列決定を行った後、これらのＢ３ドメインをＢＧＰの１−３１４残基およびＣＥＡの４９０−６６８残基からなるキメラタンパクを作成するために用いた。これらの製造物は、ＣＯＳ細胞で一時的に発現された場合に、ＰＲ１Ａ３に陽性であることが示された。ｐＣＤＭ８に挿入してＣＯＳ細胞で発現した後に、免疫蛍光実験によって、Ｋ２（リジン６３６→アラニン）およびＲ３（アルギニン５９４→アラニン）変異を有する製造物はＰＲ１Ａ３にもはや認識されないが、Ｋ１（リジン６１０→アラニン）変異は結合に何の影響も与えないことが証明された（図１０参照）。これらの結果は、エピトープのＫ２およびＲ３残基がＰＲ１Ａ３によって認識されることを示す。実施例３：ＣＥＡに反応するモノクローナル抗体の調製および特性 RichmanとBodmer(1987)の方法でＣＥＡに反応するモノクローナル抗体を調製した。組織、細胞、細胞培養正常な大腸および結腸の腫瘍の新鮮なサンプルを用いた。これらを、液体窒素で素早く凍結し−７０℃で保存した。結腸外(extra-clonic)正常成人および胎児の組織の冷凍サンプルを用いた。使用した結腸癌腫セルラインは、異なる腫瘍に由来する。ＨＴ２９結腸癌腫セルライン（FoghとTrempe，1975）は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有する培地ＲＰＭ１１６４０で、３７℃、５％ＣＯ₂を空気中に含み１００％の湿度で維持した。ＬＳ１７４Ｔ、ＳＷ１２２２、ＳＷ４８、ＳＷ６２０およびＳＷ８３７結腸癌腫セルライン（Tomら，1976；Leibovitzら，1976）を１０％ＦＣＳを含有するダルベッコの調節イーグル培地(Dulbecco's modified Eagle's medium)で、３７℃、１０％ＣＯ₂を空気中に含み１００％の湿度で維持した。Ｐ３／ＮＳ１／１-Ａｇ-４-１（ＮＳ１）は、８-アザグアニン耐性ＢＡＬＢ／ｃミエローマセルラインである。これを、１０％ＦＣＳと２ｘ１０^-5Ｍ６-チオグアニンを有するＲＰＭＩ１６４０で維持した。この研究で産生されたハイブリドーマは、２０％ＦＣＳ、１０^-4Ｍヒポキサンチン、１．６ｘ１０^-5Ｍチミジンおよび１０^-5 メトトレキセート（ＨＡＴ）を有するＲＰＭＩ１６４０で最初に培養した。クローニング後、ハイブリドーマ細胞からＨＡＴを除き、１０％ＦＣＳを有するＲＭＰＩ１６４０で維持した。免疫材料ＢＡＬＢ／ｃマウスを４種の異なる標品で免疫した。１．正常な結腸粘膜の検体。正常な大腸のサンプルをコルク板(cork board)上にピンでとめた。冷えた無菌リン酸緩衝液Ａ，ｐＨ７．４（ＰＢＳ-Ａ）で（１０回）すすいだ後、粘膜をメスでこすり落として粘膜筋板から切開した。粘膜の検体を液体窒素で素早く凍結し、タングステンボールベアリング（tungsten ballb earing）を備えたポリプロピレンバイアル中でパウダー状になるまで機械的に振動を与えた。この物質を、０．２ｍｌの完全フロイントアジュバントと０．２ｍｌのＰＢＳ-Ａで懸濁した。一度の接種につき、０．４ｍｌのエマルション中の０．２ｇの湿組織(wet tissue)を動物に与えた。２．正常な結腸上皮のクルードな膜調製物。新鮮な正常結腸粘膜検体は上述のようにして調製した。湿組織１グラムを、各膜調製物のために使用した。組織サンプルを、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含有する１０ｍｌスクロースバッファーに解かし（戻し）、Dounce-ホモジェナイズを行った（２５０ｍＭスクロール -ＲＮアーゼフリー：５０ｍＭトリエタノールアミン-ＨＣｌｐＨ７．５；６０ｍＭＭｇＣｌ₂；２ｍＭＤＴＴ）。４００００ｇで１５分間遠心した後、核およびミトコンドリアのペレットを捨てた。その上清を３０分間２００００ｇで遠心した。このミクロソームペレットを保持し、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌｐＨ７．４中の４０％スクロースに再度懸濁した。このスクロース溶液を屈折計の値が１．３９２−５となるように調節して、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌｐＨ７．４中の２５％スクロース（屈折計の値が１．３７５）を上層し、スクロース勾配を４℃で６５０００ｇで１５時間遠心した。膜を境界から回収し、１０ｍＭのＴｒｉｓｐＨ７．４で二度洗浄した；タンパク質含量をLowryら(1951)の方法で概算した。１ｇの湿組織から約１ｍｇの膜タンパクを回収した。注射用に、この膜をＰＢＳ-Ａおよび完全フロイントアジュバントに懸濁した。一度の接種につき０．４ｍｌのエマルションを動物に与えた。３．ＨＴ２９結腸癌腫セルライン。一度の接種につき、０．４ｍｌのＰＢＳ-Ａに懸濁した２ｘ１０⁶の生きたトリプシン処理細胞を与えた。４．免疫原としてのエピトープ。免疫原は、ハイブリッドＢＧＰ-ＣＥＡＢ３- ＧＰＩタンパクを保有する細胞またはＣＥＡのｃＤＮＡまたはコスミドを移入した細胞である。ＣＥＡ遺伝子を移入したマウスのＬ細胞を、ＣＥＡに対する抗体を与えるのに適したマウスの系統を免疫するために用いた。ＣＥＡを発現するヒト腫瘍細胞を使用することもできる。免疫化とハイブリドーマの作成以下のプロトコールに従って、腹腔内接種によって免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓を用いて３つの融合(fusions)を行った。融合１と２では、粘膜の検体と正常な結腸直腸の上皮の膜調製物で免疫および上昇（ブースト）させた（上記“免疫材料”参照）。融合３では、最初の免疫化を正常な結腸の膜調製物で行い、次のブースター（二次免疫）接種をＴＨ２９結腸癌腫細胞で行った。各融合の６週、２週および４日前にこれらの材料の腹腔内注射を動物に行った。それぞれの場合に、脾臓を無菌状態で取り出し、単一細胞懸濁液を機械的に調製し、ＲＰＭＩ１６４０中の５０％ポリエチレングリコール４０００（Merck）を用いて脾臓細胞を１０⁸ＮＳＩミエローマ細胞と融合した。これらの細胞を、ＨＡＴ＋２０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０および支持細胞層のマウス脾臓細胞を入れた２４または９６ウェルプレートに塗布（プレート）した。このプレートを３７℃、１００％の湿度、５％ＣＯ₂の空気中でインキュベートした。ハイブリドーマは、一般的に１４−２１日で顕微鏡で見ることができる。所望のコロニーを同定するための最初のスクリーニングをクローニングの前に行った。引き延ばされたパスツールピペットで単一の細胞を拾うことによって、これらのコロニーを二度クローン化し、２ｍｌのＲＰＭＩ１６４０、ＨＡＴおよび２０％のＦＣＳを上層したマウス脾臓細胞支持層を備えた９６ウェルのミクロタイタープレートの各ウェルに移し、３７℃、１００％の湿度、５％ＣＯ₂の空気中で培養した。抗体産生のスクリーニングアッセイ全ての融合物からの抗体産生のスクリーニングを、間接的イムノペルオキシダーゼ技術を用いた組織切片で行った。クリオスタットの切片（６μｍ厚）を正常な大腸の凍結立法体から切断した。この切片を、０．１％ポリ-１-リジンで予備被覆(precoated)された１０ウェルマルチテストスライド（C.A.Hendley-Essex， England）に載せ、室温で３０分間空気乾燥した。この切片を１５分間アセトンで固定した。各ウェルを多湿のチャンバーで室温で３０分間２０μｌの非濃縮ハイブリドーマ組織培養上清でインキュベートした。スライドをＴｒｉｓバッファー食塩水（ＴＢＳ）ｐＨ７．６（１ｌの蒸留水中にＴｒｉｓ，６０５ｍｇ、ＮａＣｌ，８ｇ）で二度洗浄した後、５％正常ヒト血清を含有するＴＢＳに１：５０で希釈したペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスイムノグロブリン（ＤＡＫＯ，コペンハーゲン、デンマーク）と共に室温で３０分間インキュベーションを行った。このスライドをＴＢＳで再度洗浄し、０．０３％過酸化水素を含有する１０ｍｌのＴｒｉｓＨＣｌｐＨ７．６中のジアミノベンジジン（Sigma．St．Louis， MO）５ｍｇの新鮮な濾過液に浸した。５分後に、水道水で洗浄することによってペルオキシダーゼ基質反応を止め、Ｈｅｙｅｒのヘマトキシリンで染色し、アルコールで脱水してＤＰＸ（ＢＤＸ、Poole，UK）に載せた。免疫組織化学法(Immunohistochemical methods) １．ホルマリン固定組織の間接的イムノペルオキシダーゼ染色。ホルマリン固定、パラフィン包理組織とＭＡｂｓとの反応性を調べるために、（ａ）１０％中性緩衝化ホルマリンもしくは（ｂ）酸性ホルマリン（１０％ホルマリン中の２％酢酸）のそれぞれに２時間固定した。一定の処理をした後、３−４μｍの切片を上述の間接ペルオキシダーゼ技術で染色した（“スクリーニング”参照）。染色の前に、メタノール中の０．５％過酸化水素の新鮮な調製液を用いて室温で多湿のチャンバー内で１０分間組織片をインキュベーションすることによって内因性のペルオキシダーゼ活性をブロックした。水道水で洗浄した後、用いた固定液のタイプに関わらず３つの方法の一つでスライドを処理した。（i）直接的染色；（i i）トリプシンで切断。切断用にスライドを蒸留水中で３７℃に温め、０．１％トリプシン（Sigma，type II）、０．１％ＣａＣｌ₂、ＮａＯＨでｐＨ７．８に調節した新鮮な溶液に５−４０分間移した。（iii）他のプロテアーゼ溶液で分解した。温められたスライドを、ＴＢＳ中のプロテアーゼ（Sigma，type IV），０．０２５％ｐＨ７．６の溶液に５−１５分間移した。上記（i）および（ii）では、酵素反応を冷えた流動水で止めた。水とＴＢＳで洗浄した後、分解された切片を間接的なイムノペルオキシダーゼ技術で染色した。２．凍結組織切片の間接イムノペルオキシダーゼ染色。正常な大腸の凍結切片、他の正常な組織および結腸の腫瘍を上述のように調製した（“スクリーニング” 参照）。これらを４ウェルのマルチテストスライド（C.A．Hendly-Essex）に拾い、染色した。これらは酵素分解されず、内因性ペルオキシダーゼ活性はブロックされていなかった。全ての組織をＭｅｙｅｒのヘマトキシリンで染色し、段階的なアルコールで脱水し、キシレンでクリアーにしてＤＰＸに載せた。３．凍結切片の免疫蛍光。正常な結腸組織と腫瘍の両方の凍結切片は、間接的免疫蛍光によって調べることもできる。アセトンで１５分間固定した後、切片をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。切片を多湿チャンバーで３０分間２０μ ｌの非濃縮ハイブリドーマの上清でインキュベートし、ＰＢＳで３度洗浄し、ＰＢＳに１：４０で希釈した蛍光結合ウサギ抗マウスＩｇＧ（ＤＡＫＯ）でさらに３０分間インキュベートした。ＰＢＳでさらに３度洗浄して、蒸留水で最後の洗浄を行った後、切片をGelvato 20/30(Monsanto，Springfield，MA)に載せ、エピフルオレセンス(epifluorescence)を備えたLeitz Orthoplan顕微鏡で観察した。４．セルラインの免疫細胞化学的試験。癌腫系統の細胞を、スライドガラス状で生育する。ＰＢＳ−Ａでこれらを三度洗浄し、生きているものか１０分間アセトンで固定したもののいずれかを染色する。５．コントロール。イムノヒストケミカル(Immunohistochemical)染色は、一次層として非ハイブリドーマ組織培養培地（１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０）の使用によって調節される。さらに、イムノペルオキシダーゼ染色用の第二の抗体酵素複合体およびジアミノベンジジン溶液は別々に使用することもできる。免疫蛍光には、ＦＩＴＣ結合ウサギ抗マウスＩｇＧを単独で使用することができる。これらの試薬による非特異的染色は観察されなかった。結腸直腸腫瘍の評価結腸腺癌は、ヘマトキシリンおよびエオシン(eosin)で染色された切片を用いてBlenkinsoppら(1981)の基準で組織学的に分類した。各抗体に対して、腫瘍を “陰性”（全く反応しない細胞）、“不均一”（ある細胞は反応する）もしくは “陽性”（全ての細胞が反応）と評価した。同じ腫瘍の異なる細胞間、もしくは腫瘍細胞と隣接した正常な上皮との間の染色強度の違いは時々観察されるが定量できない。抗体は、空気乾燥してカバーガラス上にアセトン固定したＣＥＡ陽性細胞を用いて間接的免疫蛍光アッセイでスクリーニングできる。また、ＣＥＡを有する全ての細胞または組織切片は使用され、ＥＬＩＳＡまたはラジオイムノアッセイ（ＩＲＡ）で調べることができる。ＣＥＡ発現セルラインに陽性、ＢＧＰ-およびＮＣＡ-発現セルラインに陰性、ＢＧＰ-ＣＥＡＢ３-発現およびＢＧＰ-ＣＥＡＢ３-ＢＧＰＴＭ-発現セルラインに陰性である抗体は、本発明の抗体を含むものである。実施例４：ＣＥＡに対して反応する単一特異的ポリクローナル抗体の調製ＣＥＡに対して反応する単一特異的ポリクローナル抗体を調製するために、適切な動物（ウサギ、ヤギ等）をＢＧＰ-ＣＥＡＢ３-ＧＰＩで免疫化する。