WO1996006880A1 - Biopolymere modifie par introduction de groupements soufres, procede d'obtention et applications a la fabrication de biomateriaux - Google Patents

Biopolymere modifie par introduction de groupements soufres, procede d'obtention et applications a la fabrication de biomateriaux Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to new derivatives of biopolymers:
  • Such derivatives are capable of being used, in particular, in the preparation of biomaterials, from which it is possible to obtain articles which are applicable, for example in medicine, and more particularly in surgery or in cosmetics.
  • articles we can cite: - artificial tissues or organs, such as artificial skin, prostheses or bone, ligament, cardiovascular, intraocular implants, etc.,
  • bioencapsulation systems implants, microspheres, microcapsules, allowing the controlled release of active ingredients.
  • the invention also relates to one of the processes for obtaining these new biopolymer derivatives.
  • Biopolymers must be biocompatible materials and capable of assimilating as best as possible to biological materials, particularly mechanically, so that they can be replaced.
  • biopolymers considered in this presentation are all the macromolecules of natural or synthetic origin and of protein and / or carbohydrate and / or lipid nature.
  • Collagen is a known protein, present at all levels of the organization of connective tissue: this is the main protein in the skin and connective tissue. By nature, it has biochemical and physicochemical characteristics relatively well suited for uses as biomaterials. Within the meaning of the present invention, it should be noted that the term “collagen” also designates any peptide of collagenic nature, such as native collagen with or without telopeptides, or any species of more or less denatured collagen, including gelatin.
  • graft a monofunctional reagent
  • amino acid composition may vary depending on the origin of the collagen (pig skin or bone) and the method of extraction (digestion in an acidic or basic medium) of the protein, the average amino acid composition can be determined functional function (expressed as the number of amino acids per hundred amino acids in the protein): glutamic acid ⁇ 7, aspartic acid "4, serine” 2, threonine ⁇ 3, hydroxyproline "8, arginine ⁇ 5, lysine ⁇ 3.
  • the chemical crosslinking techniques known in the art involve toxic reagents (dialdehydes, glutaraldehydes, diacid chloride and diisocyanates) and / or generate residues affected by the same defect.
  • the crosslinking agent used is a cystine derivative, in which the two amino functions of cystine have been blocked by a protective group, of the benzyloxycarbonyl type and in which the two acid functions of cystine have been activated by esterification with using nitrophenol.
  • the grafting of this cystine derivative on the collagen takes place in a neutral medium based on dimethylformamide and water. After grafting on the collagen, the disulfide bridges were reduced, then reoxidized by air oxygen (self-crosslinking factor) in basic medium.
  • 4-carboxy-L-thiazolidine is known, capable of being obtained by condensation of aldehyde or ketone with cysteine and used in synthesis peptide as an amino acid substituent.
  • the present invention aims to provide a biopolymer, and in particular a modified collagen, a precursor of crosslinkable forms by the formation of disulphide bridges in the presence of mild oxidants providing excellent control of the kinetics and of the crosslinking rate.
  • Another object of the invention is to provide a biopolymer, in particular a collagen, "thiolated” i. e crosslinkable and from a stable "pre-crosslinkable” form.
  • Another object of the invention is to provide a biopolymer, and in particular a modified collagen, which is in the form of a reticulate comprising S - S bridges.
  • Another object of the invention is to provide a process for the preparation of modified biopolymers, in particular collagens, which is simple to use and which leads to precursors of crosslinkable forms, which precursors being stable and easily convertible into crosslinkable products, without 'it is necessary to go through reticulated forms.
  • the present invention which relates, first of all, to a biopolymer, in particular collagen, modified using grafts consisting of residues of cysteine or of its derivatives ("residues cysteics ”) linked to reactive functions, of which said biopolymer is carrying and each comprising at least one sulfur group and at least one nitrogen group, both protected by a single protective group.
  • cysteic residues mentioned above are compounds comprising at least one sulfur functionality of the thiol type and at least one nitrogen functionality of the amino type. It can be, for example, residues of cysteine, homocysteine, penicillamine, etc.
  • One of the original features of the invention resides in the fact of having found a protective group, constituted by a single and same molecular entity, and matching particularly well both with the sulfur groups and with the nitrogen groups of the cysteic residue.
  • this graft corresponds to the following general formula (I)
  • R 1 and R 2 are integer and when this integer is greater than 1, R 1 and R 2 may be identical or different from carbon to carbon,
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 are similar or different and represent hydrogen or a hydrocarbon radical, preferably chosen from linear and / or cyclic and / or branched alkyls, aryls, aralkyls, alkenyls , aralkenyls, alkynes or aralcynes, all these radicals being optionally substituted, and lower C 1 -C 6 alkyls being more particularly preferred,
  • R 5 is hydrogen or a hydrocarbon radical, preferably chosen from acyl, alkyloxycarbonyl, aryloxycarbonyl or aralkyloxycarbonyl radicals, hydrogen being more particularly preferred.
  • This graft is directly linked to biopolymers via its carboxylic function, which is capable of reacting with reactive sites of the NH 2 and OH type of the biopolymer, when it has them. And this is the case with collagen.
  • the graft can consist of y repeating units, which gives it a polygreffon character, linked to at least one substitution site for the biopolymer via carbonyl.
  • x and y are equal to 1 or 2, preferably 1, independently of one another.
  • the substituents R 1 , R 2 , R 3 and R 4 of graft I according to the invention correspond to hydrogen or to the following lower alkyl radicals: methyl, ethyl, propyl, butyl.
  • the products thus transformed constitute precursors of those in crosslinkable form.
  • These precursors have the advantage of being particularly stable in the open air and of being able to be used directly for obtaining crosslinkable biomaterials, in a first step, and crosslinked biomaterials in a second step.
  • the first step is simply to put the biopolymer linked to graft I in an aqueous solution, within which the release of the protective group masking the thiol functions, which are capable of self-crosslinking in a second step and this, so spontaneous or by implementing an oxidation, preferably gentle.
  • the subject of the present invention is therefore also: - on the one hand, the biopolymer, in particular collagen, thiol obtained from the precursor defined above, - and, on the other hand, the biopolymer, in particular collagen, crosslinked by formation of disulphide bridges and obtained directly from the thiolated product and, in fact, indirectly from the precursor.
