JPH07505291A

JPH07505291A - 配列決定法

Info

Publication number: JPH07505291A
Application number: JP5517258A
Authority: JP
Inventors: ホーンズ、エリック
Original assignee: ダイナル・エイ・エス
Priority date: 1992-04-03
Filing date: 1993-04-02
Publication date: 1995-06-15
Also published as: EP0635065A1; AU662626B2; WO1993020232A1; CA2117603A1; GB9207598D0; AU3898293A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明はＤＮＡの２又はそれ以上の領域を同時に配列決定する方法に関する。

信頼性の高いＤＮＡ配列決定法に対する必要性は特にヒトゲノムプロジェクト並びに病態に関連したＤＮＡの同定との関連で益々高まっている。このような方法としては自動化に役立つものが特に望ましい。

近年、多数の技術改良が報告されているが、大多数の報文はデータ解析、すなわち、コンピューターソフトウェアに関するものである。−重鎖ファージＤＮＡを調製するためのフィルター法が報告されているが（Ｋｒｉｓｔｎｅｓｅｎ他（１９８７））、この方法は自動化法にまで発展させ得るかも知れない。遠心式試薬取扱装置（Ｍａｒｔｉｎ他（１９８５））並びにラジオグラム上のバンド検出用の画像処理プログラム（Ｅｌｄｅｒ他（１９８５））などによる自動化配列決定反応の開発の試みも報告されている。しかし、最も一般的なアプローチはロボットによって技術を自動化しようとするものである。このような方策を用いて、高速配列決定システム（Ｗａｄａ他（１９８３））並びに鋳型ＤＮＡ調製システム（ＤｅＢｏｎｖｉｌｌｅ他（１９８７））が導入されている。

ＤＮＡ断片の標識に同位体ではなく蛍光を活用することによって電気泳動工程を自動化しようとする新規なアプローチが幾つかのグループ（Ｓｍ４ｔｈ他（１９８６）、Ａｎｓｏｒｇｅ他（１９８７）並びにＰｒｏｂｅｒ他（１９８７））によって報告されている。このようなシステムでは、オンライン検出が可能になり、それによって、電気泳動と検出とデータ処理の３つの操作を一つの自動化ステーションに結合することが可能となる。従って、メガ単位の塩基配列を決定するための方策として、かかるシステムをその一部に含めることも有望である。

完全に自動化された配列決定用プロトコルを得るためには、最初の二つの操作（鋳型の調製及び配列決定反応）に関する適切な自動化法を開発することも欠かせない。

固相法が分子生物学において非常に有用であることは、ペプチド合成、ペプチドの配列決定及びＤＮＡ合成などの分野で実証されている。この技術を利用した装置は多数市販されている。固相法の利点は、通常、収率の良さと、各反応の再現性の高さと、自動化の容易さとを兼備している点である。

しかし、現在までのところ、ＤＮＡ配列決定反応や、ｃＤＮＡ合成の際の部位特異的操作などの用途に関して、クローン化ＤＮＡ配列の取扱い操作に固相法を応用したという報告は殆どない。陰イオン交換担体上におけるオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列決定法が報告されているが（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ他（１９８５））、ＤＮＡの配列決定を自動化しようとする試みの多くは実験用ロボットの使用に集中している（Ｍａｒｔｉｎ他（１９８５）並びにＷａｄａ他（１９８７））。

ＷＯ３９１０９２８２号には、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖の配列を決定する方法にして、二本鎖のうちの一方の鎖の一端を固定化し、二本鎖を分離した後、上記の固定化された鎖を配列決定に付すことからなる方法が開示されている。このようにして得られる配列情報の信頼性を高めるため、上記固定化鎖から分離させた溶液中の非固定化鎖の配列を決定することも可能である。しかし、このような溶液は、二本鎖分離工程で従来通り水酸化ナトリウムが使用されるため、通常は高いｐＨにあり、中和しなければならない。さらに、未分離鎖を含んだ溶液を配列決定に最適な濃度まで稀釈しなくてすむようにするのは困難である。

本願出願人の同時継続出願第９１２２０６０．８号には、標的ＤＮＡの予備的なＰＣＲ増幅を、増幅されたＤＮＡの二本鎖が独立して分離及び配列決定できるように、異なる固定化手段を与えたプライマ一群を用いて行うことによって、二本鎖ＤＮＡの配列決定を遂行することが提案されている。

