WO1995018236A1 - IN-SITU HYBRIDIZATION METHOD USING RecA PROTEIN AND RecA PROTEIN HAVING MARKER OR LIGAND FOR USE IN SAID METHOD - Google Patents

IN-SITU HYBRIDIZATION METHOD USING RecA PROTEIN AND RecA PROTEIN HAVING MARKER OR LIGAND FOR USE IN SAID METHOD Download PDF

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Mikayo Yamanaka
Kayo Kihara
Eli Mukai
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Definitions

  • the present invention relates to an isoschi high hybridization method utilizing RecA protein useful for detecting a double-stranded target nucleic acid sequence present in a cell or a cell structure, and the method.
  • the in situ hybridization method is a method in which a nucleic acid probe is hybridized directly to a target nucleic acid sequence such as DNA or RNA existing in a cell.
  • This method involves the use of fixed cells or cell structures with increased permeability (e.g., organs such as nuclear mitochondria, parasites such as bacteria and viruses), or Applies to biological materials such as fixed chromosomal specimens and targets nucleic acid sequences contained in them.
  • the presence of the target nucleic acid sequence can be measured at the place where it exists, that is, in situ, and information on the localization of the target nucleic acid sequence can be obtained.
  • Cell biology, genetics (particularly gene mapping), pathology It is applicable to a wide range of biomedical medicine such as genetic diagnosis.
  • the in situ hybridization method generally involves the identification of double-stranded nucleic acids, typically specific sequences of pathogens and viruses, and chromosomal DNA. Target genes.
  • the traditional in situ hybridisation method uses a single-stranded, labeled nucleic acid probe, which is added to permeabilized cells. After heating to a temperature sufficient to denature the double-stranded target nucleic acid sequence, the probe and the denatured target nucleic acid sequence are hybridized under predetermined conditions. Thereafter, the unreacted probe that has not bound to the target nucleic acid sequence is removed, and the label of the probe bound to the target nucleic acid sequence in the cell is detected.
  • the in situ hybridization method is a method of matching the position of a specific gene sequence on chromosomal DNA and the distance from a known gene (Fan. YS et al., Proc. Natl. USA, 87, 6223, 1990, etc.), studying the arrangement of satellite DNA and other repetitive sequences on the chromosome.
  • in situ hybridisation method Another common application of the in situ hybridisation method is the detection of viruses in host cells as a diagnostic tool (Han, ⁇ ⁇ H. et al., J. Virol ⁇ Methods, 37, 89, 1992, etc.). If the number of virus particles in the infected cells is very low, use the in situ polymerase re-induction (in situ PCR) method. Amplify the viral sequence in advance (Hasse, AT et al.
  • the conventional in-situ hybridization method has various limitations. For example, it is necessary to modify two target nucleic acid sequences. This denaturation is usually performed by subjecting a target nucleic acid sequence or a sample containing the nucleic acid sequence to a heat treatment in the presence or absence of a specific drug. This heat treatment often results in unpredictable changes in the nucleic acids in the sample. Such changes include structural changes in DNA, random reassortment between nucleic acids via repetitive sequences, and the like. In addition, the denaturing operation requires extra time and effort.
  • the target nucleic acid sequence when the number of copies of the target nucleic acid sequence is extremely small, a long hybridization time is required, and the hybridization between the probe and the target nucleic acid sequence is required. Does not occur efficiently. In such cases, the target nucleic acid sequence must be To some extent, it can be eliminated by amplification by the push-PCR method. However, in situ PCR is complex and unsuitable for studies on the analysis of chromosomal DNA sequence localization.
  • the target sequence is detected by detecting the target sequence.
  • the nucleic acid probe used is a detectable label, such as a fluorescent agent, a chemiluminescent agent, an enzyme label, a radioactive label, or a biotin, such as piotin-digo bovine cigenin. It has a ligand capable of binding to a specific reporter molecule.
  • the probe to which the RecA protein is bound is used as the target nucleic acid.
  • a probe such as a chemiluminescent agent, a label such as an enzyme label, and a ligand such as piotin digoxigenin
  • the probe to which the RecA protein is bound is used as the target nucleic acid.
  • the sequence is not denatured, it binds to two target nucleic acid sequences, removes unreacted probe, and then proceeds to chemiluminescence step, enzyme reaction step, or labeled avidin. Stripe business or
  • the target nucleic acid sequence is detected by a secondary reaction including a reaction with a reporter molecule such as an anti-digoxigenin antibody.
  • a fluorescent agent detect the target nucleic acid sequence using an extremely sensitive detection instrument such as a confocal laser microscope.
  • Probes without markers or ligands cannot be used with Zarling et al.
  • a known method such as a nickel translation method or a random plating method is used.
  • the number of labels or ligands that can be incorporated into the probe is about one in several 10 to several 100 bases, and can be incorporated in the probe.
  • Labels or ligands were limited. Therefore, the intensity of the signal obtained is not always sufficient.
  • counterstaining is performed using, for example, a provisional dye. When applied, the gene in a single copy is hardly detectable.
  • the detection sensitivity is further increased. To decline.
  • a different type of label or ligand should be applied to each probe complementary to each target nucleic acid sequence in advance. It had to be combined. Disclosure of the invention
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned conventional problems.
  • the target is to use a probe to which the RecA protein is stably bound and the RecA complex, and to use two probes to bind to the target nucleic acid sequenceReceived the RecA protein contained in the RecA complex
  • a highly sensitive and simple in situ hybridization method characterized in that the presence of the target nucleic acid sequence is detected by detecting the target nucleic acid sequence.
  • the present inventors have found that a probe bound to a target nucleic acid sequence obtained according to the method of Zaring et al. Described above is stable in the RecA complex. I went.
  • the target nucleic acid sequence binds to a specific reporter molecule such as biotin digoxigenin bound to the probe.
  • a specific reporter molecule such as biotin digoxigenin bound to the probe.
  • detection is performed with such a ligand, it is considered that the reaction efficiency between the reporter molecule and the ligand is reduced, and the detection sensitivity is reduced by ordinary detection means such as a fluorescence microscope.
  • the present inventors have proposed using two kinds of washing liquids such as proteinases and surfactants, a probe bound to a target nucleic acid sequence, an EecA complex- An attempt was made to remove the RecA protein in it.
  • the RecA protein could not be removed without affecting the BecA protein in the complex and the target nucleic acid sequence and the complex. Therefore, instead of detecting a probe having a label or a ligand contained in the probe 'BecA complex, it was considered to detect the RecA protein contained in the complex. .
  • the inventors have developed a fluorescent agent, a chemiluminescent agent, an enzyme label, A detectable label such as a radioactive label, or a reporter specific to them, such as biotin digigogenin—a RecA protein having a ligand capable of binding to a molecule.
  • a detectable label such as a radioactive label
  • a reporter specific to them such as biotin digigogenin—a RecA protein having a ligand capable of binding to a molecule.
  • the quality was prepared.
  • the probe-RecA complex (2 ⁇ target nucleic acid sequence) bound to the target double-stranded nucleic acid sequence ⁇
  • the probe (RecA complex) can be efficiently formed, and by detecting RecA protein having a label or a ligand contained in the complex, It has been found that the presence of the target nucleic acid sequence can be detected more sensitively and easily with high specificity.
  • a probe bound to a target double-stranded nucleic acid sequence ⁇ RecA complex (double-stranded target nucleic acid sequence ⁇ probe. RecA complex) is reacted with an anti-RecA antibody to form a target double-stranded nucleic acid sequence.
  • the presence of the target nucleic acid sequence can be detected by detecting the RecA protein contained in the probe bound to the nucleic acid sequence.
  • the RecA complex two target nucleic acid sequences. Probe / RecA complex). The present inventors have found that this is possible, and have completed the present invention.
  • the present invention relates to a method for detecting the presence of a target nucleic acid sequence contained in a fixed cell or cell structure, the method comprising the steps of: Fixing the structure so that the nucleic acid probe can enter, and obtaining a fixed cell or cell structure, wherein the cell or the cell structure is the cell Or retains the original morphological relationship with its components and nucleic acid structure contained in the cell structure; A step in which the probe and RecA protein are stably bound to form a probe-RecA complex, wherein the one-piece probe has a sequence that is complementary to the two-piece target nucleic acid sequence.
  • probe-RecA complex Adding the probe-RecA complex to the immobilized cell or cell structure under conditions that allow contact with the double-stranded target nucleic acid sequence; Reacting the probe-RecA complex 'with the double-cleavage target nucleic acid sequence under non-denaturing conditions; and binding to the probe and the EecA complex. Removing the body; and detecting the RecA protein contained in the probe / RecA complex bound to the double-stranded target nucleic acid sequence, and thereby detecting the double-stranded target nucleic acid sequence. Detecting the presence.
  • the term "cell” includes eukaryotic cells such as animal cells and plant cells, prokaryotic cells such as bacteria, and the like.For example, in animal cells, sperm, eggs, etc. It includes cells of any type that are morphologically and structurally different, such as germ cells and somatic cells. Further, it includes animal and plant tissue samples containing these cells.
  • cell structure refers to an organ, such as a bacterium, virus, or nucleus or mitochondria, a chromosome, or a cell, present in the cell. Includes parasites present in biological samples, such as blood and bacterial blood samples.
  • the nucleic acid sequence is typically a chromosomal DNA, a virus, and a double-stranded nucleic acid that is a pathogen in or associated with the parasite.
  • the cell or cell structure can be obtained from any biological material, for example, a cultured cell, a plant or animal tissue, or a biological fluid. .
  • the step of obtaining the fixed cells or the cell structure can be performed by a method similar to the method used in the conventional incubating method. Briefly, a cell or cell structure, together with its constituents and nucleic acid structure contained in the cell or cell structure, retains its original morphological relationship while maintaining the organic morphology and acidity. Alternatively, the cell or cell structure is immobilized by a crosslinking agent or the like, and the permeability of the cell or the cell structure to a probe having a sequence complementary to the target sequence is increased. Acetic acid, various salts, methanol, formalin, paraformaldehyde, glutaraldehyde, and the like can be used as general fixing agents.
  • the cells or cell structures described above can generally be treated in the presence or absence of one or more agents to remove proteins and proteins or lipids.
  • the drug includes an acid, an alcohol, a surfactant, and a combination thereof
  • the treatment includes an enzyme treatment with a protease, a lipase, or the like, a heat treatment, a washing treatment, and a combination thereof. Encompasses combinations of treatments. As a typical treatment method, it is known to wash once or several times with methanol: acetic acid.
  • the animal tissue When the cell is an animal tissue, the animal tissue is After being fixed by a conventional fixing method such as glutaraldehyde, it is embedded in a wax, or frozen, then sectioned, and slide glass or the like is used to increase permeability. On a solid support, it can be treated and fixed with e.g. acetic acid.
  • a conventional fixing method such as glutaraldehyde
  • the cell structure can be used to determine the subcellular localization of the target gene sequence or to detect the presence and / or localization of infectious organisms such as viruses, bacteria and parasites within the cell.
  • Cell structures such as nuclear mitochondria are enriched by common fractionation techniques, such as isopycnic centrifugation, and are prepared in a highly purified state. obtain. Thereafter, the concentrated preparation is fixed as described above, and treated to increase the permeability, fixed in a solution or on a solid support such as slide glass, and dried. Can be used 0
  • Cell structures such as nuclei can be prepared by pretreating cells with a 75 mM KCl solution and then removing the cytoplasm by treatment with methanol: acetic acid. That is, the cells were collected by centrifugation at low speed, suspended in a 75 ⁇ K KC1 solution, left for 5-20 minutes until the nuclei expanded appropriately, and then cooled on ice.
  • Methanol Add acetic acid and centrifuge. Ice-cold methanol: The cytoplasm can be removed from the nucleus by repeating the steps of adding acetic acid, gently agitating the cells, and centrifuging.
  • the nuclei isolated in this way are resuspended in methanol: acetic acid and about ⁇ of the nuclei are placed on a solid support such as a slide glass. Can be dried and fixed.
  • the fixed nuclei can be stored at room temperature at 80 ° C. Or the cells collected above Can be fixed by washing with phosphate buffered saline (PBS) and treating with 100% methanol or 70% ethanol. Can be stored at-20.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the preserved fixed cells can be used in a hybridization reaction in a solution in a cell suspension.
  • Cell structures such as chromosomes
  • Ordinary methanol After being treated with acetic acid, it can be dropped on slide glass or the like, dried and fixed.
  • Cell structures isolated from cells and blood samples, such as mitochondria and viral particles, can also be immobilized in the same manner as described above by conventional methods. .
  • the nucleic acid probe used in the method of the present invention is a single-stranded nucleic acid, usually a single-stranded DNA.
  • the target nucleic acid sequence can also be prepared by denaturing a double-stranded probe complementary to one or both of the target nucleic acid sequences.
  • Many single- or double-stranded probes such as various commercially available satellite DNA sequences, can be used in the present invention.
  • using methods known in the art for preparing probes e.g., directly from viruses, plasmids containing specific sequences, or other vectors Can be done. If necessary, it can be prepared by cutting out the probe DNA portion from the vector with a restriction enzyme and isolating a specific restriction enzyme fragment by electrophoresis.
  • the probe obtained in this way Is usually in a double-stranded state, but can be subcloned to a single-stranded vector, such as the M13 Fajjik, if necessary.
  • a single-stranded probe can be prepared by an oligonucleotide synthesis method.
  • it can be prepared by synthesizing a subfragment of the probe and then joining the subfragments.
  • the nucleic acid probe preferably has a small amount of the target nucleic acid sequence to ensure that a sequence-specific hybridization reaction between the target nucleic acid sequence and the probe is performed. Both have a nucleic acid sequence that has 90-95% of the porosity.
  • the length of this single probe can typically be about 100 to: L, 500 bases, and shorter or longer polynucleotide probes can be used.
  • the nucleic acid probe used in the present invention can be used in a standard condition of 300 ng or less, and preferably in an amount of 5 to: LOOng.
  • the nucleic acid probe need not have a label or a ligand, but if necessary, a detectable label such as a fluorescent agent, a chemiluminescent agent, an enzyme label, a radioactive label, or a biomarker. They may have ligands that can bind to their specific reporter molecules, such as tin and digoxigenin.
  • the probe with this label or ligand is combined with a RecA protein, an anti-RecA antibody, or a secondary antibody capable of binding to an anti-RecA antibody with a detectable label or ligand.
  • a labeled or ligand signal can be amplified.
  • the term "RecA protein" refers to E.
  • E. coli RecA protein which has all or most of the functions of E. coli RecA protein. Refers to a group of equivalent RecA-like recombinant proteins, such as E. coli RecA protein (Shibata, T. et al., Met.hods in Enzymology, 100, 197, 1983), and its similar proteins.
  • UvsX protein from the T4 phage Yonesaki, T. et al., Eur. J. Biochem., 148, 127, 1985
  • Rec protein from B. subtilis Bacillus subti 1 is
  • 'Lectin Lovett, CM et al., J. Biol.
  • the RecA protein derived from Escherichia coli includes not only its wild-type but also many mutants (for example, RecA803: Madiraju, M. et al., Proc. NaU. Acad. ScI. USA., 85, 6592, 1988 and RecA441: Kawashima, H. et al., Mol. Gen. Genet., 193, 288, 1984) may also be used.
  • the RecA protein can be purified from E. coli and used by a conventional method (for example, Shibata. T. et al., Methods in Enzyinology, 100, 197, 1983). Alternatively, commercially available RecA protein (for example, (Lumacia) can be used.
  • the RecA protein has a detectable label or ligand such as a fluorescent agent, a chemiluminescent agent, an enzyme label, a radioactive label, biotin, and digoxigenin.
  • a detectable label or ligand such as a fluorescent agent, a chemiluminescent agent, an enzyme label, a radioactive label, biotin, and digoxigenin.
  • Fluorescent agents such as fluorescein isocyanates, canoleboxes, lactones, cyanine succinyl esters (Cy3 TM , Cy5 TM: etc.), load min, text thread (sulfur load min), tetramethyl load min iso isocyanate , 7-amino-4-methylmarin-3-3-acetic acid and the like can be used.
  • the enzyme label alkaline phosphatase, peroxysidase, yS-galactosidase and the like can be used.
  • the preparation of the RecA protein having the label or the ligand can be carried out according to a method of binding a label or a ligand to a protein such as an antibody.
  • fluorescers such as fluorescein isocyanate (FITC) and tetramethylrhodamine isocyanate (TRITC) Fluorescent dyes
  • FITC fluorescein isocyanate
  • TRITC tetramethylrhodamine isocyanate Fluorescent dyes
  • the fluorescent agent of C 3 TM ⁇ Cy5 TM ⁇ carboxymethylindocyanin succinimidyl ester can be obtained by, for example, the method of Southwick et al. PL et al., Cytometry, 11, 418, 1990).
  • Ru stomach Oh, FluoroLink- Ab T M Cy3 TM Labeling it F 1 uoroL i nk-Ab TM Cy5 TM Labeling Ki t (BIOLOGICAL DETECTION SYSTEMS, I NC. , Ltd.) of any commercially available cow can be combined using
  • the amount of the fluorescent agent that binds to the RecA protein is 1 to 10 molecules per RecA protein monomer, or preferably:! To 6 molecules.
  • a chemiluminescent agent such as an atomic ester can be obtained from, for example, the method of Simpson, JSA et al. (Simpson, JSAb, Bioluiinescence and Chemiluminescence. Basic Chemistry and Analytical Applications. New York: Academic Press 1981) , Pp. 673).
  • Enzyme labels such as phenolic phosphonase, peroxidase and 91-galactosidase are described in, for example, Matsuhashi et al. Introduction to the RecA protein according to the method described in “Introduction”, page 151 (JSPS).
  • the number of enzyme labels that bind to the RecA protein is 1 to 3 molecules per RecA protein monomer, and preferably 1 to 2 molecules.
  • radiolabeled RecA protein can be prepared by purifying from Escherichia coli cultured in the presence of various radiolabeled amino acids.
  • the biotinylated RecA protein can be prepared, for example, according to the method described in Biochemical Experiment Method 11 “Enzyme Noassassie”, page 24 (Tokyo Kagaku Dojin). .
  • the amount of biotin bound to the RecA protein is 1 to 10 molecules per RecA protein monomer, It is preferably 1 to 6 molecules.
  • Di Goki Shigeni emissions of R ec A protein is di Goki sheet Geni emissions - 3-0 - Sa click senior Le - £ - ⁇ Mi Roh force pro phosphate - N- arsenide mud key sheet - Sa click sheet I It can be prepared by a conventional method (kit manufactured by Boehringer Mannheim) using midester (DiG-NHS) or the like.
  • the RecA protein (the amount of the digo-bovine shigenin to be bound is 1 to 10 molecules per RecA protein monomer; preferably 1 to 6 molecules.
  • the RecA protein having a label or a ligand described above can be used in combination with a normal RecA protein having no label or a ligand.
  • the step of forming the probe-BecA complex can be performed according to Zarling et al. As described in W093 / 05177 and 93/05178.
  • ATP 7 S GTP 7 S. rATP, rATP in the presence of a regenerating system manufactured by Behringer Mannheim
  • dATPs a mixture of ATP 7 S and rATP, ⁇ 7 S and rATP
  • a cofactor such as a mixture with ADP, a mixture of GTPyS and ADP, a mixture of GTP7S and GDP.
  • Preferred cofactors are ATP7S, .rATP or GTPyS.
  • the cofactor can be used in a concentration range of about 0.12 to 12.0 mM, preferably 0.24 to 7.0 OmM.
  • the probe used for the preparation of the probe 'RecA complex may be used in either a single or double probe form, typically about 95 to 10 (thermal denaturation for about 5 minutes in a temperature range of TC). After cooling on ice for about 20 seconds to 1 minute, it can be used for the binding reaction with the RecA protein, if necessary, for about 20 minutes before the binding reaction with the RecA protein. Centrifuge at 0-4 ° C for seconds.
  • the denatured probe can be stored in a freezer at 120 ° C, but preferably, immediately in ice water, a standard RecA reaction solution containing the cofactor (Ferrin LJ et al., Sciences 254, 149 "1991 and Sena, E.P.
  • RecA protein is stably bound to the single-molecule probe by incubating for 10 to 15 minutes in C. In this reaction, RecA protein binds to approximately 3 bases of the single-probe. Protein binds at a rate of one molecule and single-stranded probe is not coated with RecA protein.
  • the concentration of RecA protein reacted with the probe may vary depending on the size and amount of the probe, and is preferably in the range of about 0.5-100M.
  • the mixing ratio of RecA protein (monomer) to the base in the probe is in the range of about 5: 1 to 1: 3, preferably in the range of 3: 1 to 1: 2.5.
  • the coupling reaction can be performed in a range.
  • the RecA complex formation reaction may be performed, if necessary, on a single-strand binding protein (SSB) or a protein such as the T4 gene 32 protein. It can be performed in the co-presence of proteins, thereby accelerating the reaction.
  • SSB single-strand binding protein
  • T4 gene 32 protein a protein such as the T4 gene 32 protein
  • the probe for example, use carrier DNA or ENA, such as salmon sperm DNA, tRNA from yeast or E. coli.
  • carrier DNA or ENA such as salmon sperm DNA, tRNA from yeast or E. coli.
  • free RecA protein that did not bind to the probe was bound to the carrier, Non-specific binding of the RecA protein to nucleic acids other than the target nucleic acid sequence contained in the cells or cell structures can be prevented. This process is very useful for the background signal such as observation with a fluorescence microscope.
  • free RecA protein can be separated from the probe-RecA complex by ordinary column chromatography to remove the free RecA protein. If the probe's RecA complex is prepared using a RecA protein with a detectable label or ligand, the post-treatment with carrier DNA or RNA as described above may be necessary. It is valid.
  • this step can be omitted by adjusting the ratio of the probe and RecA protein used for preparing the probe-RecA complex.