  • the biopolymer in particular collagen, thiol obtained from the precursor defined above
  • the biopolymer in particular collagen, crosslinked by formation of disulphide bridges and obtained directly from the thiolated product and, in fact, indirectly from the precursor.
  • These three types of modified biopolymers or collagens can be easily shaped and handled industrially.
  • the simple and economical nature of their synthesis should be emphasized.
  • they make it possible to obtain medical articles of the type implants, prostheses or artificial skins, non-toxic, non-immunogenic and whose mechanical and biological properties can be perfectly adapted to the intended application.
  • this substituent R 5 corresponds to hydrogen.
  • This characteristic is particularly original and advantageous because it reflects the fact that, in accordance with the invention and in a su ⁇ renant and unexpected manner, it is not necessary to provide protection on the nitrogen (amino) group of the graft 1 This removes a whole series of operations and reagents more or less easy to eliminate and liable to pollute the biomaterial. It goes without saying that this advantage cannot be considered as a limitation of the invention.
  • the substituent R 5 can be constituted by any protective group known in itself and suitable for peptide synthesis, e. g: benzyloxycarbonyl, nitrobenzyloxycarbonyl, butoxycarbonyl, etc.
  • the grafting rate of this modified biopolymer, in particular of this collagen can vary within a wide range of values. This is particularly interesting with regard to the adaptability, in particular in terms of mechanical properties, of the biomaterial in its crosslinked form, to various end applications.
  • the graft I is fixed to the biopolymer, in a concentration less than or equal to about 3.0 mmol of (I) / g of collagen.
  • Collagen is a biopolymer, which is particularly well, but not limited to, within the scope of the invention. It can be native collagen, with or without telopeptides, or even collagen in denatured form (unwound). According to another of its aspects, the present invention relates to a process for the preparation of a biopolymer, in particular of modified collagen, consisting essentially:
  • a solvent preferably an organic solvent
  • a graft consisting of at least one cysteic residue comprising at least one sulfur group and at least one nitrogen group, both protected by a single protective group
  • the graft responds to the general formula (F) below
  • R 1 and R 2 are integer and when this integer is greater than 1, R 1 and R 2 may be identical or different from carbon to carbon,
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 are similar or different and represent hydrogen or a hydrocarbon radical, preferably chosen from linear and / or cyclic and / or branched alkyls, aryls, aralkyls, alkenyls , aralkenyls, alkynes or aralcynes, all these radicals being optionally substituted, and lower C 1 -C 6 alkyls being more particularly preferred,
  • R 5 is hydrogen or a hydrocarbon radical, preferably chosen from acyl, alkyloxycarbonyl, aryloxycarbonyl or aralkyloxycarbonyl radicals, hydrogen being more particularly preferred,
  • the principle of this process therefore consists in reacting the graft F with the reactive sites of the polymer chains (NH 2 , OH in the case of collagen).
  • the bonds thus formed are therefore ester or peptide bonds which make it possible to provide, through compound V, nitrogen and sulfur functionalization, the latter conferring on the biopolymers a capacity for crosslinking.
  • x and y correspond, advantageously, to 1.
  • R 5 represents, for its part, hydrogen or a protective group for conventional amines, hydrogen being more commonly retained.
  • Z a hydroxyl (acid form of the molecule) or conventional activation radicals in peptide synthesis are advantageously selected, as will be described below.
  • grafts Y examples include: 4-carboxy-2,2-dimethylthiazolidine, 4-carboxy-thiazolidine or 4-carboxy-2,2,5,5-tetramethylthiazolidine.
  • the starting biopolymer is a native collagen or an atelocollagen, denatured or not, or alternatively a mixture of at least two of these different collagens.
  • the method according to the invention allows a simple and economical grafting of compound Y on the biopolymer.
  • the graft Y is preferably formed from 4-carboxythiazolidine
  • the starting biopolymer is a native collagen or an atelocollagen, denatured or not, or alternatively a mixture of at least two of these different collagens.
  • the starting collagen biopolymer is dissolved or dispersed in the solvent medium, preferably anhydrous.
  • this solvent is selected from organic solvents and, preferably, from the following nonlimiting list: N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolydone, dimethylsulfoxide, methanol, ethanol , propanol or other alcohol as well as the analogues of all these solvents and their mixtures.
  • This solubilization is preferably carried out separately and before bringing said starting polymer into contact with graft I '.
  • Such activation is well known in the field of peptide synthesis. It consists in coupling the acid function with compounds capable of promoting the formation of an amide between the COOH of graft Y and the reactive sites of primary amide type of the biopolymer.
  • a suitable coupling system there may be mentioned:
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • CDI - carbonyldiimidazole
  • DMAP N, N-dimethylpyridine
  • the reaction between the solvated biopolymer and the graft is carried out by mixing its compounds and keeping the reaction medium under stirring for several hours.
  • solvent to precipitate collagen, mix with a suitable additive. Acetone and ethyl acetate are two examples of this type of additive.
  • This methodology makes it possible to obtain a biopolymer, in particular a collagen, modified by reaction with the graft Y, the latter corresponding to formula (I) once bound to the polymer.
  • crosslinkable biopolymer precursor i. thiolated
  • this deprotection can consist of a hydrolysis of the protective group, intervening during the implementation of said biomaterial or during a purification, such as dialysis.
  • an acid medium at a pH, preferably, less than or equal to 4.
  • the biopolymer (collagen) thus prepared is functionalized by SH groups according to variable grafting rates: between 80-90 grafts (I) (deprotected cysteic residues) per 1000 amino acids of the collagen, in the case where the biopolymer considered is formed by this protein.
  • the mild oxidation conditions recommended in accordance with the invention consist in using: air, O 2 , iodinated compounds (I 2 , betadine or the like), H 2 O 2 , sodium persulfate , etc.
  • this process makes it possible to treat numerous biopolymers having reactive OH, NH 2 functions .
  • collagen in its native form t without causing denaturation of its triple helix structure, which can be particularly advantageous in certain applications.