次いで、ＢＧＰ反応性抗体を除去して本発明に係るＣＥＡ反応性抗体を残すために、このようにして得られた抗血清を、精製したＢＧＰまたはＢＧＰを発現する細胞で吸収する。実施例５：結腸癌のラジオイムノシンチグラフィー（ＲＩＳ） Nuclear Medicine，trends and possibilities in nuclear medicine，pp．53 1-534 SchmidtとBuraggi(eds.)，Schattauer，New York．にGranowskaら(1989) が記載したＲＩＳでは抗体を用いる。実施例２の方法で得られたモノクローナル抗体を、Hnatovichら(1987)の二価性キレート法を用いてインジウム−１１１で標識する。イメージングは、メディアム・エナジー・パラレル・ホール’ガリウム’コリメーターを備え、ＮｏｄｅｃｒｅｓｔＶ７７コンピューターに連結されたＳｉｅｍａｎｓ７５チューブ・ディジトラック回転ガンマカメラセットを用いて行われる。イメージは、透明なフィルム上およびコンピューターのディスプレイ上にカラーで表示される。結腸直腸癌が最初からもしくは再発する疑いのある患者は、外科医によって選択されＲＩＳを受ける。この研究は、保険社会福祉省(Department of Health)の放射活性物質投与顧問委員会(Administration of Radioactive Substances Advi sory Committee)に承認されている。サインの入った通知された同意書を各患者から得られた。外因性のタンパクにアレルギーの経験がある患者または、抗体に対して陽性の皮膚試験を有する患者は除外する。低い直腸の腫瘍を有する患者は、リンホシンチグラフィー(lymphoscintigraphy)を行うために抗体の直腸の粘膜下注入として多様のものを用いて研究された。既知の量の活性の２−３ｍＣｉ（８０−１２０ＭＢｑ）の注入後、イメージングを、放射の断層撮影法（トモグラフィー）で直ちに、時には４時間、２４時間後に行い、さらに４８、７２もしくは９６時間後に行った。患者の還納(reposit ioning)および各時点における像をチェックするためにボーン・ランド-マーク(t he bone land-marks)に見られる６つの放射活性マーカー源と共に、下方の胸部および上方の腹部、および下方の腹部および骨盤の前方および後方の像を得る。ガンマカメライメージも、削除された外科的検体から作成される。腫瘍の組織学的な段階および等級付けが行われる。標準および適切な背景サンプルと共に、腫瘍に関係するかしないかがわかった粘膜およびリンパ節の近くの腫瘍の被検物は選別され数えられる。連続的な血液および尿のサンプルもまたアッセイされる。２４時間での血液クリアランスは、平均で５分のサンプル体積を１００％として注射量の５１％；４８時間で３３％、並びに７２時間で２７％である。尿での排出は、３％未満である。結腸直腸癌の根本的および再発のイメージは、質が高い。腫瘍部位は、４時間ほどで腹部および骨盤にはっきりと同定される。時がたつにつれて、徐々に活性を上昇させる早期イメージでは、焦点欠陥として肝臓転移が同定される。Ｉｎ− １１１抗ＣＥＡ（すなわち、ＰＲ１Ａ３によって認識されるエピトープを認識しない抗ＣＥＡ抗体）で慣れているものより正常な腸での取り込みがかなり低い。骨髄と肝臓の取り込みは似ている。間違った陽性もしくは間違った陰性の結果は得られない。平面画像が良好であったので、単一のフォトンの放出トモグラフィーは特定の利益があるものではない。外科的な被検物のイメージングは、腫瘍およびポリープは高度の取り込みを備えること、並びに他のＣＥＡ抗体（ＰＲ１Ａ３によって認識されるエピトープを認識しないもの）と違って正常な節は視認されないことを示す。粘膜に対する腫瘍の割合は、４７：１と広範である。ほとんど分化していない腫瘍は、この抗体をかなり良く取り込み、平均してＩｎ−１１１抗ＣＥＡ（ＰＲ１Ａ３によって認識されるエピトープを認識しない）より優れている。実施例６：マウスモノクローナル抗体のヒューマナイジング（ＣＤＲ移植）モノクローナル抗体の種々の領域をコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をクローン化して配列決定した。重鎖Ｖ領域のＰＣＲクローニングに使用したプライマーはOrlandiら(1989)のものであり、軽鎖Ｖ領域に用いたものはJonesとBendig (1991)のものであった。それぞれの場合で、二つの配列は与えられ、それぞれ親のＮＳ１軽鎖および重鎖のもので、重鎖と軽鎖に独特の配列である。独特な配列の特異性を確かめるために、これらを、マウス抗体Ｖ領域がヒトの定常領域に融合されたヒト-マウスキメラ抗体として発現させた。マウス抗体Ｖ_H 領域クローンは、ＰＣＲ技術でヒトＩｇＧ₁重鎖ＮＥＷＭ（Kabatら(1991)上述）のＣ領域のｃＤＮＡクローンに連結した（図１参照）。マウス抗体Ｖ_L領域をＰＣＲ技術によってヒトκ軽鎖ＲＥＩ（Kabatら(1991)上述）のｃＤＮＡクローンに連結した（図２参照）。ＮＥＷＭ配列はPoljakら(1977)Biochemistry 16，3412-3420に開示され、ＲＥＩ配列はPalmとHilschmann（1973）Z．Physiol．Chem．354，1651-1654に開示されており、参照としてこれらの両方をここに取り込む。キメラ軽鎖および重鎖を発現ベクターｐＣＤＭ８に挿入し、二つのプラスミドをＣＯＳ細胞に共移入（co-transfected）した。培養して８日後、約１μｇ／ｍｌの抗体レベルをヒトＩｇＧＦｃ特異的ＥＬＩＳＡで調べ、このキメラ抗体はＰＲ１Ａ３が同定する決定基を備えたヒトの胃癌腫セルラインＭＫＮ４５細胞上に陽性免疫蛍光染色を与えた。Ｖ領域のＤＮＡ配列は、ヒューマナイズ化した抗体を設計するのに用いられた。データベースの分析により、マウス抗体に類似したヒト抗体の選択が可能である（約７５％の相同性）。このヒト抗体の配列は、オーバーラッピングオリゴヌクレオチドおよびＰＣＲから構成され、次いでＮＥＷＭ重鎖のｃＤＮＡに連結されたヒューマナイズ化された抗体の配列を設計するための鋳型として用いられる。マウスの軽鎖は、ヒトの軽鎖に対して７０％の相同性を有していた。次いで、この軽鎖を、LewisとCrowe(1991)の方法によりオリゴヌクレオチドおよびＰＣＲを用いてヒューマナイズ化されたＰＲ１Ａ３軽鎖を作成するための鋳型として用いた。方法重鎖（図６参照）合成オリゴヌクレオチド，１−６は、モノクローナル抗体の重鎖の可変領域をコードする。これらのオリゴヌクレオチド（９０mers）は、各配列オリゴヌクレオチド間に１２塩基対のオーバーラップ（重複）があり、ＤＮＡのセンスもしくはアンチセンス鎖をコードする。オリゴヌクレオチド対間のプライマーダイマーフォーメーションを起こした後に、ＰＣＲ増幅を行う。定常領域は、プラスミド内に含まれたヒト重鎖配列から開始された。これらのプライマーに取り込まれたものは、可変領域の３’末端との５’のオーバーラップおよび遺伝子の３’最末端のクローニング部位である。ＰＣＲの条件軽鎖（図７参照）軽鎖を重鎖と同様の方法で作成した。オーバーラッピングフラグメントを産生するためにプライマー１＋２、３＋４、５＋６、７＋８をＰＣＲ増幅する。用いたプログラムは、重鎖と同様である。次いでこのフラグメントをＰＣＲプログラムに用いて連結した。最初にフラグメントだけを添加する。外側のプライマーを添加する。この作成物の鋳型は、プラスミド内に含まれていたヒト軽鎖配列であった。プライマー（２０−３０mers）は、ヒトのフレームワークに相補的な３’領域および外因性の５’領域（制限酵素部位または部分的なモノクローナル抗体ＣＤＲ）を有するように設計された。このフラグメントを増幅し、５’外因性配列をこの増幅の間に取り込んだ。個々のフラグメントを末端でオーバーラップさせ、完全な遺伝子を形成すべくオーバーラッピングＰＣＲによって結合させた。軽鎖および重鎖を発現ベクターｐＣＤＭ８に挿入し、抗体をＣＯＳ細胞で発現させ、ＭＫＮ４５細胞に対する結合活性を免疫蛍光法によって確かめた。ＰＲ１Ａ３のＶ領域は、Ｘ線結晶学的研究から知られた抗体の構造の相関性(c o-ordinates)を用いてモデル化した。相補性決定領域（ＣＤＲｓ）は、Chothia ら(1992)から引き出されたカノニカル(canonical)ループ構造を用いたフレームワーク構造に適合するものであった。このモデルの顕著な特徴は、付加的な残基を含むことであり、軽鎖のＣＤＲ３にチロシンならびに重鎖のＣＤＲ２と重鎖のＣＤＲ３にグルタミン酸残基を一つずつ含むことである。二つのグルタミン酸は、通常は不対のチャージを有するが、このループをねじらせ、構造を安定化するためにＣＤＲ３-Ｌループの二つのチロシンとＶＨの不対グルタミン酸との間に塩橋を形成する。これらの特徴があることにより、これらが抗原認識のキーポイントであり、このエピトープが陽性チャージを有することが強力に示唆される。マウスＰＲ１Ａ３重鎖Ｖ領域を配列決定することにより、ＣＤＲ１-Ｈの最初のアミノ酸の二つの残基の選択が一貫して与えられ、バリンとグルタミンの両方が見出された。両方のイソタイプのキメラ抗体は、ＭＫＮ４５細胞を用いた免疫蛍光的研究で同様に活性であり、モデル化は、両方のアミノ酸を構造上強いられる拘束のない場所に位置させる。実施例７：細胞のアセトン固定と結合の決定細胞懸濁液、約１０⁵細胞／リン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）ｍｌ、を顕微鏡のスライドガラスに滴下し、乾燥させ、１０分間アセトンに浸してＰＢＳですすいだ。もしくは、１０ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０等の培養液を含有するペトリ皿にカバーガラスを配置し、細胞をこのカバーガラス上にまく。次いで、このペトリ皿を４８〜７２時間、３７℃でインキュベートし、ペトリ皿から移し、ＰＢＳですすぎ、１０分間アセトンに浸してＰＢＳですすぐ。このスライドガラスまたはカバーガラスを適切な試験抗体とインキュベートして洗浄した。この試験抗体は、この細胞に結合するか否かのいずれかである。試験抗体の結合を調べるために、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）で標識した抗種抗体(anti-species antibody)を添加して細胞を洗浄した。結合は、蛍光を測定して調べた。マウスＩｇＧを試験抗体とする場合には、ＦＩＴＣ結合ヒツジ抗マウス抗体（ Sigma Chemical Co，Poole，Dorset，UK）をプローブとして用いる。結合の研究に用いた細胞は、結腸癌腫セルラインＨＴ-２９（ＡＴＣＣＨＴＢ３８）；ＣＥＡｃＤＮＡを移入したＣＯＳ-７細胞；および実施例１に記載したＤＮＡキメラ作成物のいずれかを移入したＣＯＳ-７細胞である。ＣＯＳ-７細胞の移入は、エレクトロポレーションによる。エレクトロポレーション：２００μｇのプラスミドＤＮＡを、１０⁷−１０⁸細胞／ｍｌの濃度のＰＢＳ中の０．８ｍｌの細胞と混合した。細胞をBio-Rad Gene P ulserを用いて１ｋｖ、２５μＦＤのキャパシタンスでパルスした。細胞を少なくとも１０分間氷上に置いてから培養液に移した。３７℃のオーバーナイトインキュベーションの後に新鮮な培地を細胞に添加した。実施例８：マウスモノクローナル抗体のヒューマナイズ化マウスモノクローナル抗体の種々の領域を、配列の５’末端にHindIII制限部位を添加し、３’末端がヒト抗体ＲＥＩのκ鎖の定常ドメインの５’末端とオーバーラップする領域を有するように設計したプライマーを用いたＰＣＲで増幅した。これは標準的な増幅工程を用いて増幅される（９５℃で１分間の後、９５℃ で１分間、６０℃で２分間、７２℃で２分間のサイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で１０分間）。このＲＥＩκ定常フラグメントを、モノクローナル抗体 κ可変部位の３’末端との５’オーバーラップと３’XbaI部位を添加するプライマーで同じ条件で増幅する。これらのフラグメントを結合させ、相互開始合成(m utually primed synthesis)で伸長して、マウスモノクローナル抗体のκ鎖の可変領域とヒト抗体ＲＥＩのκ鎖の定常ドメインとを含有する配列を作成した。ＰＣＲの条件は、両方のフラグメントを含有する反応を９５℃で２分間および７２ ℃で４分間で７回増幅し、その後、外側プライマーを添加して標準増幅工程を行う。重鎖を、マウスモノクローナル抗体の重鎖の可変領域とヒト重鎖のＮＥＷＭの定常ドメインとを用いて類似の方法で作成した。これらのフラグメントをHindIIIとXbaIを用いた制限エンドヌクレアーゼ分解によって取り出した。これらをベクターｐＣＤＭ８に個別に配置し、ＣＯＳ細胞に共移入（co-transfected）した。キメラ抗体が培地に分泌され、ＭＫＮ４５細胞の表面に発現したＣＥＡに対する免疫蛍光によって試験するとマウスを起源とする構成物の特徴の全てを示した。