  • the probe with the detectable label or ligand described above, the RecA complex can stably convert the label- or ligand-free RecA protein to a single-stranded probe.
  • a detectable label or ligand can be prepared by binding to a RecA protein in the probe-RecA complex according to the method described above.
  • the step of reacting and binding with the target nucleic acid sequence can be performed according to the description of Zarling et al. That is, under conditions where the target nucleic acid sequence is not denatured, for example, at a temperature lower than the temperature at which denaturation of the double-stranded DNA occurs, The probe. RecA complex is added to a cell or cell structure containing the target nucleic acid sequence, and the double-stranded target nucleic acid sequence and the probe-RecA complex are hybridized in a base sequence-specific manner. Knotted by a one-shot reaction.
  • the hybridization reaction is preferably performed for about 1 to 24 hours, preferably 2 hours, until binding at the homologous site of the probe's RecA complex and the target nucleic acid sequence is completed. This can be done by holding at 37 ° C for ⁇ 18 hours.
  • the hybridization reaction may be performed, if necessary, using a single-strand binding protein (SSB), topoisomerase I, topoisomerase H, or the like. It can be carried out in the presence of evening protein, thereby accelerating the reaction.
  • Probe 'RecA complex which did not bind to the target nucleic acid sequence can be removed by a known washing method. However, it is not desirable to use, for example, a washing solution containing a high concentration of a proteinase or a surfactant that solubilizes RecA protein.
  • the fixed cells or cell structures may be prepared before the step of adding the probe-RecA complex. This is because treatment in lOtnM Tris-Acetate buffer (pH 7.5) at 4 to 60 ° C or treatment with proteolytic enzymes such as pepsin and protease K is recommended. Thus, the reaction efficiency of the hybridization reaction can be increased. Also, the cells or cell structures containing the target nucleic acid sequence RNA degrading enzyme, may have been treated Ri by the n ickase (DNaseI, etc.) or a ligase.
  • DNaseI n ickase
  • the fixed cells or cell structures are treated with casein, skim milk, bovine serum albumin, and carrier.
  • a pretreatment blocking solution containing at least one selected from the group consisting of DNA and carrier RNA.
  • These substances in the pretreatment blocking solution may contain any label or ligand that binds to the RecA protein, and / or the RecA protein itself. It prevents non-specific binding to fixed cells or cell structures, and / or solid supports.
  • Cy 5 ⁇ of which Ca Ruboushi shea main switch Louis down de Xia two capacitors click Gerhard Mi Jirue scan RecA evening protein having Te le compound of any fluorescence agent Ordinary RecA protein having no label or ligand may be added to the pretreatment blocking solution. This treatment can be typically carried out by adding the pretreatment blocking solution to the fixed cells or cell structure.
  • the immobilized cells or cell structure can be subjected to a hybridization reaction with the probe-RecA complex in a suspension state. That is, the fixed cells or cell structures are suspended in a hybridization reaction solution containing the probe-RecA complex for 1 to 24 hours, preferably 2 to 18 hours. For example, it can be carried out by maintaining the temperature at 37 ° C. After the reaction, the cells are suspended in a washing solution, and washed to remove unreacted probe-RecA complex.
  • the reaction solution containing the RecA complex is fixed to the cells or cells on a slide glass. It can be performed by adding to the structure. Cover the obtained reaction solution with a cover glass, and place it in a tight container containing moisture.
  • the reaction solution used in the hybridization can be typically prepared so that the final concentration of each component in the reaction solution is in the following range; mM tris acetate buffer, 2-20 mM magnesium acetate, 0-100 mM sodium acetate, 0.4-1 mM dithiothreitol, 0-100 mM EGTA, 0- 50 mM phosphoramidin, 0 to: 10% glycerol, 0.24 to 7.
  • OmM ATP 7 S, rATP or GTP rS 0.5 to M RecA protein (labeled or Is the only RecA protein with ligand, labeled or mixed with RecA protein with ligand and normal RecA protein, or is labeled or labeled. Only for normal RecA protein that does not have), 5 to 5 per reaction: LOOng probe, 0 to 10 g of carrier DNA per reaction R A).
  • RecA protein with fluorescent agents such as TC, TRITC, Cy3 TM , C5 TM ⁇ , carboxymethylindocyanin succinimidyl esters, etc.
  • fluorescent agents such as TC, TRITC, Cy3 TM , C5 TM ⁇ , carboxymethylindocyanin succinimidyl esters, etc.
  • the probe bound to the target two nucleic acid nucleic acid sequences and these fluorescent labels contained in the RecA complex Performed by detecting fluorescent signals derived from the RecA protein with a fluorescence microscope, confocal laser microscope, or flow cytometer (FACS). I can do it.
  • RecA protein with an enzyme label such as alkaline phosphotase, peroxidase or> 9-galactosidase
  • an enzyme label such as alkaline phosphotase, peroxidase or> 9-galactosidase
  • a well-known method can be used. For example, according to the method described in Japanese Patent Publication No. 4-505556, a two-stroke, one-tetrazolometer is provided. It can be performed using a chromogenic substrate that produces an insoluble dye such as a phyto, or a chemiluminescent substrate such as AMPPD (TROP! (Manufactured by KK).
  • AMPPD chemiluminescent substrate
  • RecA protein having a radioactive label When a RecA protein having a radioactive label is detected, a known method, for example, an autoradiograph described in Yoshida Dihiro, Protein Nucleic Acid Enzyme, 38, 558, 19993. It is implemented by performing.
  • an antibody with a detectable label such as FITC-avidin, is required. It can be carried out by binding to non-streptavidin and an anti-digoxigenin antibody.
  • the probe 'RecA complex is reacted with an anti-RecA antibody having or not having a label or a recombinant. Can be detected.
  • an anti-BecA antibody having a label or a ligand the probe bound to the target nucleic acid sequence and the RecA protein contained in the RecA complex, and a detectable label or a ligand.
  • anti-RecA After reacting the antibody, the unreacted anti-RecA antibody is removed, and then the label or the ligand bound to the RecA protein according to the above-described method for detecting the label or ligand.
  • the target sequence can be detected by detecting an anti-RecA antibody having a target.
  • An anti-RecA polyclonal antibody can be easily prepared by a conventional method, for example, in Matsuhashi et al., Biochemistry Experiment Method 15 “Introduction to Immunology Experiments”.
  • An anti-RecA monoclonal antibody can be prepared, for example, by the method of Makino et al. (Makino et al., J. Biol. Chem., 260, 15402, 1985).
  • the anti-RecA antibody having a detectable label or ligand can be prepared by a method similar to the method for preparing the EecA protein having a detectable label or ligand described above. .
  • the step of detecting the presence of the double-stranded target nucleic acid sequence can be performed using an anti-RecA antibody and a secondary antibody capable of binding to the anti-RecA antibody.
  • the secondary antibody may have a detectable label or ligand.
  • an anti-mouse IgG antibody can be used, and the anti-RecA antibody can be used. If it is derived from a heron, an anti-heron IgG antibody can be used. If the anti-RecA antibody is from a goat, an anti-goat IgG antibody or the like can be used.
  • Labeled antisera eg, FITC-labeled anti-mouse IgG antibody, FITC-labeled anti-magpie IgG antibody, etc.
  • the preparation of a secondary antibody having a detectable label or ligand capable of recognizing these anti-RecA antibodies and binding to the anti-RecA antibody is performed according to the method described above. In a similar manner to the preparation of RecA protein with Can be prepared.
  • an EecA protein having a label or a ligand an anti-RecA antibody having a label or a ligand, and a label capable of binding to the anti-RecA antibody
  • a secondary antibody having a ligand it is possible to amplify the signal much more strongly than in the conventional method.
  • the present invention also provides, in another aspect, a kit for carrying out the method, comprising a RecA antibody having a detectable label or ligand.
  • the present invention also provides a kit comprising a probe-RecA complex in which a probe and a RecA protein having a detectable label or ligand are stably bound, for performing the method.
  • a probe-RecA complex in which a probe and a RecA protein having a detectable label or ligand are stably bound, for performing the method.
  • I will provide a.
  • the present invention also provides a kit for carrying out the method, comprising a RecA protein and an anti-RecA antibody having a detectable label or ligand.
  • the present invention also provides a probe 'RecA complex in which a probe and RecA protein are stably bound, and an anti-EecA antibody having a detectable label or ligand for carrying out the method.
  • a kit that includes
  • the kit according to the present invention may include the following reagents: (1) For example, a cell or cell consisting of a 70-100% alcohol solution containing 75 inM KC1, acetic acid, etc. Or a reagent for fixing a cell structure; (2) For example, 0 to 0% Triton X-100, 0.1 to: 10% skim milk, casein, bovine serum albumin, 0 to 5 mg / ml bovine DM and Z or RNA, A pretreatment buffer consisting of 10 to 10 mM tris-acetate buffer (pH 7.5) containing ordinary RecA protein without label or ligand at 0 to 10 mg / ml.
  • Locking solution (3) For example, 0 to 15 mM magnesium acetate, 0 to 50 mM sodium acetate, 0 to: ImM dithiolate plate, 0 to: lOOmM EGTA [. Ethylene glycol service (9-aminoethyl ether) N, IT, N'-4 acetic acid], 0-50 mM permidine Cell treatment solution consisting of 10- ⁇ ⁇ ⁇ -tris-acetate buffer solution (pH 7.5) containing e.g.
  • Concentrated storage reaction solution 2 to 2 OmM magnesium acetate, 0 to 100 mM sodium acetate, 0.4 to 1 mM dithiothreitol, 0 to 100 mM EGTA, 0 to 100 mM : L0% grease roll, 0 ⁇ 50 ⁇ Spermidin, 0.24 to 7. 10 to 100 mM Tris acetate buffer ( ⁇ 7.5), containing OmM ATPas or GTPyS. (5) For example, 0.1-40 g / 1 RecA protein solution.
  • the RecA protein has or does not have a sign or a ligand, or has a RecA protein with a sign or a ligand.
  • a probe solution containing a single-stranded or double-stranded probe at a concentration of 5 to 1.00 ng / ⁇ l examples include those derived from ⁇ -satellite DNA sequences specific to each chromosome, those derived from the gen gene sequence, those derived from the gan suppression gene sequence, and those derived from the virus gene sequence.
  • a probe having the following composition: RecA complex solution; OQng / ⁇ 1 single probe, RecA protein with 0.01 to 200 g / 1 label or ligand or normal RecA protein, 2 to 75mM magnesium acetate, 0 to 1.0M sodium acetate, 0.4 to 5mM dithiothreitol, 0 to 1.0M EGTA, 0 to 500mM 0 to .50% glycerol, 0.24 to 70mM 0.01 to 1M tris acetate buffer (pH 7.5) containing ATP7S or GTP7S 0
  • BecA protein or anti-RecA antibody (14)
  • lOOmg of P-phenylenediamine hydrochloride can be detected by reacting with the bound ligand—enzyme, etc .; Dissolve in 10 ml PBS After disassembly, the fluorescent agent was adjusted to pH 8 with 0.5M carbonate-bicarbonate buffer at pH 9, added with 90 ml of glycerol, and filtered through a filter. Prevent fading Anti-fading reagent solution. Promise audio if necessary
  • the present invention also provides, in another aspect, a RecA protein having a label or a ligand, which can be used in the above method.
  • Dossin succinimide medium ester, rhodamine, texas thread (sulfur load min), tetramethyl load medium A fluorescent agent selected from the group consisting of sociosinate and 7-amino-4-methylmaline-3-acetic acid was added to an EecA protein monomer.
  • RecA protein contains one to three molecules of protein per molecule, or one selected from the group consisting of piotin and digoxigenin. Pakushitsumo Roh including 1-6 molecule Ri per Ma over.
  • the position of a specific gene or its regulatory region in a chromosome, or the presence of a nucleic acid sequence derived from a virus can be measured or visualized with high sensitivity without signal amplification. Diagnostically important methods are provided.
  • a single copy gene such as a p53-repressed gene
  • the method of the present invention is based on the CGH method (compara) developed by Kal 1 ioniemi. tive genomichybridization method) (a 1 Iion ierai, A. et al., Science, 258, 818, 1992).
  • the methods of the present invention may target the following genes and sequences: (1) genes encoding specific useful gene products; (2) eg, ribosome genes, gan genes, gan suppression Genes that play important cell regulatory functions, such as genes; (3) repetitive sequences and related sequences; (4) defects in genes that inhibit the expression of active gene products; (5) known gene genes.
  • a gene or sequence associated with the marker-probe region at the capped position (6) a viral gene sequence integrated into chromatin, such as a hepatitis B virus, and a gene sequence; Virus gene in virus particle ⁇ 2 row.
  • the method of the present invention can be used for detecting various chromosomal abnormalities such as changes and deletions, insertions, translocations, inversions, duplication and amplification of chromosomes.
  • a probe-RecA complex in which a probe complementary to a specific region is stably bound to a RecA protein having a FITC label, and a complementary probe and TR in another region.
  • Probe that stably binds RecA protein with an ITC label •
  • Using a RecA complex and simultaneously performing a hybridization reaction using a fluorescence microscope for each region At the appropriate excitation wavelength. That is, gene abnormality can be detected by determining the relative direction and distance of two different gene regions in a chromosome from the positions of two types of distinguishable fluorescent signals. .
  • the method of the present invention can be used to alter ploidy or Abnormal or viruses, bacteria and parasitic pathogens in organisms, organs, tissues and cells can be detected with high sensitivity and can be used for various diagnoses.
  • the localization of infected nucleic acids such as viruses can be detected with a fluorescence microscope, or the number of infected cells can be measured in a short time using a FACS (fluorescence activated cell sorter), etc. Bells and the percentage of infected cells in sample cells can be detected.
  • FACS fluorescence activated cell sorter
  • hybridization is performed using a probe that does not contain a detectable label or ligand under conditions that do not denature the target nucleic acid sequence. Therefore, the labeling or ligand does not interfere with the hybridization reaction, and each molecule has 1 to 6 molecules of the label or ligand.
  • RecA protein can bind to the probe at a ratio of up to about one molecule per three bases, so it is several times to several hundreds more than when a label or ligand is directly introduced into the probe itself. Double labeling or ligands can be added to the probe, resulting in a much stronger signal per target nucleic acid sequence than conventional methods. In addition, since this RecA protein is detected, target sequences with a small number of copies can be detected with extremely high sensitivity and specificity.
  • RecA protein derived from Escherichia coli (Pharmacia) or Zarling from normal Escherichia coli
  • the RecA protein purified by the method described above was used.
  • the molecular weight of the RecA protein used, single-strand DNA-dependent ATPase activity, DNase activity, strand transfer ability and double D-loop forming ability were all determined by known methods (W093 / 05177; Sena, EP et al., Nature Genetics ⁇ 3, 365, 19S3: Shibata. T. et al., Methods in Enzyraology, 100, 197, 1983, etc.).
  • Cy3 TK or Cy5 T> t can be obtained using the Fluorolink-Ab TK Cy3 TM Labeling Kit or the Fluorol ink-Ab TM Cy5 TM Labeling Kit manufactured by BIOL0G ICAL DETECTION S YSTEMS. INC., Respectively. It was bound to RecA protein.
  • the resulting vial (1 mg protein reaction dye, 1 vial) was transferred and mixed, and reacted at room temperature for 30 minutes.
  • the obtained reaction solution is applied to the gel filtration column included in the kit, and eluted using the elution buffer (PBS, pH 7.2) provided with the kit.
  • I Ri, rather than to be free of Cy3 TM was Tsu bound commercialization and RecA and Cy5 T "to, Cy
  • RecA Tanno 1 ml of PBS adjusted to pH 7.2 containing 1 mg
  • the ring was added to the vial containing the buffer and mixed.
  • the mixed solution was transferred to a vial containing 20 g of FITC (1/50 of the weight of RecA protein), mixed, and reacted at room temperature for 20 minutes.
  • the obtained reaction mixture is separated into a Sephadex G-25 column (fam (Lumacia) and eluted with elution buffer (PBS, pH 7.2) to obtain free FITC without binding to RecA protein and FITC. And a fraction containing the bound RecA protein.
  • Absorbance values A 280 and A at wavelengths of 280 nm and 495 nm of the obtained solution containing the F [TC-bound RecA protein.
  • RecA protein having FITC had one or two molecules of FITC bound to BecA protein monomer (FITC used in the reaction).
  • FITC used in the reaction.
  • TRITC was bound to RecA protein in the same manner as FITC described above. That is, the RecA protein of ling was reacted with 40 g of TRITC to obtain a RecA protein having TRITC.
  • the absorbance value of the solution containing the RecA protein bound with TRITC was measured as described above, the obtained RecA protein having TRITC was found to have the same amount of TRITC protein per monomer. It was found that one or two molecules were bound to each other (by changing the amount of TRITC used in the reaction to 20-200 g per lmg of RecA protein, Protein Monomer — One to six molecules of TRITC per molecule can be prepared as needed.)
  • the anti-RecA antibody was prepared by a known method, for example, a method described in Biochemistry Experiment Method 15 Introduction to Immunology Experiments, Academic Society Publishing Center. That is, first, an antiserum containing an anti-RecA antibody was obtained from a mouse (100-200 / g RecA / animal at one time) in which the RecA protein was repeatedly injected intraperitoneally. The obtained antiserum was dialyzed once against 0.01 M PBS at pH 7.2. The dialyzed antiserum was applied to DEAE-cellulose column and eluted with 0.01M PBS at pH 7.2 to obtain a solution containing an anti-RecA antibody (IgG fraction).
  • the obtained solution containing the anti-RecA antibody was concentrated to obtain a solution containing about 1 mg / ml of the anti-RecA antibody.
  • 1/10 volume of the coupling buffer was added to this concentrate.
  • FITC which was 1/100 weight of the solid, was dissolved in a coupling buffer, added, and reacted at 7 to C for 6 hours.
  • the resulting reaction solution was applied to a Sephadex G-25 column (manufactured by Fanoresia Inc.), and the elution buffer (0.01 M PBS, pH 7.2) was used. ) To separate the free FITC that did not bind to the anti-RecA antibody from the fraction containing the anti-RecA antibody that bound to FITC.
  • the anti-RecA antibody having FITC was found to be RecA protein It was found that three to four molecules were bound to the oligomer.
  • the anti-RecA antibody having TRITC obtained using 1/40 weight of TRITC of the anti-RecA antibody amount is 2 to 3 molecules per Rec A protein monomer. It turned out that TRITC was bound.
  • Cy3 TM is bound BecA protein the fin cytidine Interview Roh using, Lee blanking Li die See tion method by that No. 1 detection of chromosome satay La wells III sequence (1) high- Breakfast Li Da I Preparation of reaction solution
  • a biotinylated DNA probe containing the 11I sequence was prepared, and 1/10 volume of 3 M sodium acetate was added to the obtained biotinylated DNA probe solution.
  • the resulting suspension is diluted with sterile water or Tris-HCl EDTA buffer, placed in a 0.6-nl microcentrifuge tube, and added to boiling water.
  • the biotinylated DNA probe was denatured by a heat treatment for 5 minutes in.
  • Human laryngeal gun-derived HEp-2 cells (ATCC CCL23) were routinely transformed with 10% fetal calf serum, sodium pyruvate, and antibiotics (penicillin, The cells were cultured in a MEM medium (manufactured by Gibeo-BRL) supplemented with Treptomycin. The obtained HEp-2 cells were treated with trypsin-EDTA, and the treated cells were collected by low-speed centrifugation, and suspended gradually in a 75 mM KC1 solution in a 37 ° C water bath, and then over time. With a microscope While keeping the temperature, the mixture was kept warm for 5 to 20 minutes to expand the nuclei appropriately.
  • the obtained nuclei were resuspended in an ice-cooled mixture of methanol and acetic acid (3: 1) to obtain a suspension having a concentration of about 1 to 2 ⁇ 10 ⁇ nuclei / ml.
  • the resulting suspension was added dropwise to slide glass at 10 / z1.
  • the suspension was air-dried and stored at room temperature to -80 ° C.
  • FITC avidin Vector, DCS grade, catalog number: A-2011, lot number: C0527, F / P value: 4.6
  • a blocking solution 4X SSC, 0.1% TritonX-100 5% skim milk, 0.02% sodium azide
  • the FITC avidin was bound to the biotinylated probe contained in the probe / RecA complex to which the target nucleic acid sequence was bound.
  • the slide glass was washed in the order of 4 ⁇ SSC, 4 ⁇ SSC containing 0.1 l Triton X-100, and 4 ⁇ SSC at room temperature for 10 minutes each.
  • an anti-fading reagent 100 mg of P-phenylenediamindihydrochloride was dissolved in 10 ml of PBS, and then pH900.5Mcarbonate- Adjust the pH to 8 with a bicarbonate buffer and add 90 ml of glycerol; the solution passed through a 0.22 / zm finalizer, if necessary.
  • Counter 1) ⁇ 4 ', 6-Jamidino-2-Fewer Dole (DAPI), etc. was added and a cover glass was covered.
  • Example 3 In a manner similar to that described in (3), the hybridization reaction solution prepared in (1) above and the slide glass prepared in (2) above were prepared. The samples were reacted, and washed at 37'C for 1.75xSSC, 1.75xSSC containing 0.1% TritonX-100, and 1.75xSSC for 10 minutes each. Next, after gently washing with bacterial water, a probe bound to the target nucleic acid sequence by adding one drop of the anti-fading reagent (including PI) • FITC bound to RecA protein in the RecA complex The signal was detected with an Olympus fluorescence microscope equipped with an IB excitation filter (BP-495).
  • BP-495 IB excitation filter
  • Oncorb biotinylated probe (0NC0B, catalog number: M710-BI0, lot number: 3C11 20 ng) prepared from the cDNA of the tumor suppressor gene p53 A hybridization reaction solution was prepared in the same manner as the method described in Example 4 (1).