  • the modified collagen according to the invention is not affected in its structural integrity and can be subjected to the known treatment of fibrillogenesis at isoelectric pH (phosphate pH approximately 7.4). According to this treatment, an alignment of the triple helices of collagen is caused by the interaction of the charged radicals NH 3 + and COO " which collagen carries at this pH.
  • the graft (F) is attached to collagen, by forming an amide bond with the amino acids, collagenic amino acids.
  • the amines thus neutralized are replaced by the NR 5 amines of the grafts (Y).
  • the modified collagen always has a amino functionality allowing fibrillogenesis.
  • the present invention therefore also relates to a modified collagen characterized in that it is in the form of non-denatured triple helices and in that these triple helices are organized and aligned in a bundle, so as to form a fibrous structure.
  • the non-hydrolyzed intermediate products which it allows to obtain are stable in the open air.
  • reaction conditions] es and the reagents used within the framework of the process according to the invention are not toxic, nor aggressive in themselves with respect to living tissues, any more than they are convertible into by-products having these characters.
  • these reagents are not numerous and can be easily removed by non-degrading methods, such as dialysis for example.
  • Obtaining thiolated biopolymers according to this process does not involve the formation of biopolymers in crosslinked form, which constitutes an additional and troublesome step on the industrial level.
  • This method according to the invention also offers the very appreciable possibility of being able to control the kinetics and the rate of crosslinking of the collagen, which subsequently makes it possible to modulate its mechanical properties.
  • crosslinkable products according to the invention find immediate applications, on the one hand, in human medicine and, on the other hand, in the field of biology.
  • these may be implants, for example ophthalmological, prostheses, for example bone, dressings in the form of films or felts, artificial tissues (epidermis, vessels, ligaments, bones), systems of bioencapsulation (microspheres, microcapsules) allowing the controlled release of active ingredients in vivo, biocompatibilization coatings for implantable medical articles or, even, sutures.
  • implants for example ophthalmological, prostheses, for example bone, dressings in the form of films or felts, artificial tissues (epidermis, vessels, ligaments, bones), systems of bioencapsulation (microspheres, microcapsules) allowing the controlled release of active ingredients in vivo, biocompatibilization coatings for implantable medical articles or, even, sutures.
  • the materials according to the invention constitute excellent supports for two-dimensional cell cultures (films) and three-dimensional (felts).
  • the crosslinked collagen according to the invention can be used alone or as a mixture with modified or unmodified biological polymers or synthetic polymers.
  • atelocollagen is carried out in 150 ml of methanol.
  • a DMT solution is prepared (according to the method of J. KEMP, "Org. Chem.”, 1989, 54, 3640).
  • An activation step is then carried out by reaction of 1.18 g of DMT-COOH and 1.17 g of carbonyldiimidazole (CDI) in 10 ml of N-methylpyrrolidine (NMP) for 60 minutes at room temperature.
  • CDI carbonyldiimidazole
  • NMP N-methylpyrrolidine
  • Collagen precipitation is carried out by the addition of one liter of ethyl acetate. Filtration and drying finally give a white product (1.5 g).
  • graft I (cysteic residue) is determined by reaction with dithionitrobenzoic acid (DTNB), then spectrophotometric assay.
  • DTNB dithionitrobenzoic acid
  • the graft I content (cysteic residue) is determined by reaction with DTNB, then spectrophotometric assay.
  • an activated DMT solution is prepared by reacting 1.0 g of 4-carboxy-thiazolidine (Aldrich) with 1.17 g of CDI in 10 ml of for 60 minutes at room temperature. The two solutions are then mixed together for 16 hours. After adding 30 ml of water at pH 2, the solution is dialyzed against water at pH 2, then lyophilized. Finally, a deprotected white product (1.5 g) is recovered.
  • the content of cysteic residues is determined by reaction with DTNB, then spectrophotometric assay.
  • Example 1 The product obtained in Example 1 is dissolved in an aqueous medium pH 3 at a concentration of 1% and the solution is poured into a mold. Hydrogen peroxide is added to obtain a final concentration of 0.3% and left to stand for 24 hours. The soft gel is then recovered, washed with water and stored in a humid enclosure. The calorimetric analysis reveals that the denaturation temperature in buffer solution pH 7.4 is 48 ° C.
  • Example 2 The product obtained in Example 1 is dissolved in an aqueous medium pH 3 at a concentration of 1% and an iodine solution (3% I 2 -KI) is added. The disappearance of the characteristic color of the iodine is observed and the formation of a gel identical to that obtained in Example 2.
  • Example 1 The product obtained in Example 1 is dissolved at + 4 ° C in an aqueous medium of pH 2 at a concentration of 3.5 g / 1 for 24 hours. The solution thus obtained is maintained at 4 ° C. A quantity of 0.2 M of potassium phosphate (dibasic) is added thereto to reach a pH of 7.4. The solution is then heated to 24 ° C. It is maintained at 24 ° C for 4 hours. The medium is then centrifuged to recover the pieces of hydrogel, which are washed with phosphate buffer (pH 7.4) then recentrifuged. The calorimetric analysis reveals that the denaturation temperature in buffer solution pH 7.4 is 48 ° C.
  • the products obtained in Examples 2 and 3 can be dissolved in an aqueous medium pH 3-10 at a concentration of 10%.
  • a physical gel is obtained by cooling the solutions. Then, the object can be removed from the mold and placed in a hydrogen peroxide bath (at 1%) cooled to 4 ° C for 24 hours. The crosslinked gels obtained are then recovered from the bath, washed with water and stored in a humid enclosure.

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Abstract

La présente invention concerne de nouveaux dérivés de biopolymères: sous forme de précurseurs de produits réticulables, sous forme de produits réticulables ou sous forme de produits au moins partiellement réticulés. Plus précisément, l'invention a pour objet un biopolymère, en particulier collagène, modifié à l'aide de greffons constitués par des résidus de cystéine ou de ses dérivés ('résidus cystéiques') liés à des fonctions réactives dont est porteur ledit biopolymère et comprenant chacun au moins un groupement soufré et au moins un groupement azoté, tous deux protégés par un seul et même groupement protecteur. L'invention vise, également, un procédé d'obtention d'un tel biopolymère. Ce biopolymère est susceptible d'être utilisé, notamment, dans la préparation de biomatériaux, à partir desquels des articles applicables, par exemple en médecine, et plus particulièrement en chirurgie ou en cosmétique, peuvent être obtenus (prothèses, implants, etc...).