診断においては、体内に侵入した生物などに由来するＤＮＡの１箇所以上の標的領域を配列決定することや、上述の通り、信頼性を高めるために二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を配列決定することが望まれることが多い。一般に、特に自動化システムにおいては、操作に要する時間と労力を節減するために、ＤＮＡの２又はそれ以上の領域を同時に配列決定できれば都合がよい。

本発明は、配列決定用プライマーの各々に固定化担体及び／又は標識結合用の異なる手段を設けることによって、標的ＤＮＡの２又はそれ以上の領域の配列決定を行うという発想に基づくものである。

本発明においては、標的ＤＮＡの２又はそれ以上の領域を配列決定する方法が提供される。この方法では、上記領域の各々に異なる配列決定用プライマーをアニーリングした後、配列決定用ポリメラーゼ及び配列決定用ヌクレオチドを用いてＤＮＡ合成を行い、次に合成されたＤＮＡのサイズ分画を行うが、上記配列決定用プライマーの各々には別々の識別用及び／又は固定化用の手段が与えてあり（ただし、上記配列決定用プライマーの一つはかかる手段を欠いていてもよい）、それによってＤＮＡの各々の領域から合成されたＤＮＡの集団を識別及び／又は分離が可能になる。

本発明の方法は、同じＤＮＡＮ玉鎖上なる領域の配列決定に使用することもできるし、ざらに、標的Ｄ　Ｎ　Ａの別々の鏡上の異なる領域の配列決定にも使用することができる。

本発明の方法は標的二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を配列決定するのに特に適しており、本発明のさらに別の態様においては、標的二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を配列決定する方法が提供される。この方法では、溶液中で上記ＤＮＡを２つの一本鎖に分離して、各々の鎖に異なる配列決定用プライマーをアニーリングした後、配列決定用ポリメラーゼ及び配列決定用ヌクレオチドを用いてＤＮＡ合成を行い、次に合成されたＤＮＡのサイズ分画を行うが、上記配列決定用プライマーの一つには識別用及び／又は固定化用の手段が与えてあり、もう一方のプライマーはかかる手段を欠いているか或いは異なる識別用及び／又は固定化用の手段が与えてあり、それによって、各ＤＮＡ鎖から合成されたＤＮＡの集団を識別及び／又は分離が可能になる。

標的ＤＮＡの両方の鎖の配列決定を行う場合、使用すべきポリメラーゼの選択は標的二本鎖ＤＮＡに適用する鎖分離の方法と関連する。熱安定ポリメラーゼを用いると二本鎖を熱的に（例えば９５℃で）分離させることができるが、このような系にはＴａｑポリメラーゼが有用である。しかし、シークエナーゼ（ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）やＴ７やフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントのような熱不安定ポリメラーゼはこのような方法に用いることができず、熱によらずに鎖分離するための予備工程が必要となる。かかる目的には、例えばエタノール沈殿のような化学的又は物理的鎖分離が必要とされる。シークエナーゼは、約５５℃でのプライマーのアニーリング工程後に、約３７℃で用いるのが最適である。鎖分離を要しない場合には、どのようなポリメラーゼを使用してもよい。

プライマーに存在していてそのため合成されるＤＮＡ中に取込まれる上記識別用手段は、例えば蛍光色素でもよいし、３２Ｐのような放射性同位体でもよいし、或いはかかる標識を結合するための手段であってもよい。一般に、上記のＤＮＡ集団を（固定化ではなく）標識に基づいて識別する場合には、個別に視覚化又は検出し得る様々な物質が存在する。しかし、同一の標識を異なる量で使用することもでき、その場合、シグナルの強度に基づいて識別する。例えば、仮に一方のプライマーが１分子の標識を保有していて、もう一方のプライマーが同じ標識を２分子保有していれば、これらのシグナルを別個に（１又は２シグナル単位で）識別することも、−緒に（３シグナル単位で）識別することも可能である。