  • HEp-2 cell nuclei were prepared in the same manner as described in Example 3 (2).
  • Hybridization reaction with a native target nucleic acid and detection were carried out in the same manner as described in Example 4 (3).
  • a target nucleic acid / probe complex can be efficiently formed within 2 hours.
  • FITC included in By detecting the RecA protein bound to the target nucleic acid sequence the target nucleic acid sequence (single copy p53 gene) can be used without the hybridization reaction and the staining step after washing. It has been found that the presence of the sequence can be easily detected by ordinary fluorescence microscopy even when counterstaining is performed.
  • Example 2 50 ng of 0NC0R biotinylated probe prepared from p53 cDNA, 6 Recg of RecA tannoprotein, and 20 ng of Piotin idorobe, 2.4 g RecA protein
  • the probe conjugate was prepared according to the method disclosed in Example 2 of WO 93/05177 by Zarling et al. This complex was added to a sample prepared by a method similar to that described in Example 3 (2), followed by a method similar to that described in Example 3B of W 093/05177 by Zarling et al. Hybridization was performed for 2 hours by the method described above, and then washing was performed. However, prior to the hybridization reaction, a pretreatment was performed at 60 for 60 minutes in lOmM tris acetate buffer (pH 7.5). Blocking treatment with the pretreatment blocking solution was not performed.
  • FITC avidin Vector, DCS grade, Cataro
  • FITC avidin Vector, DCS grade, Cataro
  • BP-495 IB excitation filter
  • Plasmid pAM6 (ATCC 45020) containing the entire HBV (Hepatitis B virus) DNA sequence was transferred to the BRL Nick Transsion Kit in the presence of dNTP.
  • a DNA probe containing the HBV sequence was prepared by fragmentation using the DNA probe. This DNA probe has no detectable label or ligand.
  • a hybridization reaction solution was prepared in the same manner as described in Example 4 (1).
  • Alexander cells (ATCC CEL8024), which are derived from liver cancer and are known to have part of the HBV nucleic acid sequence integrated into the chromosome, are cultured in the same manner as HEp-2 cells, and centrifuged. Thus, cells were collected and washed with PBS. After removing the PBS by centrifugation, the precipitated cells were fixed by adding 100% cold methanol (or an appropriate fixative such as 70% ethanol). The cells were adjusted to a cell concentration of 2 ⁇ 10 ′ cells / ⁇ 1 and stored at 20 ° C. As a control, a suspension of HEp-2 cells was prepared by fixing in the same manner.
  • the resulting reaction solution was centrifuged to remove the supernatant.
  • the cells were suspended by adding 30 1 anti-fading reagent (does not include a staining agent such as P1), and 2; zl was added dropwise to the slide glass.
  • the FITC signal was observed with an Olympus fluorescence microscope equipped with a cover glass and a 1B excitation filter (BP-495). As a result, the signal of FITC could be detected from Alexander cells without the hybridization reaction and the staining step after washing, but not from HEp-2 cells. No signal was detected.
  • a chromosome specimen is cultured by lymphocyte separation from healthy human blood according to the conventional method described in, for example, Trask. BJ et al., Methods in Cell Biology, 35, 16, 1991. After processing It was prepared by fixing in the same manner as in Example 3 (2).
  • Example 3 HEp-2 cell nuclei were prepared in the same manner as described in (2).
  • an anti-RecA antibody solution of lOO / z 1 (FITC-conjugated anti-RecA antibody obtained in Example 2 was purified at a concentration of 15 g / ml). (Dissolved in solution) and cover with parafilm 37. The reaction was performed at C for 1 hour. The scan La I Dogara vinegar containing a sample of this, 4 55 Ji, Ji 4 55 containing 0.1% 1 1 1 "1 011 (-100, 4
  • Example 9 Washing was performed for 10 minutes at room temperature in the order of SSC. After washing gently with sterile water, add one drop of the above anti-fading reagent, cover with a cover glass, and attach an IB excitation filter (BP-4.95). The presence of the chromosome 1 satellite III DNA could be detected by observing with a fluorescence microscope manufactured by the company and detecting the FITC signal. The signal obtained was stronger than the signal obtained in Example 4. In addition, there was no difference between the case where ATP7S was used as the cofactor and the case where GTP7S was used. Example 9
  • Target nucleic acid sequence No. 1-chromosome satellite I II sequence
  • secondary antibody that can recognize anti-RecA antibody
  • a hybridization reaction solution was prepared in the same manner as described in Example 8 (1).
  • HEp-2 cell nuclei were prepared in the same manner as described in Example 3 (2).
  • a goat anti-mouse IgG antibody solution with 100; / 1 FITC bound thereto (a goat anti-mouse IgG antibody manufactured by Sigma,
  • DIG antibody labeling kit manufactured by Boehringer Mannheim Digoxigenin was used to bind RecA protein. That is, 1 mg of RecA protein was first dissolved in 1 ml of phosphate buffer solution (PBS), and 43.5 // 1 digoxigenin-3-0-succinate was added to the obtained solution. Add a solution of gel- ⁇ -aminopuronic acid- ⁇ -hydroxy-succinimide ester (DIG-.NHS) (2 // g / 1) and slowly The mixture was reacted at room temperature for 2 hours with stirring. Here, one mole! ? ecA Tanno ,. The protein reacts with 5 moles of D1G-NHS.
  • PBS phosphate buffer solution
  • DIG-.NHS gel- ⁇ -aminopuronic acid- ⁇ -hydroxy-succinimide ester
  • the obtained reaction mixture was applied to Sephadex G-25 and eluted with an elution buffer (PBS, pH 7.2), so that it did not bind to RecA.
  • PBS elution buffer
  • the free D1G-NHS and the RecA protein bound to DIG-NHS were separated.
  • the multidrug resistance (MDR1) gene Plasmid containing cDNA sequence pMDRAl (Kioka, N. et al., Biochem. Biophys. Res. Coinmu., 162, 224, 1989), including cDNA sequence from multidrug resistant (MDR1) gene DNA probes were prepared.
  • the resulting DNA probe does not contain any detectable label or ligand.
  • the A probe was killed and recovered.
  • the recovered DNA probe is suspended in Tris-HCl EDTA buffer (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.5) and purified using Microcon-100 (manufactured by Amicon). As a result, a DM probe solution was obtained.
  • the resulting DNA probe solution was diluted with sterile water or Tris-HCl EDTA buffer and placed in a 0.6 ml microcentrifuge tube. The DNA probe was denatured by holding the tube in boiling water for 5 minutes. After denaturation, the tube was transferred to ice water and ⁇ ? Tv Lo 1
  • a magnesium acetate solution (100 raM) was added to the obtained reaction solution and mixed well to obtain a hybridized reaction solution.
  • the sample was washed with a 1X RecA reaction solution containing no glycerol, and a 100/1 pretreatment block solution (53 ⁇ 4 skim milk, 10 mM trim) was used.
  • slide glass containing the reaction sample was added to a plating solution (4 X SSC, 0.1% Triton X-100 ⁇ 5% skim phenol, 0.02% sodium azure). ) And react for 20 minutes at room temperature Locked.
  • slide glass containing the sample is immersed in a blocking solution containing 20 g / m 1 of anti-digoxigenin monooletsusen (manufactured by Behringer Mannheim). And reacted at 37 ° C for 20 minutes.Anti-digoxigenin was added to the probe bound to the target nucleic acid sequence and the RecA protein bound to DIG-NHS contained in the RecA complex. Fluorescein was combined.
  • the slide glass was washed in the order of 4 ⁇ SSC, 4 ⁇ SSC containing 0.1% Triton X-100, and 4 ⁇ SSC at room temperature for 10 minutes each.
  • one drop of the anti-fading reagent described in Example 3 was added and covered with a cover glass.
  • This sample was observed with an Olympus fluorescence microscope equipped with an IB excitation filter (BP-495), and the target nucleic acid (cDNA sequence derived from the multidrug resistance (MDR1) gene) Fluorescein (FITC) signal derived from EecA protein bound to DIG-NHS contained in a single-complex was detected.
  • FITC Fluorescein

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Description

明細害
R e c A 夕 ン ノ、。ク質を用い る ィ ン シ チ ュ ノ、イ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン法およ び該方法に使用する標識ま たは リ ガ ン ドを有す る R e c A タ ンパク 質 技術分野
本発明は、 細胞または細胞構造体に存在する 2 本鎖標的核 酸配列を検出す る のに有用な RecAタ ンパク質を利用する ィ ソ シチ ュ ハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン法、 該方法の実施に使用する キ ッ ト、 および、 標識ま たは リ ガン ドを有する RecAタ ンパク 質に関する。 背景技術
ィ ン シチ ュ ハ イ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン法は、 細胞内に存在す る DNAや RNAな どの標的核酸配列に直接核酸プロー ブをハイ ブ リ ダィ ズさせ る方法であ る。 こ の方法は、 透過性を高めた、 固定 した細胞ま たは細胞構造体 （核ゃ ミ ト コ ン ド リ ア等の器 官、 細菌や ウ ィ ル ス等の寄生体な ど） 、 または固定された染 色体標本な どの生物材料に適用され、 それら に含まれる核酸 配列を標的にする。 そ の結果、 標的核酸配列の存在を、 そ の 存在する場所で、 即ち、 イ ン シチ ュ に測定 し得、 標的核酸配 列の局在についての情報が得 られる こ とか ら、 発生生物学、 細胞生物学、 遺伝学 （ と り わけ遺伝子マ ッ ピ ン グ） 、 病理学、 遺伝子診断等の生体臨床医学の広い分野に適用可能であ る。 イ ン シチ ュ ハ イ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ン法は、 一般に、 2 本鎖 - の核酸、 代表的には、 病原体や ウ ィ ル ス の特定の配列、 およ び、 染色体 DNAの特定遺伝子を標的にする。 従来のイ ン シ チ ュ ハイ ブ リ ダィ ゼー シ.ヨ ン法では、 1 本鎖の標識された核酸プ ロ ーブを使用 し、 こ のプローブを透過性を高めた細胞に添加 し、 2 本鎖の標的核酸配列が変性する の に十分な温度に加熱 した後、 所定の条件下で こ のプローブと変性 した標的核酸配 列 と をハイ ブ リ ダィ ズさせる。 その後、 標的核酸配列と結合 しなか っ た未反応のプローブを除去 し、 細胞中の標的核酸配 列に結合 したプロー ブの標識を検出する。
イ ン シチ ュ ハ イ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ン法は、 染色体 DNA上の特 定の遺伝子配列の位置や既知の遺伝子と の距離のマ ツ ビ ン グ (Fan. Y. S. ら、 Proc. Natl . Acad. Sc i . USA、 87、 6223、 1990他） 、 サテ ラ イ ト DNAやその他の反復配列の染色体上での配置の研究
(杉本憲治ら、 臨床分子医学、 1、 348、 1993他） 、 染色体異 常の解析 ( Hopman, A. H. N. ら、 Histochemistry、 89、 307、 88他） 、 DNA損傷部位の解析 （Baan, R. A. ら、 Prog. CI i n. B i ol . Res. , 340A、 101、 1990他） やフ ローサ イ ト メ一タ ーを用いた 染色体量の解析 （Trask. B. ら、 Hum. Genet.、 78、 251、 1988他） 、 遗伝子のコ ピー数の解析 （Kallioniemi, 0. P. ら、 Proc. Natl. Acad, Sci. USA.、 89、 5321、 1992や、 K a 11 i on i em i , A. ら、 Sci ence、 258、 818、 1992他） 等の染色体 DNA研究に広 く 利用 さ れ て い る。 また、 宿主染色体に組み込ま れたウ ィ ル ス核酸配列 の局在に関する研究に利用されて い る （ Lawrence, J. B. ら、 P roc. Natl. Acad, Sci. USA.、 87、 5420、 1990他） 。 さ ら に、 断 - 面化した核を 3次元的に再構成する こ と によ る染色体の位置 研究に も使用されている。
イ ン シチ ュ ハイ ブ.リ ダィ ゼー シ ヨ ン法のその他の一般的な 応用例と しては、 診断手段と し て の宿主細胞中の ウ ィ ル ス の 検出がある （Han, Κ· H. ら、 J. Virol · Methods、 37、 89、 1992他） 。 感染細胞中の ウ ィ ル ス粒子の数が非常に少ない場合は、 イ ン シ チ ュ ポ リ メ ラ ー ゼチ ェ イ ン リ ア ク シ ョ ン （ィ ン シ チ ュ PCR)法 によ ってあ らか じめ ウ イ ノレ ス配列を増幅する （ Hasse, A. T. ら、
Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 87、 4971、 1990) 。
しか しながら、 従来のイ ン シ チ ュ ハ イ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン 法には種々 の制約がある。 例えば、 2本鑌標的核酸配列を変 性させる必要がある。 こ の変性は、 通常、 標的核酸配列また は該核酸配列を含む試料を、 特定の薬剤存在下ま たは非存在 下で加熱処理する こ と に よ り行われる。 こ の加熱処理は、 し ば しば、 試料中の核酸に予期できない-変化を-生.じ させる。 こ の変化は、 DNAの構造的変化、 反復配列を介 した核酸間の ラ ン ダムな再結合な どを含む。 さ ら に、 変性操作は余分の時間や 労力を必要とする。
あ るいは、 標的核酸配列の コ ピー数が極めて少ない場合に は、 長いハイ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ン時間が必要で、 プロ ー ブ と 標的核酸配列と のハイ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ンが効率良く 起こ ら ない。 こ の よ う な場合、 あ らか じめ標的核酸配列をイ ン シ チ ュ P C R法で増幅する こ と によ り あ る程度解消 し得る。 しか し、 イ ン シ チ ュ P C R法は繁雑であ り、 染色体 DNA配列の局在 の解析に関する研究には不適切であ る。
上記の制約を解決 して、 標的核酸配列を変性せずに、 少な いコ ピー数の標的配.列を高精度で検出でき る方法と して、 Za rl ing, D. A. らに よ る WO 93/05177に記載 さ れた、 RecA夕 ンパ ク 質を用いる ィ ン シチ ュハイ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン法が開発され た。 こ の方法は、 標的核酸配列に相補的な配列を有する、 標 識または リ ガ ン ドを有する 1 本鎮核酸プロー ブと、 EecA夕 ン パク質とが安定に結合 したプローブ ' RecA複合体を使用 し、 標的核酸配列が変性 しない条件下で、 こ の複合体と標的核酸 配列をハイ ブ リ ダイ ス させ、 標的核酸配列と結合 した、 標識 ま たは リ ガ ン ドを有す る プロ ー ブを検出する こ と によ っ て、 該標的配列を検出する。 こ の方法では、 使用される核酸プ ロ ーブが、 蛍光剤、 化学発光剤、 酵素標識、 放射性標識等の検 出可能な標識、 ま た は、 ピオ チ ンゃ ジ ゴ牛 シゲニ ンな どそれ ら に特異.的な リ ポー タ ー分子と結合 し得る よ う な リ ガ ン- ドを 有する。
化学発光剤、 酵素標識な どの標識、 お よ び ピオ チ ンゃ ジ ゴ キ シゲニ ン な どの リ ガ ン ドを有する プローブを使用する場合 は、 RecAタ ンパク質が結合 した該ブローブを、 標的核酸配列 が変性しない条件下で、 2 本鑌の標的核酸配列と結合させ、 未反応のブ ロ ー ブを除去 した後に、 化学発光工程、 酵素反応 工程、 ま た は、 標識付ア ビ ジ ン、 ス ト レ プ ト ア ビ ジ ン ま た は 抗ジゴキ シゲ二 ン抗体な どの リ ポータ ー分子と の反応な どを 含む 2 次反応によ り標的核酸配列を検出する。 蛍光剤を使用 · する場合は、 共焦点レーザー顕微鏡な どきわめて高感度の検 出機器を用いて標的核酸配列を検出する。 Z a r l i n gらの方法で は、 標識または リ ガン ドを有 しないプロ ーブは使用でき ない。 標識または リ ガ ン ドを有する プロ ーブを調製するためには、 ニ ッ ク ト ラ ン ス レー シ ョ ン法ゃ ラ ン ダム プ ラ イ ミ ン グ法な ど 公知の方法が用いられる。 しか し、 こ れ ら方法によ り、 プロ ーブに取り込み得る標識または リ ガ ン ドの数は、 数 1 0〜数 1 0 0塩基に約 1 つであ り、 プロ ーブに取り込み得る標識または リ ガ ン ド量には限界があ った。 従って、 得られる シ グナ ルの強 さ は必ずし も十分ではな く、 例えば、 通常の蛍光顕微鏡を使 用 して検出する場合、 プロ ビジゥ ム ィ ォダイ ドな どでカ ウ ン タ ー染色を施した場合、 単一コ ピーの遺伝子はほ とん ど検出 でき ない。 また、 プローブに取り込ま れた標識ま たは リ ガ ン ドによ り、 プロ ーブと標的核酸配列と のハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン反応が阻害される場合は、 検出感度が.さ ら に低下する。 さ らに、 複数の異なる標的核酸配列を同時に検出する場合は、 あ らか じめそれぞれの標的核酸配列に相補的な各プローブに、 異なる タ イ プの標識も し く は リ ガ ン ドを結合させる必要があ つ た。 発明の開示
本発明は、 上記従来の課題を解決する も のであ り、 そ の 目 的とする と こ ろは、 RecA夕 ンパク質が安定に結合 したブロ ー ブ · RecA複合体を用い、 2 本鑌標的核酸配列と結合 したプロ 一ブ · RecA複合体に含まれる RecAタ ンパク質を検出する こ と に よ り該標的核酸配列の存在を検出する こ と を特徴とする、 高感度で簡便なイ ン シチ ュ ハ イ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン法を提供
9 る にある。
本発明者 らは、 上記の Zar l ingらの方法に従っ て得られた、 標的核酸配列と結合 したプローブ ■ RecA複合体中に、 RecA夕 ンパク質が安定に保持されている こ とを見いだ した。 RecA夕 ンパク質がプロ ーブに結合 した状態では、 例えば、 標的核酸 配列を、 プロ ーブに結合 した ビォ チ ンゃ ジゴキ シゲニ ン等そ れら に特異的な リ ポータ ー分子と結合 し得る よ う な リ ガ ン ド で検出する場合、 前記 リ ポー タ ー分子と リ ガ ン ドの反応効率 が低下 し、 蛍光顕微鏡な ど通常の検出手段では検出感度が低 下する と考え られる。 本発明者 らは、 こ のよ う な観点から、 夕 ン パ ク質分解酵酵素や界面活性剤な ど種々 の洗浄液を用い て、 2 本鑌標的核酸配列と結合 したプローブ ， EecA複合-体中 の RecAタ ンパク質を除去 しよ う と試みた。 し力 し、 該複合体 中の BecAタ ンパク質を標的核酸配列および上記複合体に影響 を及ぼすこ と な く RecAタ ンパク質を除去 し得なか った。 そ こ で、 プローブ ' BecA複合体に含まれる標識ま たは リ ガ ン ドを 有する プロ ーブを検出するかわ り に上記複合体に含まれる Re cAタ ンパク 質を検出する こ とを考えた。
そ して次に発明者らは、 蛍光剤、 化学発光剤、 酵素標識、 放射性標識な どの検出可能な標識、 ま た は ビォ チ ンゃ ジ ゴ丰 シゲニ ン等それらに特異的な リ ポ―タ —分子と結合 し得る よ う な リ ガ ン ドを有する RecA夕 ンパク質を調製 した。 こ の よ う な標識または リ ガ ン ドを有する RecAタ ンパク質を用いた場合 で も、 標的とな る 2本鎮核酸配列と結合 したプロ ーブ · RecA 複合体 （ 2 本鑌標的核酸配列 · プローブ ' RecA複合体） を効 率よ く 形成させ る こ とができ、 かつ該複合体に含まれる標識 ま たは リ ガ ン ドを有する RecA夕 ンパク質を検出する こ と によ り、 よ り高感度にかつ簡便に特異性高 く 該標的核酸配列の存 在を検出でき る こ と を見いだ した。
また、 標的となる 2 本鎖核酸配列と結合したプローブ · Re cA複合体 （ 2 本鎖標的核酸配列 · プローブ . RecA複合体） に、 抗 RecA抗体を反応させて、 標的とな る 2 本鎮核酸配列と結合 したプローブ . RecA複合体 （ 2 本鎮標的核酸配列 . プローブ · RecA複合体） に含まれる RecAタ ンパク質を検出する こ と に よ り、 該標的核酸配列の存在を検出する こ と も可能であ る こ とを見いだ して、 本発明を完成する に至った。
本発明は、 固定された.細胞ま たは細胞構造体に含ま れる 2 本鑌標的核酸配列の存在を検出する方法に関 し、 該方法は以 下の工程を包含する ： 細胞ま たは細胞構造体を、 核酸プロ 一 ブが侵入し得る よ う に固定し、 固定された細胞ま たは細胞構 造体を得る工程、 こ こ で、 該細胞ま たは細胞構造体は、 該紬 胞または細胞構造体に含まれる その構成成分および核酸構造 と と に もに、 本来の形態学的な関係を保持している ； 1 本鑌 プローブと RecAタ ンパク 質が安定に結合 したプロ ーブ · RecA 複合体を形成する工程、 こ こ で、 該 1 本鑌プロ ーブは該 2 本 鑌標的核酸配列に栢捕的な配列を有する ； 該プロ ーブ · RecA 複合体を、 該固定された細胞または細胞構造体に、 該 2 本鎖 標的核酸配列と接触 .し得る条件下で添加する工程 ；.該 2 本鑌 標的核酸配列が変性 しない条件下で、 該プロ ーブ - RecA複合' 体と該 2本鎮標的核酸配列とを反応さ せて結合す る工程 ； 該 2 本鎮標的核酸配列と結合 しなかっ たプローブ . EecA複合体 を除去する工程 ； およ び該 2 本鎮標的核酸配列と結合 したプ ローブ · RecA複合体に含まれる RecAタ ンパク 質を検出 し、 そ れに よ っ て該 2 本鎖標的核酸配列の存在を検出する工程。 発明を実施するため の最良の形態
本明細書で使用する用語 「細胞」 は、 動物細胞、 植物細胞 な どの真核細胞、 細菌な どの原核細胞な どを包含 し、 ま た、 例えば、 動物細胞にお いて、 精子、 卵子などの生殖細胞、 体 細胞な ど、 形態学的およ び構造的に異なる任意の種 の細胞 を包含する。 さ らに、 こ れ ら細胞を含む動植物組織サ ン プル を も包含する。
本明細書で使用する用語 「細胞構造体」 は、 前記細胞内に 存在する、 細菌、 ウ ィ ル ス、 または核や ミ ト コ ン ド リ アな ど の器官、 染色体、 あ る いは、 ウ ィ ル ス、 細菌な どの血液サ ン プルな どの生体由来の試料に存在する寄生体を包含する。
前記細胞または細胞構造体に含まれる、 標的と なる 2 本鎮 核酸配列は、 代表的には、 染色体 D NA、 ウ ィ ル ス、 およ び、 前 記寄生体の中で病原体と なる ま たは病原に関連する 2 本鎖核' 酸であ る。
前記の細胞または細胞構造体は、 例えば、 培養細胞、 動植 物組織、 生物体液な.どの生物材料か ら得られ得る。.