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年８月２１日【補正内容】明細書モノクローナル抗体本発明は、結腸大腸癌の診断および治療に使用できる抗体に関する。抗体が、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）と反応することが知られているが、膜結合ＣＥＡと可溶型ＣＥＡの両方と反応するため、結腸大腸癌の診断には使用されていない。モノクローナル抗体ＰＲ１Ａ３は、ＮＳ１（Ｐ３／ＮＳ１／Ｉ-Ａｇ-４-１）ミエローマ細胞と正常な結腸大腸上皮細胞で免疫されたマウスの脾臓細胞とを融合することによって産生される（Richman & Bodmer 1987）。ＰＲ１Ａ３は、両方と非常に強く反応し、結腸直腸癌腫をほとんど区別せず、腫瘍に固定された抗原は見えるが、腫瘍を流出するリンパ管またはリンパ節内では見られないことから、他の結腸直腸上皮反応性抗体以上の利点を備えている（Granowska等 1989）。ＰＲ１Ａ３は、５９／６０の結腸大腸腫瘍と反応したが（Richman & Bodmer 1 987）、ＣＥＡ反応性Ｂ７２．３は７５％しか反応しなかった（Salvatore等 198 9）。胃、回腸、ｏｅｓｏｐｈａｇｕｓ、気管およびｂｒｅａｓｔの正常細胞に弱く結合することがいくつか証明されているが、ｉｎｖｉｖｏ試験により、基底膜がこれらの組織への上記抗体の接近を妨げることが示された（Granowska等 1990）。 Sheahanら（1990）Am．J．Clin．Path．94，157-164は、癌胎児性抗原に対する特異性を示す二つのモノクローナル抗体（Ｄ１４とＢ７．１）について言及している。 Sakuraiら（1989）J．Surg．Oncol．42，39-46は、癌胎児性抗原に対する特異性を示す種々のモノクローナル抗体について述べている。ＰＲ１Ａ３は、イムノグロブリンとして一般に普及しているが、そのハイブリドーマは利用されていない。ＰＲ１Ａ３が結合する的確なエピトープは、知られていなかった。本発明は、結腸直腸癌に対してＰＲ１Ａ３と同等以上の特異性を備えたモノクローナル抗体を含む分子を提供する。このような抗体は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、すなわち結腸直腸癌腫に提示された腫瘍マーカーの一部であることが判明した新規に見出されたＰＲ１Ａ３エピトープに対するモノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）を産生することによって調製することができる。本発明の第一の態様は、（i）膜結合性ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を結合し、（ii）完全なヒトＣＥＡの４９０残基〜Ｃ末端に結合（Ｎ−Ｃ）したヒトの胆汁糖タンパク質（ＢＧＰ）の１〜３１４残基からなるハイブリッドポリペプチドを結合し、（iii）ヒトのＢＧＰに結合しない分子であって、Ｖ_H鎖の配列が、あるいはＶ_H鎖の配列が、Ｖ_HＣＤＲ１の最初のアミノ酸残基がグルタミンであること以外は上と同じであり、どちらの場合でもＶ_L鎖の配列がであるＩｇＧ₁グループＩＩＡ重鎖とκグループＶ軽鎖とを備える完全なマウスモノクローナル抗体以外の分子を提供する。Ｖ_H鎖の配列は、以下のようにも記載できる。また、Ｖ_L鎖の配列は以下のようにも記載できる。Ｖ_H ＣＤＲ１の最初のアミノ酸残基は、上記Ｖ_H配列の３１位である。前記分子は、抗体であることが好ましい。ヒトＣＥＡの（Ａ３のＣターミナルハーフ）-Ｂ３-ＧＰＩドメインに結合（Ｎ −Ｃ）したＢＧＰのＮ-Ａ１-Ｂ１-（Ａ２のＮターミナルハーフ）ドメインからなるハイブリッドポリペプチドが、実施例１に詳細に記載され、図８にキメラ１として図式的に示されている。これは、ＢＧＰの１〜３１４残基をＣＥＡの４９０残基〜Ｃ末端にＮ−Ｃ型に融合したものである。完全なＣＥＡのＣ末端は、６６８残基である。 “膜結合”という用語により、例えばAmerican Type Culture Collection．12 301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，USA カタログナンバー ATCC HTB 38の適度に良く分化したグレードIIヒト結腸アデノカルシノーマ（adenoca rcinoma）セルライン、ＨＴ-２９セルライン等の結腸癌腫細胞に見られるようなＣＥＡを意味する。 “結合”という用語は、カバーガラスで生育したアセトン固定ＣＥＡ陽性細胞単層の間接免疫蛍光法によって評価する際に、陽性シグナルは、その後の蛍光複合抗マウス（またはヒト）ＩｇＧ抗体を用いたインキュベーションによって見ることができることを意味する。実施例７は、細胞のアセトン固定および結合の決定について記載する。抗体重鎖がＩｇＧ₁であることは、免疫拡散法ゲル（Ouchterlony technique）におけるイソタイプ血清に特異的な抗血清との反応によって、または酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定することができる。マウスＩｇＧ重鎖に反応し、診断に使用できるモノクローナル抗体は、市販のものを利用することができ、例えば９ｘ１０⁸Ｍ^-1の結合活性を備えたSerotec社、22 Bankside，Station Approach，Kidlington，Oxford OX5 1JE，UKのラットモノクローナル抗体クローンＬＯ-ＭＧ１-２を利用することができる。抗体軽鎖がκであることは、免疫拡散法ゲルにおける特異的抗血清との反応およびＥＬＩＳＡによって決定することができる。マウスκ軽鎖と反応し診断に使用できるモノクローナル抗体は、市販のものを利用することができ、例えばSero tec社のラットモノクローナル抗体クローンＭＲＣＯＸ-２０を利用することができる。ＩｇＧグループＩＩＡおよびκグループＶは、Ｖ領域のサブタイプと称され、参照として取り込んだKabatら(1991)Sequence of Proteins of Immunological I nterest，fifth edition，US Department of Health and Human Services，NIH Publication No91-3242に記載されたＶ領域フレームワークの配列によって明確にされている。上記分子は、ヒトの体内に存在し、腸に位置する自然に産生した他のヒトタンパクに実質的に結合しないことが好ましい。このようなタンパクには、コラーゲンおよび血清アルブミンが含まれる。この分子が、Ｎ-Ａ１-Ｆｃ、Ｎ-Ａ１-Ｂ１-ＦｃもしくはＮ-Ａ１-Ｂ１-Ａ２- Ｆｃに結合しないことが好ましい。ここで、Ａ１、Ｂ１およびＡ２はＣＥＡのドメインであり、ＦｃはイムノグロブリンのＦｃタンパクである。この分子が、Ｂ３ハイブリッドに結合しないことがさらに好ましい。ここでＧＰＩアンカーは除去されているか、ＧＰＩアンカーはＢＧＰトランスメンブレンセグメントで置換されている。この分子が抗体である場合には、ヒトフレームワーク領域および少なくとも請求項１記載のＶ_H鎖およびＶ_L鎖の相補性決定領域を含有することが好ましく、ここでＶ_H鎖のＣＤＲ１はＶＦＧＭＮ（ＳＥＱＩＤＮｏ３）、ＣＤＲ２はＷＩＮＴＫＴＧＥＡＴＹＶＥＥＦＫＧ（ＳＥＱＩＤＮｏ４）およびＣＤＲ３はＷＤＦＹＤＹＶＥＡＭＤＹ（ＳＥＱＩＤＮｏ５）であり、Ｖ_L鎖のＣＤＲ１はＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡ（ＳＥＱＩＤＮｏ６）、ＣＤＲ２はＳＡＳＹＲＹＳ（ＳＥＱＩＤＮｏ７）およびＣＤＲ３はＨＱＹＹＴＹＰＬＦＴ（ＳＥＱＩＤＮｏ８）である。ＰＲ１Ａ３は、ＩｇＧ１グループＩＩＡ重鎖およびκグループＶ軽鎖を有するマウスモノクローナル抗体であり、Ｖ_H鎖の配列が本発明の第一の態様から除外した上述のものもしくはＶ_H ＣＤＲ１の最初のアミノ酸残基がグルタミンであるもの、並びにＶ_L鎖の配列が本発明の第一の態様から除外した上述のものである。ＣＥＡは、免疫グロブリンスーパージーンファミリー（Thompson & Zimmerman n 1988；Thompsonら 1991参照）の一つである。ＣＥＡは、Ｎ-Ａ１-Ｂ１-Ａ２- Ｂ２-Ａ３-Ｂ３-ＧＰＩのドメイン構造を備えており、ＧＰＩはグリコホスファチジルイノシトール膜アンカーである。かなりの程度の配列相同性が、ＣＥＡのドメインおよびＮＣＡ等のファミリーの他のメンバーとの間に存在する。胆汁糖タンパク（ＢＧＰ）も、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの一つであり、Ｎ-Ａ１-Ｂ１-Ａ２-ＴＭのドメイン構造をとりＴＭはトランスメンブレンドメインであるが、ＢＧＰのＡ１、Ｂ１およびＡ２ドメインは、ＣＥＡのＡ１、Ｂ１およびＡ２と称されるドメインとは別である。 “抗体”という用語に、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体、抗体断片を含める。この抗体断片は、（i）ヒトＣＥＡ、（ii）ヒトＣＥＡの４９０残基〜Ｃ末端に結合（Ｎ−Ｃ）したヒトのＢＧＰの１〜３１４残基からなるハイブリッドポリペプチドに特異的かつ可逆的に結合するが、（iii）ヒトＢＧＰには結合しないものであって、ＩｇＧ₁グループＩＩＡ重鎖とκグループＶ軽鎖とを備える完全なマウスモノクローナル抗体、すなわちＶ_H鎖の配列が（図１に示されたもの）かもしくはＶ_H ＣＤＲ１の最初のアミノ酸残基がグルタミンでありかつ、Ｖ_L鎖の配列が（図２に示されたもの）である抗体を除く。抗体または抗体断片が、モノクローナル抗体から誘導されることが好ましい。モノクローナル抗体は、参照として取り込まれたZola，H．(1988)("Monoclona l Antibodies -A manual of techniques"CRC Press)の技術によって一般的に調製することができる。Ｆａｂ、（Ｆａｂ）₂、Ｆｖ、ｓｃＦｖもしくはｄＡｂ断片等の抗体断片は、これに基づいて既知の方法で調製することができる。抗体は、例えばヒトの抗体のフレームワークにマウスの抗体のＣＤＲ領域を挿入することによって既知の方法でヒューマナイズ(humanized)することができる。抗体様分子は、国際特許第８４／０３７１２号の組換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる。このタンパクに特異的な領域を、McCaffertyら（1990）Nature 348 ，552-554の技術を用いてバクテリオファージの一部として発現させることができる。本発明の抗体様分子は、細胞内で発現されたＣＥＡまたはハイブリッドタンパクを固定してファージを選別するのに使用するGriffithsら(1993)EMBO J．12，7 25-734に記載された方法を用いてファージディスプレイライブラリー(phage dis play libraries)から選別することができる。また、単層で生育され、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドで固定もしくは固定されていない適切な細胞もファージを結合するのに使用することができる。関係の無いファージを洗い流して、結合したファージを回収した。ＣＥＡまたはハイブリッドタンパクへの結合を切断し、バクテリアで再度増幅(reamplifying)して回収した。この選別および増幅工程は、本発明の抗体様分子である上記分子に係るファージを増すために数回行う。また、本発明の抗体様分子にファージディスプレイライブラリーからのペプチドと同様にして、ランダムペプチドライブラリーから選別されたペプチドも含める。抗体の可変重（Ｖ_H）領域と可変軽（Ｖ_L）領域は抗原認識に関与し、これは初期のプロテアーゼ分解実験で最初に認識された事実である。げっ歯類抗体の“ヒューマナイゼーション（humanisation）”によってさらなる確証が得られた。得られた抗体が、げっ歯類を親とする抗体の抗原特異性を保有するように、げっ歯類に由来する可変領域を、ヒトに由来する定常領域に融合することができ（Morr isonら（1984）Proc．Nat．Acad．Sci．USA 81，6851-6855）、げっ歯類の抗体をヒューマナイズするために“ＣＤＲ移植”を用いることができる。追加的または選択的に、組換えモノクローナル抗体を“プリマタイズ(primatised)”、すなわち重鎖および軽鎖の可変領域またはその一部並びに定常領域を二つの異なる霊長類の種から誘導することができ、好ましくは抗体の可変領域をマカクザル、定常領域をヒトから誘導する。このような抗体の利点としては、ヒト免疫グロブリンに対する高い相同性、ヒトエフェクター機能(human effector functions)の存在、低い免疫原性およびより長い血清半減期(serum half-life)（Newmanら（199 2）Biotechnology 10，1455）が含まれる。抗原特異性が可変領域によって付与され、定常領域とは別であることは、抗体断片の細菌発現を含む実験からわかっており、全てが一つ以上の可変領域を含んでいる。