一般に、配列決定はサンガー（Ｓａｎ、ｇｅｒ）法で行い、合成に必要な４種類のデオキシ塩基と共に、ジデオキシ塩基その他の３′末端がブロックされた塩基を使用するが、ジデオキシ塩基はそれが鎖に取込まれた時点で鎖の伸長反応を停止させる。ジデオキシ塩基とデオキシ塩基との間の競争機構に基づいて、全範囲にわたってジデオキシ停止ＤＮＡ鎖が合成されることが判明している。適当なゲル上でのサイズ分画でＤＮＡ鎖を分子量の順に並べることができ、多積の末端ジデオキシ塩基についての情報から各塩基の位置を決定することができる。

元々のサンガー法では、配列決定反応は、各々１種類ずつ異なるジデオキシ塩基を用いた４種類のアリコートで行われる。４回の反応のＤＮＡ生成物を４つの別々のレーンでサイズ分画して、各ジデオキシ塩基の位置についての情報を総合することによって標的ＤＮＡの全配列が分かる。この場合、分画ゲルの各レーンにおけるＤＮＡのバンドが視覚化できればよいので、配列決定用プライマー又はジデオキシ塩基又はデオキシ塩基のいずれを標識してもよい。

最近、上記４種類のアリコートの各々に含まれるプライマーが別々に（通常は４種類の異なる蛍光色素で）標識されているような系（この場合、各ジデオキシ塩基は別々の４つの反応で取込まれ、ゲルにかける前に混合される）や、さらに洗練された系として、各ジデオキシ塩基を１回の反応で同時に取込むことができるように各ジデオキシ塩基を別々に標識した系などが紹介されている。いずれの系においても、ＤＮＡ鎖を分子貴顕に並べるためのサイズ分画は１つのレーンで行うことができ、異なるジデオキシ塩基は各ジデオキシ塩基に結合した別々の蛍光色素によってそれぞれの正確な位置において視覚化される。

最初の標的ＤＮＡが極微量しか存在していないような場合もあるが、そのような場合には、そのＤＮＡを予備的ＰＣＲ段階で増幅しておくことが望ましい。

ＰＣＲプライマーは、標的ＤＮＡとはハイブリダイズしないが標準配列決定用プライマーとはハイブリダイズするような拡張ＤＮＡ部分を保有していてもよい。

このような拡張ＤＮＡ部分は増幅ＤＮＡの中に取込まれて標準配列決定用プライマー用の部位をもたらし、その結果、標準配列決定系を使用することができるようになる。この場合、かかる標準部位を保有する増幅ＤＮＡも本発明で配列決定し得る標的ＤＮＡとみなすことができるのは明らかであろう。

合成されたＤＮＡの固定化はどのような従来法で行ってもよく、適当な媒液中に懸濁した適当な活性化固体相を用いて回分式で行ってもよいし、活性化固体相のカラム上で行ってもよい。適当な固体相であれば如何なるものを用いてもよく、例えばセファロース系ビーズ（スウェーデンのＰｈａｒｍａｃｉａ社製）フィルター、キャピラリー、プラスチック製ディツプスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）、微量滴定用ウェル（ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ　ｗｅｌｌ）などがある。磁性ビーズ、例えばノルウェー国オスロのＤｙｎａ　１社製の超常磁性・単分散型ビーズが特に好ましい。

使用することのできる固定化用手段には、ビオチン（アビジン又はストレプトアビジンと共に使用される）、例えばジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）やＤＮＰやＮＩＰやＢＲＤＵなどの各種ハプテン（抗ハプテン抗体と共に使用される）、並びにＬａｃオペレーター（タンパク質のＬａｃリプレッサーと共に使用される）などのＤＮＡ結合タンパク質に特異的なりＮＡが含まれる。

以下、本発明の数々の実施態様について詳細に説明する。

Ａ、　配列決定用プライマ一群が（異なる）固定化用手段を保有している場合には、ＤＮＡ合成の生成物を標的ＤＮＡの各々の領域に由来する各集団に分離することができる。従って、例えば、一方のプライマーがビオチンを保有していてもよく、そうすれば２つのＤＮＡ集団のうちの一方にビオチンが取込まれて、その集団はアビジン又はストレプトアビジンを保有する固体相との反応によって溶液から取り除くことができる。仮にもう一つのプライマーが別のハプテン（ジゴキシゲニン又はＮＰＩなど）を保有していれば、それにより、固体相に結合した抗ハブテンを利用しての固定化が可能になる。プライマー群のうちの一つは識別用又は固定化用の手段を結合していなくてもよく、このこと（かかる手段をもたないこと）を基準にして同定することができる。