Description

BIOPOLYMERE MODIFIE PAR INTRODUCTION DE GROUPEMENTS SOUFRES , PROCEDE D' OBTENTION ET APPLICATIONS A LA FABRICATION DE BIOMATERIAUX
DOMAINE TECHNIQUE :
La présente invention concerne de nouveaux dérivés de biopolymères :
- sous forme de précurseurs de produits réticulables,
- sous forme de produits réticulables, - ou sous forme de produits au moins partiellement réticulés.
De tels dérivés sont susceptibles d'être utilisés, notamment, dans la préparation de biomatériaux, à partir desquels on peut obtenir des articles applicables, par exemple en médecine, et plus particulièrement en chirurgie ou en cosmétique. Parmi ces articles, on peut citer : - les tissus ou les organes artificiels, tels que la peau artificielle, les prothèses ou implants osseux, ligamentaires, cardiovasculaires, intra-oculaires, etc,
- les accessoires médicaux, tels que les fils de sutures ou les revêtements de biocompatibilisation d'articles médicaux implantables,
- ou bien encore les systèmes de bioencapsulation (implants, microsphères, microcapsules), permettant la libération contrôlée de principes actifs.
L'invention concerne, égalemement, l'un des procédés d'obtention de ces nouveaux dérivés de biopolymères.
Les biopolymères doivent être des matériaux biocompatibles et capables de s'assimiler au mieux aux matériaux biologiques, notamment sur le plan mécanique, de manière à pouvoir les remplacer.
Les biopolymères considérés dans le présent exposé sont toutes les macromolécules d'origine naturelle ou synthétique et de nature protéique et/ou glucidique et/ou lipidique.
Sans que cela ne soit limitatif, on s'intéressera ici plus spécifiquement aux dérivés de collagène.
Le collagène est une protéine connue, présente à tous les niveaux de l'organisation des tissus conjonctifs : il s'agit de la principale protéine de la peau et du tissu conjonctif. Par nature, il possède des caractéristiques biochimiques et physico-chimiques relativement bien adaptées pour des utilisations en tant que biomatériaux. Au sens de la présente invention, il est à noter que le terme "collagène" désigne également tout peptide de nature collagénique, tel que le collagène natif avec ou sans télopeptides, ou toute espèce de collagène plus ou moins dénaturé, gélatine y compris.
TECHNIQUE ANTERIEURE :
Pour adapter les biopolymères, en particulier le collagène, à leurs applications, il est très vite apparu nécessaire de les soumettre à des modifications chimiques en vue de leur conférer de nouvelles propriétés chimiques et/ou biochimiques et/ou physiques, dont notamment une meilleure résistance mécanique et une meilleure résistance à la protéolyse.
S'agissant du collagène, on distingue trois types de modifications chimiques ayant en commun la mise en réaction d'une ou plusieurs fonctions libres réactives du collagène avec au moins un composé organique ou minéral :
- autoréticulation du collagène sous l'effet du composé ajouté, - réticulation du collagène à l'aide d'un composé difonctionnel créant des pontages entre les chaînes,
- greffage d'un réactif monofonctionnel ("greffon") sur le collagène, de façon à modifier son comportement chimique et/ou physique.
11 va de soi qu'il existe un plafond de réticulation et/ou de fonctionnalisation du biopolymère, par des greffons réticulants. Ce plafond est dépendant du nombre de sites ou de fonctions réactives présentes sur chaque chaîne de collagène.
Bien que la composition d'acides aminés puisse varier selon l'origine du collagène (peau ou os de porc) et la méthode d'extraction (digestion en milieu acide ou basique) de la protéine, on peut déterminer la composition moyenne en acides aminés fonctionnels suivante (exprimée en nombre d'acides aminés pour cent acides aminés de la protéine) : acide glutamique ≈ 7, acide aspartique « 4, serine » 2, thréonine ≈ 3, hydroxyproline « 8, arginine ≈ 5, lysine ≈ 3. Les techniques de réticulation chimique connues en la matière font intervenir des réactifs toxiques (dialdéhydes, glutaraldéhydes, chlorure de diacide et diisocyanates) et/ou génèrent des résidus affectés du même défaut.
Il a été proposé, également, d'exploiter le pontage le plus couramment rencontré sur le plan biologique, la liaison disulfure - S - S -.
L'article intitulé "Einbau von cystin-brucken in kollagen", F. SCHADE & H. ZAHN, Angew, Chem 74, 904 (1962), décrit ainsi la fixation directe d'un dérivé de la cystine sur du collagène, pour tenter d'effectuer une réticulation par pontage S - S - ("thiolation du collagène"). L'agent réticulant mis en oeuvre est un dérivé de la cystine, dans lequel les deux fonctions aminés de la cystine ont été bloquées par un groupement protecteur, du genre benzyloxycarbonyle et dans lequel les deux fonctions acides de la cystine ont été activées par estérification à l'aide de nitrophénol. Le greffage de ce dérivé de cystine sur le collagène s'opère dans un milieu neutre à base de diméthylformamide et d'eau. Après greffage sur le collagène, les ponts disulfure ont été réduits, puis réoxydés par l'oxygène de l'air (facteur d'autoréticulation) en milieu basique.
On connaît également, par la demande de brevet EP 0 052 288, ainsi que par la demande de brevet FR 92-07 692 au nom de la Demanderesse, une modification du collagène consistant à lui greffer, sur ses fonctions réactives de type NH2 et OH, des greffons formés par un composé d'espacement et un reste cystéique (= cystéine). Dans ces deux demandes de brevet, les composés d'espacement sont, respectivement, un dialdéhyde et un diacide carboxylique.
Il est à souligner que ces deux techniques sont relativement complexes et comprennent un nombre important d'étapes. En particulier, elles imposent de passer par une forme réticulée S - S du collagène, d'où il s'ensuit que les formes réticulables ne peuvent être obtenues qu'après une étape de réduction plus ou moins complexe.
