WO1995014931A1 - Procede de dosage d'une substance reagissant avec un reactif de limulus - Google Patents

Procede de dosage d'une substance reagissant avec un reactif de limulus Download PDF

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WO1995014931A1
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Hiroshi Tamura
Toshio Oda
Shigenori Tanaka
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Seikagaku Corp
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Seikagaku Corp
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/579—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving limulus lysate

Definitions

  • the present invention uses a Limulus 'Amebosite' lysate reagent (hereinafter referred to as Limulus reagent) to react with a Limulus reagent such as endotoxin or (1 ⁇ 3) - ⁇ - ⁇ -glucan (hereinafter abbreviated as ⁇ -glucan).
  • Limulus reagent such as endotoxin or (1 ⁇ 3) - ⁇ - ⁇ -glucan (hereinafter abbreviated as ⁇ -glucan).
  • ⁇ -glucan a Limulus reagent
  • the present invention relates to a measurement method for measuring a toxic substance.
  • Injecting blood, infusions, and injections containing endotoxin into the body can cause side effects such as strong fever and shock.
  • side effects such as strong fever and shock.
  • the endotoxin level must be measured each time.
  • Limulus amebosite and lysate were found to react with endotoxin to form a gel, and a measurement method applying this phenomenon has been used as a method of measuring endotoxin instead of the rabbit fever test. .
  • This measurement method involves irradiating the reaction solution with a specific light beam in order to objectively determine the degree of turbidity of the reaction solution (reaction mixture solution containing the sample solution and Limulus reagent) due to gelation.
  • the reaction solution reaction mixture solution containing the sample solution and Limulus reagent
  • the ratio to the initial value is determined, and the time until this ratio reaches a certain value is determined as the gelation time, and the endotoxin concentration measurement is performed.
  • a measuring method as an index is known (a type of turbidimetric limulus test by a reaction rate method: turbidimetric time analysis method; see Japanese Patent Publication No. 5-311744).
  • a light emitting diode emitting a light beam having a wavelength of about 660 nm is used as a light source, and a photo, diode, photoelectric cell, or the like is used as a light amount detector.
  • glucan also gels Limulus 'amebosite' lysate It is known.
  • the measurement method of the present invention provides a highly sensitive and highly accurate method for measuring a limulus reagent-reactive substance such as endotoxin or / S-glucan by a turbidimetric limulus test without being affected by interfering substances. It was designed to determine the wavelength of light that can be measured. Disclosure of the invention
  • a Limulus reagent is allowed to act on a sample solution, gelation is caused, and an increase in the turbidity of the reaction solution accompanying the gelation is detected by irradiating a light beam, and the Limulus reagent-reactive substance in the sample is detected.
  • the wavelength of the light beam irradiated to the reaction solution was set to a wavelength selected from the range of 340 to 420 nm.
  • the wavelength of the light beam is preferably a wavelength selected from the range of 390 to 410 nm.
  • examples of the Limulus reagent-reactive substance include endotoxin and / S-glucan.
  • FIG. 1 is a side view showing an example of a turbidity measuring device used in the method for measuring a Limulus reagent-reactive substance of the present invention
  • Fig. 2 is a characteristic curve diagram showing the absorbance value with respect to the wavelength of the light beam irradiating the reaction solution.
  • Fig. 3 is the relationship between the change rate of the absorbance value of the reaction solution and the concentration of the Limulus reagent reactive substance (endotoxin). Characteristic curve diagram showing the relationship,
  • FIG. 4 shows the time required for the absorbance value of the reaction solution to reach a certain threshold value and the Limulus test.
  • FIG. 4 is a characteristic curve diagram showing a relationship with a concentration of a drug-reactive substance (/?-Glucan). BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • Limulus reagents used in the present invention include Limulus polyphemus, Tachypleus' Tridentus (Tachypleus tridentatus), Taki Preus' Gigas (T. gigas), and Carcinos corpius' Candinoica corp. Rot A blood cell extract (limulus amebosite 'lysate) or a processed product thereof prepared from a horseshoe crab hemolymph of the same manner by a conventional method (for example, see Journal of Biochemistry, 80, 1011-1021 (1976)). It is a reagent that causes tondoxin and Z or / S-glucan to act on it to gel.