サイズ分画の前に、固定化されたＤＮＡを溶液中に遊離させなければならない。

ビオチン／アビジン又はビオチン／ストレプトアビジンはホルムアミド処理で遊離させることができる。ハプテン／抗ハプテン結合は、加熱又は過剰のハプテンもしくはその抗体とより強く結合するようなハプテン類似体との反応により、通常は温和な条件下で切断することができる。

別々のＤＮＡ集団の固定化によって、サイズ分画前にこれらを洗浄することが可能になるが、これらのＤＮＡ集団のうちの一つを溶液中に遊離させ、そのＤＮＡ集団を含有する残留溶液をサイズ分画用ゲルに直接かけることも実際に可能である。これにより、熱論、後者のＤＮＡを固体相から取り外す必要はなくなる。

このようにして、多積について別々の配列決定用レーンを作成することができ、各ＤＮＡ集団を区別するためのそれ以上の手段を必要としない。

上述のように各塩基について別々のＤＮＡ合成段階を設けて４レ一ン式配列決定を行う場合、ゲル中のＤＮＡが視覚化できるようになるシグナルを与えるプライマーを用いることも可能である。ただし、このようなシグナルの不在下では、ＤＮＡ又はゲルを後で染色すればよい。従って、プライマーは蛍光色素、放射性同位体又はこのような視覚化に適した如何なる標識を保有していてもよい。例えば、プライマーの５′アミノ基に固定化促進用のハプテン結合基と視覚化促進用の蛍光色素を共に結合させることも可能である。

Ｂ、プライマ一群が異なる標識を保有する場合には、ＤＮＡ集団の分離を行う必要がなくなる。この場合、合成された全ＤＮＡをサイズ分画ゲルにかけることができる。ただし、サイズ分画前に合成されたＤＮＡの洗浄ができるように、プライマーが例えばビオチンのような固体相との結合手段を保有しているのが都合がよい。

上述の４レ一ン式配列決定を行う場合、各レーンはそれぞれ１種類の塩基の位置を示すが、その塩基が１又はそれ以上のどのＤＮＡ集団に属しているかはプライマー由来の結合標識によって同定することができ、こうして、これら４つのレーンからの情報を総合すれば別々の鎖の配列についての完全な情報を得ることができる。

Ｃ０配列決定とＰＣＲを組合せた方法が最近提案されたが（サイクリング配列決定法）、この方法では、ＰＣＲ反応を１又はそれ以上のジデオキシ塩基の存在下で実施して、増幅されたジデオキシ停止ＤＮＡ鎖の集団が生ずるようにする。

この方法は極微量の標的ＤＮＡの配列決定に役立つ。本発明においては、上記の配列決定用プライマーをＰＣＲプライマーとして利用することにより、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖についてサイクリング配列決定法を行うことができる。上記と同様に、異なるＤＮＡ鎖の集団が生ずるが、これらは上述の通り分離及び／又は識別することができる。一般に、Ｔａｑｌのような熱安定ポリメラーゼを使用し、従来の熱ＰＣＲサイクル（例えば鎖分離過程には９５℃程度の温度を用いる）を行うのが好ましい。

本発明のさらに別の態様においては、上述の配列決定法を実施するためのキットにして、識別用及び／又は固定化用の手段を与えた配列決定用プライマー、かかる手段をもたないか或いは異なる識別用又は固定化用の手段を与えた第二の配列決定用プライマー、並びに任意成分として、上記第−及び第二のプライマーとは異なる識別用又は固定化用の手段を与えた１又はそれ以上の別の配列決定用プライマー；ポリメラーゼ；デオキシヌクレオチド三すン酸；ジデオキシヌクレオチド三リン酸（任意には、標識してあってもよい）；配列決定用緩衝液、のうちの１以上を含んでなるキットが提供される。

本発明を以下の非限定的な実施例を参照して説明する。

ａ）プラスミドｐＧＥＭ　３２ｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、ｐＧＥＭは登録商標）ベクターｐＧＥＭ　７Ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）中にアブリンＡ遺伝子の挿入されたものからなるプラスミドｐＧＡ７．３　（Ｇ、Ｅｖｅｎｓｅｎ他、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

−ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）Ｍ２Ｂ５−ストレプトアビジン（］）ｙｎａ１社製） −抗ジニトロフェノール（ＤＮＰ）でコーティングしたダイナビーズＣ）抗ＤＮＰ　（Ｓｉ　ｇｍａ社製）ｄ）配列決定に使用したプライマー５’ＤＮＰ−ＣＡＧ−ＧＡＡ−ＡＣＡ−ＧＣＴ−ＡＴＧ−３’＝　５’ＤＮＰリバ一スト配列決定用プライマー５′ビオチンＧＴＡ−ＡＡＡ−ＣＧＡ−ＣＧＧ− ＣＣＡ−ＧＴ−３’：５′ビオチンユニヴア一サル配列決定用プライマーｅ）親！櫃２ｘＢ＆Ｗ　＝　１０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）１ｍＭ　ＥＤＴＡ２．０ＭＮａＣｌ２０ｘＰＢＳ　＝　ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ３，１２ｇＮａＨＰＯ４’　２Ｈ２０１９，６ｇＮａＣ１０，１５Ｍ　１６２ｇ蒸留水で１リツトルに調整ＮａＯＨでｐＨ７，４に調節実際に使用する溶液は１×保存液ＡＢＩ社製９部品番号９０１４９７磁石（Ｄｙｎａ１社製、ＭＰＣ−Ｅ）とエッペンドルフチューブを利用して、２０μｌの２ＸＢ＆Ｗ緩衝液中で２０μ１（２００μｇ）の上記ダイナビーズを１回洗浄した。洗浄後、このビーズを４０μＩの２ＸＢ＆Ｗ緩衝液中に再懸濁した。

２、抗ＤＮＰ被覆ダイナビーズＭ２８０の調製抗ＤＮＰ（Ｓｉ　ｇｍａ社製）とトシル活性化ダイナビーズＭ２８０　（Ｄｙｎａ　１社製）をＤｙｎａ１社による商品使用説明書に記載の通りに使用した。

３、サイクル配列決定プロトコル１ＭｇのプラスミドＤＮＡと３．２Ｍｍｏｌのプライマー（この場合、両方のプライマーの量）を最終容積２０μｌとして使用して、ＡＢ１社の部品番号９０１４９７の説明書に示されたプロトコルに従った。

サイクリング反応はＰｅｒｋｉｎ　Ｅ１ｍｅｒ社製Ｔｈｅｒｍｏ　ｃｙｃｌｅｒ４８０を用いて下記のサイクルにて行った。

９６℃、３０秒間５０℃、１５秒間６０℃、４分間合計２５サイクル次に４℃に急冷してその温度に維持した。このサイクル・シーフェンシング・キット（ＡＢ１社製）に示されたフェノール／クロロホルム抽出プロトコル（過剰の色素ターミネータ−の除去のため）を行って、配列決定用生成物を精製した。

最終容積は４０μ】であった。

精製後、配列決定用生成物をダイナビーズＭ２８０に固定化した。

４、配列決定用生成物の固定化４０μｌのフェノール抽出配列決定用生成物を９０℃に１分間加熱した後急冷した。これに、予め洗浄しておいたグイナビーズＭ２８０ストレプトアビジン４０ μｌを加えて、ビーズを懸濁状態に維持しながら室温で１５〜３０分間インキュベートした。

ＭＰＣ−Ｅ磁石（Ｄｙｎａ１社製）を利用して上清を分離して別に保存しておき、８μｌの０．１Ｍ　ＮａＯＨを加えて室温で１０分間インキュベートした。

チューブに移し、８μＩの０．ＩＭＮａＯＨによる処理を新たに行った。

ビオチニル化鎖の固定化されたダイナビーズを５０μｌの０．１Ｍ　ＮａＯＨで１回、４０μｌのＢ＆Ｗ緩衝液で１回、並びに５０μｌのＴＥ緩衝液で１回洗浄した。９５％ホルムアミドを含有した「ローディング」緩衝液（すなわち重層用緩衝液）中にビーズを再懸濁して、９５℃に数分間加熱し、その上清を配列決定用ゲルにかけるために残しておいた。

６、ＤＮＰ標識配列決定用生成物の固定化工程４で保存しておいた上清と工程５で得られた２×８μｍの保存上清を混合し、１６μｌの０．ＩＭＨＣＩと２μｌのＴ　ｒ　ｉ　５−ＨＣ１（ｐＨ７，４）で中和し、ＰＢＳ（ｐＨ７，４）を用いて容積を４００μｌに調整した。