D'autres propositions de l'art antérieur reposent sur l'emploi de composés réactifs du type N-acétylhomocystéinethiolactone (cf. brevet US-A-1 712 193, US-A-3 329
574, US-A-3 111 512, EP-A-0 049 469). La protection de la fonction aminé de l'homocystéine par "N-acétalisation", mise en oeuvre dans ces propositions techniques, est particulièrement gênante en raison de sa non réversibilité. Aucun des susdits documents ne donne d'ailleurs de moyens faciles pour l'élimination de ce groupement protecteur.
Dans un autre registre que celui de la modification chimique de biopolymères, et en particulier de collagènes, on connaît la 4-carboxy-L-thiazolidine, susceptible d'être obtenue par condensation d'aldéhyde ou de cétone avec la cystéine et utilisée en synthèse peptidique en tant que substituant d'acides aminés. A cet égard, on se référera aux articles suivants :
- T. W. GREENE, P. G. M. WUTS ; John Wiley & Sons (NEW YORK), 1991, p. 292 : "Protective Groups in Organic Synthesis" (Voir également références citées dans cet article),
- ROSAMOND & FERGER - Oxytocyn Analogues - Journal of Médicinal Chemistry, 1976, vol. 19, n° 7, p. 873-876 : "Synthesis and Some Pharmacological Properties of Oxytocin Analogues Having L-Thiazolidine-4-carboxylic Acid in Position 7'".
Aucun de ces articles ne suggère la mise en oeuvre de la 4-carboxy-L- thiazolidine en tant que greffon de biopolymères et, en particulier, de collagène, afin de lui apporter une fonctionnalité "thiolée" de réticulation. Qui plus est, ces articles auraient plutôt tendance à détourner l'homme du métier de la démarche consistant à recourir à ces produits à titre de greffons. En effet, ces articles présentent la protection de la fonction aminé du cycle thiazolidine comme une étape indispensable et il est clair qu'une telle disposition est contraignante dans une perspective industrielle.
Force est donc de constater que l'art antérieur ne comprend que des propositions non satisfaisantes en matière de modifications chimiques de biopolymères, et en particulier de collagènes, à des fins de préparation de matériaux "préréticulables", réticulables et réticulés par formation de pontages S - S.
Il s'ensuit que la présente invention vise à fournir un biopolymère, et en particulier un collagène, modifié, précurseur de formes réticulables par formation de ponts disulfures en présence d'oxydants doux procurant une excellente maîtrise de la cinétique et du taux de réticulation. Un autre but de l'invention est de fournir un biopolymère, en particulier un collagène, "thiolé" i. e réticulable et issu d'une forme stable "préréticulable". Un autre but de l'invention est de fournir un biopolymère, et en particulier un collagène, modifié se présentant sous forme de réticulat comprenant des pontages S - S.
Un autre but de l'invention est de fournir un procédé de préparation de biopolymères modifiés, en particulier de collagènes, simple à mettre en oeuvre et conduisant à des précurseurs de formes réticulables, lesquels précurseurs étant stables et transformables facilement en produits réticulables, sans qu'il soit nécessaire de passer par des formes réticulées.
BREVE DESCRIPTION DE LÎNVENTION :
Tous ces buts, parmi d'autres, sont atteints par la présente invention qui concerne, tout d'abord, un biopolymère, en particulier collagène, modifié à l'aide de greffons constitués par des résidus de cystéine ou de ses dérivés ("résidus cystéiques") liés à des fonctions réactives, dont est porteur ledit biopolymère et comprenant chacun au moins un groupement soufré et au moins un groupement azoté, tous deux protégés par un seul et même groupement protecteur.
Les résidus cystéiques sus-mentionnés sont des composés comprenant au moins une fonctionnalité soufrée du type thiol et au moins une fonctionnalité azotée du type aminé. Il peut s'agir, par exemple, de restes de cystéine, d'homocystéine, de pénicillamine, etc.
L'une des originalités de l'invention réside dans le fait d'avoir trouvé un groupement protecteur, constitué par une seule et même entité moléculaire, et s'appariant particulièrement bien à la fois aux groupements soufrés et aux groupements azotés du résidu cystéique.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION :
De manière préférée, ce greffon répond à la formule générale suivante (I)
Figure imgf000008_0001
dans laquelle :
- x est un nombre entier et lorsque ce nombre entier est supérieur à 1, R1 et R2 peuvent être identiques ou différents de carbone à carbone,
- y est un nombre entier,
- R1, R2, R3, R4 sont semblables ou différents et représentent l'hydrogène ou un radical hydrocarboné, de préférence choisi parmi les alkyles linéaires et/ou cycliques et/ou ramifiés, les aryles, les aralkyles, les alcényles, les aralcényles, les alcynes ou les aralcynes, tous ces radicaux étant éventuellement substitués, et les alkyles inférieurs en C,-C6 étant plus particulièrement préférés,
- R5 est l'hydrogène ou un radical hydrocarboné, de préférence choisi parmi les radicaux acyles, alkyloxycarbonyles, aryloxycarbonyles ou aralkyloxycarbonyles, l'hydrogène étant plus particulièrement préféré.
Ce greffon est directement lié aux biopolymères par l'intermédiaire de sa fonction carboxylique, laquelle est apte à réagir avec les sites réactifs de type NH2 et OH du biopolymère, lorsqu'il en possède. Et c'est bien le cas en ce qui concerne le collagène.
Comme cela ressort de la formule (I), le greffon peut être constitué de y unités récurrentes, ce qui lui donne un caractère de polygreffon, lié à au moins un site de substitution du biopolymère par l'intermédiaire du carbonyle.
Avantageusement, x et y sont égaux à 1 ou 2, de préférence à 1, indépendamment l'un de l'autre.
Selon une disposition préférée de l'invention, les substituants R1, R2, R3 et R4 du greffon I selon l'invention correspondent à l'hydrogène ou aux radicaux alkyles inférieurs suivants : méthyle, éthyle, propyle, butyle.
De façon encore plus privilégiée, R1 = R2 = H ou CH3 et R3 = R4 = CH3.
Pour compléter la définition de ce mode préféré de réalisation du greffon selon l'invention, il convient d'indiquer que la forme la plus courante est celle dans laquelle : x = y ≈ 1 avec R1, R2 = H et R3 = R4 = CH3. On est alors en présence d'un reste 4-carbonyle-L-thiazolidine fixé sur les chaînes du biopolymère et, en particulier, du collagène.