  • Examples of the above-mentioned processed product include those obtained by subjecting Limulus amebocyte lysate to an extraction treatment with an organic solvent such as black form or adding a surfactant to improve the sensitivity to endotoxin.
  • Limulus amebocyte lysate usually contains both endotoxin-sensitive factor (Factor C) and / 3-glucan-sensitive factor (Factor G), but the above processed products include dextran sulfate, Limulus amebosite lysate is treated with a carrier to which a sulfopropyl group or the like is bound, and either factor C or factor G is fractionated or removed, and only one of endotoxin or S-glucan is treated.
  • the Limulus reagent may be in any form such as a liquid, a powder, and a solid.
  • the sample solution for which the Limulus reagent-reactive substance is to be measured is not particularly limited, and examples thereof include blood, urine, cerebrospinal fluid, infusion, injection, and water.
  • the sample solution is pre-treated (acid treatment, alkali treatment, heat treatment, surfactant treatment, etc.) if necessary, and the Limulus reagent is allowed to act in a suitable reaction vessel to cause gelation.
  • the increase in turbidity caused by the gelation is detected by irradiating the reaction mixture with light having a wavelength selected from the range of 340 to 420 nm and measuring the absorbance.
  • the amount of the Limulus reagent-reactive substance in the sample solution is quantified by comparing a calibration curve prepared by measuring the solution containing a known concentration of the Limulus reagent-reactive substance in the same manner with the value obtained by the measurement. Can be.
  • the comparison between the calibration curve and the value obtained by the measurement can be automatically performed according to a program created in advance.
  • the wavelength of the light beam is smaller than 340 nm or larger than 420 nm, it will be mixed with the aqueous solution of the Limulus reagent-reactive substance under the influence of various interfering substances that may coexist in the sample solution. Equivalent absorbance cannot be obtained.
  • Representative interfering substances include proteins having a maximum absorption at 280 nm and nucleic acids having a maximum absorption at 260 nm.
  • the sample solution and the Limulus reagent are mixed to form a reaction solution, and at 30 to 50 ° C, preferably 35 to 45 ° C, for 15 minutes to 3 hours, preferably May be reacted for 30 minutes to 90 minutes.
  • the method of measuring the absorbance may be either a method of measuring after stopping the reaction (end-point method) or a method of measuring while reacting (reaction rate method: force-inetic method).
  • reaction rate method a method in which the time until the absorbance (the amount of transmitted light) of the reaction solution reaches a certain value is a gelation time (turbidimetric time analysis method), a method in which the rate of change in the absorbance of the reaction solution is measured, etc. Is mentioned.
  • the reaction vessel may be any vessel used for a normal Limulus test, and a vessel having a material and shape that does not substantially affect light transmission is used.
  • a test tube or a microplate made of glass, plastic, or the like is suitable.
  • the absorbance measuring device used in the embodiment for carrying out the present invention is, for example, a reaction solution comprising a sample and a reagent, as shown in FIG.
  • a light source 3 consisting of a light emitting body 31 such as a light bulb, a slit 32, and a filter 33 that transmits light of a selected specific wavelength
  • An optical system composed of an optical fiber 34 for dividing the selected light beam into the number of rows of the well 11 of the microphone opening plate 1 for measurement and a photoelectric conversion element 4 for converting the intensity of the light beam transmitted through the reaction solution 14 into an electric signal.
  • the aluminum plate 2 having the holes 21 provided on the bottom surface of the microplate 1 is for making the temperature distribution uniform.
  • Limulus reagent manufactured by Associates of Cape Cod, marketed by Seikagaku Corporation under the name of “Paiguchi Teru”
  • E. coli 0111: B4 derived strain was used.
  • 1 ml of a tondoxin solution (0.25 EU / m 1: EU stands for Endotoxin Unit) was added, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 30 minutes. Then, the reaction was stopped by adding 0.02 ml of 10% trifluoroacetic acid.