この懸濁液を９５℃で１分間加熱した後、氷上で急冷した。

５００μｇのグイナビーズー抗ＤＮＰをＰＢＳ中で１回洗浄し、５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁して、これを上記の中和ＤＮＰ標識溶液に加えた。時々撹拌しながら混合物を室温で３０分間インキュベートし、１００μｌのＰＢ、Ｓと５０μｌのＩＸＴＥで１回洗浄した後、ローディング緩衝液を加え、９５℃で１分間加熱し、その上清をゲルにかけるために用いた。

７、ゲル分離ＡＢ１社製の３７３Ａ　ＤＮＡシークエンサーを使用した。

実施例２実施例１に記載されたプラスミドと同じプラスミドを使用した。

１、鋳型の調製標的鋳型、　２０ｎｇ　ｐＧＡ７．３プライマ一対：　５’−ＡＡＡＧＧＧＧＧＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧ−３ ’５’−ＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧ−３″ポリメラーゼ＝　１単位のＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ社製）１０×緩衝液＋ｄＮＴＰ：　５０ｍＭ　ＫＣＩ、１００ｍＭ　Ｔｒ　１ｓ（ｐＨ８，３）。

１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．０．０１％ゼラチン、２ｍＭｄＮＴＰ（超高純度、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）サイクリング条件：サイクリング反応は、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅ１ｍｅｒ社製の９６００　ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲシステムを用いて、以下のサイクルにて実施した。

９５℃、５秒間６５℃、１秒間７２℃、１分間合計２５サイクル次いで４℃に急冷してその温度に維持した。

過剰のプライマーを除去するためのＰＣＲ生成物の精製：Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　１００微量濃縮器（Ｃｅｎ　ｔ　ｒ　ｉ　ｃｏｎは登録商標。

Ａｍｌｃｏｎ社製）を使用した。Ａｐｐｌ　ｆｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢり社の以下のプロトコルに従った。

上記のカラムにＰＣＲ溶液と水（２ｍｌに調整）を加えて、ａｏｐｏｘｇで１０分間遠心した。カラムをひっくり返して２７０Ｘｇで２分間遠心した。

２、配列決定反応プロトコルは、Ｔａｑ　Ｄｙｅ　Ｄｅｏｘｙ　（登録商標）ターミネータ−・サイクル・シーフェンシング・キット（ＡＢＩ社製）に基づく。

配列決定用ミックス：１０反応用：４０ｐ１５ＸＴＡＣ９緩衝液（４００ｍＭ　Ｔｒｊｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭＭｇＣ１２，１００ｍ　ｌ　（ＮＨｌｈＳＯａ。

ｐ　Ｈ９，０）１０μｌ　ｄＮＴＰ　（７５０ａＭ　ｄＩＴＰ、１．５０ａＭ　ｄＡＴＰ。

１５０ａＭ　ｄＴＴＰ、１５０ａＭ　ｄＣＴＰ）１０μＩ　Ａ　Ｄｙｅ　Ｄｅｏｘｙ（登録商標）ターミネータ−１０μＩ　ＣＤｙｅ　Ｄｅｏｘｙ（登録商標）ターミネータ−１０μＩ　Ｇ　Ｄｙｅ　Ｄｅｏｘｙ（登録商標）ターミネータ− １０μＩ　Ｔ　Ｄｙｅ　Ｄｅｏｘｙ（登録商標）ターミネータ−５μｌ　Ａｍｐｌｊ　Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、８Ｕ／、ｕｌ（１）ＤＮＰ標識ユニヴア−サル配列決定用プライマー５’ＤＮＰ−ＤＮＰ−ＤＮＰ−ＧＴＡ−ＡＡＡ−ＣＧＡ−ＣＧＧ−ＣＣＡ−ＧＴ−３’（２）ビオチンリバースト配列決定用プライマー５′ビオチン−ＣＡＧ−ＧＡＡ−ＡＣＡ−ＧＣＴ−ＡＴＧ−３’下記の条件下で上記プライマーを用いて２つの別個の反応を行った。