Les produits ainsi transformés constituent des précurseurs de ceux se présentant sous forme réticulable. Ces précurseurs présentent l'avantage d'être particulièrement stables à l'air libre et de pouvoir être utilisés directement pour l'obtention de biomatériaux réticulables, dans une première étape, et de biomatériaux réticulés dans une deuxième étape.
La première étape consiste simplement à mettre le biopolymère lié au greffon I dans une solution aqueuse, au sein de laquelle se produit la libération du groupement protecteur masquant les fonctions thiols, lesquelles sont aptes à s'autoréticuler dans une deuxième étape et ce, de manière spontanée ou par mise en oeuvre d'une oxydation, de préférence douce.
La présente invention a donc également pour objet : - d'une part, le biopolymère, en particulier le collagène, thiolé obtenu à partir du précurseur défini ci -dessus, - et, d'autre part, le biopolymère, en particulier le collagène, réticulé par formation de ponts disulfures et obtenu directement à partir du produit thiolé et, de fait, indirectement à partir du précurseur. Ces trois types de biopolymères ou collagènes modifiés sont aisément façonnables et manipulables industriellement. Il convient, en outre, de souligner le caractère simple et économique de leur synthèse. De plus, ils permettent d'obtenir des articles médicaux du type implants, prothèses ou peaux artificielles, atoxiques, non immunogènes et dont les propriétés mécaniques et biologiques peuvent être parfaitement adaptées à l'application visée.
Dans le mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, ce substituant R5 correspond à l'hydrogène. Cette caractéristique est particulièrement originale et avantageuse car elle traduit le fait que, conformément à l'invention et de manière suφrenante et inattendue, il n'est pas nécessaire de prévoir une protection sur le groupement azoté (aminé) du greffon 1 Cela supprime toute une série d'opérations et de réactifs plus ou moins faciles à éliminer et susceptibles de polluer le biomatériau. Il va de soi que cet avantage ne saurait être considéré comme une limitation de l'invention. Ainsi, le substituant R5 peut être constitué par tout groupement protecteur connu en lui-même et approprié en synthèse peptidique, e. g : benzyloxycarbonyle, nitrobenzyloxycarbonyle, butoxycarbonyle ... Le taux de greffage de ce biopolymère, en particulier de ce collagène, modifié peut varier dans une large plage de valeurs. Ceci est particulièrement intéressant au regard de l'adaptabilité, notamment sur le plan des propriétés mécaniques, du biomatériau dans sa forme réticulée, à diverses applications finales.
Suivant une caractéristique avantageuse de l'invention, le greffon I est fixé sur le biopolymère, dans une concentration inférieure ou égale à environ 3,0 mmol de (I)/g de collagène.
Le collagène est un biopolymère, qui s'inscrit particulièrement bien, mais non limitativement, dans le cadre de l'invention. Il peut s'agir de collagène natif, avec ou sans télopeptides, ou bien encore de collagène sous forme dénaturée (débobinée). Selon un autre de ses aspects, la présente invention concerne un procédé de préparation d'un biopolymère, en particulier de collagène modifié, consistant, essentiellement :
- à mettre le biopolymère de départ en présence d'un solvant, de préférence organique, - à mettre en oeuvre au moins un greffon constitué par au moins un résidu cystéique comprenant au moins un groupement soufré et au moins un groupement azoté, tous deux protégés par un seul et même groupement protecteur,
- à faire réagir le biopolymère solvaté avec le greffon, - et à récupérer le biopolymère ainsi modifié.
Selon une caractéristique préférée de ce procédé, le greffon répond à la formule générale (F) suivante
(D
dans laquelle :
Figure imgf000011_0001
- x est un nombre entier et lorsque ce nombre entier est supérieur à 1, R1 et R2 peuvent être identiques ou différents de carbone à carbone,
- y est un nombre entier,
- R1, R2, R3, R4 sont semblables ou différents et représentent l'hydrogène ou un radical hydrocarboné, de préférence choisi parmi les alkyles linéaires et/ou cycliques et/ou ramifiés, les aryles, les aralkyles, les alcényles, les aralcényles, les alcynes ou les aralcynes, tous ces radicaux étant éventuellement substitués, et les alkyles inférieurs en C,-C6 étant plus particulièrement préférés,
- R5 est l'hydrogène ou un radical hydrocarboné, de préférence choisi parmi les radicaux acyles, alkyloxycarbonyles, aryloxycarbonyles ou aralkyloxycarbonyles, l'hydrogène étant plus particulièrement préféré,
- Z = H, halogène, OR6 avec R6 = hydrogène, alkyle, aryle ou aralkyle, imidazole ou autres résidus minéraux ou organiques, aptes à conférer au greffon une réactivité vis-à-vis des fonctions aminés et ou alcools du biopolymère, afin de former des liaisons covalentes de type ester et/ou amide.
Le principe de ce procédé consiste donc à faire réagir le greffon F avec les sites réactifs des chaînes du polymère (NH2, OH dans le cas du collagène). Les liaisons ainsi formées sont donc des liaisons esters ou peptidiques qui permettent d'apporter, au travers du composé V, une fonctionnalisation azotée et soufrée, cette dernière conférant aux biopolymères une aptitude à la réticulation.
Avantageusement, R2, R3 et R4 = CH3 ou H dans la formule Y. Plus préférentiel lement encore, R', R2 = CH3 et R3, R4 ≈ H.
De même que pour le greffon I' décrit ci-avant, x et y correspondent, avantageusement, à 1.
R5 représente, quant à lui, l'hydrogène ou un groupement protecteur des aminés conventionnels, l'hydrogène étant plus couramment retenu. S'agissant de Z, on sélectionne avantageusement un hydroxyle (forme acide de la molécule) ou des radicaux d'activation classique en synthèse peptidique, comme cela sera décrit infra.
A titre d'exemples de greffons Y on peut citer : le 4-carboxy-2,2- diméthylthiazolidine, le 4-carboxy-thiazolidine ou le 4-carboxy-2,2,5,5- tétraméthylthiazolidine.