  • the absorbance value is measured using a light beam having a wavelength in the range of 340 to 420 nm, and is used as an index of the concentration of the Limulus reagent-reactive substance. It is.
  • a turbidimetric method using endotoxin or S-glucan as the Limulus reagent-reactive substance is used.
  • a light beam with a wavelength range of 340 to 420 nm, preferably 390 to 410 nm in the method of measuring by the Limulus test high sensitivity, high accuracy, and stability without interference by coexisting proteins and coexisting dyes Measurement becomes possible.

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Description

明 細 書 リムルス試薬反応性物質の測定法
技術分野
この発明は、 リムルス 'ァメボサイ ト 'ライセ一ト試薬 （以下、 リムルス試薬 という） を用いて、 エンドトキシン、 （1→3 ) 一 β— Όーグルカン (以下、 β ーグルカンと略称する） などのリムルス試薬反応性物質を測定する測定法に関す る。 背景技術
エンドトキシンが混入した血液、 輸液、 注射液を体内に注入すると、 強い発熱 やショックなどの副作用を引き起こすことがあるので、 輸液、 注射液などの医薬 品の製造工程においては、 エンドトキシンの混入を防ぐために、 その都度エンド トキシン量を測定しなければならない。
リムルス ·ァメボサイ 卜 ·ライセ一卜が、 ェンドトキシンと反応してゲル化す る現象が見出され、 従来より兎発熱試験に代わるエンドトキシンの測定法として、 この現象を応用した測定法が実施されている。
この測定法としては、 ゲル化にともなう反応液 （検体溶液とリムルス試薬を含 有する反応混台液） の濁りの程度を客観的に判定する目的で、 反応液に特定の光 線を照射し、 時間の経過とともに透過光量の減少 （吸光度の増加） を検知して、 初期値との比率を求め、 この比率が一定値に到達するまでの時間をゲル化時間と 判定してェンドトキシン濃度測定の指標とする測定法が知られている （反応速度 法による比濁法リムルステス卜の一種：比濁時間分析法；特公平 5— 3 1 7 4 4 号公報参照） 。
このような光学的な測定法においては、 光源として波長 6 6 0 n m程度の光線 を放射する発光ダイォ一ドが使用され、 光量検出器としてフォト，ダイォード、 光電セルなどが使用されている。
また、 ^ーグルカンも、 リムルス 'ァメボサイト 'ライセートをゲル化させる ことが知られている。
このような従来の光学的な測定法においては、 光源から照射される光線の波長 力、 ゲル化して行く反応液の透過度または吸光度の検知に適した波長であるか否 かについて考慮されていなかった。
また、 検体溶液中に着色物質、 タンパク、 核酸等の妨害物質が存在しても、 測 定値が安定し、 かつ、 実用に供し得る感度を有することが必要であるにもかかわ らず、 従来の測定法においては、 このような条件を満たしているとは言えなかつ た。
そこで、 この発明の測定法は、 比濁法リムルステストによって、 エンドトキシ ンまたは/ S—グルカン等のリムルス試薬反応性物質を測定する際に、 妨害物質の 影響を受けることなく、 高感度、 高精度に測定できる光線の波長を決定すること を目的として考えられたものである。 発明の開示
この発明は、 検体溶液にリムルス試薬を作用させ、 ゲル化を起こさせてゲルィ匕 に伴う反応液の濁度の上昇を光線を照射することによって検出し、 検体中のリム ルス試薬反応性物質を測定する測定法において、 反応液に照射する光線の波長を 3 4 0〜4 2 0 n mの範囲から選定された波長とした。