１μｌ　精製ｐＧＡ７．３　ＰＣＲ生成物２μｌ　ＤＮＰプライ７　（１，６ｐｍｏｌ／μｍ）１μｌ　ビオチンブライｖ　（４，８ｐｍ、ｏｌ／ｇｌ）９．５ μｌ　配列決定用ミックス６．５μｍ　蒸留水サイクリング反応はＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　９６００システムを用いて以下のサイクルにて行った。

９６℃、１５秒間５０℃、１秒間６０℃、４分間合計２５サイクル次いで４℃に急冷してその温度に維持した。

３、配列決定用生成物の精製フェノール抽出前に各反応液に８０μｌのＨ２Ｏを加えた。フェノールは使用前にＬＭ　Ｔｒ　ｉ　５（ｐＨ８，０）及びＩＸＴＥの緩衝液で処理しておいた。

各サンプルは１００μｌのフェノール：クロロホルム：水（６８：１４　：１８）で２回抽出した。水相を１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム及び３００μｌのエタノール（ＥｔＯＨ）で沈殿させ、４℃において１７０００Ｘｇで３０分間遠心した。得られたペレットを２５０μｌの７０％ＥｔＯＨで洗浄し、上記と同様に５分間遠心し、５ｐｅｅｄ　Ｖａｃを用いて３分間乾燥した。

４、配列決定用生成物の分離各ペレットをＰＢＳ緩衝液（５０￥ＰＢＳ緩衝液（３，０Ｍ　ＮａＣ１，０，２ＭＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ６，４））４０μｌの中に溶解し、得られた２つの溶液を一緒に混合した。

手回能）（ｂ）　グイナビーズＭ２８〇−抗ＤＮＰ：　製造業者（Ｄｙｎａ１社）の推奨する通り、ダイナビーズＭ２８０　ＲＡＭ　Ｇ２ａを抗ＤＮＰ？ウスＩｇＧ、２Ａ（Ｏｓｗｅｌｌ　ＤＮＡ　５ｅｒｖｉｃｅ　Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ）とインキュベートして調製。

下記の２通りの分離法について実験した。

１２、Ａ：　４０μｌの配列決定用生成物を１００℃に１０分間加熱し、直ちに氷上に２分間おいた。

ＰＢＳ中で予め洗浄して６０μｌのＰＢＳ中に懸濁しておいた２ｍｇのグイナビーズＭ２８〇−抗ＤＮＰを加え、室温（ＲＴ）で３０分間ローラー上においた。

その上清を別のチューブに移した。

５μｍのホルムアミド：　ＥＤＴＡを加えて１０分間沸騰させた。上清を配列決定用ゲルにかけた。この画分はＤＮＰ標識配列決定用生成物を含んでいる。

最初に回収した上清を１００μｌの０．２Ｍ　ＮａＯＨ＋２Ｍ　ＮａＣ１に加え、ＲＴに５分間おいた。４００ａｇのグイナビーズＭ２８０−ストレプトアビジンを加えて、ＲＴで３０分間ローラー上においた。

上清を除き、ダイナビーズに５μｌのホルムアミド：　ＥＤＴＡを加えて１００ ℃で１０分間加熱した。上清を配列決定用ゲルにかけた。

この画分はビオチン標識配列決定用生成物を含んでいる。

代表的な結果を表１及び表２に示す（それぞれ、１２ａ　ＤＮＰと１２ａ　ＳＡ）。

１２、Ｂ：　４０μ＋の配列決定用生成物に４μｌのＩＭＮａＯＨを加え、ＲＴに５分間おいた。５６μｌのＰＢＳ中の４００ａｇのグイナビーズＭ２８０−ストレプトアビジンを加え、最終的にさらに７μｌのＬＭ　ＮａＯＨを加えてＲＴで３０分間ローラー上においた。その上清を別のチューブに移し、残ったダイナビーズに５μｍのホルムアミド：　ＥＤＴＡを加えて１００’Ｃに１０分間加熱した。その上清を配列決定用ゲルにかけた。この画分はビオチン標識配列決定用生成物を含んでいる。

最初の上清１．：３０ｇ１の０．３３Ｍ　ＨＣｌ加、ｔ、ｐＨを８〜９に調整した。１００μ！のＰＢＳを加えて１０分間沸騰させ、氷上に２分間おいた。２ｍｇのグイナビーズＭ２８０−抗ＤＮＰを加えて、ＲＴで３０分間ローラー上においた。上清を除き、５μｍのホルムアミド：ＥＤＴＡを加えて１０分間簿履きせた。その上清を配列決定用ゲルにかけた。