Conformément à une modalité préférée de l'invention, le biopolymère de départ est un collagène natif ou un atélocollagène, dénaturé ou non, ou bien encore un mélange d'au moins deux de ces différents collagènes.
Le procédé selon l'invention permet un greffage simple et économique du composé Y sur le biopolymère. A ce propos, on peut d'ailleurs signaler que, dans le cas où le greffon Y est formé de manière préférée de 4-carboxythiazolidine, on a affaire à un réactif disponible facilement, préparable par condensation de cystéine avec une cétone ou un aldéhyde.
Conformément à une modalité préférée de l'invention, le biopolymère de départ est un collagène natif ou un atélocollagène, dénaturé ou non, ou bien encore un mélange d'au moins deux de ces différents collagènes.
En pratique, le biopolymère collagène de départ est solubilisé ou dispersé dans le milieu solvant, de préférence anhydre. Suivant une disposition avantageuse de l'invention, ce solvant est sélectionné parmi les solvants organiques et, de préférence, parmi la liste non limitative suivante : N,N-diméthylformamide, N,N- diméthylacétamide, N-méthylpyrrolydone, diméthylsulfoxyde, méthanol, éthanol, propanol ou autre alcool ainsi que les analogues de tous ces solvants et leurs mélanges.
Cette solubilisation (ou dispersion) s'effectue, de préférence, séparément et avant la mise en présence dudit polymère de départ avec le greffon I'. Selon une modalité avantageuse de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, il est prévu d'activer le reste carboxylique du greffon Y avant de le faire réagir avec le biopolymère, en particulier le collagène. Une telle activation est bien connue dans le domaine de la synthèse peptidique. Elle consiste à accoupler la fonction acide avec des composés aptes à favoriser la formation d'un amide entre le COOH du greffon Y et les sites réactifs de type amide primaire du biopolymère. A titre d'exemple de système de couplage approprié, on peut citer :
- le dicyclohexylcarbodiimide (DCC) en présence ou non de N-hydroxysuccinimide ou de N-hydroxybenzotriazole, respectivement HOSu et HOBt,
- le carbonyldiimidazole (CDI) en présence ou non de N,N-diméthylpyridine (DMAP).
La réaction entre le biopolymère solvaté et le greffon (système d'activation) s'effectue par mélange de ses composés et maintien du milieu réactionnel sous agitation pendant plusieurs heures. Une fois la modification chimique du biopolymère terminée, on récupère celui-ci par précipitation et/ou élimination du solvant, ladite élimination s'opère, de préférence, par filtration, par séparation selon un gradient de densité (décantation, centrifugation) ou par évaporation de solvant. Pour précipiter le collagène, on mélange avec un additif approprié. L'acétone et l'acétate d'éthyle sont deux exemples de ce type d'additif.
Cette méthodologie permet d'obtenir un biopolymère, en particulier un collagène, modifé par réaction avec le greffon Y, ce dernier répondant à la formule (I) une fois lié au polymère.
Il s'agit donc d'un précurseur de biopolymère réticulable, i. e thiolé, qui peut être préparé très aisément en mettant ledit précurseur en présence d'un milieu aqueux de déprotection. En pratique, cette déprotection peut consister en une hydrolyse du groupement protecteur, intervenant lors de la mise en oeuvre dudit biomatériau ou lors d'une purification, telle qu'une dialyse. Pour éviter que le biopolymère s'autoréticule lors de la dialyse, on effectue celle-ci en milieu acide, à un pH, de préférence, inférieur ou égal à 4.
Le biopolymère (collagène) ainsi préparé est fonctionnalisé par des groupements SH selon des taux de greffage variables : compris entre 80-90 greffons (I) (résidus cystéiques déprotégés) pour 1 000 acides aminés du collagène, dans le cas où le biopolymère considéré est formé par cette protéine.
Pour poursuivre encore la transformation du biopolymère (collagène), il est possible de le soumettre, dans sa forme thiolée protégée ou non, à une oxydation, de préférence dans des conditions douces, aptes à l'amener à un état au moins partiellement réticulé, par formation de ponts disulfures.
Les conditions d'oxydation douces préconisées conformément à l'invention consistent à recourir à : l'air, l'O2, des composés iodés (I2, bétadine ou analogues), de l'H2O2, du persulfate de sodium, etc.
Une telle oxydation conduit à un réseau tridimensionnel insoluble dans les milieux physiologiques et soluble dans des milieux réducteurs capables de réduire les ponts disulfures.
Comme cela ressort de ce qui précède, le procédé selon l'invention bénéficie de nombreux avantages.
Tout d'abord, ce procédé permet de traiter de nombreux biopolymères possédant des fonctions réactives OH, NH2. En particulier du collagène, dans sa forme nativet sans engendrer de dénaturation de sa structure triple hélice, ce qui peut être particulièrement intéressant dans certaines applications.
A cet égard, il faut observer que le collagène modifié selon l'invention n'est pas atteint dans son intégrité structurelle et peut être soumis au traitement connu de fibrillogénèse au pH isoélectrique (phosphate pH environ 7,4). Selon ce traitement, on provoque un alignement des triples hélices de collagène grâce à l'interaction des radicaux chargés NH3 + et COO" dont est porteur le collagène à ce pH,.
Or, comme indiqué supra, le greffon (F) est fixé au collagène, par formation d'une liaison amide avec les aminés, des acides aminés collagéniques. Les aminés ainsi neutralisées sont remplacées par les aminés N-R5 des greffons (Y).
Ainsi, dans le cas où R5 = H, le collagène modifié dispose toujours d'une fonctionnalité aminé permettant la fibrillogénèse.
Conformément à l'invention, il est donc possible d'obtenir un alignement et une organisation en fibres alignées, des triples hélices non dénaturées du collagène modifié. La présente invention a donc également pour objet un collagène modifié caractérisé en ce qu'il se présente sous forme de triples hélices non dénaturées et en ce que ces triples hélices sont organisées et alignées en faisceau, de manière à former une structure fibreuse.
Pour compléter la liste des avantages du procédé selon l'invention, on indiquera qu'il est de mise en oeuvre aisée, rapide et économique.