これらの分子は、Ｆａｂ様分子（Betterら（1988）Science 240，1041 ）；Ｆｖ分子（Skerraら（1988）Science 240，1038）；Ｖ_HおよびＶ_Lパートナー領域が柔軟なオリゴペプチドを介して連結されたシングルチェーンＦｖ（ＳｃＦｖ）分子（Birdら（1988）Science 242，423；Hustonら（1988）Proc．Natl． Acad．Sci．USA 85，5879）および単離されたＶ領域を含有するシングルドメイン抗体（ｄＡｂｓ）（Wardら（1989）Nature 341，544）を含む。特異的結合部位を保有する抗体断片の合成に係る技術の一般的な書評は、Winter & Milstein （1991）Nature 349，293-299に見られる。 “ＳｃＦｖ分子”とは、Ｖ_HおよびＶ_Lパートナー領域が柔軟なオリゴペプチドを介して連結された分子を意味する。ある状況では、抗体全体より抗体断片を用いた方が有利である。より小さい大きさの断片は、クリアランスを早め、かつ非腫瘍に対する腫瘍の割合を改善することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体断片は、Ｅ．ｃｏｌｉで発現および分泌され、大量の前記断片を容易に産生することができる。全体の抗体およびＦ（ａｂ’）₂フラグメントは“二価”である。“二価”とは、前記抗体およびＦ（ａｂ’）₂フラグメントが二つの抗原結合部位を有することである。対照的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂフラグメントは一価であり、一つだけの抗原結合部位を有する。 Tan，L.K.およびMorrison，S.L.(1988)Adv．Drug Deliv．Rev．2：129-142、W illiams，G.(1988)Tibtech 6：36-42およびNeuberger，M.S.ら(1988)8th Intern ational Biotechnology Symposium Part 2，792-799（これらの全てを参照としてここに取り込む）に記載されているように、“抗体技術”は急速に進んでおり、本発明の抗体から誘導された抗体様分子を調製するのに良く適している。抗体が特異的に結合する抗原の研究もしくは単離および精製、並びに抗原提示細胞の視認化（イメージング）および処置に係る種々の目的にこれらの抗体を使用することができる。他の実施態様では、本発明の抗体を、シンチグラフィックラジオラベル(scintigraphic radiolabel)、細胞毒性化合物またはラジオアイソトープ、非毒性のプロドラッグを細胞毒性の薬剤に変換する酵素、得られた複合物を結腸の腫瘍に向けるために免疫系を活性化する化合物、もしくは細胞剌激性化合物に結合する。このような複合物は、本発明の抗体からなる“結合部位”と、ラジオラベル、毒素または酵素等からなる“機能部位”とを備える。この抗体は、他の化合物の結合を物理的に妨害することによって、単にＣＥＡ抗原の活性をブロックするためのみに用いることもできる。この複合体（ペプチドまたはポリペプチド）の結合部位と機能部位は、O'Sull ivanら(1979)Anal．Biochem．100，100-108に一般に記載されたような、クロスリンキングポリペプチドの何らかの通常の方法によって互いに結合することができる。例えば、ある部位にチオール基を増し、他の部位をこれらのチオール基と反応する二価性の試薬、例えばヨード酢酸のＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＩＡ）またはＮ-スクシニミジル-３-（２-ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）と反応させる。例えば、ｍ-マレイミドベンゾイル-Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル等のアミドおよびチオエーテル結合は、一般的にジスルヒド結合よりin vivoでより安定である。結合部位が炭水化物を含有する場合、抗体またはある抗体断片の場合等では、欧州特許第００８８６９５号の結合技術を用いて機能部位を炭水化物部位を介して結合することができる。複合体の機能的部位は、例えばBagshaweとその共同者の複合体（Bagshawe（19 87）Br．J．Cancer 56，531；Bagshaweら（1988）Br．J．Cancer 58，700；国際特許第８８／０７３７８号）またはシアニド放出システム（国際特許第９１／１１２０１号）等の非毒性のプロドラッグを毒性の薬剤に変換するための酵素とすることができる。複合体に酵素全体が存在する必要はないが、当然に触媒部位は存在しなければならない。いわゆる“アブザイム(abzymes)”を用いることができ、モノクローナル抗体は、通常は反応仲間状態である、触媒反応を望む反応に係る化合物に対して産生される。得られた抗体は、反応のための酵素として作用することができる。複合体は、サイズ排除またはアフィニティークロマトグラフィーで精製することができ、二重の生物学的活性を試験することができる。抗原免疫反応性は、固定化した抗原を用いたenzyme-linked immunosorbent assay（ＥＬＩＳＡ）および生きた細胞内におけるラジオイムノアッセイを用いて測定することができる。エンザイムアッセイは、グルコース残基が加水分解されたときに吸収に変化を与える基質、例えば遊離した２-ニトロフェノールが４０５ｎｍで分光光学的に測定されるｏＮＰＧ（ｏ-ニトロフェニル-β-Ｄ-グルコピラノシド）等を用いて、 β-グルコシダーゼに使用することができる。複合体の安定性は、血清中で３７度でインキュベートすることによって最初にｉｎｖｉｔｒｏで試験を行い、次いでサイズ排除ＦＰＬＣ分析を行った。ｉｎｖｉｔｒｏでの安定性は、複合体を注射してから様々な時間経過後に血清を分析することによってマウスにおいても同様に試験することができる。さらに、複合体形成前に¹²⁵Ｉで抗体を、また¹³¹Ｉで酵素を放射能標識することができ、マウス内における複合体、遊離した抗体および遊離した酵素の生物学的拡散（バイオディストリビューション）を測定することができる。あるいは、前記複合体を組換えＤＮＡ技術により融合化合物として産生することもでき、この技術によれば、互いに隣接した、もしくは複合体の所望の特性を壊さないリンカーペプチドをコードする領域で分けられた複合体の二つの部位をコードする各領域を一本のＤＮＡが備えている。考えられるところでは、化合物の二つの機能的部位は、完全または部分的にオーバーラップしてもよい。次いで、ＤＮＡを、既知の方法を用いて適切な宿主中で発現させる。この複合体は、例えば等張生理食塩水（静脈内投与する場合）等の、標準的な無菌の非発熱原性の希釈および輸送剤とあわせて、通常は静脈内または腹腔内（ intraperitoneally）等の非経口的に適切な方法で投与することができる。複合体が標的細胞に結合して（必要であれば）血流から除去されたら（普通は一日くらいかかる）、一般的には一回の注入量としてプロドラッグを投与するか、腫瘍を視認（イメージ）できるようにする。必要であれば、複合体が抗原性であることから、より長い間治療できるようにシクロスポリンまたは他の免疫抑制剤を投与することができるが、普通は必要としない。複合体の投与とプロドラッグの投与との間の時間は、非発明的方法で最適化することができる。複合体の腫瘍／正常組織比は（少なくとも静脈輸送が続く）、約４−６日後に最高となるが、このとき腫瘍に結合した複合体の絶対量、すなわちグラムあたりの注入量のパーセントに換算すると前に比べて低くなる。それゆえ、複合体の投与とプロドラッグの投与との間の最適な間隔は、酵素のピーク腫瘍濃度と、腫瘍と正常な組織との間の最適な分散率との間の折衷となる。複合体の投与量は、通常の基準に従って医師によって選択される。少なくとも β-グルコシダーゼ等の標的化された酵素と毒性プロドラッグとしてアミグダリンの静脈内投与を用いる方法の場合には、体の表面積の平方メートルあたり０．１〜１０．０ｇの１〜５０の日々の投与、好ましくは１．０〜５．０ｇ／ｍ²が適切であろう。経口治療では、０．０５〜１０．０ｇ、好ましくは１．０〜５．０ｇの一日３回投与を１〜５０日間行うのが適切である。どの複合体の投与量も、特に腫瘍のタイプ、段階および位置並びに患者の体重を参考に通常の基準に従って同様に選択される。治療の持続期間は、複合体に対するあらゆる免疫反応の急速性および範囲に部分的に依存する。複合体を診断に使用する際には、通常はこの複合体の機能的部位が、例えばテクネチウム９９ｍ（^99mＴｃ）またはヨウ素１２３（¹²³Ｉ）等のシンチグラフィーの研究のための放射活性原子、もしくはヨウ素１２３、ヨウ素１３１、インジウム１１１、フッ素１９、炭素１３、窒素１５、酸素１７、ガドリニウム(gadol inium)、マンガンもしくは鉄等の核磁気共鳴（ｎｍｒ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ｍｒｉとしても知られる）用のスピンラベルを備える。腫瘍の選択的破壊のための化合物に用いる場合には、機能的部位は、隣接する細胞を破壊するのに十分なエネルギーを照射するヨウ素１３１、レニウム１８６、レニウム１８８、イッテリウム９０または鉛２１２等の高度に放射活性を備えた原子、あるいはメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド(v inca alkaloids)（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド(etoposide)）、ダウノルビシンもしくは他の挿入剤等の細胞毒性化学化合物を含有することができる。放射線または他の標識は、既知の方法で複合体に取り込むことができる。例えば、ペプチドは、生合成によりもしくは、例えば水素の位置にフッ素１９を含む適切なアミノ酸前駆物質を用いた化学的アミノ酸合成方法によって合成することもできる。^99mＴｃ、¹²³Ｉ、¹⁸⁶Ｒｈ、¹⁸⁸Ｒｈおよび¹¹¹Ｉｎ等の標識は、ペプチドのシステイン残基を介して取り付けることができる。イッテリウム９０はリジン残基を介して取り付けることができる。ヨードゲン方法(The IODOGEN metho d)（Frakerら（1978）Biochem．Biophys．Res．Commun．80：49-57）は、ヨウ素１２３の取り込みに使用できる。“イムノシンチグラフィーにおけるモノクローナル抗体(Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy)”（Chatal，CRC Pre ss 1989）は、詳細に他の方法を記載している。本発明の第二の態様は、医薬に用いるための本発明の第一の態様に定義したような分子、好ましくは抗体を提供する。本発明の第三の態様は、結腸のがん腫を診断または治療することに用いる医薬の製造における、本発明の第一の態様に定義した分子、好ましくは抗体の使用を提供する。本発明の第四の態様は、単一特異的な抗体を作成する方法を提供するものであって、この方法は、（i）ヒトの膜に基づくＣＥＡに結合し、（ii）ヒトＣＥＡの４９０残基〜Ｃ末端に結合（Ｎ−Ｃ）したヒトＢＧＰの１〜３１４残基からなるハイブリッドポリペプチドに結合するが、（iii）ヒトＢＧＰには結合しない単一特異的抗体を選択するために抗体のプールをスクリーニングすることを含む。単一特異的抗体がモノクローナル抗体であり、抗体のプールがモノクローナル抗体のプールであると好ましい。プール内の抗体は、組換えＤＮＡ方法によって産生された抗体を有するとさらに好ましい。好ましい態様では、スクリーニング段階で抗体が以下の条件合うものである：（１）結腸の癌腫細胞（RichmanとBondmer（1987）Int．J．Cancer 39，317-328 ）等のヒトの腫瘍細胞およびヒトの胃の癌腫セルラインＭＫＮ４５（Kojamaら（ 1990）Jpn．J．Cancer 81，967-970）に結合するもの。例えばアセトンを用いて細胞をスライドガラスまたはカバーガラスに固定し、第二の蛍光標識化抗種抗体、例えばもし最初の抗体がマウスＩｇＧであればＦＩＴＣ標識化した抗マウスＩｇＧによって抗体の結合を検出する間接的な免疫蛍光アッセイで結合を検出する。もしくは懸濁液中の細胞に結合する抗体を測定することができ、抗体結合を放射線活性標識した第二抗体、例えば¹²⁵Ｉ標識化抗マウスＩｇＧによって検出することができる。（２）ヒトＣＥＡが移入され、ヒトＣＥＡを発現する細胞に結合するもの。例えば、ベクターｐＣＤＭ８（Invitrogen）内のＣＥＡｃＤＮＡ（Beaucheminら（1 987）Mol．Cell．Biol．