前記固定された細胞ま たは細胞構造体を得る工程は、 従来 のィ ン シチ ュ ハ イ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン法において用い られて いる方法と同様の方法で実施され得る。 簡単に言えば、 細胞 ま たは細胞構造体は、 該細胞または細胞構造体に含まれる そ の構成成分および核酸構造と と もに、 本来の形態学的な関係 を保持 しながら有機溶媒、 酸または架橋剤な どによ り 固定さ れ、 該細胞または細胞構造体の、 標的配列に相補的な配列を 有する プロ ーブに対する透過性が増加する。 一般的な固定剤 と し ては、 酢酸、 各種塩類、 メ タ ノ ー ル、 ホ ルマ リ ン、 パ ラ ホ ル ム ア ルデ ヒ ド、 グル タ ル ァ ルデ ヒ ドな どが使用され得る。 前記の細胞または細胞構造体は、 一般的には、 1 種ま たは 複数の薬剤の存在下または非存在下で処理され、 タ ンパ ク 質 およびノま たは脂質を除去し得る。 該薬剤は、 酸、 ア ル コ ー ル、 界面活性剤、 およびこれ ら の組み合せを包含 し、 該処理 は、 プロテアーゼ、 リ パーゼな どによ る酵素処理、 熱処理、 洗浄処理、 および、 これらの処理の組み合わせを包含する。 代表的な処理方法と しては、 メ タ ノ ー ル ： 酢酸で 1 回ま たは 数回洗浄する こ とが知られてい る。
前記細胞が動物組織の場合は、 該動物組織は、 ホ ル マ リ ン、 グルタ ルアルデ ヒ ドな どの従来の固定法によ り 固定された後 に、 ろ う に埋め込み、 ま たは、 凍結 した後、 切片に し、 透過 - 性を増すために、 ス ラ イ ドガラ ス等の固体支持体上でメ 夕 ノ ー ル ： 酢酸な どで処理され固定され得る。
前記細胞構造体は、 標的遺伝子配列の細胞内局在を決定 し た り、 細胞内の ウ ィ ルス、 細菌や寄生体等の感染生物の存在 及び/または局在を検出する の に使用 され得る。 核ゃ ミ ト コ ン ド リ ァな どの細胞構造体は、 等密度遠心法のよ う な一般的 な分画法によ っ て濃縮され、 そ して十分に精製 した状態で調 製さ れ得る。 その後濃縮された調製物を前記のよ う に固定 し て透過性を増すよ う な処理を して、 溶液中で、 ま たは ス ラ イ ドガラ ス等の固体支持体上に固着され、 乾燥させて使用 し得 る 0
核な どの細胞構造体は、 細胞を 7 5 mMの K C 1溶液で前処理 した 後、 メ タ ノ ー ル ： 酢酸処理によ って細胞質を取り除いて調製 され得る。 すなわち、 細胞を低速で遠心分離する こ と によ り 集めた後、 7 5 πΜの K C 1溶液に懸濁 し、 核が適度に膨張する まで 5分〜 20分間放置 してか ら氷冷したメ タ ノ ー ル ： 酢酸を加 えて遠心する。 氷冷 した メ タ ノ ー ル ： 酢酸を加えて細胞をゆ るやかに攪拌 して遠心する操作を緣り返 して、 核から細胞質 を除去 し得る。 こ の よ う に して単離された核は メ タ ノ ー ル ： 酢酸に再懸濁 し、 その内の約 Ι Ο μ Ιを ス ラ イ ド ガ ラ ス な どの固 体支持体の上に滴下 して乾燥 し固着され得る。 固定された核 は、 室温 8 0 °Cで保存 し得る。 あ る いは、 上記集めた細胞 は、 リ ン酸緩衝溶液（PBS)を用いて洗浄後、 100% メ タ ノ ー ル ま たは 70%エ タ ノ ー ルで処理する こ と に よ り 固定 し得、 固定 - された細胞は— 20でで保存し得る。 こ の保存された固定細胞 は、 細胞懸濁液の状態で、 溶液中でのハイ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン反応に使用され得る。
染色体な どの細胞構造体は、 Trask. B. J. ら、 Methods in C ell Biology、 35、 16、 1991に記載の通常の方法で、 例えば、 リ ン パ球の中期細胞か ら得られ、 こ の染色体は、 通常メ タ ノ ー ル ： 酢酸で処理された後にス ラ イ ドガラ ス等の上に滴下さ れ、 乾燥して固着され得る。
ミ ト コ ン ド リ ア、 ウ ィ ル ス粒子な ど、 細胞およ び血液サ ン プルか ら単離された細胞構造体もま た、 常法によ り、 前記同 様に固定され得る。
本発明の方法に用い られる前記核酸プローブは、 1 本鎖の 核酸であ り、 通常は、 1 本鑌の DNAであ る。 標的核酸配列の一 方または両方の鎮に栢補的な 2 本鎮プロ ーブを変性する こ と によ っても調製 し得る。 市販されている種々 のサテ ラ イ ト DN A配列など、 多 く の 1 本鎮ま たは 2 本鑌プローブを本発明に使 用 し得る。 ある いは、 当該技術分野で公知のプローブ調製法 に よ り、 例えば、 ウ ィ ル ス、 特異的な配列を有する ブ ラ ス ミ ドゃコ ス ミ ドまたはその他のベク タ ーか ら直接調製され得る。 必要に応じて、 ベク タ ーから ブローブ DNA部分を制限酵素で切 り 出 し、 電気泳動によ っ て特異的な制限酵素断片を単離する こ と によ り調製され得る。 こ のよ う に して得 られたプロ ーブ は通常 2本鎮の状態であるが、 必要に応じて M 13フ ァ ー ジべ ク 夕 一のよ う な 1 本鎖ベク タ ーにサ ブク ロー ニ ン グされ得る。 あ る いは、 オ リ ゴヌ ク レ オチ ド合成法によ っ て 1 本鎖プロ一 ブを調製 し得る。 長いプローブを調製する場合は、 プローブ のサ ブフ ラ グメ ン ト を合成 した後、 それ ら のサ ブ フ ラ グメ ン ト をつなぎ合わせて調製され得る。
前記核酸プローブは、 標的核酸配列と プロ ー ブとの間の配 列特異的なハイ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン反応を確実に実施する た めに、 好適には、 標的核酸配列と少な く と も 90〜 95% の ホ 乇 口 ジーを持つ核酸配列を有する。 こ の 1 本鑌プ ロ ー ブの長さ は、 通常、 約 100〜： L, 500塩基であ り得、 よ り短い、 ま たよ り 長いポ リ ヌ ク レオチ ドプローブも使用され得る。
本発明に使用される前記核酸プローブは、 標準的な条件で は 300n g以下で使用され、 好ま し く は 5〜： LOOngの量で使用され 得る。
前記核酸プローブは、 標識ま たは リ ガ ン ドを有する必要は ないが、 必要に応 じて、 ¾光剤、 化学発光剤、 酵素標識、 放 射性標識な どの検出可能な標識や、 ピオ チ ンや ジ ゴキ シゲニ ンな ど、 それら に特異的な リ ポータ ー分子と結合 し得る リ ガ ン ドを有し得る。 こ の標識または リ ガ ン ドを有する プローブ を、 検出可能な標識ま たは リ ガ ン ドを有する、 RecAタ ンパク 質、 抗 RecA抗体、 ま たは抗 RecA抗体に結合し得る 2 次抗体と 組み合わせて用いる こ と によ り標識または リ ガン ドの シグナ ルを増幅し得る。 本明細書で使用する用語 「RecAタ ンパク質」 は、 大腸菌 Re cAタ ン パ ク 質の機能のすべてを、 ま たはそ の機能の大部分を 有する、 大腸菌 RecAタ ンパク質と実質的に同等の RecA様組換 えタ ンパク質の一群を指 し、 例えば、 大腸菌 RecAタ ンパク質 ( Shibata, T. ら、 Met.hods in Enzymology、 100、 197、 1983 ) 、 その類似夕 ンパク質であ る T 4 フ ァ ー ジ由来の uvsXタ ンパク 質 （ Yonesaki, T. ら、 Eur. J. Biochem.、 148、 127、 1985) 、 枯 草菌 （Bacillus subti 1 is) 由来の Rec夕 ン ノ、 'ク質 (Lovett, C. M. ら、 J. Biol. Chem.、 260、 3305、 1985 ) 、 黒穂菌 （Ustilag o) 由来の Beclタ ン ノ、'ク質 （ Kmiec. E. B. ら、 Cell、 29、 367、 1982) 、 酵母、 マ ウ ス、 ヒ ト 由来の RecA様タ ン パ ク質 （ Shin ohara. A. ら、 ature Genetics^ 4、 239、 1993) 、 Thermus a quaticus(Angov, E. ら、 J. Bacteriol.、 176、 1405、 1994)や T hermus thermophi lus (Kato, R. ら、 J, Biochem.、 114、 926、 1 993 )等の高温菌由来の耐熱性 RecA様タ ンパク質な どを包含す る。 これらの内で、 最も よ く 機能が研究されている のは大腸 菌由来の Rec-Aク ン.パク質であ る。 大腸菌由来の RecAタ ンパク 質と しては、 そ の野生型のみな らず多 く の変異型 （例えば Re cA803 ： Madiraju, M. ら、 Proc. NaU . Acad. Sc i . USA.、 85、 659 2、 1988や RecA441 : Kawashima, H. ら、 Mol. Gen. Genet.、 193、 288、 1984 ) も使用 し得る。
RecAタ ン パ ク 質は、 常法 （例えば、 Shibata. T. ら、 Method s in Enzyinology, 100、 197、 1983 ) によ り大腸菌から精製 し て使用 し得る。 または、 市販の RecAタ ンパク質 （例えばフ ァ ル マ シァ社製） を使用 し得る。
前記 RecAタ ンパク質は、 蛍光剤、 化学発光剤、 酵素標識、 · 放射性標識、 ビ ォ チ ン、 ジ ゴキ シ ゲ ニ ン な ど の検出可能な標 識ま たは リ ガ ン ドを有 し得る。 蛍光剤と して、 フ ルォ レ セ ィ ン イ ソ チ オ シ ァ ネ ー .卜、 カ ノレボ キ シ メ チ ノレイ ン ド シ ァ ニ ン サ ク シ 二 ミ ジ ル エ ス テ ル （Cy3TM、 Cy5™¾: ど）、 ロ ーダ ミ ン、 テ キ サ ス レ ツ ド （ ス ル フ ォ ロ ーダ ミ ン） 、 テ ト ラ メ チ ルロ ーダ ミ ン イ ソ チ オ シ ァ ネ ー ト、 7-ァ ミ ノ - 4-メ チ ル ク マ リ ン -3-酢 酸な どを使用 し得る。 酵素標識と し て は、 ア ル カ リ ホ ス フ ァ タ ーゼ、 ペ ルォキ シダーゼ、 yS —ガラ ク ト シダーゼな どを使 用 し得る。
前記標識または リ ガン ドを有する RecAタ ンパク質の調製は、 抗体な どのタ ンパク質に標識あ るいは リ ガ ン ドを結合させる 方法に準 じて実施し得る。 例えば、 フ ル ォ レ セ イ ン イ ソ チ ォ シ ァ ネ ー ト （FITC)ゃ テ ト ラ メ チ ル ロ ー ダ ミ ン イ ソ チ オ シ ァ ネ ー ト （TRITC)な どの蛍光剤 （蛍光色素） は、 松橋ら、 生物化学 実験法 15 「免疫学実験入門」 、 137ペー ジ （学会出版セ ン タ ー） の方法に準 じて前記 RecAタ ンパク質に結合され得る。 ま た、 C 3™^ Cy5™^の カ ルボ キ シ メ チ ル イ ン ド シ ァ ニ ンサ ク シ ニ ミ ジ ル エ ス テ ル類 の蛍光剤は、 例えば、 Southwickら の方法 ( Southwick, P. L. ら、 Cytometry、 11、 418、 1990 ) に準 じ て RecAタ ンパク質に結合され得る。 あ る いは、 FluoroLink- AbT MCy3™ Labeling i t F 1 uoroL i nk-Ab™ Cy5™ Labeling Ki t ( BIOLOGICAL DETECTION SYSTEMS, I NC.製） な どの市販の牛 ッ ト を用いて結合され得る。 前記 RecA夕 ンパク質に結合する 前記蛍光剤の量は、 RecAタ ンパク質モノ マーあた り 1~ 10分子、- 好ま し く は：!〜 6分子であ る。
ア タ リ ジニ ゥ ム エ ス テ ル等の化学発光剤は、 例えば、 Simp son, J. S. A. らの方法 ·( Simpson, J. S. A. b、 Bioluiinescence and Chemi luminescence. Basic Chemistry and Analytical Applications. New York ： Academic Press 1981、 673ペ ー ジ） に準 じて前記 RecAに結合され得る。
ァ ノレ カ リ ホ ス フ ァ タ ー ゼ、 ペ ルォ キ シ ダ一 ゼ， 9一ガ ラ ク ト シダ一ゼな どの酵素標識は、 例えば、 松橋ら、 生物化学実 験法 15 「免疫学実験入門」 、 151ペー ジ （学会出版セ ン タ 一） の方法に準 じて前記 RecAタ ンパク質に結合され得る。 RecAタ ンパク質に結合する酵素標識の数量は、 RecA夕 ンパク質モ ノ マーあた り 1〜 3分子、 好ま し く は 1〜 2分子である。
1 28 I や 121 I 等の放射性標識は、 例えば、 松橋らの生物化 学実験法 15 「免疫学実験入門」 、 143ペー ジ （学会出版セ ン 夕 ― ) の方法に準 じて前記 RecAタ ンパ ク 質に結合され得る。 あ る いは、 種々 の放射性標識を有する ア ミ ノ酸存在下で培養 し た大腸菌か ら精製する こ と によ り、 放射性標識を有する RecA タ ンパク質を調製 し得る。
ピ オ チ ン化 RecAタ ンパク 質は、 例えば、 生化学実験法 11 「ェ ン ザィ ム ィ ム ノ ア ッ サ セィ 」 、 24ペー ジ （東京化学同人） の方法に準 じて調製され得る。 前記 RecAタ ンパク 質に結合す る ビォ チ ンの量は、 RecAタ ンパ ク質モ ノ マーあた り 1〜： 10分子、 好ま し く は 1〜 6分子であ る。
ジ ゴキ シゲニ ン化 RecAタ ンパク質は、 ジ ゴキ シ ゲニ ン - 3-0 -サ ク シニ ル - £ -ァ ミ ノ 力 プロ ン酸- N-ヒ ド ロ キ シ -サ ク シ ィ ミ ドエ ス テル （DiG-NHS)等を用いて定法（ベー リ ン ガ一マ ンハイ ム社製のキ ッ ト ）によ.つ て調製され得る。 前記 RecAタ ンパク質 (こ結合する ジ ゴ牛 シゲニ ンの量は、 RecAタ ンパ ク質モ ノ マー あた り 1 〜； 10分子、 好ま し く は 1〜6分子であ る。
前記の標識ま たは リ ガ ン ドを有する RecA夕 ンパク質は、 標 識ま たは リ ガ ン ドを有 しない通常の RecA夕 ンパク質と混合 し て使用され得る。
前記プロ ーブ · BecA複合体を形成する工程は、 Zarl ingらに よ る W093/05177、 および 93/05178の記載に準 じて実施され 得る。 好ま し く は、 ATP 7 S GTP 7 S. rATP、 ΓΑΤΡ再生系 (ベ 一リ ン ガー マ ン ハ イ ム社製） 存在下の rATP、 dATPs ATP 7 Sと rATPと の混合物、 ΑΤΡ 7 Sと ADPと の混合物、 GTP y Sと ADPと の 混合物、 GTP 7 Sと GDPと の混合物などの コ フ ァ ク タ 一の存在下 で実施され得る。 好ま し いコ フ ァ ク タ .一は、 ATP 7 S、，.rATPま たは GTP y Sであ る。 前記コ フ ァ ク タ 一は、 約 0.12〜 12.0mM、 好ま し く は 0.24〜 7. OmMの濃度範囲で使用され得る。
前記プローブ ' RecA複合体の調製に用いる プローブは、 1 本鑌ま たは 2 本鎮いずれの形態でも使用され得、 代表的には、 約 95〜10(TCの温度範囲で約 5 分間熱変性 し、 約 20秒か ら 1分 間氷冷 した後、 前記 RecA夕 ンパク質との結合反応に使用され 得る。 必要に応 じて、 RecAタ ンパク 質 と の結合反応前に約 20 秒間 0〜 4°Cで遠心される。 変性されたプロー ブは一 20 °Cの フ リ ーザ一で保存し得るが、 好ま し く は、 氷水中で直ち に前記 コ フ ァ ク タ ーを含む標準的な RecA反応溶液 （Ferrin. L. J. ら、 Sciences 254、 149" 1991や Sen a, E- P . ら、 Nature Genet icss 3、 365、 1993等） お.よ び前記 RecAタ ン パク 質 と混合する。 こ の混合液を 3 Cで 10〜 15分間保温する こ と に よ っ て、 1 本鎮' プロ一ブに RecAタ ンパク質を安定に結合させる。 こ の反応で 1 本鑌プローブの約 3塩基に対 し、 RecAタ ンパク質が 1分子の 割合で結合 し、 1 本鎖プローブが RecAタ ンパク質でコ ー ト さ れな 0
前記プロ ー ブと反応させる RecAタ ンパク質の濃度は、 プロ ーブの大き さや量によ って変化 し得、 好ま し く は約 0.5〜 100 Mの範囲であ る。 RecAタ ンパ ク 質 （ モ ノ マー） と プロ ー ブ中 の塩基との混合比率は、 約 5 :1〜1: 3の範囲で、 好ま し く は、 3 :1〜1 :2. 5の範囲で結合反応を実施 し得る。 前記プローブ -
RecA複合体形成反応は、 必要に応じて、 single-strand bind ing protein (SSB) ノ、'ク テ リ オ フ マ ー ジ T 4 遺伝子 32タ ンパ ク 質（T4 gene 32 pro t e i n)な どの タ ンパ ク 質の共存下で実施 し 得、 それによ つ て反応を促進 し得る。
プローブに結合しなかった遊離の RecAタ ンパク質の影響を 除去するために、 例えば、 サケ精子 DNA、 酵母ま たは大腸菌由 来の t RNAな どのキ ヤ リ ァー DNAま た は ENAを プ ロ ー ブ ' RecA複 合体形成後に加えて、 プロー ブに結合 しなかっ た遊離の RecA タ ンパク質を こ のキ ヤ リ ァ一に結合させ、 固定された上記細 胞ま たは細胞構造体に含まれる標的核酸配列以外の核酸等へ の RecAタ ンパク 質の非特異的な結合を防ぎ得る。 こ の処理は 蛍光顕微鏡観察な どのバ ッ ク グ ラ ウ ン ドの ノ ィ ズ シ グナ ル '减 少に有用である。 あ るいは、 通常のカ ラ ム ク ロ マ ト で遊離の RecAタ ンパク質と前記プローブ · RecA複合体を分離して遊離 の RecAタ ンパ ク 質を除去 し得る。 検出可能な標識または リ ガ ン ドを有する RecAタ ンパク質を使用 してプロ ーブ ' RecA複合 体を調製する場合は、 前記のキ ャ リ ア ー DNAま たは RNAを用い る後処理が有効であ る。
ま た、 プローブ · RecA複合体の調製に用いる プローブと Re cAタ ンパク質の比率を調節する こ と によ り こ の工程を省略す る こ と も可能であ る。
あ る いは、 前記の検出可能な標識ま たは リ ガ ン ドを有する プローブ ' RecA複合体は、 標識または リ ガン ドを有さない Re cAタ ンパク質を、 1 本鎖プローブに安定に結合 した後、 前記 の方法に従って、 検出可能な標識または リ ガ ン ドを、 プロ一 ブ · RecA複合体中の RecAタ ンパク質に結合-する こ と によ り調 製 し得る。
前記プローブ · RecA複合体を、 固定された細胞または細胞 構造体に、 前記 2本鑌標的核酸配列と接触し得る条件下で添 加する工程、 および、 前記プ π—ブ · RecA複合体と 2 本鑌標 的核酸配列とを反応させて結合する工程は、 前記 Zarl ingらの 記載に準 じて実施し得る。 すなわち、 該標的核酸配列が変性 しない条件、 例えば、 2 本鑌 DNAの変性がお こ る温度以下で、 前記ブローブ . RecA複合体を標的核酸配列を含む細胞ま たは 細胞構造体に添加 し、 2 本鎖の標的核酸配列と、 プローブ - RecA複合体とを塩基配列特異的なハイ ブ リ ダィ ゼ一 シ ョ ン反 応によ り結台させる。
前記ハ イ ブ リ ダィ ゼ一 シ ヨ ン反応は、 該プロ ーブ ' RecA複 合体と標的核酸配列との相同部位で結合がお こ る まで、 約 1〜 24時間、 好ま し く は 2〜 18時間、 37°C に保持する こ と に よ り 実 施され得る。 前記ハ イ ブ リ ダィ ゼ一 シ ヨ ン反応は、 必要に応 じて、 single-strand binding protein (SSB)、 ト ポ イ ソ メ ラ ーゼ Iや ト ポィ ソ メ ラ ーゼ Hな どの夕 ンパク 質の共存下で実施 し得、 それによ つて反応を促進 し得る。 標的核酸配列に結合 しなかったプローブ ' RecA複合体は、 公知の洗浄方法によ り 除去 し得る。 但し、 例えば、 タ ンパク 質分解酵素や、 RecA夕 ンパク質を可溶化する界面活性剤を高濃度に含む洗浄液の使 用は望ま し く ない。