光線の波長は 3 9 0〜4 1 0 n mの範囲から選定された波長であることが好ま しい。 また、 リムルス試薬反応性物質としては、 エンドトキシンまたは/ S—グ ルカンが挙げられる。 図面の簡単な説明
第 1図は、 この発明のリムルス試薬反応性物質の測定法で使用する濁度測定装 置の一例を示す側面図、
第 2図は、 反応液に照射する光線の波長に対する吸光度値を示す特性曲線図、 第 3図は、 反応液の吸光度値の変化率と、 リムルス試薬反応性物質 （エンドト キシン） の濃度との関係を示す特性曲線図、
第 4図は、 反応液の吸光度値がある閾値に到達するまでの時間と、 リムルス試 薬反応性物質 （/?—グルカン） の濃度との関係を示す特性曲線図である。 発明を実施するための最良の形態
この発明で使用するリムルス試薬とは、 リムルス ·ポリフヱムス （Limulus po lyphemus) 、 タキプレウス ' トリデンタツス （Tachypleus tridentatus) 、 タキ プレウス 'ギガス （T. gigas) 、 カルシノスコルピウス 'ロッンディ力ウダ （Ca rcinoscorpius rotundicauda) 等のカブトガニ血リンパ液から、 通常の方法 （例 えば、 Journal of Biochemistry, 80, 1011-1021(1976)参照) により調製した血 球抽出物 （リムルス ·ァメボサイ ト 'ライセート） またはその加工物であり、 ェ ンドトキシンおよび Zまたは/ S—グルカンがこれに作用してゲル化する試薬であ 。
上記加工物とは、 例えば、 リムルス ·ァメボサイ ト 'ライセートをクロ口ホル ム等の有機溶媒で抽出処理したり、 界面活性剤を添加してエンドトキシンに対す る感受性を向上させたものが挙げられる。 また、 リムルス ·ァメボサイト ·ライ セートには、 通常、 エンドトキシン感受性因子 （C因子） および /3—グルカン感 受性因子 （G因子） の両方が含まれるが、 上記加工物としては、 デキストラン硫 酸、 スルホプロピル基等を結合した担体等を用いてリムルス ·ァメボサイ ト .ラ イセートを処理し、 上記 C因子または G因子の何れか一方の因子を分画もしくは 除去してエンドトキシンまたは S—グルカンの一方のみに作用するように加工さ れたものが挙げられる。
さらに、 リムルス ·ァメボサイト ·ライセー卜に、 例えば （1→3 ) - /3 - D -ダルコシド構造単位が特定個数結合したポリグリコシドを共存させることによ つて、 G因子の活性化を阻害し、 エンドトキシンにのみ反応するように加工した ものも上記加工物に包含される。 なお、 リムルス試薬は液体、 粉末、 固形物等の いずれの形態であってもよい。
この発明においてリムルス試薬反応性物質を測定すべき検体溶液は、 特に限定 されることはなく、 血液、 尿、 髄液、 輸液、 注射液、 水などが例示される。
検体溶液を、 必要に応じて前処理 （酸処理、 アルカリ処理、 加熱処理、 界面活 性剤処理等） し、 適当な反応容器中でリムルス試薬を作用させ、 ゲル化を起こさ せてゲル化に伴う濁度の上昇を、 反応液に 3 4 0〜4 2 0 n mの範囲から選定さ れた波長の光線を照射し、 吸光度を測定することによって検出する。 そして、 既 知濃度のリムルス試薬反応性物質を含む溶液について同様に測定して作成した検 量線と測定により得られた値とを比較して検体溶液中のリムルス試薬反応性物質 を定量することができる。 検量線と測定により得られた値との比較は、 予め作成 されたプログラムに従って自動的に行なうこともできる。
光線の波長が 3 4 0 n mより小さい場合、 および 4 2 0 n mより大きい場合に は、 検体溶液中に共存する可能性のある種々の妨害物質の影響を受けてリムルス 試薬反応性物質の水溶液と同等の吸光度が得られない。 なお、 代表的な妨害物質 としては 2 8 0 n mに極大吸収を有するタンパク、 2 6 0 n mに極大吸収を有す る核酸など挙げられる。
検体溶液にリムルス試薬を作用させるには、 検体溶液とリムルス試薬を混合し て反応液とし、 3 0〜5 0 °C、 好ましくは 3 5〜4 5 °Cにおいて 1 5分〜 3時間、 好ましくは 3 0分〜 9 0分反応させればよい。