7，3221-3230）を用いてエレクトロポレーションによって移入されたサルウイルス４０-形質転換されたサルの繊維芽細胞ラインＣＯＳ- ７；デキサメタゾン(dexamethasone)誘発性ベクターｐＭＡＭｎｅｏ(Clontech) 内のＣＥＡｃＤＮＡを用いてエレクトロポレーションによって形質転換されたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）：プラスミドｐＳＶｎｅｏ２を用いたリポフェクションによってマウス結腸直腸の癌腫セルラインＣＭＴ９３に共形質転換（co-transfected）されたＣＥＡのコスミドクローン（Willcocks，T.C. とCraig，I.W.(1990)Genomics 8，492-500）；ＣＥＡ遺伝子クラスター、例えばクロモソーム１９の長い腕のｑ１３．１−ｑ１３．３領域のＩＣＲＦｙ９０００Ｃ０２４００を含有し、かつ、ｐＹＡＣ４の右腕のベクターアームを備えたプラスミドベクターｐＲＡＮ４（Ragoussisら（1992）Nucleic Acids Res．290，313 5-3138）を用いた相同的組換え(homologous recombination)によってネオマイシン耐性（ｎｅｏ^R）遺伝子を含むように修飾されたイーストの人工的染色体（yea st artificial chromosome）すなわちＹＡＣで形質転換したＣＨＯ細胞であって、形質転換はイーストスフェロプラスト細胞融合（Burgers，P.とPercival，K. （1987）Anal．Biochem 163，391-397）によって成されたものとすることができる。（３）例えばハイブリッド遺伝子を有するプラスミドｐＣＤＭ８を用いたエレクトロポレーションで形質転換されたＣＯＳ-７細胞等の、ハイブリッド遺伝子ＢＧＰ-ＣＥＡＢ３-ＧＰ１が移入され、これを発現する細胞に結合するもの。エレクトロポレーションは実施例６に記載されている。（４）ＣＥＡを発現せずにＢＧＰを発現する細胞には結合しないもの。例えば、ＢＧＰのｃＤＮＡを有するプラスミドｐＣＤＭ８を用いて形質転換されたＣＯＳ -７細胞など。（５）ＣＥＡを発現せずにＮＣＡを発現する細胞には結合しないもの。例えば、ＮＣＡのｃＤＮＡを有するプラスミドｐＣＤＭ８を用いて形質転換されたＣＯＳ -７細胞など（Heftaら（1990）Cancer Res．50，2397-2403）。（６）ＧＰＩアンカーが無くハイブリッドＢＧＰ-ＣＥＡＢ３を発現する細胞には結合しないもの。これらの細胞では、正常に処理されればＧＰＩアンカーで置換されるＣＥＡＢ３配列内の疎水性テール部の最初の位置にストップコドンが取り込まれた、ＢＧＰ-ＣＥＡＢ３のハイブリッド遺伝子を有するプラスミドｐＣＤＭ８を用いて形質転換した形質転換型ＣＯＳ-７がある。ＰＣＲは、このようなストップコドンを取り込むのに使用することができる。（７）ＢＧＰ-ＣＥＡＢ３-ＢＧＰＴＭを発現する細胞には結合しないもの。例えば、ＣＥＡの処理された疎水性セグメントに代えてＣＥＡのＢ３ドメインにＢＧＰのトランスメンブレンドメインが付加されたハイブリッド遺伝子を有するｐＣＤＭ８を用いて形質転換されたＣＯＳ-７など。ＣＥＡに結合しない使用可能な対照の抗体は、例えばＴ細胞マーカーＣＤ４を認識するものである。適切な抗ＣＤ４抗体は、例えばＯＫＴ４（抗ヒトヘルパーＴ細胞サブセット；ＡＴＣＣＣＲＬ８００２）等のＡＴＣＣから利用できる。本発明の抗体の選択は、どの順序で上記工程を行ってもよい。最初のスクリーニングを、ヒト腫瘍セルラインまたはｃＤＮＡまたはコスミドのＣＥＡを発現するトランスフェクトマ（transfectoma）等のＣＥＡ発現細胞ラインで行うことが好ましい。第二のスクリーニングを、上述の遺伝子およびハイブリッド遺伝子を用いて形質転換されたセルラインで行うことが好ましい。ＮＣＡは非特異的交差反応抗原であって、Ｎ、Ａ１およびＢ１ドメインとＧＰＩアンカーを備えている（ThomsonとZimmerman（1988）Tumour Biol．9，63-83 並びにThomsonら（1991）J．Clin．Lab．Analysis 5，344-366参照）。発現に適切な親セルラインは、ＣＥＡを発現しないＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞を含む。本発明を、以下の実施例および図面を参照しながら詳細に記載する。図１は、マウスのモノクローナル抗体のＶ_H鎖の推測されるアミノ酸配列（マウスの重鎖；ＳＥＱＩＤＮｏ１）、ヒューマナイゼーション（humanisation）用のフレームワーク配列を提供するために用いたヒト抗体ＲＦ-ＴＳ３’ＣＬのＶ_H配列との比較（ＲＦ-ＴＳ３バックボーン；ＳＥＱＩＤＮｏ２７）および作成したヒューマナイズ化配列（ヒューマナイズ化重鎖；ＳＥＱＩＤＮｏ２８）を示す。ＲＦ-ＴＳ３’ＣＬの配列は、参照としてここに取り込まれたPascualら（1990）J．Clin．Invest．86，1320-1328に開示されている。図２は、マウスのモノクローナル抗体のＶ_L鎖の推測されるアミノ酸配列（マウスのκ；ＳＥＱＩＤＮｏ２）、ヒューマナイゼーション用のフレームワーク配列を提供するために用いたヒト抗体ＲＥＩのＶ_L配列との比較（ＲＥＩバックボーン；ＳＥＱＩＤＮｏ２９）および作成したヒューマナイズ化配列（ヒューマナイズ化κ；ＳＥＱＩＤＮｏ３０）を示す。図３は、ＣＥＡとＮＣＡ−５０とのアミノ酸配列の比較を示す。対応するドメインは共にグループ化されている。どちらの場合も、点は各グループの一番上の行に示されたＣＥＡドメインのアミノ酸と同一であることを示す。ダッシュは、ＣＥＡと比較した場合のアミノ酸の欠失を示す。Ｎ-グリコシル化の可能性のある位置に下線を付した。図４は、ＢＧＰのｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮｏ３１）と推測されるアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮｏ３２）とを示す。図５は、ＧＰＩの構造を示す。図６は、ヒューマナイズ化した重鎖の構成を示す。ＦＲは、フレームワーク領域（framework regions）を示す；ＣＤＲは、相補性決定部位を示す；＝はヒト重鎖をコードする二本鎖ＤＮＡを示す；→は、オーバーラッピングＰＣＲ(overl aping PCR)のためのプライマーとして用いられた５’−３’の方向を示す合成オリゴヌクレオチドを示す。図７は、ヒューマナイズ化した軽鎖の構造を示す。ＦＲは、フラグメント領域を示す；ＣＤＲは相補性決定領域を示す；＝ヒューマナイズ化した重鎖をコードする二本鎖ＤＮＡを示す；→は、オーバーラップＰＣＲのためのプライマーとして用いられた５’−３’の方向を示す合成オリゴヌクレオチドを示す。図８は、ＢＧＰ−ＣＥＡキメラ構造物を示す。図９は、ヒューマナイズ化抗体のＶドメインのモデルを示す。軽鎖（Ｌ）および重鎖（Ｈ）の相補性決定部位（ＣＤＲｓ）１〜３の位置を示す。抗原認識に関係する二つのグルタミン酸残基、Ｅ（Ｈ：１０６）−重鎖の１０６位およびＥ（Ｈ：５７）−重鎖の５７位にしるしを付した。図１０は、ＣＥＡのＢ３ドメインのモデルを示す。リジンとアルギニン残基の位置にしるしを付した。ＫＧ３６（６３６位がリジン）とＲ５９４（５９４位がアルギニン）のｉｎｖｉｔｒｏ変異は、抗原へのＰＲ１Ａ３結合を破壊する。図１１は、ＮＣＡのｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮｏ３３）および推測されるアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮｏ３４）を示す。図１２は、ＣＥＡのｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮｏ３５）および推測されるアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮｏ３６）を示す。図１３は、ＰＲ１Ａ３κ軽鎖のｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮｏ３７）および推測されるアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮｏ３８）を示す。図１４は、ＰＲ１Ａ３重鎖のｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮｏ３９）および推測されるアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮｏ４０）を示す。実施例１：ＰＲ１Ａ３によって認識されるエピトープの同定ＹＡＣ（イーストの人工的クロモソーム）およびコスミドの研究は、ＰＲ１Ａ３抗原をコードする遺伝子を、ＣＥＡ遺伝子が位置する染色体の領域にマッピングし、ＣＥＡ様のＰＲ１Ａ３エピトープがγ-インターフェロンによってアップレギュレートされることが示された。ＣＥＡのｃＤＮＡの種々の細胞への移入により、これらの細胞上にＰＲ１Ａ３が出現し、モノクローナル抗体ＰＲ１Ａ３はＣＥＡのエピトープを認識することが示唆された。ＣＥＡのドメインは、Ｎ-Ａ１-ＦＣ、Ｎ-Ａ１-Ｂ１-ＦｃおよびＮ-Ａ１-Ｂ１- Ａ２-ＦｃとしてイムノグロブリンのＦｃ部位への融合物としてＣＯＳ細胞内に発現した。これらのどの構造物もＰＲ１Ａ３と反応するタンパク質を産生しなかったことから、前記エピトープはＮ-Ａ１-Ｂ１-Ａ２領域に位置していない。ＢＧＰとＣＥＡのハイブリッド構造物は、ＣＥＡの（Ａ３のＣ末端ハーフ）- Ｂ３-ＧＰＩドメインが、ＢＧＰのＮ-Ａ１-Ｂ１-（Ａ２のＮ末端ハーフ）ドメインに融合するように調製された。ＣＥＡとＢＧＰのアミノ酸配列は、図３および４に示されている。このハイブリッド構造物ナンバー１は、ＢＧＰのシステイン３１４までとＣＥＡのグルタミン酸４９０〜Ｃ末端までを含む（図８参照）。このハイブリッド構造物は、発現プラスミドｐＣＤＭ８からＣＯＳ細胞内に発現された。免疫蛍光アッセイで分析すると、形質転換されたＣＯＳ細胞は、マウスＰＲ１Ａ３抗体とヒト／マウスキメラ抗体との両方で正のシグナルを与えた（以下を参照）。これは、ＰＲ１Ａ３エピトープがＢ３-ＧＰＩ領域の領域内にあることを確証する。プラスミドｐＣＤＭ８は、SeedとAruffo（1987）Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 84，3365-3369に記載されている。ＧＰＩアンカーがタンパク質に添加されないように、ハイブリッド構造物ナンバー１にストップコドンを導入した。ＣＥＡ部は、もはや膜結合型ではないが、可溶化され分泌される。ストップコドンは、ＣＥＡの６４４残基の位置に導入され、（Ｎ-Ａ１-Ｂ１-（Ａ２のＮ末端ハーフ））ＢＧＰ−（（Ａ３のＣ末端ハーフ）-Ｂ３）ＣＥＡが形成された（構造物ナンバー２；図８）。ベクターｐＣＤＭ８を用いたこの構造物のＣＯＳ細胞への移入（トランスフェクション）により、ＢＧＰと交差反応する抗体３Ｂ１０を用いた免疫蛍光的研究で陽性であるが、ＰＲ１Ａ３に陰性な細胞を得た。これは、ハイブリッドタンパクが発現したが、ハイブリッドが膜結合型でないときにはＰＲ１Ａ３エピトープが欠如していることを確証する。キメラ構造物３ａおよび３ｂを作成した。これらは、図８に示すような構造である。発現構造物の作成に用いたＰＣＲ法ＢＧＰのクローニングに以下のプライマーを用いた：ＣＥＡのクローニングに以下のプライマーを用いた：キメラ１用にＢＧＰとＣＥＡフラグメントを親分子からＰＣＲで増幅した。生産物をＣｌａＩで切断し、連結した。アニールした産物の５’と３’末端を、ＣＯＳ-７細胞内における一過性の発現のためのｐＣＤＭ８ベクターのＨｉｎｄIII -ＸｂａＩ部位に連結するために、ＨｉｎｄIIIとＸｂａＩで切断した。以下のプライマーを用いた：キメラ２は、キメラ１から増幅して、ｐＣＤＭ８への連結のためにＨｉｎｄII IとＸｂａＩで切断した。以下のプライマーを用いた：キメラ３ａと３ｂを作成するために、分子の５’部位を、ＢＧＰ５’プライマーと必要な継ぎ目に相補的なアンチセンスオーバーラッピングプライマーとを用いてキメラ１の鋳型から増幅した。このＢＧＰトランスメンブレンドメインを、センスオーバーラッピングプライマー(sense overlapping primer)とＢＧＰ３’ プライマーとを用いたＢＧＰから増幅した。アニール化した分子を集めるために、“プライマー-ダイマー”を形成するために二つの相補的フラグメントを１８ＰＣＲサイクルにかけ、１２の更なるＰＣＲサイクル用のＢＧＰ５’および３’アウトサイド(outside)プライマーを添加した。構造物３ａ用に以下のプライマーを用いた：以下のプライマーを構造物３ｂ用に用いた：アンカーの構造は、Ferguson(1992)に記載されており、哺乳類のＧＰＩの遺伝子構造は図５に示されている。ＧＰＩアンカーから脂質の尾部（テール）を切断して可溶生産物を与えるホスホリパーゼでインキュベートすることによってＭＫＮ４５細胞から放出されたＣＥＡを用いた研究により、ＰＲ１Ａ３エピトープを含有するＣＥＡを生産される。ＳＤＳＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングで試験する際に、ジスルフィド結合を切断する還元剤ジチオトレイトールを含む２％ＳＤＳサンプルバッファーでこの抗原を煮沸した場合に、弱いシグナルが得られる。