前記のハイ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン反応を行う前に、 必要に応 じて、 前記固定された細胞ま たは細胞構造体は、 前記プロ一 ブ · RecA複合体を添加する工程に先だ って、 lOtnMの ト リ ス酢 酸緩衝液（pH 7.5)中で、 4〜 60°Cで処理 した り、 ペ プ シ ンや p roteinaseK等のタ ンパク質分解酵素で処理する こ と によ り、 ハイ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン反応の反応効率を高め得る。 また、 標的核酸配列を含む細胞または細胞構造体を RNA分解酵素、 n ickase(DNaseI等）や リ ガーゼによ り処理 しておいて も よい。
あ る いは、 必要に応じて、 ハ イ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ン反応を 行 う前に、 前記固定された細胞ま たは細胞構造体を、 カ ゼィ ン、 ス キム ミ ル ク、 および、 牛血清ア ルブ ミ ン、 キャ リ アー
DNA. およ び、 キ ャ リ アー RNAか らな る群から選ばれる少な く と も一種を含む、 前処理用ブロ ッ キ ン グ液で処理 し得る。 前 処理用ブロ ッ キ ング液に含まれる これ ら の物質は、 RecAタ ン パク質に結合 している標識ま たは リ ガ ン ド、 およ び/ま たは RecA夕 ンパク質それ自身が、 固定 した細胞ま たは細胞構造体、 および/ま たは固体支持体に非特異的に結合する のを防止す る。 ま た、 FIT TRITCや Cy3TK、 Cy 5 τκな どの カ ルボ牛 シ メ チ ルイ ン ド シァ ニ ンサ ク シュ ミ ジルエ ス テ ル類な どの蛍光剤を 有する RecA夕 ンパク質を使用する場合には、 標識または リ ガ ン ドを有しない通常の RecAタ ンパク質を前処理用プロ ッ キ ン グ液に添加 しておいて も よい。 こ の処理は、 代表的には、 前 記前処理用ブ ロ ッ キ ン グ液を前記固定された細胞ま たは細胞 構造体に添加する こ と によ り実施され得る。
前記固定された細胞ま たは細胞構造体は、 懸蘅液の状態で、 前記ブ ロ ーブ · RecA複合体とハ イ ブリ ダイ.ゼ シ ョ ン反応さ せ得る。 すなわち、 プローブ · RecA複合体を含むハイ ブ リ ダ ィ ゼー シ ョ ン反応溶液に、 固定された細胞ま たは細胞構造体 を懸闺させて 1〜 24時間、 好ま し く は 2〜 18時間、 例えば、 37 °Cに保持する こ と によ り実施し得る。 反応後、 洗浄液に細胞 を懸蘅させ、 洗净 して未反応のプローブ · RecA複合体を除去 する。
ス ラ イ ドガラ ス等の固体支持体上に固着された細胞ま たは 細胞構造体と前記プローブ · RecA複合体とを反応する場合は、 通常、 約 10〜20 lのプローブ . RecA複合体を含む反応溶液を、 ス ラ イ ドガラ ス上の固着させた前記細胞または細胞構造体に 添加 して実施し得る。 得 られた反応溶液にカ バーガラ ス を被 せ、 湿気を含んだ密 容器に入れて、 例えば、 37°Cで約 1〜 2
4時間、 好ま し く は 2〜 18時間ハ イ ブ リ ダィ ズさ せる。 反応後、 数回洗浄して未反応のプロー ブ ■ RecA複合体を取り除 く。
前記のハイ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン に用いる反応溶液は、 代表 的には、 反応溶液中の各構成成分の最終濃度が、 以下の範囲 にな る よ う に調製 し得る ； 1 〜 100 mMト リ ス酢酸緩衝液、 2 ~ 20mM酢酸マ グ ネ シ ゥ ム、 0 〜 lOOmM酢酸ナ ト リ ウ ム、 0.4〜 1 mMジ チ オ ス レ ィ ト ー ル、 0〜 100mM EGTA、 0〜 50mMス ぺ ノレ ミ ジ ン、 0〜： 10%グ リ セ ロ ー ル、 0.24〜 7. OmM ATP 7 S、 rATPま た は GTP r S、 0.5〜 M RecAタ ン バ ク 質 （標識ま た は リ ガ ン ド を有する RecA夕 ンパク質のみ、 標識ま たは リ ガ ン ドを有する RecA夕 ンパク質および通常の RecAタ ンパク質と の混合物、 あ る いは標識ま たは リ ガ ン ドを有 しない通常の RecAタ ンパク 質 のみ〉 、 1 反応あた り 5〜： LOOngのプロ ー ブ、 1 反応あ た り 0〜 10 gキ ャ リ ア ー DNAも し く は R A) 。
前 Ϊ己 2 本鑌標的配列の存在を検出する工程は、 例えば、 F1
TC、 TRITCや Cy3TM、 C 5™^の カ ル ボ キ シ メ チ ル イ ン ド シ ァ ニ ン サ ク シ ニ ミ ジ ルエ ス テ ル類等の蛍光剤を有する RecAタ ン バ ク質を検出する場合は、 標的 と なる 2 本鎮核酸配列と結合 し たプローブ · RecA複合体に含ま れる これら蛍光標識を有する RecAタ ンパ ク 質由来の蛍光シ グナ ルを、 蛍光顕微鏡、 共焦点 レーザー顕微鏡やフ ロ ーサイ ト メ 一夕 一 （ FACS = f luorescenc e activated cell sor t er)で検出する こ と に よ り 実施 し得る。
ア ルカ リ ホ ス フ ァ タ ー ゼ、 ペルォ キ シ ダー ゼま たは >9 — ガ ラ ク ト シダ一ゼなどの酵素標識を有する RecA夕 ンパク 質を検 出する場合は、 公知の方法、 例えば、 特公表平 4- 505556号に 記載の方法によ り、 二 ト ルブル一 テ ト ラ ゾ リ ゥ ム ゃ 5 -ブ ロ モ -4 -ク 口 口 - 3 -ィ ン ド リ ル ホ ス フ エ ー ト な どの不溶性色素を生 産する発色性の基質、 AMPPD(TROP! (社製）な どの化学発光性の 基質を用いて実施し得る。
放射性標識.を有する RecAタ ンパク 質を検出する場合は、 公 知の方法、 例えば、 吉田廸弘、 蛋白質核酸酵素、 38、 558、 1 993に記載の、 ォー ト ラ ジオ グ ラ フ ィ ーを行 う こ と によ り 実施 し ¼る。
ピ オ チ ンゃ ジ ゴキ シゲニ ンな どの リ ガ ン ドを有する B e c Aタ ンパク質を検出する には、 F I TC-ア ビ ジ ンな どの よ う な、 検出 可能な標識を有する ア ビジ ンノス ト レブ ト ア ビジ ン、 および、 抗ジゴキ シゲニ ン抗体と結合する こ と によ り実施 し得る。
あ る いは、 前記 2 本鎮標的核酸配列の存在を検出する工程 は、 プローブ ' RecA複合体に、 標識ま たは リ カ ン ドを有する、 ま たは、 有 しない抗 RecA抗体を反応させて検出 し得る。 標識 ま たは リ ガ ン ドを有する抗 BecA抗体を使用する場合は、 標的 核酸配列と結合したプローブ · RecA複合体に含ま れる RecAタ ン パ ク質と、 検出可能な標識ま たは リ ガ ン ドを有する抗 RecA 抗体を反応させた後、 未反応の抗 RecA抗体を除去 してか ら、 前記の標識ま たは リ ガ ン ドの検出方法に準 じて、 RecA夕 ンパ ク質に結合 した標識または リ ガ ン ドを有する抗 RecA抗体を検 出する こ と に よ り、 該標的配列を検出 し得る。
抗 RecAポ リ ク ローナ ル抗体は、 例えば、 松橋らの生物化学 実験法 15 「免疫学実験入門」 な ど、 常法によ り、 容易に調製 し得る。 そ して、 抗 RecAモ ノ ク ロ ー ナ ル抗体は、 例えば、 牧 野らの方法 （Makinoら、 J. Biol. Chem.、 260、 15402、 1985 ) によ り調製 し得る。 検出可能な標識ま たは リ ガ ン ドを有する 抗 RecA抗体の調製は、 前記の検出可能な標識ま たは リ ガ ン ド を有する EecAタ ンパク質の調製法と同様の方法で調製 し得る。
ある いは、 前記 2 本鎮標的核酸配列の存在を検出する工程 は、 抗 RecA抗体および抗 RecA抗体と結合 し得る 2 次抗体を用 いて行われ得る。 該 2 次抗体は、 検出可能な標識または リ ガ ン ドを有 し得,る。 抗 RecA抗体を認識 して結合でき る 2 次抗体 と しては、 例えば、 抗 EecA抗体がマ ウ ス 由来であ る場合は、 抗マ ウ ス I g.G抗体を使用 し得、 抗 RecA抗体がゥ サ ギ由来であ る 場合は、 抗ゥ サ ギ IgG抗体を使用 し得、 抗 RecA抗体がャ ギ由来 であ る場合は、 抗ャギ IgG抗体な どを使用 し得、 通常は、 市販 の標識抗血清 （例えば、 FITC標識抗マ ウ ス IgG抗体や FITC標識 抗ゥ サギ IgG抗体等） を使用 し得る。 こ れら の抗 RecA抗体を認 識して抗 RecA抗体に結合 し得る、 検出可能な標識または リ ガ ン ドを有する 2 次抗体の調製は、 前記の検出可能な標識ま た は リ ガ ン ドを有する RecAタ ンパク質の調製法と同様の方法で 調製 し得る。
ま た、 上記の検出方法を組み合せ、 標識または リ ガ ン ドを - 有する EecAタ ンパク質、 標識ま たは リ ガ ン ドを有する抗 RecA 抗体、 および、 抗 RecA抗体と結合可能な標識ま たは リ ガ ン ド を有する 2 次抗体を組み合わせて使用する こ と によ り、 シ グ ナルを従来法よ り も はるかに強 く 増幅する こ とが可能であ る。 本発明は、 また、 別の局面で、 前記方法を実施する ため の、 検出可能な標識または リ ガ ン ドを有する RecA抗体を含むキ ッ ト を提供する。
本 明はまた、 前記方法を実施するための、 プローブと検 出可能な標識ま たは リ ガ ン ドを有する RecAタ ンパク質とが安 定に結合したプローブ · RecA複合体を含むキ ッ ト を提供する。
本発明は ま た、 前記方法を実施する た めの、 RecAタ ンパ ク 質および検出可能な標識または リ ガ ン ドを有する抗 RecA抗体 を含むキ ッ ト を提供する。
本発明はまた、 前記方法を実施するための、 プローブと Re cA夕 ンパク質とが安定に結合 したプローブ ' RecA複合体、 お よび検出可能な標識ま たは リ ガ ン ドを有する抗 EecA抗体を含 むキ ッ ト を提供する。
本発明によ る キ ッ ト は、 以下の試薬を包含 し得る ： （1)例え ば、 75inM KC1、 酢酸な どを含む 70〜 100%の ア ル コ ール溶液か ら な る、 細胞ま たは細胞構造体固定用試薬 ； （2〉例えば、 0〜 0. % TritonX-100, 0. 1〜： 10 % ス キ ム ミ ル ク、 カ ゼイ ン、 牛血 清アルブ ミ ン、 0〜 5mg/ml牛 ャ リ ア一 DMおよび Zまたは RNA、 0〜 lOmg/mlの標識ま たは リ ガ ン ドを有 しない通常の RecAタ ン パク質な どを含む 10〜 ΙΟΟπιΜト リ ス酢酸緩衝液 （ pH7.5) か ら な る前処理用ブ ロ ッ キ ン グ液 ； （ 3〉例えば、 0 ~ 15mM酢酸マ グ ネ シ ゥ ム、 0〜 50mM酢酸ナ ト リ ウ ム、 0〜： ImMジ チ オ ス レ イ ト一 ル、 0〜： lOOmM EGTA [.エ チ レ ン グ リ コ ー ル一 ビ ス （ 9 — ァ ミ ノ ェ チ ル エ ー テ ル） N, IT , N' -4酢酸] 、 0〜 50mMス ぺル ミ ジ ン な どを含む 10〜 ΙΟΟπιΜ卜 リ ス酢酸緩衝液（pH7.5)か らな る、 細 胞処理液 ； )例えば、 使用時に以下のよ う な組成の反応溶液 を調製するために希釈されるべき濃厚な保存反応溶液 ； 2~ 2 OmM 酢酸マ グ ネ シ ウ ム、 0〜 lOOmM 酢酸ナ ト リ ウ ム、 0.4〜 1 mMジ チ オ ス レ ィ ト ー ル、 0〜 lOOmM EGTA、 0〜： L0%グ リ セ ロ ー ル、 0〜 50πιΜ ス ペル ミ ジ ン、 0.24〜 7. OmM ATPァ Sも し く は GT P y Sを含む、 10〜 lOOmMト リ ス酢酸緩衝液（ρΗ7· 5)。 ； （5)例え ば、 0.1〜 40 g/ 1の RecAタ ンパク 質溶液。 こ こ で、 RecA夕 ンパ ク 質は、 標識ま たは リ ガ ン ドを有 し ま た は有 さ ず、 あ る いは、 標識ま たは リ ガ ン ドを有する RecAタ ンパク質と有さな い EecAタ ンパク質と の混合物である ； （6)例えば、 5〜1.00ng/ μ 1の濃度の 1 本鎖または 2 本鎮のプローブを含むプローブ溶 液。 プ ロ ー ブの例と して各染色体特有の α サ テ ラ イ ト DNA配列 由来、 ガ ン遺伝子配列由来、 ガ ン抑制遗伝子配列由来や ウ イ ル ス遺伝子配列由来のプローブな どが考え られる ； （ 7 )例えば、 約 0.01〜 5ing/inl濃度のサ ケ精子 DNAおよ び/ま たは大腸菌ゃ酵 母由来の tRNAを含む、 キ ヤ リ ァ 一 DNAま たは RNA溶液 ； （8)例え ば、 以下の組成を有する プローブ . RecA複合体溶液 ； 0.5〜 5 OQng/ μ 1の 1 本鑌プローブ、 0· 01〜 200 g/ 1の標識ま たは リ ガ ン ドを有する RecA夕 ンパク 質およ び ま たは通常の RecA タ ン パ ク 質、 2〜 75mM酢酸マ グネ シ ウ ム、 0〜 1. 0M酢酸ナ ト リ ゥ ム、 0· 4〜 5mMジチ オ ス レ ィ ト ー ル、 0〜 1.0M EGTA、 0〜 500 mMス ぺ ノレ ミ ジ ン、 0〜.50% グ リ セ ロ ー ル、 0.24〜 70m.M ATP 7 S ま たは GTP 7 Sを含む 0.01〜 1M ト リ ス酢酸緩衝液（pH7. 5)0 こ の 液は、 あ ら力 じめ 1 本鑌 DNAに、 標識ま たは リ ガ ン ドを有する RecAタ ンパク質および/または通常の RecAタ ンパク質を安定 に結合 したプロー ブ · RecA複合体を含む溶液で、 前記 (4) (5) (6)および必要に応 じて（7)を混合して調製する ； （9)例えば、
10〜 1000 g/mlの濃度の、 檩識または リ ガ ン ドを有する抗 Be cA抗体を含む、 抗 RecA抗体溶液 ； （10)例えば、 0〜 1000 // g/m 1の濃度の、 標識または リ ガ ン ドを有 し、 そ して抗 RecA抗体と 結合 し得る 2 次抗体を含む 2 次抗体溶液 ； （11)希釈 して使用 される濃厚な保存洗浄液 ； （12)例えば、 0.1〜 10% ス キ ム ミ ル ク、 カ ゼイ ン、 牛血清ア ル ブ ミ ン、 4 X SSC ( 20 X SSC： 3M塩ィ匕 ナ ト リ ウ ム、 0. 3Mク ェ ン酸ナ ト リ ウ ム、 ρΗ7· 5を希釈した液） 、 0〜 0. 5%TritonX-100な どを含む， 抗体反応の前処理用ブロ ッ キ ン グ液 ； （13)BecAタ ンパク質または抗 RecA抗体に結合 した リ ガ ン ドゃ酵素等と反応する、 検出可能な リ ボーター シ ス テ ム ； （14)例えば、 lOOmgの P-フ ェ ニ レ ン ジ ア ミ ン ジ ヒ ド ロ ク ロ リ ドを 10mlの PBSに溶解 した後、 pH9の 0. 5M carbonate-bi car bonate bufferで pH8に調製し、 90m 1の グ リ セ ロ ー ルを加えて か ら の フ ィ ル ターで濾過 して得た、 蛍光剤の退色を防 ぐ抗退色試薬溶液。 必要に応 じてプロ ピディ ウ ム ィ ォ ダイ ド
(PI)や 4' , 6-ジ ア ミ デ ィ ノ - 2-フ エ ニ ノレ イ ン ド ー ノレ （DAPI)な ど の力 ゥ ンタ ー染色剤を含有 し得る。
本発明は、 ま た、 別の局面で、 前記の方法に使用 し得る、 標識ま たは リ ガン ドを有する RecAタ ンパク質を提供する。 該
RecAタ ン ノ、' ク質は、 好ま し く は、 フ ル ォ レ セ イ ン イ ソ チ オ シ ァ ネ ー ト、 Cy3T"、 Cy5™¾どのカ ノレ ポ キ シ メ チ ノレ イ ン ド シ ァ ニ ン サ ク シ 二 ミ ジ ル エ ス テ ル、 ローダ ミ ン、 テ キ サ ス レ ッ ド ( ス ル フ ォ ロ ーダ ミ ン） 、 テ ト ラ メ チ ルロー ダ ミ ン イ ソ チ ォ シ ァ ネ ー ト、 および、 7-ァ ミ ノ - 4-メ チ ル ク マ リ ン -3—酢酸カ らな る群から選択される蛍光剤を、 EecAタ ンパク質モ ノ マ ー あた り 1〜 6分子を含み、 または、 ア ル カ リ ホ ス フ ァ タ ーゼ、 ペ ルォキ シダ一ゼまたは 9 — ガラ ク ト シダーゼか らな る群か ら選択される酵素標識を、 RecAタ ンパク質モ ノ マ 一あた り 1〜 3分子含み、 または、 ピオチ ン、 ジゴキ シゲニ ン の群か ら選択 される リ ガ ン ドを、 RecA夕 ンパク質モ ノ マ ーあた り 1〜 6分子 含む。
本発明によ り、 染色体中の、 特定の遺伝子やその調節領域 の位置や、 ゥ ィ ル ス由来の核酸配列の存在を シ グナ ル増幅な しで高感度にかつ簡便に測定ま たは視覚化 し得る、 診断上重 要な方法が提供される。
本発明によ り、 p53のよ う なガ ン抑制遗伝子等の単一コ ピー 遺伝子を、 高感度で簡便に検出でき る。 さ ら に、 本発明の方 法は、 Kal 1 ioniemi. A. ら に よ っ て開発された CGH法 ( compara tive genomichybridization 法) ( a 1 I i on i era i , A. ら、 Scien ce、 258、 818、 1992 ) に も適用 し得る。
本発明の方法は、 以下の遺伝子および配列を標的と し得る ： (1)特定の有用な遺伝子産物を コー ドする遺伝子 ； （2)例え ば、 リ ボゾー ム遺伝子、 ガ ン遺伝子、 ガ ン抑制遺伝子な ど、 重要な細胞制御機能を果た している遺伝子 ； （3)反復配列 およびそれに関連する配列 ； （4)活性遺伝子産物の発現を阻害 する遺伝子の欠陥 ； （5〉既知の遺伝子マ ッ プ位置にある マーカ 一プロ ーブ領域と関連する遠伝子ま たは配列 ； （6) B型肝炎ゥ ィ ルス な どの、 ク ロ マチ ン に組み込ま れたウ ィ ルス遺伝子配 列およびゥ ィ ルス粒子中のゥ ィ ルス遺伝子 §2列。
さ らに、 本発明の方法は、 染色体の倍数性の変化や欠失、 挿入、 転座、 逆位、 重複や増幅等の多様な染色体異常の検出 に使用 し得る。 例えば、 特定の領域に相補的なプローブと FI TC標識を有する RecAタ ンパク 質とを安定に結合させたプロ一 ブ · RecA複合体、 および、 別の領域に栢補的なブロ ーブと TR ITC標識と を有する RecA夕 ンパク質を安定に結合 したプローブ • RecA複合体を用いて、 同時にハイ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン反応 を行う こ と によ り、 それぞれの領域を蛍光顕微鏡を用いて適 切な励起波長で検出 し得る。 即ち、 2 種類の識別可能な蛍光 シ グナ ルの位置から、 染色体中の 2 つの異な る遺伝子領域の 相対的な方向と距離を判定する こ と に よ っ て遗伝子異常を検 出 し得る。
あ る いは、 本発明の方法は、 倍数性の変化や多様な遺伝子 異常、 または生物、 器官、 組織および細胞中の ウ ィ ル ス、 細 菌および寄生性病原体を高感度に検出 し得、 種々 の診断に利 用 し得る。 感染 した ウ ィ ルス等の核酸の局在は、 蛍光顕微鏡 で検出 し得、 あ るいは、 FACS (f luorescence activated cell sorter)な どによ り短時間で感染細胞を測定し得、 感染の レ ベルや検体細胞中に占める感染細胞の割台な どを検出 し得る。 従っ て、 例えば本方法を用いて感染細胞の減少を測定する こ と によ り、 抗ウ ィ ルス剤療法の経過を評価し得る。