吸光度の測定方式は、 反応を停止した後測定する方式 （ェンドボイント法） 、 または反応させながら測定する方式 （反応速度法；力イネティック法） の何れで あってもよい。 反応速度法としては、 反応液の吸光度 （透過光量） が一定の値に 達するまでの時間をゲル化時間とする方式 （比濁時間分析法） 、 反応液の吸光度 の変化率を測定する方式などが挙げられる。
なお、 反応容器は、 通常のリムルステストに使用される容器であればよく、 実 質的に光の透過に影響を及ぼさない材質および形状の容器が使用される。 例えば、 ガラス、 プラスチック等の試験管またはマイクロプレートが好適である。
この発明を実施するための形態で使用する吸光度測定装置は、 例えば、 マイク 口プレートを反応容器とした場合、 第 1図に示すように、 キャリア 5に載せられ、 検体および試薬よりなる反応液 14を入れる複数のゥエル 11を設けた測定用マイク 口プレート 1と、 電球などの発光体 31、 スリツ ト 32、 選定された特定波長の光線 を透過させるフィルタ 33よりなる光源 3と、 このフィルタ 33で選定された光線を 測定用マイク口プレート 1のゥエル 11の列数に分割する光学繊維 34と、 反応液 14 を透過した光線の強度を電気信号に変換する光電変換素子 4とよりなる光学系を 備えている。 なお、 マイクロプレート 1の底面に設けられた孔 21を有するアルミ 板 2は、 温度分布を均一化するためのものである。
[発明を実施するための形態 1 ：ェンドボイン卜法によるェンドトキシンの測 定]
この発明のリムルス試薬反応性物質の測定法において使用する光線の最適な波 長を求めるために、 次の実験を行なった。
市販のリムルス試薬 （Associates of Cape Cod社製造、 生化学工業株式会社が 「パイ口テル」 という名称で販売している試薬） lm 1をガラス試験管に採り、 大腸菌 0111 : B 4株由来のェンドトキシン溶液 （0.25EU/m 1 ： EU は、 Endotoxin Unitの略） 1m lを加え、 37°Cで 30分間反応させた後、 10 %トリフルォロ酢酸 0.02m 1を添加して反応を停止させた。
次いで、
(条件 A)上記反応物に対して、 タンパクとして 25%ヒト血清アルブミン （ HSA) 製剤 （ミ ドリ十字株式会社製） を終濃度で 0.5%となるように添加し、 (条件 B)上記反応物に対して、 黄色色素として 5 mMのパラ二トロア二リン
(pNA) を終濃度で 0.5mMとなるように添加し、
(条件 C)上記反応物に対して、 蒸留水 （DW) を条件 Aおよび条件 Bの水溶 液と同量添加して、
3種の検体溶液を作り、 これら 3種の検体溶液に対して、 波長範囲 200 nm 〜900nmにおける吸光度値 （濁度） を測定した。
それらの結果は、 第 2図の特性曲線図に示すとおりであり、 タンパク共存状態 (条件 A： HSA) でも、 黄色色素共存状態 （条件 B： pNA) でも、 蒸留水 （ 条件 C： DW) と同値を示し、 かつ、 比較的高い吸光度を呈する波長範囲は、 波 長 340〜420 nmであり、 特に好ましい波長範団は 390〜410 nmの範 囲であることが明らかになった。
そこで、 この発明の測定法においては、 この知見に基づいて波長 340〜42 0 n mの範囲の光線を使用して吸光度値の測定を行なつて、 リムルス試薬反応性 物質の濃度の指標とするものである。
[発明を実施するための形態 2 ：反応速度法によるェンドトキシンの測定] 市販されているリムルス試薬 （Associates of Cape Cod社製造、 生化学工業株 式会社が「パイ口テル— T」 という名称で販売している試薬） 0.05mlを 9 6穴マイクロプレート （生化学工業株式会社から発売されているトキシぺットプ レート 96F)のゥ ルに採り、 大腸菌 0113株由来のエンドトキシン溶液の 0.01〜： L 0 OEUZm 1の範囲内で濃度が異なる 5種類のもの各 0.05ml を加えた。 それらに対して、
(条件 A) タンパクとして 25%ヒト血清アルブミン （HS A)製剤を終濃度 で 0.5%となるように添加し、