この画分はＤＮＰ標識配列決定用生成物を含んでいる。反応はすべてＡＢＩ社製の３７３Ａ　ＤＮＡシークエンサー上で行った。

代表的な結果を表１及び表２に示す（それぞれ、１２ｂ　ＤＮＰと１２ｂ　ＳＡ）。

複合配列決定用溶液についての分離法は、配列決定法の如何にかかわらず、同一である。

国際調査報告　＋１１’Ｔ／／！１１０１７ｎＭＯ７

Claims

【特許請求の範囲】

１．標的ＤＮＡの２又はそれ以上の領域を配列決定する方法にして、上記領域の各々に異なる配列決定用プライマーをアニーリングした後、配列決定用ポリメラーゼ及び配列決定用ヌクレオチドを用いてＤＮＡ合成を行い、続いて合成されたＤＮＡのサイズ分画を行うが、上記配列決定用プライマーの各々には別々の識別用及び／又は固定化用の手段が与えてあり（ただし、上記配列決定用プライマーの一つは識別用及び／又は固定化用の手段を欠いていてもよい）、それによってＤＮＡの各々の領域から合成されたＤＮＡの集団を識別及び／又は分離を可能にすることを特徴とする方法。
２．請求項１記載の方法にして、標的二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を配列決定するため、溶液中で上記ＤＮＡを２つの一本鎖に分離して、各々の鎖に異なる配列決定用プライマーをアニーリングした後、配列決定用ポリメラーゼ及び配列決定用ヌクレオチドを用いてＤＮＡ合成を行い、続いて合成されたＤＮＡのサイズ分画を行うが、上記配列決定用プライマーの一つには識別用及び／又は固定化用の手段が与えてあり、もう一方のプライマーはかかる手段を欠いているか或いは異なる識別用及び／又は固定化用の手段が与えてあり、それによって、各ＤＮＡ鎖から合成されたＤＮＡの集団を識別及び／又は分離を可能にすることを特徴とする方法。
３．請求項１記載の方法にして、上記領域が同じＤＮＡ鎖上に別個に存在することを特徴とする方法。
４．請求項２記載の方法にして、上記鎖分離を加熱によって行い、かつ配列決定用ポリメラーゼが熱安定ポリメラーゼであることを特徴とする方法。
５．請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法にして、上記識別用手段が蛍光色素又は放射性核種であることを特徴とする方法。
６．請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法にして、上記固定化用手段がビオチン、ハプテン又はタンパク質結合ＤＮＡ配列であることを特徴とする方法。
７．請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法にして、様々な鎖長での鎖停止によって上記のＤＮＡ集団を生じさせるためのジデオキシヌクレオチドとデオキシヌクレオチドが存在していることを特徴とする方法。
８．請求項７記載の方法にして、ジデオキシヌクレオチドが異なる蛍光色素で標識され、かつ配列決定用プライマーが異なる固定化用手段を与えられていて、それにより、異なるプライマーを含有するＤＮＡ集団の分離及びサイズ分画を可能にすることを特徴とする方法。
９．請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法にして、１又はそれ以上の上記プライマーが固定化用手段と視覚シグナルを与える手段とを保有していることを特徴とする方法。
１０．請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法にして、最初の標的ＤＮＡを増幅に付すことを特徴とする方法。
１１．請求項１０記載の方法にして、ジデオキシヌクレオチド及びデオキシヌクレオチド存在下で請求項１記載のプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行うことによって、増幅及び配列決定を同時に実施することを特徴とする方法。
１２．請求項１記載の方法を実施するためのキットにして、識別用及び／又は固定化用の手段を与えた第一の配列決定用プライマー、かかる手段をもたないか或いは異なる識別用又は固定化用の手段を与えた第二の配列決定用プライマー、並びに任意成分として、上記第一及び第二のプライマーとは異なる識別用又は固定化用の手段を与えた１又はそれ以上の別の配列決定用プライマー；ポリメラーゼ；デオキシヌクレオチド三リン酸；ジデオキシヌクレオチド三リン酸（任意には、標識してあってもよい）；配列決定用緩衝液、のうちの１以上を含んでなることを特徴とするキット。