本発明によ れば、 検出可能な標識ま たは リ ガ ン ドを含ま な いプロ ーブを用いて、 標的核酸配列が変性しない条件で、 ハ イ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ンを行う ので、 標識または リ ガン ドによ る前記ハイ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ン反応の妨害がな く、 ま た、 1分 子あた り、 1〜 6分子の標識または リ ガ ン ドを有する RecA夕 ン パク質が、 最大約 3塩基に 1分子程度の割合でプロ ーブに結合 し得る ので、 プローブそのものに直接標識ま たは リ ガン ドを 導入する場合よ り も数倍〜数 100倍の標識ま たは リ ガ ン ドをプ ローブに付加でき る こ と にな り、 標的核酸配列あた り、 従来 法よ り もはるかに強い シ グナ ルが得 られる。 ま た、 こ の RecA タ ンパ ク 質を検出するので、 コ ピー数の少ない標的配列を極 めて高感度に特異性高 く 検出でき る。
(以下余白） 実施例
本発明を説明するために以下に実施例を示す。 こ れ ら の実 施例は、 本発明の例示であ り、 本発明を限定する ものではな い。
' 実施例 1
蛍光剤を有する RecA夕 ンパク質の調製 RecAタ ンパク質と して、 市販されている大腸菌由来の Rec A タ ンパ ク 質 （ フ ア ルマ シア社製） 、 ま たは、 通常の大腸菌か ら Zarlingらの方法 （W0 93/05177) によ り精製 した RecAタ ン パク質を使用 した。 使用された RecAタ ンパク 質の分子量、 1 本鎮 DNA依存 ATPase活性、 DNase活性、 strand transfer能ゃダ ブル D ループ形成能は、 すべて公知の方法 （W0 93/05177 ;Se na, E. P. ら、 Nature Genetics^ 3、 365、 19S3： Shibata. T. ら、 Methods in Enzyraology、 100、 197、 1983等） であ ら；^ じめ ij 定 した。
Cy3TKも し く は Cy5T>tは、 それぞれ B I OL0G I CAL DETECTION S YSTEMS. INC.社製の Fluorolink-AbTK Cy3™ Labeling Kitま た は Fluorol ink-AbTM Cy5™ Label ing Kitを用いて RecAタ ン ノ■« ク質に結合させた。
即ち、 まず、 100 1カ ッ プ リ ングバッ フ ァ ー （1M sodium c arbonate buffer. pH 9.3)の人っ た '、'ィ ァノレ （こ、 1 ml ® pH7. Z に調整 した リ ン酸緩衝溶液（PBS)に溶解 した RecA夕 ンパク 質 1 mgを加えて混台 した。 こ の混合液を、 Cy3T "ま たは Cy5TMの入 つ たバイ ア ル （lmgタ ンパク質反応用色素、 1バイ ア ル）に移 し て混合 し、 室温で 30分間反応させた。 得 られた反応液をキ ッ 卜 に含まれているゲル濾過カ ラ ムにアプラ イ し、 キ ッ 卜 に付 属の溶出バッ フ ァ ー （PBS、 pH7. 2)を用いて溶出する こ と に よ り、 RecAと結合 しなか っ た遊離の Cy3TMも し く は Cy5T "と、 Cy
3TMま たは Cy5TMと結合 した RecAタ ンパク質を含む画分と を分 離 した。
こ のよ う に して得 られた Cy3TMまたは Cy5TMと結合した RecA タ ンパク質を含む溶液の、 波長 280nm、 552 nmま たは 652 n にお け る吸光度値 A 280、 A 552 ( Cy3TMの場合） 、 ま たは A 652 (Cy 5 TMの場合）から計算した結果、 得られた Cy3TMまたは Cy5TMを 有する RecA夕 ン ノ、'ク質には、 RecA夕 ン ノ、 'ク質モ ノ マ 一あた り、 それぞれ Cy3TMまた Cy5TMが 1〜 2分子結合している こ とが判 明 した（反応に用いる RecAタ ンパク質の量を、 lmgタ ンパク質 反応用色素 1 バイ アルあた り、 0. 3〜 2. Omgに変化させる こ と によ り、 RecAタ ンパク質モ ノ マ ーあた り Cy3TMま たは Cy5T "が 1〜 6分子結合 したものを、 必要に応じて随時調製する こ とが でき る）。
F ITCは以下のよ う に して RecAタ ンパク質に結合させた。 即 ち、 RecAタ ンノ、。ク質 1 mgを含む 1 mlの pH7. 2に調整 した PBSを、
100 1の力 ッ プ リ ン グノ、' ッ フ ァ 一の入ったバイ ア ルに加えて 混合 した。 こ の混台液を 20 gの FITC(RecAタ ンパ ク質重量の 1/50) の入っ たバイ ア ルに移 して混合 し、 室温で 20分間反応 さ せた。 得られた反応液をセ フ ア デ ッ ク ス G- 25カ ラ ム （ フ ァ ルマ シ ア製） にアブラ イ し、 溶出パ ッ フ ァ ー （PBS、 pH7.2)を 用いて溶出する こ と によ り、 RecA夕 ンパク質と結合 し なか つ た遊離の FITCと、 FITCが結合 した RecAタ ンパク 質を含む画分 と に分離 した。 得られた F【TCが結合 した RecAタ ンパク 質を含 む溶液の、 波長 280nmおよび 495nmにおける吸光度値 A 280と A
4S5か ら計算 して、 得られた FITCを有する RecAタ ンパク質は、 BecA夕 ンパク質モ ノ マ ーあた り FITCが 1~ 2分子結合 している こ とが判明 した（反応に用いる FITCの量を、 RecAタ ンパク 質 1 mgあた り、 10〜 80 gに変化させ る こ と によ り、 BecAタ ンパク 質モ ノ マ ーあた り FITCが 1〜6分子結合 した も のを、 必要に応 じて随時調製する こ とができ る）。
TRITCは上記の FITCと同様の方法で RecA夕 ンパク質に結合さ せた。 即ち、 lingの RecAタ ンパク質を、 40 gの TR I TCと反応さ せて TRITCを有する RecAタ ンパク 質を得た。 上記同様 TRITCが 結合 した RecA夕 ン パク質を含む溶液の吸光度値を測定 した と こ ろ、 得 られた TRITCを有する RecAタ ンパク質には、 RecAタ ン パク質モ ノ マ ーあた り TRITCが 1〜 2分子結合 してい る こ とが判 明した（反応に用いる TRITCの量を、 RecAタ ンパク質 lmgあた り、 20〜 200 gに変ィ匕させる こ と によ り、 RecA夕 ン ノ ク質モ ノ マ —あた り TRITCが 1 〜 6分子結合 した ものを、 必要に応 じて随 時調製する こ とができ る）。 実施例 2
蛍光剤を有する抗 RecA抗体の調製 抗 RecA抗体は、 公知の方法、 例えば、 生物化学実験法 15 免 疫学実験入門、 学会出版セ ン タ ーに記載の方法で調製 した。 即ち、 まず、 RecAタ ンパク質を腹腔内に反復注射 したマ ウ ス ( 1 回につ き 100〜 200 / g RecA/ 1 匹）か ら抗 RecA抗体を含む抗 血清を得た。 得られ 抗血清を pH7.2の 0.01M PBSに対 して一 晚透析 した。 透析した抗血清を DEAE-セ ル ロ ー ス カ ラ ム にアブ ラ イ し、 pH7.2の 0.01M PBSで溶出 して抗 RecA抗体（IgG分画）を 含む溶液を得た。 得られた抗 RecA抗体を含む溶液を濃縮 して 約 1 mg/mlの抗 RecA抗体を含む液を得た。 こ の濃縮液に、 1/1 0容量のカ ッ プ リ ン グバッ フ ァ ーを加えた。 得 られた溶液に、 夕 ン ノ、。ク 質の 1/100重量の、 FITCをカ ッ プ リ ン グバ ッ フ ァ ー に 溶解して添加 し、 7〜 Cで 6時間反応させた。 得られた反応液 を、 セ フ ア デッ ク ス G-25カ ラ ム （ フ ァ ノレ マ シ ア社製） にァプ ラ イ し、 溶出バ ッ フ ァ 一 (0.01M PBS、 pH7.2) を用いて溶出 する こ と によ り、 抗 RecA抗体と結合 しなかっ た遊離の FITCと、 FITCと結合 した抗 RecA抗体を含む画分と を分離 した。
得られた FITCが結合 した抗 RecA抗体を含む溶液の、 波長 28 0 nmおよび 495 nmにおける吸光度値 A 280および A 495か ら計算 して、 FITCを有する抗 RecA抗体は、 RecAタ ンパ ク 質モ ノ マー あた り 丁(：が3〜4分子結合し ている こ と が判明 し た。
上記と同様に、 抗 RecA抗体量の 1/40重量の TRITCを用いて得 た、 TRITCを有する抗 RecA抗体は、 R e c Aタ ンパ ク 質モ ノ マ 一あ た り、 2〜 3分子の TRITCが結合 している こ とが判明 した。
また、 実施例 1 と同様の方法で、 BIOLOGICAL DETECTION S YSTEMS. IN 社製の Fluoronnk-AbTK Cy3™ Labeling Kitま た は Fluorol ink-AbTM Cy5™ Labeling Kitを用いて、 Cy3TKも し く は Cy5TMを抗 RecA抗体に結合 した。 上 Ϊ己のよ う に 1 mg/mlに 調製 した抗 RecA抗体溶液の 1 mlを使用 して、 得 られた Cy3TMま たは Cy5TMを有する抗 RecA抗体は、 BecAタ ンパク 質モ ノ マーあ た り、 Cy3T "ま たは Cy'5T "がそれぞれ 4~ 5分子結合 している こ とが判明 した。 実施例 3
Cy3TMが結合 した BecAタ ンパク質を用いたィ ン シチ ュ ノ、イ ブ リ ダイ ゼー シ ョ ン法によ る 1 番染色体サテ ラ イ ト I I I配列の検出 (1)ハ イ ブ リ ダィ ゼー シ s ン反応溶液の調製
ヒ ト の 1 番染色体サ テ ラ イ ト III配列を含むブラ ス ミ ド pUC 1.77 ( Cooke, Η· J. ら、 Nucleic Acids Res.、 6、 3177、 1979 ) を、 Μο-14-dATP (Gibco-B R L 社製〉 存在下で、 BRL社製の ニ ッ ク ト ラ ン ス レー シ ョ ンキ ッ ト を使用 して ピオ チ ン ラ ベル する こ と によ り、 1 番染色体サ テ ラ イ ト 11 I配列を含む ビォ チ ン化 DNAブローブを調製 した。 得 られた ビォ チ ン化 DNAプロ一 ブ溶液に 1/10量の 3 M酢酸ナ ト リ ウ ムを加えた後、 2 倍量の冷 エ タ ノ ールを加えて ピオ チ ン化 DNAプローブを沈殿させて回収 した後、 ト リ ス塩酸 EDTA緩衝液 ( 0. lniM EDTAを含む PH7.5の 1 OmMト リ ス塩酸〉 に懸濁 した。
得 られた懸濁液を、 滅菌水ま たは ト リ ス塩酸 EDTA緩衝液で 希釈 し、 0.6nl容量のマ イ ク 口遠心チ ュ ーブに入れて沸腾水中 で 5 分間加熱処理する こ と に よ り、 ビォ チ ン化 DNAプロ ー ブを 変性 した。 チ ュ ーブを氷水中に移 して急冷 した後、 1 / 1の 1 0 X RecA反応溶液 （ 20mM酢酸マ グネ シ ゥ ム、 500 mM酢酸ナ ト リ ゥ ム、 lOmMジチ オ ス レ ィ ト ール、 ImM EGTA (エ チ レ ン グ リ コ —ル一 ビス （ ー ア ミ ノ エチ ルェ一テル） Ν,Ν,Ν' , Ν· -4酢酸） 、 および 50%グ リ セ 口 」 ルを含む ρΗ7.5の lOOraMト リ ス酢酸緩衝 液） 、 1〃 1の ATPブ S溶液または GTPァ S溶液 （各 48.6mM濃度） 、 4 ; gの RecAタ ンパク 質、 およ び、 2 gの実施例 1 で得 ら れた Cy3TMを有する RecAタ ンパク質か らな る溶液を含む、 0.6ral容 量のマイ ク ロ遠心チ ュ ーブに、 上 己のよ う に して得た 5Qngの 変性ビォ チ ン化 DNAプローブを含む溶液を加え、 全量が 10 1 になる よ う に弒菌水で希釈 し、 37°Cで 15分間反応させた。 その後、 ピ才 チ ン化 DNAプロ ーブと同様に変性 して得た 40 g/mlのサケ精子 DNA溶液の 1/z 1を加え、 さ らに 37 °Cで 10分間反 応させた。 得られた反応液に、 1 Iの lOOraM酢酸マ グネ シ ウ ム 溶液を加えてよ く 混合 し、 ハイ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン反応溶液 を得た。
(2)HEp-2細胞核の調製
ヒ ト喉頭ガ ン由来の HEp-2細胞 （ATCC CCL23) を、 常法によ り、 10%牛胎児血清、 ピル ビ ン酸ナ ト リ ウ ム、 および抗生物質 (ペ ニ シ リ ン、 ス ト レ プ ト マ イ シ ン）を添加した MEM培地 (Gibe o-BRL社製）で培養した。 得られた HEp- 2細胞を ト リ プシ ン- ED TA処理 し、 処理された細胞を低速遠心分離で集めて、 37°Cの 温浴中で 75mMの KC1溶液に徐々 に懸濁 し、 経時的に顕微鏡で確 認 しながら、 5〜20分間保温 し、 適度に核を膨張させた。 そ の 後、 氷冷したメ タ ノ ール ： 酢酸（3 : 1)混合液を加えて、 0〜 4°C で遠心分離 した。 上清を除去 してか ら、 さ ら に氷冷したメ タ ノ 一 ル ： 酢酸（3： 1)混合液を加えてゆる やかに混合 した後遠心 分離 した。 こ の操作を約 8回繰 り返す こ と に よ り細 質を除去 して核を固定 した。
得られた核を、 氷冷 したメ タ ノ ー ル ： 酢酸（3 : 1)混合液に再 懸濁 し、 約 1〜 2 Χ 10β核/ ml濃度の懸濁液を得た。 得られた懸 濁液を 10 /z 1ずつス ラ イ ドガラ ス に滴下 した。 滴下 した懸濁液 を風乾 した後、 室温〜― 80 °Cで保存 した。
(3)未変性の標的核酸配列と のハイ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン反応と 検出
上記（2)のよ う に調製 したス ラ ィ ドガラ ス上の標的核酸配列 を含む試料に、 0. 5〃 g/mlの protenaseK溶液（ベー リ ンガーマ ンハ イ ム社製、 PBSに溶解した も の） 100/2 1を添加 し、 こ の上 にパ ラ フ ィ ルム を被せて 37。Cで 3分間処理 し た。 proteinaseK 溶液を除去 してから、 PN(0.5¾Nonidet P-40を含む pH8.0の 0. 1Mリ ン酸緩衝液）で洗浄 した。 次.に、 100 1の前処理用ブロ ッ キ ン グ液（5%ス キム ミ ル ク、 0. TritonX-100、 0.02%ア ジ化 ナ ト リ ウ ムを含む、 ρΗ7· 5の 10mM ト リ ス酢酸緩衝液）を添加 し た後、 パラ フ ィ ルム を被せて室温〜 37。Cで 20〜 60分間処理す る こ と によ り試料を プ ロ ッ キ ン グ し た。 前処理用プロ ッ 丰 ン グ液を除去 した後、 pH7. 5の 10mMト リ ス酢酸緩衝液で軽 く 洗浄 し、 上記（ 1 )で調製した 10 1のハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン反応 溶液を試料の上に添加 した。
次いで、 気泡が入らないよ う に注意 してカ バ一ガラ ス を被 せ、 湿気を含んだ密閉容器に入れて 37。Cのィ ン キ ュ ベー夕一 中で 2時間反応させた。 得られた反応試料を、 37。Cに保温 した 1. 75 X SSC(20 X SSC :.3M塩化ナ ト リ ウ ム、 0. 3Mク エ ^ ^酸ナ ト リ ゥ ム、 pH7. 5を希釈 して調製 した）を用いて、 10分間ずつ 3回洗 浄 した。 次に反応試料を含むス ラ イ ドガラ スをブロ ッ キ ング 液（4xSSC、 0. l¾TritonX-100, 5¾ス キ ム ミ ル ク、 0.02%ア ジ化 ナ ト リ ウ ム）に浸 して室温で 20分間反応する こ と によ り、 試料 をブロ ッ キ ングした。 次に、 5 / g/mlの FITCア ビ ジ ン （Vector 社製、 DCSグ レー ド、 カ タ ロ グ番号 ： A-2011、 ロ ッ ト番号 ： C 0527、 F/P値 ： 4.6)を含むブ ロ ッ キ ン グ液（4X SSC、 0. 1% Tri tonX-100 5% ス キ ム ミ ルク、 0.02%ア ジ化ナ ト リ ゥ ム） に浸 し、 室温で 20分間反応させ、 標的核酸配列が結合 したプロ一 ブ · RecA複合体中に含まれる ビォ チ ン化プローブに FITCァ ビ ジ ンを結合さ せた。 その後、 ス ラ イ ド ガ ラ ス を、 4X SSC、 0. l¾TritonX-100を含む 4 x SSC、 および 4 x SSCの順に室温で各 1 0分間ずつ洗浄 した。
さ ら に、 滅菌水で軽 く 洗浄 した後、 抗退色試薬（lOOmgの P- フ ヱ ニ レ ン ジア ミ ン ジ ヒ ド ロ ク ロ リ ドを 10mlの PBSに溶解 した 後、 pH900.5Mcarbonate-bi carbonate bufferで pH8に調製 し、 90mlの グ リ セ ロ ールを加えて；^ ら 0. 22/z mの フ ィ ノレタ ーで澳過 した液。 必要に応じてプロ ビデ ィ ゥ ム ィ ォダイ ド 1)ゃ4' , 6 -ジァ ミ デ ィ ノ - 2-フ エ 二 ルイ ン ドー ル （DAPI)等のカ ウ ン タ ー 染色剤を添加する） を 1滴添加 してカ バーガラ ス を被せた。
こ の試料をまず G励起フ ィ ル タ ー （BP- 545 ) と補助励起フ ィ - ル夕 一 E0530を組み合わせたォ リ ン パ ス社製の蛍光顕微鏡で観 察 し、 Cy3TMが結合 した RecAタ ンパク質由来の Cy3TMの シグナ ルを検出 した。 次に IB励起フ ィ ル夕 一 （BP-495 ) と補助吸収フ ィ ルタ ー （G520)を組み台わせて、 標的核酸配列 · プロ ーブと の複合体中に含まれる ビォチ ン化プロ ーブ由来の F1TCの シ グ ナ ルを検出 した。 こ の結果、 Cy3TMの シ グナ ルの方が FITCの シ グナ ルよ り強 く、 かつ Cy3TMの シ グナ ル と F1TCの シ グナ ルが全 く 同 じ位置に重な っている こ とが判明 した。 この こ と力 ら、 得られた標的核酸 . プローブ複合体中に RecA夕 ンパク質が除 去されずにそのま ま残っ ている こ とが確認できた と同時に、 Cy3TMが結合 した RecAタ ンパク質を用いて標的核酸 · ブロ ーブ 複合体を 2時間以内に効率よ く 形成させる こ と がで き、 こ の標 的核酸 · プローブ複合体中に含まれる Cy 3 τ "が結台 した RecA夕 ン ノ、。ク質を検出する こ と によ り、 ハイ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン反 応 ， 洗浄後の染色工程な しに、 標的核酸配列であ る 1 番染色 体サテ ラ イ ト Π Ι配列の存在を、 Zarling の方法よ り も よ り 高感度によ り簡便にかつ同程度の特異性で検出でき る こ と力 ί 実証できた。 尚、 コ フ ァ ク タ 一 と して ΑΤΡ7 Sを用いた場合 も、 GTP 7 Sを用いた場合も結果に差はなかっ た。 実施例 4
FITCが結合 した RecA夕 ンパク質を用いたィ ン シ チ ュ ハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン法によ る 1 番染色体サ テ ラ イ ト Π I配列の検出 ( 1 )ハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン反応溶液の調製