(条件 B)黄色色素として 5 mMのパラ二トロア二リン （pNA) を終濃度で 0.5mMとなるように添加し、
(条件 C)蒸留水 （DW) を条件 A、 条件 Bの各水溶液と同量添加して、 15種 （=5種類 X 3条件） の反応液を作り、 マイクロプレートの各ゥエルに 採り、 恒温槽を備えたマイクロプレートリーダー （生化学工業株式会社から発売 されているゥエルリーダー SK601) にセッ トし、 攪拌した後、 37°Cで反応 させながら、 波長 400 nmの光線を 15秒間隔で照射して、 吸光度値を測定し o
そして、 上記吸光度値の変化率をエンドトキシンの各濃度に対して、 それぞれ 対数プロッ卜したところ、 第 3図に示す特性を得ることができた。
第 3図の特性曲線図 （検量線） より、 タンパク共存状態 （条件 Λ： HSA)、 黄色色素共存状態 （条件 B： pNA) でも、 蒸留水 （条件 C： DW) とほぼ同じ 吸光度値の変化率を示し、 かつ、 この変化率が、 エンドトキシン濃度と正比例し、 妨害物質が共存しても良好な直線性および再現性が得られることが明らかになつ た。
[発明を実施するための形態 3：反応速度法による 5—グルカンの測定] 「パイ口テル一 T」 0.05m 1をトキシぺッ トプレート 96 Fのゥヱルに採 り、 ^ーグルカンとしてパキマン溶液 （0. IN NaOHに溶解後、 蒸留水で 希釈） の 0.01〜1 n g/m 1の範囲内で濃度が異なる 3種類のもの各 0.05 m 1を加えた。 それらに対して、
(条件 A) タンパクとして 25%ヒト血清アルブミン （HSA)製剤を終濃度 で 0.5%となるように添加し、
(条件 B) 黄色色素として 5 mMのパラ二トロア二リン （pNA) を終濃度で 0.5mMとなるように添加し、
(条件 C) 蒸留水 （DW) を条件 A、 条件 Bの各水溶液と同量添加して、 9種 （=3種類 X 3条件） の反応液を作り、 波長 41 Onmの光線を使用した ほかは発明を実施するための形態 2と同様に操作した。
そして、 吸光度値が、 一定の閾値 （吸光度値が 0.020) に到達するまでの 時間 （ゲル化時間） tを、 各 3—グルカン濃度に対して、 それぞれ対数プロット したところ、 第 4図に示す特性を得ることができた。
第 4図の特性曲線図より、 グルカンの測定においても、 妨害物質の影響を 受けることなく、 良好な直線性および再現性が得られることが明らかになつた。 産業上の利用可能性
以上の発明を実施するための形態に基づく説明から明らかなように、 この発明 のリムルス試薬反応性物質の測定法によると、 リムルス試薬反応性物質としてェ ンドトキシンまたは S—グルカンを用いた比濁法リムルステストにより測定する 方法において、 波長範囲が 340〜420 nm、 好ましくは 390〜410 nm の光線を使用することにより、 共存タンパクや共存色素の妨害を受けることなく、 高感度、 高精度で、 安定した測定が可能になる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 検体溶液にリムルス試薬を作用させ、 ゲル化を起こさせてゲル化に伴う反応 液の濁度の上昇を光線を照射することによって検出し、 検体中のリムルス試薬反 応性物質を測定する測定法において、 反応液に照射する光線の波長を 3 4 0〜4 2 0 n mの範囲から選定された波長としたことを特徴とするリムルス試薬反応性 物質の測定法。
2. 光線の波長が 3 9 0〜4 1 0 n mの範囲から選定された波長である請求の範 囲 1に記載のリムルス試薬反応性物質の測定法。
3. リムルス試薬反応性物質が、 エンドトキシンまたは（1→3 )— /3— D—グル 力ンであることを特徴とする請求の範囲 1に記載のリムルス試薬反応性物質の測 定法。
PCT/JP1994/001973 1993-11-22 1994-11-22 Procede de dosage d'une substance reagissant avec un reactif de limulus Ceased WO1995014931A1 (fr)

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