還元剤がジスルフィド結合を完全には維持しないことを除いては同様の方法で、この抗原を試験した場合には、強いシグナルが得られた。このことから、このエピトープが少なくとも部分的に配座的（コンホメーショナル）であることが示唆される。さらに、ＮＣＡは高度の配列相同性を備えた点でＣＥＡと関係しており、ＧＰＩアンカーを備えているが、ＰＲ１Ａ３と反応しない。従って、ＧＰＩは、このエピトープに十分なものではない。実施例２：分子モデルおよびｉｎｖｉｔｒｏ変異抗体ＰＲ１Ａ３の分子モデルは、抗体のＣＤＲ領域に通常のものではない二つの不対のネガティブチャージがあることを示している。これらのチャージは、抗体によって認識されたエピトープに相補的なチャージが存在することを示唆しているのだろう（図９および１０参照）。ＣＥＡのＢ３ドメインの分析および他のファミリーメンバーであるＮＣＡとの比較により、抗原-抗体反応で重要な役割を演ずるポジティブチャージを有する３つの残基があることが示唆された。この残基は、ＣＥＡＢ３ドメインの６１０位および６３６位のリジンと５１４位のアルギニンであった。抗体ＰＲ１Ａ３によって認識されるエピトープにおける個々のチャージの役割を調べるために、これらの残基をリジンまたはアルギニンからアラニンに変えた。ＤＮＡ配列を変えることによりアミノ酸を変更することが可能である。ポリメラーゼチェーン反応は、増幅プライマーの一つに取り込まれる部分変異（ポイントミューテーション）を導入するために使用することができる。このフラグメントを、クレノウフラグメントを備えた平滑末端とするか制限エンドヌクレアーゼで切断し、産物を配列決定するために適切なベクターに連結する。あるいは、配列の中部に変異を導入するために、ミューテーションを包括する二つのフラグメントを互いにアニールし、相互に開始される合成法（mutually primed synthesis）によって延長する。次いで、このフラグメントを切断し、配列決定するのに適した適切なベクターに連結する。ＴａｑポリメラーゼおよびＴａｑリガーゼで増幅する際に、リン酸化オリゴヌクレオチドを取り込むためにＰＣＲを使用することもできる（Michel，BioTechn iques 16(3)，410-412）。変異は、全体的に合成された遺伝子もしくは遺伝子の一部の調製によっても導入することができる。配列に変化を導入するのに使用した方法は、Ｋｕｎｋｅｌの方法（1985 Proc. Natl．Acad．Sci．USA 82，488-492）によるオリゴヌクレオチド向け変異誘発(o ligonucleotide directed mutagenesis)である。ＣＥＡの反復特性は、変異誘発を行うためにＣＥＡのＢ３ドメインおよび下流配列が類似の上流配列から単離される必要があることを意味する。この領域を、 ClaI５’部位とXbaI３’部位を導入するプライマーを用いて増幅し、このフラグメントをｐBluescriptII KS-にクローン化した。このプラスミドを、チミジンの代わりに多量のウラシル残基を含むプラスミドを産生するＥ．ｃｏｌｉのｄｕｔ^- ｕｎｇ^-Ｆ’株（ＣＪ２３６）に形質転換した。一本鎖鋳型をヘルパーファージＭ１３Ｋ０７を用いたスーパーインフェクション（superinfection）で産生した。変異配列を含有するリン酸化オリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニールし、二本鎖環状分子を産生するためにＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびリガーゼの存在下で伸長した。このヘテロ二本鎖分子を野生株（ｄｕｔ⁺ｕｎｇ⁺）に導入することにより、ウラシル含有野生型鎖の分離および変異鎖の複製を引き起こした。コロニーを単離し、変異遺伝子型が存在することを確かめるためにＤＮＡの配列を決定した。変異変異構造物の配列決定を行った後、これらのＢ３ドメインをＢＧＰの１−３１４残基およびＣＥＡの４９０−６６８残基からなるキメラタンパクを作成するために用いた。これらの製造物は、ＣＯＳ細胞で一時的に発現された場合に、ＰＲ１Ａ３に陽性であることが示された。ｐＣＤＭ８に挿入してＣＯＳ細胞で発現した後に、免疫蛍光実験によって、Ｋ２（リジン６３６→アラニン）およびＲ３（アルギニン５９４→アラニン）変異を有する製造物はＰＲ１Ａ３にもはや認識されないが、Ｋ１（リジン６１０→アラニン）変異は結合に何の影響も与えないことが証明された（図１０参照）。これらの結果は、エピトープのＫ２およびＲ３残基がＰＲ１Ａ３によって認識されることを示す。実施例３：ＣＥＡに反応するモノクローナル抗体の調製および特性 RichmanとBodmer(1987)の方法でＣＥＡに反応するモノクローナル抗体を調製した。組織、細胞、細胞培養正常な大腸および結腸の腫瘍の新鮮なサンプルを用いた。これらを、液体窒素で素早く凍結し−７０℃で保存した。結腸外(extra-clonic)正常成人および胎児の組織の冷凍サンプルを用いた。使用した結腸癌腫セルラインは、異なる腫瘍に由来する。ＨＴ２９結腸癌腫セルライン（FoghとTrempe，1975）は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有する培地ＲＰＭ１１６４０で、３７℃、５％ＣＯ₂を空気中に含み１００％の湿度で維持した。ＬＳ１７４Ｔ、ＳＷ１２２２、ＳＷ４８、ＳＷ６２０およびＳＷ８３７結腸癌腫セルライン（Tomら，1976；Leibovitzら，1976）を１０％ＦＣＳを含有するダルベッコの調節イーグル培地(Dulbecco's modified Eagle's medium)で、３７℃、１０％ＣＯ₂を空気中に含み１００％の湿度で維持した。Ｐ３／ＮＳ１／１-Ａｇ-４-１（ＮＳ１）は、８-アザグアニン耐性ＢＡＬＢ／ｃミエローマセルラインである。これを、１０％ＦＣＳと２ｘ１０^-5Ｍ６-チオグアニンを有するＲＰＭＩ１６４０で維持した。この研究で産生されたハイブリドーマは、２０％ＦＣＳ、１０^-4Ｍヒポキサンチン、１．６ｘ１０^-5Ｍチミジンおよび１０^-5 メトトレキセート（ＨＡＴ）を有するＲＰＭＩ１６４０で最初に培養した。クローニング後、ハイブリドーマ細胞からＨＡＴを除き、１０％ＦＣＳを有するＲＭＰＩ１６４０で維持した。免疫材料ＢＡＬＢ／ｃマウスを４種の異なる標品で免疫した。１．正常な結腸粘膜の検体。正常な大腸のサンプルをコルク板(cork board)上にピンでとめた。冷えた無菌リン酸緩衝液Ａ，ｐＨ７．４（ＰＢＳ-Ａ）で（１０回）すすいだ後、粘膜をメスでこすり落として粘膜筋板から切開した。粘膜の検体を液体窒素で素早く凍結し、タングステンボールベアリング（tungsten ballb earing）を備えたポリプロピレンバイアル中でパウダー状になるまで機械的に振動を与えた。この物質を、０．２ｍｌの完全フロイントアジュバントと０．２ｍｌのＰＢＳ-Ａで懸濁した。一度の接種につき、０．４ｍｌのエマルション中の０．２ｇの湿組織(wet tissue)を動物に与えた。２．正常な結腸上皮のクルードな膜調製物。新鮮な正常結腸粘膜検体は上述のようにして調製した。湿組織１グラムを、各膜調製物のために使用した。組織サンプルを、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含有する１０ｍｌスクロースバッファーに解かし（戻し）、Dounce-ホモジェナイズを行った（２５０ｍＭスクロール -ＲＮアーゼフリー：５０ｍＭトリエタノールアミン-ＨＣｌｐＨ７．５；６０ｍＭＭｇＣｌ₂；２ｍＭＤＴＴ）。４００００ｇで１５分間遠心した後、核およびミトコンドリアのペレットを捨てた。その上清を３０分間２００００ｇで遠心した。このミクロソームペレットを保持し、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌｐＨ７．４中の４０％スクロースに再度懸濁した。このスクロース溶液を屈折計の値が１．３９２−５となるように調節して、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌｐＨ７．４中の２５％スクロース（屈折計の値が１．３７５）を上層し、スクロース勾配を４℃で６５０００ｇで１５時間遠心した。膜を境界から回収し、１０ｍＭのＴｒｉｓｐＨ７．４で二度洗浄した；タンパク質含量をLowryら(1951)の方法で概算した。１ｇの湿組織から約１ｍｇの膜タンパクを回収した。注射用に、この膜をＰＢＳ-Ａおよび完全フロイントアジュバントに懸濁した。一度の接種につき０．４ｍｌのエマルションを動物に与えた。３．ＨＴ２９結腸癌腫セルライン。一度の接種につき、０．４ｍｌのＰＢＳ-Ａに懸濁した２ｘ１０⁶の生きたトリプシン処理細胞を与えた。４．免疫原としてのエピトープ。免疫原は、ハイブリッドＢＧＰ-ＣＥＡＢ３- ＧＰＩタンパクを保有する細胞またはＣＥＡのｃＤＮＡまたはコスミドを移入した細胞である。ＣＥＡ遺伝子を移入したマウスのＬ細胞を、ＣＥＡに対する抗体を与えるのに適したマウスの系統を免疫するために用いた。ＣＥＡを発現するヒト腫瘍細胞を使用することもできる。免疫化とハイブリドーマの作成以下のプロトコールに従って、腹腔内接種によって免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓を用いて３つの融合(fusions)を行った。融合１と２では、粘膜の検体と正常な結腸直腸の上皮の膜調製物で免疫および上昇（ブースト）させた（上記“免疫材料”参照）。融合３では、最初の免疫化を正常な結腸の膜調製物で行い、次のブースター（二次免疫）接種をＴＨ２９結腸癌腫細胞で行った。各融合の６週、２週および４日前にこれらの材料の腹腔内注射を動物に行った。それぞれの場合に、脾臓を無菌状態で取り出し、単一細胞懸濁液を機械的に調製し、ＲＰＭＩ１６４０中の５０％ポリエチレングリコール４０００（Merck）を用いて脾臓細胞を１０⁸ＮＳＩミエローマ細胞と融合した。これらの細胞を、ＨＡＴ＋２０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０および支持細胞層のマウス脾臓細胞を入れた２４または９６ウェルプレートに塗布（プレート）した。このプレートを３７℃、１００％の湿度、５％ＣＯ₂の空気中でインキュベートした。ハイブリドーマは、一般的に１４−２１日で顕微鏡で見ることができる。所望のコロニーを同定するための最初のスクリーニングをクローニングの前に行った。引き延ばされたパスツールピペットで単一の細胞を拾うことによって、これらのコロニーを二度クローン化し、２ｍｌのＲＰＭＩ１６４０、ＨＡＴおよび２０％のＦＣＳを上層したマウス脾臓細胞支持層を備えた９６ウェルのミクロタイタープレートの各ウェルに移し、３７℃、１００％の湿度、５％ＣＯ₂の空気中で培養した。抗体産生のスクリーニングアッセイ全ての融合物からの抗体産生のスクリーニングを、間接的イムノペルオキシダーゼ技術を用いた組織切片で行った。クリオスタットの切片（６μｍ厚）を正常な大腸の凍結立法体から切断した。この切片を、０．１％ポリ-１-リジンで予備被覆(precoated)された１０ウェルマルチテストスライド（C.A.Hendley-Essex， England）に載せ、室温で３０分間空気乾燥した。この切片を１５分間アセトンで固定した。各ウェルを多湿のチャンバーで室温で３０分間２０μｌの非濃縮ハイブリドーマ組織培養上清でインキュベートした。スライドをＴｒｉｓバッファー食塩水（ＴＢＳ）ｐＨ７．６（１ｌの蒸留水中にＴｒｉｓ，６０５ｍｇ、ＮａＣｌ，８ｇ）で二度洗浄した後、５％正常ヒト血清を含有するＴＢＳに１：５０で希釈したペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスイムノグロブリン（ＤＡＫＯ，コペンハーゲン、デンマーク）と共に室温で３０分間インキュベーションを行った。このスライドをＴＢＳで再度洗浄し、０．０３％過酸化水素を含有する１０ｍｌのＴｒｉｓＨＣｌｐＨ７．６中のジアミノベンジジン（Sigma．St．Louis ，MO）５ｍｇの新鮮な濾過液に浸した。５分後に、水道水で洗浄することによってペルオキシダーゼ基質反応を止め、Ｈｅｙｅｒのヘマトキシリンで染色し、アルコールで脱水してＤＰＸ（ＢＤＸ、Poole，UK）に載せた。免疫組織化学法(Immunohistochemical methods) １．ホルマリン固定組織の間接的イムノペルオキシダーゼ染色。ホルマリン固定、パラフィン包理組織とＭＡｂｓとの反応性を調べるために、（ａ）１０％中性緩衝化ホルマリンもしくは（ｂ）酸性ホルマリン（１０％ホルマリン中の２％酢酸）のそれぞれに２時間固定した。一定の処理をした後、３−４μｍの切片を上述の間接ペルオキシダーゼ技術で染色した（“スクリーニング”参照）。染色の前に、メタノール中の０．５％過酸化水素の新鮮な調製液を用いて室温で多湿のチャンバー内で１０分間組織片をインキュベーションすることによって内因性のペルオキシダーゼ活性をブロックした。水道水で洗浄した後、用いた固定液のタイプに関わらず３つの方法の一つでスライドを処理した。（i）直接的染色；（i i）トリプシンで切断。