1 番染色体サ テ ラ イ ト i l l配列を含むブ ラ ス ミ ド pUC1. 77 (C ooke. H. J. ら、 Nucleic Acids Res.、 6、 3177、 1979 )力 ら、 d NTP (dATP、 dTTP> dGTP、 dCTP)存在下で BRL社製のニ ッ ク ト ラ ン ス レ ー ン ヨ ン キ ッ ト'を使用 し て、 1番染色体サ テ ラ イ ト I I I 配列を含む DNAプローブを調製 した。 得 られた DNAプローブは 標識および リ ガ ン ドを含んでいない。 得られた DNAプロ ーブ溶 液に 1/10容量の 3M酢酸ナ ト リ ウ ム溶液を添加 した後、 2倍量の 冷エ タ ノ ー ルを加えて DNAプロ ーブを沈殿させて回収 し、 0. 1 ni EDTAを含む ρΗ7. 5の ΙΟιηΜト リ ス塩酸緩衝液に懸阓 した。 こ の懸濁液を同一組成の ト リ ス塩酸緩衝液または滅菌水で 希釈 し、 0.6ml容量のマ イ ク 口遠心チ ユ ーブに入れて沸縢水中 で 5 分間加熱処理してプローブを変性した後、 チ ュ ーブを氷 水中に移して急冷した。 1 1の 10X RecA反応溶液 （ 20mM酢酸 マ グ ネ シ ウ ム、 500πιΜ酢酸ナ ト リ ウ ム、 lOmMジ チ オ ス レ ィ ト ー ル、 ImM EGTA、 50 %グ リ セロ ー ルを含む pH7.5の lOOmMト リ ス 酢酸緩衝液） 、 1/1 1の ATP 7 S溶液ま た は GTP 7 S溶液（48.6mM濃 度の保存溶液）（ある いは、 rATP、 dATP、 ATP 7 Sな どと ADPの混 合物を用いて も よい）、 1· 6〃 gの RecAタ ンパク質、 および、 実 施例 1 で得られた0.8 8の？1丁(：が結合 した 0 タ ンパク 質か らな る溶液を含む、 0.6ral容量のマイ ク ロ遠心チ ュ ー ブに、 上 記のよ う に し て得た 20ngの変性 DNAブローブを含む溶液を加え、 全量が 10 1になる よ う に滅菌水で希釈 し、 37 で 15分間反応 さ せた。
その後、 DNAプローブと同様に変性 して得た 40 g/ralのサケ 精子 DNA溶液の 1/z 1を加え、 さ ら に 37°Cで 10分間反応させた。 得られた反応液に、 1// 1の lOOmM酢酸マ グネ シ ゥ ム溶液を加え てよ く 混合 し、 ハイ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ン反応溶液を得た。
(2) HEp-2細胞核の調製
実施例 3 (2)に記載 した方法と同様の方法で調製 した。
(3)未変性の標的核酸と のハイ ブ リ ダイ ゼー シ ョ ン反応および 検 UJ
実施例 3 (3)に記載した方法と同様の方法で、 上記（1)で調 製 したハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン反応溶液およ び上記（ 2 )で調製 したス ラ イ ドガラ ス上の試料を反応させて、 1.75xSSC、 0.1¾ TritonX-100を含む 1· 75xSSC、 1.75 xSS Cの順で各 10分間ずつ 3 7'Cで洗浄 した。 次に缄菌水で軽 く 洗浄 した後、 前記抗退色試 薬（PIを含む）を 1滴添加 して標的核酸配列に結合 したプローブ • RecA複合体中の RecAタ ンバク踅に結合 した FI TCシグナルを、 IB励起フ ィ ル タ ー （BP-495)を取り付けたォ リ ン パ ス社製の蛍 光顕微鏡で検出 した。
この結果よ り、 20ngのプロ ーブと FITCが結合 した RecA夕 ン パク質を用いて、 2時間以内に樣的核酸 . プローブ複合体を効 率よ く 形成させる こ とができ、 該標的核酸 . プローブ複合体 中に含まれる FITCを有する RecA夕 ンパク質を検出する こ と に よ り、 ハイ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン反応 . 洗浄後の染色工程な し に、 標的核酸配列の存在を、 カ ウ ン タ ー染色を施 した埸合も、 通常の蛍光顕微鏡で容易に検出でき る こ とが判明 した。 これ によ っ て本方法を用いる こ と によ り、 Zarlingら の方法に比べ よ り高感度によ り簡便に標的核酸配列の存在を検出でき る こ とが実証できた。 尚、 コ フ ァ ク タ 一 と して ATP 7 Sを用いた場 合 も、 GTP 7 Sを用いた場合も結果に差はなかった。 実施例 5
F I TCを有する RecA夕 ンパク質を用いたィ ン シチ ュ ハイ プ リ ダ ィ ゼ一 シ ョ ン法によ る ガ ン抑制遺伝子 p 53の検出
( 1 )ハ イ ブ リ ダィ ゼ一 シ ヨ ン反応溶液の調製
ガン抑制遗伝子 p53の cDNAか ら調製 した ON CO R社製の ビォ チ ン化プローブ（0NC0B社製、 カ タ ロ グ番号 ： M710-BI0、 ロ ッ ト 番号 ： 3C11 20ngを使用 して、 実施例 4 (1)に記載の方法と同 様の方法でハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン反応溶液を調製した。
(2)HEp-2細胞核の調製
実施例 3 (2)に記載の方法と同様の方法で HEp-2細胞核を調 製 した。
( 3 )未変性の標的核酸と のハイ ブ リ ダイ ゼ一 シ ョ ン反応および 検 lii
実施例 4 (3)に記載の方法と同様の方法で、 未変性の標的核 酸とのハイ ブ リ ダィ ゼ一 シ ョ ン反応および検出を行った。 20 ngの p53プ ロ ー ブと FITCを有する RecAタ ンパク質を用いて、 2 時間以内に標的核酸 · プローブ複合体を効率よ く 形成させ る こ と がで き、 該標的核酸 · プローブ複合体中に含まれる FITC が結合 した RecA夕 ンパク質を検出する こ と によ り、 ハ イ ブ リ ダイ ゼー シ ヨ ン反応 ， 洗浄後の染色工程な し に、 標的核酸配 列 （単一コ ビー であ る p53遺伝子配列） の存在を、 カ ウ ン タ ー 染色を施 した場合も、 通常の蛍光顕微鏡で容易に検出でき る こ とが判明 した。
(4)Zarlingらの方法によ る検出
p53の cDNAか ら調製した 50ngの 0NC0R社製の ビォチ ン化ブ口 ーブ、 6〃 gの RecAタ ンノ、'ク質、 および、 20ngの ピオチ ンィ匕プ ロ ーブ、 2.4 gRecAタ ンパク質を使用 して、 Zarlingら によ る W0 93/05177の実施例 2 に開示される方法に従って、 プロ ーブ 複合体を調製 した。 こ の複合体を、 実施例 3 (2)に記載の方法 と同様の方法で調製 した試料に添加 して、 Zarlingらによ る W 0 93/05177の実施例 3 Bに記載の方法と同様の方法で 2時間 ハ イ ブ リ ダィ ズ し、 次いで洗浄を行っ た。 ただ し、 ハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン反応の前に lOmMト リ ス酢酸緩衝液 （pH7.5) 中 で 60で、 45分間の前処理を行っ た。 前処理用ブロ ッ キ ン グ液 によ る ブロ ッ キ ング処理は行わなかっ た。
次いで、 上記実施例 3 (3)に記載の方法で、 標的核酸配列 - プローブ複合体中に含ま れる ビォチ ンィ匕プロ ーブに FITCァ ビ ジ ン （Vector社製、 DCSグレー ド、 カ タ ロ グ番号 ： A- 2011、 π ッ ト 番号 ： CO 527、 F/P値 ： 4.6) を結合させ、 IB励起フ ィ ル夕 一 （BP-495)を取り付けたオ リ ン パ ス社製の蛍光顕微鏡で観察 し、 ビォチ ン化ブロ ー ブ由来の FITCの シ グナ ルを検出 した。
50ngの ビォチ ン化 p53プローブを使用 した場合は、 力 ゥ ン 夕 ー 染色 しなければ、 非常に弱いながら も一応通常の蛍光顕微鏡 で シ グナ ルを検出でき たが、 カ ウ ン タ ー染色 した場合は ビォ チ ン化 p53プロ ーブ由来の F I TCの シ グナ ルを全 く 検出できなか つ た 0
また 20ngの ピ オ チ ン化 p53プロ ーブを使用 した場合には、 力 ゥ ン夕 ー染色 しない場合において も ビォチ ン化 p53プロ ーブ由 来の F I TCの シグナルを全 く 検出でき なかった。 こ の結果は、 本発明によ る方法が、 Zar lingらの方法に比べよ り高感度によ り簡便に、 単一コ ピーである p53遺伝子を検出でき る こ と を示 す。 尚、 コ フ ァ ク タ 一 と して ATPァ Sを用いた場合も、 GTP 7 S を用いた場合も結果に差はなかった。 実施例 6
FITCを有する RecAタ ンパク質を用いたィ ン シ チ ュ ハイ プ リ ダ ィ ゼー シ ョ ン法によ る メ タ ノ ー ル固定 した肝臓ガ ン由来細胞 懸濁液中の HBV核酸配列の検出
(1)ハイ ブ リ ダィ ゼ一 シ ヨ ン反応溶液の調製
全 HBV( B型肝炎 ゥ ィ ル ス ）DNA配列を含むプ ラ ス ミ ド pAM6 (ATCC 45020 ) を、 dNTP存在下で BRL社製のニ ッ ク ト ラ ン ス レ ー シ ヨ ンキ ッ ト を使用 して断片化する こ と に よ り、 HBV配列を 含む DNAプローブを調製 した。 こ の DNAプローブは、 検出可能 な標識や リ ガ ン ドを有 していない。 こ のよ う に して調製 した 20ngの HBVプロ ーブを使用 して、 実施例 4 (1)に記載の方法と 同様の方法でハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン反応溶液を調製 した。 (2)固定した肝臓ガ ン由来細胞懸濁液の調製
肝臓ガン由来で、 HBV核酸配列の一部が染色体に組み込まれ ている こ とが知 られている " Alexander" 細胞（ATCC CEL8024) を、 HEp-2細胞と同様に して培養 し、 遠心分離によ って細胞を 集め PBSで洗浄 した。 遠心分離 して PBSを除去 した後、 沈殿 し た細胞を、 100%冷メ'夕 ノ ール（または、 70%エ タ ノ ール等の 適当な固定液）を加えて固定した。 細胞濃度が 2 X 10 '個/ πι 1に なる よ う に調製 して一 20°Cで保存 した。 対照と して、 HEp-2钿 胞の懸濁液を同様の方法で固定 して調製 した。
(3)細胞懸濁液中での未変性の標的核酸とのハイ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ン反応と検出
上記（2)で調製した、 約 I X 10β個の細胞を含む細胞懸濁液を、 0.6 m 1容量のマ イ ク 口遠心チ ュ ーブに分取し、 0〜 4てで遠心分 離 して上清を除去した。 沈殺と して集め られた細胞を風乾し た後、 の前処理用ブロ ッ キ ン グ液を加えて細胞を懸濁 し、 室温〜 37'Cで 20〜 30分間保持する こ と によ り ブロ ッ キ ン グ した。 こ の液を遠心分離して前処理用ブロ ッ キ ン グ液を除 去 し、 次いで、 PH7.5の 10mMト リ ス酢酸緩衝液で細胞を洗浄 し た。 上記（1)で調製 したハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン反応溶液
1を钿胞に添加 して懸濁 した後、 37'Cの温浴中で 2 時間反応さ せた。
得られた反応液を遠心分離 して上清を除去 した。 次いで、 37°C に保温 した 1.75 X SSCを 200 1加えて細胞を懸濁後、 37°C の温浴中で 5 分間保温 し、. その後、 遠心分離 して上淸を除去 した。 0. l%TritonX-100を含む 1.75xSSC、 1.75xSSCの順でさ ら に 2 回洗浄 した。 そ して 30 1の抗退色試薬（P1等の力 ゥ ン 夕 一染色剤は含ま ない）を加えて細胞を懸濁 し、 こ の う ち 2;z lを ス ラ イ ドガラ ス に滴下 し、 カ バーガラ ス を被せて 1 B励起フ ィ ル タ ー （BP-495 )を取り付けたォ リ ン パ ス社製の蛍光顕微鏡で FITCシ グナ ルを観察 した。 そ の結果、 Alexander細胞か ら は、 ハイ ブ リ ダィ ゼ一 シ ョ ン反応 · 洗浄後の染色工程な しに、 F I TCの シ グナ ルを検出でき たが、 HEp-2細胞か ら は全 く シ グナ ル は検出されなかつた。
こ の結果か ら、 細胞懸蜀液を使用 した場合でも、 本方法に よ り高感度によ り簡便に特異性高 く 標的核酸配列の存在を検 出でき る こ とが実証された。 尚、 コ フ ァ ク タ 一 と して ATP7 S を用いた場合も、 GTP 7 Sを用いた場合も結果に差はなかっ た。 実施例 7
FITCを有する RecAタ ンパク質を用いたィ ン シ チ ュ ハイ ブ リ ダ ィ ゼー シ ヨ ン法によ る中期細胞由来の染色体標本中の 1番染色 体サ テ ラ イ ト I I IDNAの検出
(1)ハ イ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン反応溶液の調製
実施例 4 (1)に記載の方法と同様の方法で調製 した。
(2)染色体標本の調製
染色体標本を、 例えば、 Trask. B. J. ら、 Methods in Cell Biology, 35、 16、 1991に記載される常法に従っ て、 健常人の 血液か ら分離 した リ ン パ球を培養 して コ ルセ ミ ド処理 した後 実施例 3 (2)と同様の方法で固定する こ とによ つ て調製 した。
(3)未変性の標的核酸と のハイ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン反応と検出 実施例 4 (3)に記載の方法と同様の方法で行っ た。 20ngのプ ロ ーブと FITCが結合 した BecAタ ンパク 質を用いて、 2時間以内 に染色体標本中の標的核酸と標的核酸 · プローブ複合体を効 率よ く 形成させる こ とができ、 FITCを検出する こ と によ り、 ハイ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ン反応 . 洗浄後の染色工程な し に、 染 色体標本中の標的核酸配列であ る 1 番染色体サ テ ラ イ ト Π Ι配 列の存在を、 カ ウ ン タ ー染色を行っ た場合も、 通常の蛍光顕 微鏡で容易に検出でき る こ とが判明 し、 本発明による方法が 染色体標本に も適用でき る こ とが確認できた。 尚、 コ フ ァ ク タ ー と して ATP 7 Sを用いた場合 も、 GTP 7 Sを用いた場合 も結 果に差はなかつた。 実施例 8
FITCを有する抗 RecA抗体を用い る標的核酸配列（1番染色体サ テ ラ イ ト I I I配列）の検出
( 1 )ハ イ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン反応溶液の調製
検出可能な標識ま たは リ ガン ドを有 しない 2.4 gの RecA夕 ンパク質を使用 して、 実施例 4 (1)に記載の方法と同様の方法 でハイ ブリ ダィ ゼー シ ョ ン反応溶液を調製した。
(2) HEp-2細胞核の調製
実施例 3 (2)に記載の方法と同様の方法で HEp-2細胞核を調
S^,し フ (3)未変性の標的核酸と のハ イ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン反応と検出 上記（2〉で調製 した試料に、 10/2 1の上記（1)で調製したハイ ' ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン反応溶液を添加 した。 気泡が入らないよ う に注意してカ バーガラ スを被せ、 湿気を含んだ密閉容器に 入れて 37。Cのイ ンキ ュ ベー タ 一中で 2 時間反応させ.た。 こ の 反応試料を、 37°Cに保温 した 1.75X SSC中で 10分間ずつ 3回洗 浄 した。 次に試料を含むス ラ イ ドガ ラ スをブ ロ ッ キ ン グ液（4 X SSC、 0.1% Triton X-100、 ス キ ム ミ ルク、 0.02%ア ジ化 ナ ト リ ゥ ム）に浸 して室温で 20分間反応する こ と によ り試料を ブ ロ ッ キ ン グ した。
ブロ ッ キ ン グ液を除ま した後、 lOO/z 1の抗 RecA抗体溶液（実 施例 2 で得られた、 FITCが結合 した抗 RecA抗体を 15 g/mlの 濃度でプロ ッ キ ン グ液に溶解 した も の）を添加 し、 パラ フ ィ ル ム を被せて 37。Cで 1 時間反応させた。 こ の試料を含むス ラ ィ ドガラ スを、 4 55じ、 0.1%111"1 011 (—100を含む4 55じ、 4
SSCの順に室温で各 10分間ずつ洗浄 した。 さ らに婊菌水で軽 く 洗浄 した後、 上記の抗退色試薬を 1 滴添加してカ バーガラ ス を被せて IB励起フ ィ ルタ ー （BP-4.95)を取り付けたォ リ ン パ ス 社製の蛍光顕微鏡で観察 し、 FITCシ グナ ルを検出する こ と に よ り 1番染色体サテ ラ イ ト IIIDNAの存在を検出でき た。 得られ た シ グナ ルは、 実施例 4 で得られた シ グナルよ り も さ ら に強 かっ た。 尚、 コ フ ァ ク タ 一 と して ATP7 Sを用いた場合も GTP7 Sを用いた場合 も結果に差はなかった。 実施例 9
抗 RecA抗体を認識 し得る 2 次抗体を用いた標的核酸配列（ 1 番- 染色体サ テ ラ イ ト I II配列）の検出
( 1 )ハ イ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン反応溶液の調製
実施例 8 (1)に記載した方法と同様の方法でハ イ ブ リ ダィ ゼ ー シ ョ ン反応溶液を調製した。
(2) HEp-2細胞核の調製
実施例 3 (2)に記載の方法と同様の方法で HEp-2細胞核を調 製 した。
(3)未変性の標的核酸とのハイ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン反応と検出 上記（2)で調製 した試料に、 10/ 1の上記（1)で調製 したハ イ ブ リ ダィ ゼ一 シ ヨ ン反応溶液を添加 した。 気泡が入ら ないよ う に注意してカ バーガラ スを被せ、 湿気を含んだ密閉容器に 入れて 37。Cの ィ ン キ ュ ベー タ一中で 2 時間反応させた。 得ら れた反応試料を、 37°Cに保温 した 1.75X SSC中で 10分間ずつ 3 回洗浄 した。 次に試料を含むス ラ イ ドガラ ス をブ ロ ッ キ ン グ 液（4X SSC、 0. UTriton X-100、 5%ス キ ム ミ ル ク、 0.02%ア ジ 化ナ ト リ ゥ ム ）に浸 して室温で 20分間反応させてブ ロ ッ キ ン グ を行った。 ブ ロ ッ キ ン グ液を除去した後、 100// 】の抗 RecA抗 体溶液 （実施例 2 で得られた FITCが結合 した抗 RecA抗体を 15 g/mlの澳度でプロ ッ キ ング液に溶解 した もの。 FITCが結合 していなぃ抗 RecA抗体を使用 して も よ い）を添加 し、 パラ フ ィ ル ム を被せて 37 °Cで 1 時間反応させた。 こ の試料を含むス ラ ィ ドガラ スを、 4X SSC、 0. l¾Triton X-100を含む 4 x SSC、 4 x SSCの順に室温で各 10分間ずつ洗浄 した。 さ ら に も う 1度ス ラ ィ ドガラ スをブロ ッ キ ン グ液に浸 して室温で 20分間反応させ て再度ブロ ッ キ ングを行った。
プロ ッ キ ン グ液を除去 した後、 100;/ 1の FITCが結合 したャ ギ抗マ ウ ス IgG抗体溶液（シ グマ社製のャギ抗マ ウ ス IgG抗体を、
0. l%Tween-20. 2%正常ャギ血清（G i bco社製）を含む PBSで 1/10 00希釈 した溶液）を添加 し、 パラ フ ィ ル ム を被せて 37。Cで 1時 間反応させた。 こ の試料を含むス ラ イ ドガラ ス を、 0.1%Twe en-20を含む PBSを用いて室温で 5分間ずつ 3回洗浄 した。 さ ら に、 滅菌水で軽 く 洗浄 した後、 上記の抗退色試薬を 1滴添加 し てカ バーガラ スを被せて IB励起フ ィ ル タ ー （BP-495 )を取り付 けたオ リ ン パ ス社製の蛍光顕微鏡で観察し、 F I TCシグナルを 検出する こ と によ り 1番染色体サテ ラ イ ト III DNAの存在を検 JL した。
得 られた シ グナルは、 実施例 4 や 8 で得られた シ グナ ルよ り も強かった。 尚、 コ フ ァ ク タ 一 と して ATP 7 Sを用いた場合 も、 GTP 7 Sを用いた場合も結果に差はなかった。 実施例 1 0
ジゴキ シゲニ ンを有する RecA夕 ンパク質を用いる ィ ン シチ ュ ハイ ブ リ ダィ ゼ一 シ ヨ ン法によ る多剤耐性（MDR1)遺伝子の検
(1)ジゴキ シゲニ ンを結合させた RecAタ ンパク質の調製
ベー リ ンガーマ ン ハ イ ム社製の DIG抗体ラ ベ リ ン グキ ッ ト を 用いて、 ジゴキ シゲニ ンを RecA夕 ンパク 質に結合させた。 即ち、 まず RecAタ ンパク質 1 mgを 1 mlの リ ン酸緩衝溶液（P BS)に溶解 し、 得られた溶解液に、 43.5// 1の ジ ゴキ シ ゲニ ン -3-0 -サク シ ェ ル- ε -ァ ミ ノ 力 プロ ン酸- Ν-ヒ ド ロ キ シ -サ ク シ イ ミ ドエ ス テ ル （DIG-.NHS)溶液（2// g/ 1)を加えて、 ゆるやか に攪拌 しながら室温で 2 時間反応させた。 こ こ で、 1モ ル の！？ ecAタ ンノ、。ク質は、 5モ ルの D1G-NHSと反応する。
得 られた反応液を、 セ フ ア デ ッ ク ス G-25にア プラ イ し、 溶 出緩衝液（PBS、 pH7.2)を用いて溶出する こ と によ り、 RecAと 結合しなかった遊離の D1G-NHS、 および DIG-NHSと結合 した Re cA夕 ンパク質とを分離 した。
(2)ハイ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン反応溶液の調製
BRL社製のニ ッ ク ト ラ ン ス レ ー シ ョ ンキ ッ ト を使用 して、 d NTP(dATP、 dTTP、 dGTP、 dCTP)の存在下で、 多剤耐性（MDR1)遺 伝子由来の cDNA配列を含むプ ラ ス ミ ド pMDRAl (Kioka、 Nら、 Bi ochem. Biophys. Res. Coinmu. , 162、 224、 1989 )力 ら、 多剤 耐性（MDR1)遗伝子由来の cDNA配列を含む DNAプローブを調製 し た。 得 られた DNAプローブは、 検出可能な標識ま たは リ ガ ン ド を含んでいない。 得られた DNAプローブを含む溶液に、 0.3 酢酸ナ ト リ ウ ムを含むエ タ ノ ー ルを添加する こ と によ り、 DN
Aプローブを沈殺させて回収 した。 回収 した DNAプローブを ト リ ス塩酸 EDTA緩衝液（10mM卜 リ ス塩酸、 0.1 mM EDTA、 pH7.5) に懸濁 し、 Microcon-100 (ァ ミ コ ン社製）を用いて精製する こ と によ り、 DMプローブ溶液を得た。 得 られた DNAプロ ーブ溶液を、 璩菌水ま たは 卜 リ ス塩酸 EDT A緩衝液で希釈 し、 0. 6ml容量のマイ ク 口遠心チ ュ ーブに入れ た。 こ のチ ュ ーブを沸騰水中で 5分間保持する こ と に よ り DNA プローブを変性 した。 変性後、 こ のチ ュ ーブは氷水中に移 し ,ΪΞ? tv L o 1
別に、 0.6ml容量のマイ ク ロ遠心チ ュ ーブに、 1/ 1の 10ズ 1？ ecA 反応溶液（lOOmMト リ ス酢酸緩衝液 ρΗ7· 5、 20mM酢酸マ グネ シ ゥ ム、 500mM酢酸ナ ト リ ウ ム、 10mMジチ オ ス レ ィ ト ー ル、 5 0%グ リ セ ロー ル）、 1 1の ATP 7 S溶液または GTP 7 S溶液（4.8 6mMに調製 した保存溶液）、 114ngO SSB(single-strand bindi ng protein^ フ ア ル マ シ ア社製）、 および 1.6〃 gの Re cAタ ン パ ク質と 0.8 gO DIG-NHSとを結合 して得た RecAタ ンパク質を添 加 し混合した。 なお、 上記 ATP 7 S溶液ま たは GTP 7 S溶液の代 わ り に、 rATP、 dATP、 ま たは ATP 7 Sと ADPの混合物を必要に応 じて使用 した。 '
こ のマイ ク ロ遠心チ ュ ーブに、 上記のよ う に して変性させ た DNAブ口一ブを 20ng加え、 さ ら に全量が 10 1になる よ う に 域菌水を添加 した後、 37eCで 15分間反応させた。
得られた反応液に、 の酢酸マ グ ネ シ ウ ム溶液（100 raM) を加えてよ く 混合する こ と によ り、 ハイ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ン 反応溶液を得た。
(3) HEp-2細胞核の調製
実施例 3 (2)に記載 した方法と同様の方法で調製 した。
(4)未変性の標的配列とのハイ プ リ ダイ ゼー シ ョ ン反応と検出 上記（3)で得たス ラ イ ドガラ ス上の HEp-2細胞核に、 100/^ 1 の RNase溶液（ベー リ ンガーマ ンハイ ム社製の RNAaseを、 グ リ セ ロ ー ルを含ま ない 1 X RecA反応溶液に、 50 g/mlの濃度にな る よ う に溶解 した液）を添加 し、 パラ フ ィ ル ム を被せて、 37 °C で 60分間処理 した。 処理後、 RNase溶液を除去 し、 グ リ セ ロ ー ルを含ま ない 1 X RecA反応溶液で洗浄 し、 次に室温で 10分間、 10¾の ホ ルマ リ ン溶液（和光純薬社製）で試料を処理 した。
次いで、 こ の試料を、 グ リ セ ロー ルを含ま ない 1 X RecA反応 溶液で洗浄 し、 100 / 1の前処理用ブ ロ ッ キ ン グ液（5¾ス キ ム ミ ル ク、 10mMト リ ス酢酸緩衝液、 0.1% Triton X-100、 0.02%ァ ジ化ナ ト リ ウ ム ）を添加し、 パ ラ フ ィ ル ムを被せた後、 室温〜 37°Cで 20〜 60分間保持する こ と によ り試料を プ ロ ッ キ ン グ し た。
次いで、 前処理用ブロ ッ キ ン グ液を除去し、 グルセ ロール を含ま ない IX RecA反応溶液を用いて軽 く 洗浄 した後、 （2)で 調製 したハ イ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン反応溶液 10// Iを試料の上に 添加 した。 気泡が入らないよ う に注意 してカバーガラ ス を被 せ、 湿気を含んだ密閉容器に入れて 37。Cのィ ン 牛 ュ ベータ一 中で 2時間保持する こ と によ り ハイ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ン反応を 行'つた。 得られた反応試料は、 37°Cに保温 した 1.75 X SSCを用 いて 10分間ずつ 3回洗浄 した。
次に反応試料を含むス ラ イ ドガラ ス をプロ ッ キ ン グ液（4 X SSC、 0. l%Tri ton X-100^ 5%ス キ ム ミ ノレ ク、 0.02%ア ジ化ナ ト リ ウ ム ）に浸 して室温で 20分間反応する こ と に よ り、 試料をブ ロ ッ キ ン グ した。 次いで、 試料を含むス ラ イ ドガラ ス を 20 g/m 1の抗ジゴキ シゲニ ン 一 フ ノレ オ レ ツ セ ン （ベ ー リ ンガーマ ン ハイ ム社製）を含むプロ ッ キ ン グ液に浸 して 37 °Cで 20分間反応 させ、 標的核酸配列に結合したプロ ーブ · RecA複合体中に含 ま れる DIG-NHSを結台'させた RecAタ ンパク質に、 抗ジゴキ シゲ ニ ン一フ ルォ レ ツ セ ンを結合させた。 その後、 ス ラ イ ドガラ ス を、 4X SSC、 0. l%Triton X-100を含む 4 x SSC、 および 4x S SCの順に室温で各 10分間ずつ洗浄した。 次に滅菌水で軽 く 洗 浄 した後、 実施例 3 に記載の抗退色試薬を 1滴添加 してカ バー ガ ラ スを被せた。 こ の試料を IB励起フ ィ ル タ ー （BP-495 )を取 り 付けた ォ リ ンパス社製の蛍光顕微鏡で観察 し、 標的核酸 (多剤耐性（MDR1)遺伝子由来の cDNA配列） · プロ一ブ複台体 中に含まれる DIG-NHSを結合させた EecA夕 ンパク質由来のフ ル ォ レ ツ セ ン （FITC)の シ グナ ル を検出 した。
こ の結果力 ら、 DIG-NHSを結合させた RecAタ ンパク質を用い て も標的核酸 · プロ ーブ複合体を効率よ く 形成させる こ とが でき、 該標的核酸 · プローブ複合体中に含ま れる DIG-NHSを結 合させた RecA夕 ンパク質を検出する こ と によ り、 単一コ ピー であ る標的配列 （多剤耐性（MDR1)遺伝子由来の cDNA配列） の 存在を Zar lingらの方法に比べよ り簡便によ り高濃度に検出で き る こ とを実証できた。
尚、 補因子と して ATP7 Sを用いた場合も、 GTP7 Sを用いた 場合も結果に差はなかっ た。

Claims

請求の範囲
1. 固定された細胞ま たは細胞構造体に含まれる 2 本鎮標 的核酸配列の存在を検出する方法であ っ て、 該方法は以下の 工程を包含する ： 細胞または細胞構造体を、 核酸プロー ブが 侵入 し得る よ う に固定し、 固定された細胞または細 構造体 を得る工程 ； 1 本鎮ブロ ーブと EecAタ ンパク質が安定に結合 したプローブ · RecA複合体を形成する工程、 こ こ で、 該 1 本 鎖プローブは 2 本鑌標的核酸配列に相補的な配列を有す る ； 該プローブ · RecA複合体を、 該固定された細胞ま たは細胞構 造体に、 該 2 本鎮標的核酸配列と接触 し得る条件下で添加す る工程 ； 該 2 本鎮標的核酸配列が変性しない条件下で、 該プ ロ ーブ ' RecA複合体と該 2本鎮標的核酸配列と を反応させて 結合する工程 ； 該 2 本鎮標的核酸配列と結合 しなかったプロ 一ブ · RecA複合体を除去する工程 ； および該 2 本鎮標的核酸 配列と結合 したプロ ーブ · RecA複合体に含ま れる RecAタ ンパ ク質を検出 し、 それによ つて該 2本鎮標的核酸配列の存在を 検出する工程。
2： 前記 2 本 標的核酸配列の存在を検出する工程が、 検 出可能な標識または リ ガ ン ドを有する RecAタ ンパク質を用い て行われる、 請求項 1 に記載の方法。
3. 前記標識または リ ガ ン ドが、 蛍光剤、 化学発光剤、 酵 素標識、 放射性標識、 ピオ チ ン、 ジ ゴキ シゲ.ニ ンか ら な る群 か ら選択される、 請求項 2 に記載の方法。
4. 前記ブローブ · RecA複合体を形成する工程が、 ATP 7 S, GTP y S、 rATP、 dATP、 ATP 7 Sと rATPと の混合物、 ATP 7 Sと AD Pと の混合物、 GTP 7 Sと ADPとの混合物、 およ び、 0了？ 7 と 00 Pとの混合物か らな る群か ら選択される コ フ ァ ク 夕 一の存在下 で行われる、 請求項 1 ま たは 2 に記載の方法。
5. 前記蛍光剤力；、' フ ルォ レセ イ ン イ ソ チ オ シァネー ト、 カ ル ボ キ シ メ チ ル イ ン ド シ ァ ニ ンサ ク シ ニ ミ ジ ノレ エ ス テ ル、 ローダ ミ ン、 テ キサ ス レ ッ ド ( ス ノレ フ ォ ロ ーダ ミ ン） 、 テ ト ラ メ チ ル ロ ーダ ミ ン イ ソ チ オ シ ァ ネ ー ト、 およ び、 7-ァ ミ ノ
-4-メ チ ル ク マ リ ン -3-酢酸か らなる群か ら選択される、 請求 項 3 に記載の方法。
6. 前記標識が蛍光剤であ り、 前記 2 本鎮標的核酸配列の 存在を検出する工程が、 蛍光顕微鏡またはフ ロ ー サ イ ト メ一 夕 一 に よ り行われる、 請求項 2 に記載の方法。
7. 前記酵素標識が、 ア ル カ リ ホ ス フ ァ タ ー ゼ、 ペ ル ォ キ シダーゼまたは ^一ガラ ク ト シダ一ゼか らな る群から選択さ れる、 請求項 3 に記載の方法。
8. 前記 2 本鎮標的核酸配列の存在を検出する工程が、 抗 RecA抗体を用いて行われる、 請求項 1 に記載の方法。
9. 前記抗 RecA抗体が、 検出可能な標識ま たは リ ガ ン ドを 有する請求項 8 に記載の方法。
1 0. 前記標識ま たは リ ガ ン ドが、 蛍光剤、 化学発光剤、 酵素標識、 放射性標識、 ピオ チ ン、 ジ ゴキ シ ゲ ニ ン か ら な る 群から選択される、 請求項 9 に 己載の方法。
1 1. 前記蛍光剤が、 フ ル ォ レセ イ ン イ ソ チ オ シ ァ ネ ー ト、 カ ル ボ キ シ メ チ ノレ イ ン ド シ ァ ニ ン サ ク シ ニ ミ ジ ノレ エ ス テ ル、 ロ ーダ ミ ン、 テ キ サ ス レ ッ ド （ ス ノレ フ ォ ロ ー ダ ミ ン） 、 テ ト ラ メ チ ル ロ ー ダ ミ ン イ ソ チ オ シ ァ ネ ー ト、 お よ び、 7 — ア ミ ノ ー 4 ー メ チ ル ク マ リ ン ー 3 —酢酸か らなる群か ら選択され る、 請求項 1 0 に記載の方法。
1 2. 前記標識が蛍光剤であ り、 前記 2 本鎮標的核酸配列 の存在を検出する工程が、 蛍光顕微鏡ま たは フ ロ ーサ イ ト メ 一夕 一に よ り行われる、 請求項 8 に記載の方法。
1 3. 前記酵素標識が、 ア ル カ リ ホ ス フ ァ タ ー ゼ、 ペ ル ォ キ シダーゼまたは /9一ガラ ク ト シダーゼから な る群か ら選択 される、 請求項 1 0 に記載の方法。
1 4. 前記 2 本鎮標的核酸配列の存在を検出する工程が、 抗 RecA抗体および抗 RecA抗体と結合 し得る 2 次抗体を用いて 行われる、 請求項 1 に記載の方法。
1 5. 検出可能な標識または リ ガ ン ドを有する RecAタ ン パ ク質を含む、 請求項 1 または 2 に記載の方法を実施する ため の キ ッ ト。
1 6. 前記標識ま た は リ ガ ン ドが、 蛍光剤、 化学発光剤、 酵素標識、 放射性標識、 ピオ チ ン、 ジ ゴキ シ ゲ ニ ン か ら な る 群か ら選択される、 請求項 1 5 に記載のキ ッ ト。
1 7. 前記蛍光剤が、 フ ル ォ レセ イ ン イ ソ チ オ シァ ネー ト、 カ ノレ ボ キ シ メ チ ル イ ン ド シ ァ ニ ン サ ク シ ニ ミ ジ ル エ ス テ ル、 ロ ー ダ ミ ン、 テ キサ ス レ ッ ド （ ス ソレ フ オ ロ ーダ ミ ン〉 、 テ ト ラ メ チ ル ロ ーダ ミ ン イ ソ チ オ シ ァ ネ ー ト、 および、 7-ァ ミ ノ -4-メ チ ル ク マ リ ン -3-酢酸か らな る群か ら選択される、 請求 項 1 6 に記載のキ ッ ト。
1 8. 前記酵素標識が、 ア ルカ リ ホ ス フ ァ タ ー ゼ、 ペル ォ 牛 シ ダ一ゼま た は 9 — ガ ラ ク ト シ ダー ゼか ら な る群か ら選択 5 される、 請求項 1 6 に記載のキ ッ ト。
' 1 9. プローブと検出可能な標識ま たは リ ガ ン ドを有する
RecAタ ンパク質とが安定に結合 したプロ ーブ · RecA複合体を 含む、 請求項 1 または 2 に記載の方法を実施する ための牛 ッ 卜
10 2 0. 前記標識または リ ガ ン ドが、 蛍光剤、 化学発光剤、 酵素標識、 放射性標識、 ピオ チ ン、 ジ ゴキ シゲニ ンか ら な る 群か ら選択される、 請求項 1 9 に記載の牛 . y ト。
2 1. 前記蛍光剤が、 フ ル ォ レ セ イ ン イ ソ チ オ シァネー ト、 カ ル ボ キ シ メ チ ル イ ン ド シァ ニ ン サ ク シ ユ ミ ジ ル エ ス テ ル、
15 ロ ー ダ ミ ン、 テキサ ス レ ッ ド （ ス ノレ フ ォ ロ ー ダ ミ ン ） 、 テ ト ラ メ チ ルローダ ミ ン イ ソ チオ シァネー ト、 および、 7-ァ ミ ノ
-4-メ チ ル ク マ リ ン - 3-酢酸か らなる群か ら選択さ れる、 請求 項 2 0 に記載のキ ッ ト。
2 2. 前記酵素標識が、 ア ル カ リ ホ ス フ ァ タ 一 ゼ、 ペ ル ォ 20 キ シダ—ゼまたは ^一ガラ ク ト シダーゼからなる群か ら選択 される、 請求項 2 0 に記載のキ ッ ト。
2 3. RecAタ ンパク質および検出可能な標識ま たは リ ガ ン ドを有する抗 RecA抗体を含む、 請求項 8 または 9 に記載の方 法を実施する ためのキ ッ ト。
2 4. 前 己標識または リ ガ ン ドが、 蛍光剤、 化学発光剤、 酵素標識、 放射性標識、 ピオ チ ン、 ジ ゴキ シ ゲニ ンか ら な る 群か ら選択される、 請求項 2 3 のキ ッ ト。
2 5. 前記蛍光剤が、 フ ル ォ レ セ イ ン イ ソ チ オ シ ァ ネ ー ト . カ ル ボ キ シ メ チ ル イ ン ド シ ァ ニ ンサ ク シ 二 ミ ジ ノレ エ ス テ ル、 ローダ ミ ン、 テ キ サ ス レ ッ ド （ ス ル フ ォ ロ ーダ ミ ン） 、 テ ト ラ メ チ ノレ ローダ ミ ン イ ソ チ オ シ ァ ネ ー ト、 および、 7-ァ ミ ノ -4-メ チ ルク マ リ ン -3-酢酸か らなる群か ら選択さ れる、 請求 項 2 4 に記載のキ ッ ト。
2 6. 前記酵素標識が、 ア ル カ リ ホ ス フ ァ タ 一 ゼ、 ペ ル ォ キ シダーゼまたは 一ガラ ク ト シダーゼからな る群か ら選択 される、 請求項 2 4 に記載のキ ッ ト。
2 7. プロ ーブと RecAタ ンパク質とが安定に結合 したプロ 一ブ · RecA複合体、 および検出可能な標識ま たは リ ガ ン ドを 有する抗 RecA抗体を含む、 請求項 8 または 9 に記載の方法を 実施する'ためのキ ッ ト。
2 8. 前記標識または リ ガ ン ドが、 蛍光剤、 化学発光剤、 酵素標識、 放射性標識、 ピ オ チ ン、 ジ ゴキ シ ゲニ ンか ら な る 群か ら選択される、 請求項 2 7 に記載のキ ッ ト。
2 9. 前記蛍光剤が、 フ ル ォ レセ イ ン イ ソ チ オ シ ァ ネ ー ト、 カ ル ボキ シ メ チ ルイ ン ド シ ァ ニ ンサ ク シ ニ ミ ジ ル エ ス テ ル、 ローダ ミ ン、 テ キサ ス レ ッ ド （ ス ル フ ォ ロ ーダ ミ ン） 、 テ ト ラ メ チ ル ロ ーダ ミ ン イ ソ チ オ シ ァ ネ ー ト、 およ び、 7 -ァ ミ ノ -4-メ チ ルク マ リ ン -3-酢酸か らな る群か ら選択される、 請求 項 2 8 に記載のキ ッ ト。
3 0. 前記酵素標識が、 ア ル カ リ ホ ス フ ァ タ ー ゼ、 ペ ル ォ キ シダーゼま たは S — ガラ ク ト シダーゼか らな る群か ら選択 される、 請求項 2 8 に記載のキ ッ ト。
3 1 . 請求項 1 ま たは 2 の方法に使用 し得る、 標識ま たは リ ガ ン ドを有する RecA夕 ンパ ク 質。
3 2. 前記標識ま たは リ ガ ン ドが、 蛍光剤、 化学発光剤、 酵素標識、 放射性標識、 ピオ チ ン、 ジ ゴキ シ ゲ ニ ンか ら な る 群か ら選択される、 請求項 3 1 に記載の RecA夕 ンパク質。
3 3. フ ル ォ レ セ イ ン イ ソ チ オ シ ァ ネ ー ト、 カ ノレポ キ シ メ チ ル イ ン ド シ ァ ニ ン サ ク シ ユ ミ ジル エ ス テ ル、 ロ ーダ ミ ン、 テ キ サ ス レ ツ ド （ ス ル フ ォ ロ ー ダ ミ ン） 、 テ ト ラ メ チ ル ロ ー ダ ミ ン イ ソ チ オ シ ァ ネ ー ト、 および、 7-ァ ミ ノ - 4 -メ チ ノレ ク マ リ ン -3-酢酸からなる群から選択される蛍光剤を、 RecAタ ン パ ク質モ ノ マ ーあた り 1〜 6分子含む、 請求項 3 2 に記載の RecA タ ン パ ク 質。
3 4. ア ル カ リ ホ ス フ ァ タ ー ゼ、 ペ ル ォ キ シ ダー ゼま た は — ガラ ク ト シダ一ゼか らな る群から選択される酵素標識を、 RecAタ ンパ ク質モ ノ マ ー あた り 1〜 3分子含む、 請求項 3 2 項 に記載の RecAタ ンパク質。
3 5. ピオチ ン、 ジゴキ シゲニ ン の群から選択される リ ガ ン ド を、 RecAタ ン パ ク 質モ ノ マ ー あ た り 1〜 6分子含む、 請求 項 3 2 項に記載の RecA夕 ンパク質。
3 6. 前記固定化された細胞または細胞構造体を前処理用 ブ ロ ッ キ ン グ液で処理する工程をさ らに包含する、 請求項 1 または 2 に記載の方法。
3 7. 前記'ブロ ッ キ ン グ液が、 カ ゼ イ ン、 ス キ 厶 ミ ノレ ク、 牛血清ア ル ブ ミ ン、 前記細胞ま たは細胞構造体に含まれる核 酸およびプローブとハ.ィ ブ リ ダィ ズ しないキ ャ リ ア ー DNA、 お よび、 キ ャ リ アー RNAからなる群から選択される少な く と も一 種を含む、 請求項 3 6 に記載の方法。
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