切断用にスライドを蒸留水中で３７℃に温め、０．１％トリプシン（Sigma．type II）、０．１％ＣａＣｌ₂、ＮａＯＨでｐＨ７．８に調節した新鮮な溶液に５−４０分間移した。（iii）他のプロテアーゼ溶液で分解した。温められたスライドを、ＴＢＳ中のプロテアーゼ（Sigma，type IV），０．０２５％ｐＨ７．６の溶液に５−１５分間移した。上記（i）および（ii）では、酵素反応を冷えた流動水で止めた。水とＴＢＳで洗浄した後、分解された切片を間接的なイムノペルオキシダーゼ技術で染色した。２．凍結組織切片の間接イムノペルオキシダーゼ染色。正常な大腸の凍結切片、他の正常な組織および結腸の腫瘍を上述のように調製した（“スクリーニング” 参照）。これらを４ウェルのマルチテストスライド（C.A．Hendly-Essex）に拾い、染色した。これらは酵素分解されず、内因性ペルオキシダーゼ活性はブロックされていなかった。全ての組織をＭｅｙｅｒのヘマトキシリンで染色し、段階的なアルコールで脱水し、キシレンでクリアーにしてＤＰＸに載せた。３．凍結切片の免疫蛍光。正常な結腸組織と腫瘍の両方の凍結切片は、間接的免疫蛍光によって調べることもできる。アセトンで１５分間固定した後、切片をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。切片を多湿チャンバーで３０分間２０μ ｌの非濃縮ハイブリドーマの上清でインキュベートし、ＰＢＳで３度洗浄し、ＰＢＳに１：４０で希釈した蛍光結合ウサギ抗マウスＩｇＧ（ＤＡＫＯ）でさらに３０分間インキュベートした。ＰＢＳでさらに３度洗浄して、蒸留水で最後の洗浄を行った後、切片をGelvato 20/30(Monsanto，Springfield，MA)に載せ、エピフルオレセンス(epifluorescence)を備えたLeitz Orthoplan顕微鏡で観察した。４．セルラインの免疫細胞化学的試験。癌腫系統の細胞を、スライドガラス状で生育する。ＰＢＳ−Ａでこれらを三度洗浄し、生きているものか１０分間アセトンで固定したもののいずれかを染色する。５．コントロール。イムノヒストケミカル(Immunohistochemical)染色は、一次層として非ハイブリドーマ組織培養培地（１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０）の使用によって調節される。さらに、イムノペルオキシダーゼ染色用の第二の抗体酵素複合体およびジアミノベンジジン溶液は別々に使用することもできる。免疫蛍光には、ＦＩＴＣ結合ウサギ抗マウスＩｇＧを単独で使用することができる。これらの試薬による非特異的染色は観察されなかった。結腸直腸腫瘍の評価結腸腺癌は、ヘマトキシリンおよびエオシン(eosin)で染色された切片を用いてBlenkinsoppら(1981)の基準で組織学的に分類した。各抗体に対して、腫瘍を “陰性”（全く反応しない細胞）、“不均一”（ある細胞は反応する）もしくは “陽性”（全ての細胞が反応）と評価した。同じ腫瘍の異なる細胞間、もしくは腫瘍細胞と隣接した正常な上皮との間の染色強度の違いは時々観察されるが定量できない。抗体は、空気乾燥してカバーガラス上にアセトン固定したＣＥＡ陽性細胞を用いて間接的免疫蛍光アッセイでスクリーニングできる。また、ＣＥＡを有する全ての細胞または組織切片は使用され、ＥＬＩＳＡまたはラジオイムノアッセイ（ＩＲＡ）で調べることができる。ＣＥＡ発現セルラインに陽性、ＢＧＰ-およびＮＣＡ-発現セルラインに陰性、ＢＧＰ-ＣＥＡＢ３-発現およびＢＧＰ-ＣＥＡＢ３-ＢＧＰＴＭ-発現セルラインに陰性である抗体は、本発明の抗体を含むものである。実施例４：ＣＥＡに対して反応する単一特異的ポリクローナル抗体の調製ＣＥＡに対して反応する単一特異的ポリクローナル抗体を調製するために、適切な動物（ウサギ、ヤギ等）をＢＧＰ-ＣＥＡＢ３-ＧＰＩで免疫化する。次いで、ＢＧＰ反応性抗体を除去して本発明に係るＣＥＡ反応性抗体を残すために、このようにして得られた抗血清を、精製したＢＧＰまたはＢＧＰを発現する細胞で吸収する。実施例５：結腸癌のラジオイムノシンチグラフィー（ＲＩＳ） Nuclear Medicine，trends and possibilities in nuclear medicine，pp．53 1-534 SchmidtとBuraggi(eds.)，Schattauer，New York．にGranowskaら(1989) が記載したＲＩＳでは抗体を用いる。実施例２の方法で得られたモノクローナル抗体を、Hnatovichら(1987)の二価性キレート法を用いてインジウム−１１１で標識する。イメージングは、メディアム・エナジー・パラレル・ホール’ガリウム’コリメーターを備え、ＮｏｄｅｃｒｅｓｔＶ７７コンピューターに連結されたＳｉｅｍａｎｓ７５チューブ・ディジトラック回転ガンマカメラセットを用いて行われる。イメージは、透明なフィルム上およびコンピューターのディスプレイ上にカラーで表示される。結腸直腸癌が最初からもしくは再発する疑いのある患者は、外科医によって選択されＲＩＳを受ける。この研究は、保険社会福祉省(Department of Health)の放射活性物質投与顧問委員会(Administration of Radioactive Substances Advi sory Committee)に承認されている。サインの入った通知された同意書を各患者から得られた。外因性のタンパクにアレルギーの経験がある患者または、抗体に対して陽性の皮膚試験を有する患者は除外する。低い直腸の腫瘍を有する患者は、リンホシンチグラフィー(lymphoscintigraphy)を行うために抗体の直腸の粘膜下注入として多様のものを用いて研究された。既知の量の活性の２−３ｍＣｉ（８０−１２０ＭＢｑ）の注入後、イメージングを、放射の断層撮影法（トモグラフィー）で直ちに、時には４時間、２４時間後に行い、さらに４８、７２もしくは９６時間後に行った。患者の還納(reposit ioning)および各時点における像をチェックするためにボーン・ランド-マーク(t he bone land-marks)に見られる６つの放射活性マーカー源と共に、下方の胸部および上方の腹部、および下方の腹部および骨盤の前方および後方の像を得る。ガンマカメライメージも、削除された外科的検体から作成される。腫瘍の組織学的な段階および等級付けが行われる。標準および適切な背景サンプルと共に、腫瘍に関係するかしないかがわかった粘膜およびリンパ節の近くの腫瘍の被検物は選別され数えられる。連続的な血液および尿のサンプルもまたアッセイされる。２４時間での血液クリアランスは、平均で５分のサンプル体積を１００％として注射量の５１％；４８時間で３３％、並びに７２時間で２７％である。尿での排出は、３％未満である。結腸直腸癌の根本的および再発のイメージは、質が高い。腫瘍部位は、４時間ほどで腹部および骨盤にはっきりと同定される。時がたつにつれて、徐々に活性を上昇させる早期イメージでは、焦点欠陥として肝臓転移が同定される。Ｉｎ− １１１抗ＣＥＡ（すなわち、ＰＲ１Ａ３によって認識されるエピトープを認識しない抗ＣＥＡ抗体）で慣れているものより正常な腸での取り込みがかなり低い。骨髄と肝臓の取り込みは似ている。間違った陽性もしくは間違った陰性の結果は得られない。平面画像が良好であったので、単一のフォトンの放出トモグラフィーは特定の利益があるものではない。外科的な被検物のイメージングは、腫瘍およびポリープは高度の取り込みを備えること、並びに他のＣＥＡ抗体（ＰＲ１Ａ３によって認識されるエピトープを認識しないもの）と違って正常な節は視認されないことを示す。粘膜に対する腫瘍の割合は、４７：１と広範である。ほとんど分化していない腫瘍は、この抗体をかなり良く取り込み、平均してＩｎ−１１１抗ＣＥＡ（ＰＲ１Ａ３によって認識されるエピトープを認識しない）より優れている。実施例６：マウスモノクローナル抗体のヒューマナイジング（ＣＤＲ移植）モノクローナル抗体の種々の領域をコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をクローン化して配列決定した。重鎖Ｖ領域のＰＣＲクローニングに使用したプライマーはOrlandiら(1989)のものであり、軽鎖Ｖ領域に用いたものはJonesとBendig (1991)のものであった。それぞれの場合で、二つの配列は与えられ、それぞれ親のＮＳ１軽鎖および重鎖のもので、重鎖と軽鎖に独特の配列である。独特な配列の特異性を確かめるために、これらを、マウス抗体Ｖ領域がヒトの定常領域に融合されたヒト-マウスキメラ抗体として発現させた。マウス抗体Ｖ_H 領域クローンは、ＰＣＲ技術でヒトＩｇＧ₁重鎖ＮＥＷＭ（Kabatら（1991）上述）のＣ領域のｃＤＮＡクローンに連結した（図１参照）。マウス抗体Ｖ_L領域をＰＣＲ技術によってヒトκ軽鎖ＲＥＩ（Kabatら(1991)上述）のｃＤＮＡクローンに連結した（図２参照）。ＮＥＷＭ配列はPoljakら(1977)Biochemistry 16，3412-3420に開示され、ＲＥＩ配列はPalmとHilschmann（1973）Z．Physiol．Chem．354，1651-1654に開示されており、参照としてこれらの両方をここに取り込む。キメラ軽鎖および重鎖を発現ベクターｐＣＤＭ８に挿入し、二つのプラスミドをＣＯＳ細胞に共移入（co-transfected）した。培養して８日後、約１μｇ／ｍｌの抗体レベルをヒトＩｇＧＦｃ特異的ＥＬＩＳＡで調べ、このキメラ抗体はＰＲ１Ａ３が同定する決定基を備えたヒトの胃癌腫セルラインＭＫＮ４５細胞上に陽性免疫蛍光染色を与えた。Ｖ領域のＤＮＡ配列は、ヒューマナイズ化した抗体を設計するのに用いられた。データベースの分析により、マウス抗体に類似したヒト抗体の選択が可能である（約７５％の相同性）。このヒト抗体の配列は、オーバーラッピングオリゴヌクレオチドおよびＰＣＲから構成され、次いでＮＥＷＭ重鎖のｃＤＮＡに連結されたヒューマナイズ化された抗体の配列を設計するための鋳型として用いられる。マウスの軽鎖は、ヒトの軽鎖に対して７０％の相同性を有していた。次いで、この軽鎖を、LewisとCrowe(1991)の方法によりオリゴヌクレオチドおよびＰＣＲを用いてヒューマナイズ化されたＰＲ１Ａ３軽鎖を作成するための鋳型として用いた。方法重鎖（図６参照）合成オリゴヌクレオチド，１−６は、モノクローナル抗体の重鎖の可変領域をコードする。これらのオリゴヌクレオチド（９０mers）は、各配列オリゴヌクレオチド間に１２塩基対のオーバーラップ（重複）があり、ＤＮＡのセンスもしくはアンチセンス鎖をコードする。オリゴヌクレオチド対間のプライマーダイマーフォーメーションを起こした後に、ＰＣＲ増幅を行う。定常領域は、プラスミド内に含まれたヒト重鎖配列から開始された。これらのプライマーに取り込まれたものは、可変領域の３’末端との５’のオーバーラップおよび遺伝子の３’最末端のクローニング部位である。ＰＣＲの条件軽鎖（図７参照）軽鎖を重鎖と同様の方法で作成した。オーバーラッピングフラグメントを産生するためにプライマー１＋２、３＋４、５＋６、７＋８をＰＣＲ増幅する。用いたプログラムは、重鎖と同様である。次いでこのフラグメントをＰＣＲプログラムに用いて連結した。最初にフラグメントだけを添加する。外側のプライマーを添加する。この作成物の鋳型は、プラスミド内に含まれていたヒト軽鎖配列であった。プライマー（２０−３０mers）は、ヒトのフレームワークに相補的な３’領域および外因性の５’領域（制限酵素部位または部分的なモノクローナル抗体ＣＤＲ）を有するように設計された。このフラグメントを増幅し、５’外因性配列をこの増幅の間に取り込んだ。個々のフラグメントを末端でオーバーラップさせ、完全な遺伝子を形成すべくオーバーラッピングＰＣＲによって結合させた。軽鎖および重鎖を発現ベクターｐＣＤＭ８に挿入し、抗体をＣＯＳ細胞で発現させ、ＭＫＮ４５細胞に対する結合活性を免疫蛍光法によって確かめた。ＰＲ１Ａ３のＶ領域は、Ｘ線結晶学的研究から知られた抗体の構造の相関性(c o-ordinates)を用いてモデル化した。相補性決定領域（ＣＤＲｓ）は、Chothia ら(1992)から引き出されたカノニカル(canonical)ループ構造を用いたフレームワーク構造に適合するものであった。このモデルの顕著な特徴は、付加的な残基を含むことであり、軽鎖のＣＤＲ３にチロシンならびに重鎖のＣＤＲ２と重鎖のＣＤＲ３にグルタミン酸残基を一つずつ含むことである。二つのグルタミン酸は、通常は不対のチャージを有するが、このループをねじらせ、構造を安定化するためにＣＤＲ３-Ｌループの二つのチロシンとＶＨの不対グルタミン酸との間に塩橋を形成する。これらの特徴があることにより、これらが抗原認識のキーポイントであり、このエピトープが陽性チャージを有することが強力に示唆される。マウスＰＲ１Ａ３重鎖Ｖ領域を配列決定することにより、ＣＤＲ１-Ｈの最初のアミノ酸の二つの残基の選択が一貫して与えられ、バリンとグルタミンの両方が見出された。両方のイソタイプのキメラ抗体は、ＭＫＮ４５細胞を用いた免疫蛍光的研究で同様に活性であり、モデル化は、両方のアミノ酸を構造上強いられる拘束のない場所に位置させる。実施例７：細胞のアセトン固定と結合の決定細胞懸濁液、約１０⁵細胞／リン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）ｍｌ、を顕微鏡のスライドガラスに滴下し、乾燥させ、１０分間アセトンに浸してＰＢＳですすいだ。もしくは、１０ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０等の培養液を含有するペトリ皿にカバーガラスを配置し、細胞をこのカバーガラス上にまく。次いで、このペトリ皿を４８〜７２時間、３７℃でインキュベートし、ペトリ皿から移し、ＰＢＳですすぎ、１０分間アセトンに浸してＰＢＳですすぐ。このスライドガラスまたはカバーガラスを適切な試験抗体とインキュベートして洗浄した。この試験抗体は、この細胞に結合するか否かのいずれかである。試験抗体の結合を調べるために、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）で標識した抗種抗体(anti-species antibody)を添加して細胞を洗浄した。結合は、蛍光を測定して調べた。マウスＩｇＧを試験抗体とする場合には、ＦＩＴＣ結合ヒツジ抗マウス抗体（ Sigma Chemical Co，Poole，Dorset，UK）をプローブとして用いる。結合の研究に用いた細胞は、結腸癌腫セルラインＨＴ-２９（ＡＴＣＣＨＴＢ３８）；ＣＥＡｃＤＮＡを移入したＣＯＳ-７細胞；および実施例１に記載したＤＮＡキメラ作成物のいずれかを移入したＣＯＳ-７細胞である。ＣＯＳ-７細胞の移入は、エレクトロポレーションによる。エレクトロポレーション：２００μｇのプラスミドＤＮＡを、１０⁷−１０⁸細胞／ｍｌの濃度のＰＢＳ中の０．８ｍｌの細胞と混合した。細胞をBio-Rad Gene P ulserを用いて１ｋｖ、２５μＦＤのキャパシタンスでパルスした。細胞を少なくとも１０分間氷上に置いてから培養液に移した。３７℃のオーバーナイトインキュベーションの後に新鮮な培地を細胞に添加した。実施例８：マウスモノクローナル抗体のヒューマナイズ化マウスモノクローナル抗体の種々の領域を、配列の５’末端にHindIII制限部位を添加し、３’末端がヒト抗体ＲＥＩのκ鎖の定常ドメインの５’末端とオーバーラップする領域を有するように設計したプライマーを用いたＰＣＲで増幅した。これは標準的な増幅工程を用いて増幅される（９５℃で１分間の後、９５℃ で１分間、６０℃で２分間、７２℃で２分間のサイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で１０分間）。このＲＥＩκ定常フラグメントを、モノクローナル抗体 κ可変部位の３’末端との５’オーバーラップと３’XbaI部位を添加するプライマーで同じ条件で増幅する。これらのフラグメントを結合させ、相互開始合成(m utually primed synthesis)で伸長して、マウスモノクローナル抗体のκ鎖の可変領域とヒト抗体ＲＥＩのκ鎖の定常ドメインとを含有する配列を作成した。ＰＣＲの条件は、両方のフラグメントを含有する反応を９５℃で２分間および７２℃で４分間で７回増幅し、その後、外側プライマーを添加して標準増幅工程を行う。重鎖を、マウスモノクローナル抗体の重鎖の可変領域とヒト重鎖のＮＥＷＭの定常ドメインとを用いて類似の方法で作成した。これらのフラグメントをHindIIIとXbaIを用いた制限エンドヌクレアーゼ分解によって取り出した。これらをベクターｐＣＤＭ８に個別に配置し、ＣＯＳ細胞に共移入（co-transfected）した。キメラ抗体が培地に分泌され、ＭＫＮ４５細胞の表面に発現したＣＥＡに対する免疫蛍光によって試験するとマウスを起源とする構成物の特徴の全てを示した。請求の範囲１．完全なマウスモノクローナル抗体におけるＶ_H鎖の配列が、あるいは完全なマウスモノクローナル抗体におけるＶ_H鎖の配列が、Ｖ_HＣＤＲ１の最初のアミノ酸残基がグルタミンであること以外は上と同じであり、どちらの場合でも前記完全なモノクローナル抗体におけるＶ_L鎖の配列がであるＩｇＧ₁グループＩＩＡ重鎖とκグループＶ軽鎖とを備える完全なマウスモノクローナル抗体以外の分子であって、（i）膜結合性ヒト癌胎児性抗原を結合し、（ii）ヒト癌胎児性抗原の４９０残基〜Ｃ末端に結合（Ｎ−Ｃ）したヒトの胆汁糖タンパク質の１〜３１４残基からなるハイブリッドポリペプチドを結合し、（iii）ヒトの胆汁糖タンパク質に結合せず、かつ（iv）可溶性でＣＯＳ細胞から分泌されるヒト癌胎児性抗原の４９０〜６４３残基に結合（Ｎ−Ｃ）したヒトの胆汁糖タンパク質の１〜３１４残基からなるハイブリッドポリペプチドを結合しない分子。２．分子が単一特異的抗体である請求項１記載の分子。３．ヒトフレームワーク領域と、請求項１に記載されたＶ_H鎖とＶ_L鎖の少なくとも一つの相補性決定領域を有する抗体であって、Ｖ_H鎖のＣＤＲ１がＶＦＧＭＮ、ＣＤＲ２がＷＩＮＴＫＴＧＥＡＴＹＶＥＥＦＫＧおよひＣＤＲ３がＷＤＦＹＤＹＶＥＡＭＤＹであり、Ｖ_L鎖のＣＤＲ１がＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡ、ＣＤＲ２がＳＡＳＹＲＹＳおよびＣＤＲ３がＨＱＹＹＴＹＰＬＦＴとされた抗体である請求項１記載の分子。４．抗体がモノクローナル抗体である請求項３記載の分子。５．さらに直接的または間接的な細胞毒性分子を備えた請求項１ないし４のいずれか一項に記載の分子。６．さらに容易に検出可能な標識を備えた請求項１ないし４のいずれか一項に記載の分子。７．医薬に用いるための請求項１ないし６のいずれか一項に記載の分子。８．結腸直腸癌腫の診断に使用される医薬の製造における請求項１ないし４および６のいずれか一項に記載の分子の使用。９．結腸直腸癌腫の治療に使用される医薬の製造における請求項１ないし５のいずれか一項に記載の分子の使用。１０．（i）ヒト癌胎児性抗原を結合し、（ii）ヒト癌胎児性抗原の４９０残基〜Ｃ末端に結合（Ｎ−Ｃ）したヒトの胆汁糖タンパク質の１〜３１４残基からなるハイブリッドポリペプチドを結合し、かつ（iii）ヒトの胆汁糖タンパク質に結合しない単一特異的抗体を選択するように、抗体のプールをスクリーニングすることを含む、請求項２記載の単一特異的抗体の製造方法。１１．単一特異的抗体がモノクローナル抗体であり、抗体のプールがモノクローナル抗体のプールである請求項１０記載の方法。１２．プール内の抗体が、組換えＤＮＡ方法によって製造された抗体である請求項１０記載の方法。１３．抗体の結合部位が、レプリカベクターの表面に提示される請求項１２記載の方法。１４．レプリカベクターがバクテリオファージである請求項１３記載の方法。１５．完全なマウスモノクローナル抗体におけるＶ_H鎖の配列が、あるいは完全なマウスモノクローナル抗体におけるＶ_H鎖の配列が、Ｖ_H ＣＤＲ１の最初のアミノ酸残基がグルタミンであること以外は上と同じであり、どちらの場合でも前記完全なモノクローナル抗体におけるＶ_L鎖の配列がであるＩｇＧ₁グループＩＩＡ重鎖とκグループＶ軽鎖とを備える完全なマウスモノクローナル抗体以外の分子であって、請求項１０ないし１４のいずれか一項に記載の方法によって得られる単一特異的抗体。１６．ヒト癌胎児性抗原の４９０残基〜Ｃ末端に結合（Ｎ−Ｃ）したヒトの胆汁糖タンパク質の１〜３１４残基からなるハイブリッドポリペプチド。１７．ヒト癌胎児性抗原の４９０〜６４３残基に結合（Ｎ−Ｃ）したヒトの胆汁糖タンパク質の１〜３１４残基からなるハイブリッドポリペプチド。１８．ヒトの胆汁糖タンパク質の１〜３１４残基、ヒト癌胎児性抗原の４９０〜６４４残基、ヒトの胆汁糖タンパク質の３９１〜４３０残基の順で結合（Ｎ−Ｃ）したハイブリッドポリペプチド。１９．ヒトの胆汁糖タンパク質の１〜３１４残基、ヒト癌胎児性抗原の４９０〜６４２残基、ヒトの胆汁糖タンパク質の３８７〜４３０残基の順で結合（Ｎ−Ｃ）したハイブリッドポリペプチド。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 15/02 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/574 Ｅ 15/09 0276−2Ｊ 33/577 ＢＧ０１Ｎ 33/53 9284−4ＣＡ６１Ｋ 39/395 Ｔ 33/574 9284−4ＣＡＤＵＥ 33/577 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ａ // Ａ６１Ｋ 39/395 9162−4ＢＣＡＤＵ 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ダービン，ヘルガイギリス国ロンドンＷＣ２Ａ３ＰＸピーオーボックス 123 リンカーンズインフィールズ 44 インペリアルキャンサーリサーチファンド (72)発明者スネイリー，デイビッドイギリス国ロンドンＥＣ１Ａ７ＢＥバーソロミュークロース 59 ドミニオンハウスエスティーバーソロミューズホスピタルアプライドディベロップメントラボラトリーインペリアルキャンサーリサーチファンド (72)発明者スチュワート，ローナマリーダイエットイギリス国ロンドンＥＣ１Ａ７ＢＥバーソロミュークロース 59 ドミニオンハウスエスティーバーソロミューズホスピタルアプライドディベロップメントラボラトリーインペリアルキャンサーリサーチファンド (72)発明者ヤング，スーザンイギリス国ロンドンＥＣ１Ａ７ＢＥバーソロミュークロース 59 ドミニオンハウスエスティーバーソロミューズホスピタルアプライドディベロップメントラボラトリーインペリアルキャンサーリサーチファンド (72)発明者ベイツ，ポールアランイギリス国ロンドンＷＣ２Ａ３ＰＸピーオーボックス 123 リンカーンズインフィールズ 44 インペリアルキャンサーリサーチファンド

Claims

【特許請求の範囲】１．Ｖ_H鎖の配列が、あるいはＶ_H鎖の配列が、Ｖ_HＣＤＲ１の最初のアミノ酸残基がグルタミンであること以外は上と同じであり、どちらの場合でもＶ_L鎖の配列がであるＩｇＧ₁グループＩＩＡ重鎖とκグループＶ軽鎖とを備える完全なマウスモノクローナル抗体以外の分子であって、（i）膜結合性ヒト癌胎児性抗原を結合し、（ii）ヒト癌胎児性抗原の４９０残基〜Ｃ末端に結合（Ｎ−Ｃ）したヒトの胆汁糖タンパク質の１〜３１４残基からなるハイブリッドポリペプチドを結合し、かつ（iii）ヒトの胆汁糖タンパク質に結合しない分子。２．ヒトフレームワーク領域と、請求項１に記載されたＶ_H鎖とＶ_L鎖の少なくとも一つの相補性決定領域を有する抗体であって、Ｖ_H鎖のＣＤＲ１がＶＦＧＭＮ、ＣＤＲ２がＷＩＮＴＫＴＧＥＡＴＹＶＥＥＦＫＧおよびＣＤＲ３がＷＤＦＹＤＹＶＥＡＭＤＹであり、Ｖ_L鎖のＣＤＲ１がＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡ、ＣＤＲ２がＳＡＳＹＲＹＳおよびＣＤＲ３がＨＱＹＹＴＹＰＬＦＴとされた抗体である請求項１記載の分子。３．抗体がモノクローナル抗体である請求項２記載の分子。４．さらに直接的または間接的な細胞毒性分子を備えた請求項１ないし３のいずれか一項に記載の分子。５．さらに容易に検出可能な標識を備えた請求項１ないし３のいずれか一項に記載の分子。６．医薬に用いるための請求項１ないし５のいずれか一項に記載の分子。７．結腸直腸癌腫の診断に使用される医薬の製造における請求項１ないし３および５のいずれか一項に記載の分子の使用。８．結腸直腸癌腫の治療に使用される医薬の製造における請求項１ないし４のいずれか一項に記載の分子の使用。９．（i）ヒト癌胎児性抗原を結合し、（ii）ヒト癌胎児性抗原の４９０残基〜Ｃ末端に結合（Ｎ−Ｃ）したヒトの胆汁糖タンパク質の１〜３１４残基からなるハィブリッドポリペプチドを結合し、かつ（iii）ヒトの胆汁糖タンパク質に結合しない単一特異的抗体を選択するように、抗体のプールをスクリーニングすることを含む単一特異的抗体の製造方法。１０．単一特異的抗体がモノクローナル抗体であり、抗体のプールがモノクローナル抗体のプールである請求項９記載の方法。１１．プール内の抗体が、組換えＤＮＡ方法によって製造された抗体である請求項９記載の方法。１２．抗体の結合部位が、レプリカベクターの表面に提示される請求項１１記載の方法。１３．レプリカベクターがバクテリオファージである請求項１２記載の方法。１４．請求項９ないし１３のいずれか一項の方法によって得られる単一特異的抗体。１５．ヒト癌胎児性抗原の４９０残基〜Ｃ末端に結合（Ｎ−Ｃ）したヒトの胆汁糖タンパク質の１〜３１４残基からなるハイブリッドポリペプチド。１６．ヒト癌胎児性抗原の４９０〜６４３残基に結合（Ｎ−Ｃ）したヒトの胆汁糖タンパク質の１〜３１４残基からなるハイブリッドポリペプチド。１７．ヒトの胆汁糖タンパク質の１〜３１４残基、ヒト癌胎児性抗原の４９０〜６４４残基、ヒトの胆汁糖タンパク質の３９１〜４３０残基の順で結合（Ｎ−Ｃ）したハイブリッドポリペプチド。１８．ヒトの胆汁糖タンパク質の１〜３１４残基、ヒト癌胎児性抗原の４９０〜６４２残基、ヒトの胆汁糖タンパク質の３８７〜４３０残基の順で結合（Ｎ−Ｃ）したハイブリッドポリペプチド。