La préparation des différentes formes de modification, à savoir précurseur, forme thiolée, forme réticulée, s'effectue de manière douce, sans multiplication de réactifs et d'étapes de procédé.
Les produits intermédiaires non hydrolyses qu'il permet d'obtenir sont stables à l'air libre.
Le schéma réactionnel qui caractérise ce procédé est énantiosélectif, ce qui permet de garantir la biocompatibilité des matériaux synthétisés.
Les conditions réactionnel] es et les réactifs utilisés dans le cadre du procédé selon l'invention ne sont pas toxiques, ni agressifs en eux-mêmes vis-à-vis des tissus vivants, pas plus qu'ils ne sont transformables en sous-produits ayant ces caractères. De plus, ces réactifs ne sont pas nombreux et sont facilement éliminables par des procédés non dégradants, comme la dialyse par exemple.
L'obtention de biopolymères thiolés selon ce procédé ne passe pas par la formation de biopolymères sous forme réticulée, qui constitue une étape supplémentaire et gênante sur le plan industriel.
Ce procédé selon l'invention offre également la possibilité très appréciable de pouvoir contrôler la cinétique et le taux de réticulation du collagène, ce qui permet, subséquemment, de moduler ses propriétés mécaniques.
Il faut souligner que les produits selon l'invention sont stérilisables par les méthodes classiques de stérilisation de polymères biologiques. APPLICATION INDUSTRIELLE :
Il s'ensuit que les produits réticulables selon l'invention trouvent des applications immédiates, d'une part, en médecine humaine et, d'autre part, dans le domaine de la biologie.
En médecine humaine, il peut s'agir d'implants, par exemple ophtalmologiques, de prothèses, par exemple osseuses, de pansements sous forme de films ou de feutres, de tissus artificiels (épiderme, vaisseaux, ligaments, os), de systèmes de bioencapsulation (microsphères, microcapsules) permettant la libération contrôlée de principes actifs in vivo, de revêtements de biocompatibilisation d'articles médicaux implan tables ou bien, encore, de fils de suture.
En biologie, les matériaux suivant l'invention constituent d'excellents supports pour cultures cellulaires bidimensionnelles (films) et tridimensionnelles (feutres). Le collagène réticulé selon l'invention peut être utilisé seul ou en mélange avec des polymères biologiques modifiés ou non ou des polymères synthétiques.
Pour chacune des applications biomédicales précitées, il est indispensable de disposer d'un collagène, réticulé, possédant des propriétés physicochimiques, mécaniques ou biologiques déterminées et spécifiques. Par conséquent, il est nécessaire de maîtriser parfaitement les modifications chimiques du collagène, de manière à pouvoir produire une gamme de collagènes réticulables et répondre ainsi, de façon satisfaisante, aux contraintes apparaissant lors de l'élaboration du cahier des charges d'une application donnée. Comme cela ressort de la description ci-dessus, l'invention répond parfaitement à cette nécessité. D'autres avantages et variantes de la présente invention ressortent bien des exemples de mise en oeuvre du procédé suivant l'invention donnés ci-après. EXEMPLES
EXEMPLE 1 : MODIFICATION DE COLLAGENE TRIPLE HELICE PAR REACTION
AVEC LE 4-CARBOXYi^DEVlETHYLTHIAZOLIDINE (DMT) [R1, R1 - H, RJ, R4 = CH, DANS LE GREFFON (T)J.
On effectue le gonflement de 1,5 g d'atélocollagène dans 150 ml de méthanol. Parallèlement à cela, on prépare une solution de DMT (selon la méthode de J. KEMP, "Org. Chem.", 1989, 54, 3640). On met ensuite en oeuvre une étape d'activation par réaction de 1,18 g de DMT- COOH et de 1,17 g de carbonyldiimidazole (CDI) dans 10 ml de N-méthylpyrrolidine (NMP) pendant 60 minutes à température ambiante. Les deux préparations sont ensuite mélangées ensemble pendant 16 heures. La précipitation du collagène est effectuée par l'addition d'un litre d'acétate d'éthyle. Une filtration et un séchage permettent d'obtenir enfin un produit blanc (1,5 g).
La teneur du greffon I (résidu cystéique) est déterminée par réaction avec l'acide dithionitrobenzoïque (DTNB), puis dosage spectrophotométrique.
RÉSULTATS : [SH] μmol/mg collagène modifié = 0,224, soit environ 26 résidus cystéiques par chaîne de collagène,
Analyse calorimétrique : température de dénaturation en solution tampon pH 7,4 de
44° C. Ceci est révélateur de la conservation de la triple hélice lors du greffage du
DMT.
EXEMPLE 2 : DENATURATION ET MODIFICATION DE COLLAGENE PAR
REACTION AVEC LE DMT (R', R' = H, RJ, R4 - CH,).
On effectue la dissolution de 1,5 g d'atélocollagène dans un mélange de 20 ml de méthanol (MeOH) et 30 ml de N-méthylpyrrolidinone (NMP). Après évaporation sous vide du méthanol, on obtient une solution transparente de collagène, qui a perdu sa forme en triple hélice.
Parallèlement, on prépare une solution de DMT activée par réaction de 1,18 DMT-
COOH et de 1,17 g de N,N-carbonyldiimidizole (CDI) dans 10 ml de NMP pendant
60 minutes à température ambiante. Les deux solutions sont ensuite mélangées ensemble avec 1 g de N,N-diméthylaminopyridine (DMAP) pendant 16 heures. Après l'ajout de 30 ml d'eau à pH 2, la solution est dialysée contre l'eau à pH 2, puis lyophilisée, afin d'obtenir un produit blanc déprotégé (1,5g).
La teneur en greffon I (résidu cystéique) est déterminée par réaction avec le DTNB, puis dosage spectrophotométrique.
RÉSULTATS :
[SH] μmol/mg collagène modifié = 0,229, soit environ 3,9 résidus cystéiques pour 100 AA de la chaîne de collagène.
Analyse calorimétrique : la température de fusion du gel physique en présence d'une solution tampon pH 7,4, est de 28° C. Ceci montre que la triple hélice a été détruite lors de la modification chimique.
EXEMPLE 3 : MODIFICATION DE GELATINE PAR REACTION AVEC LE DMT (R1,
R1 = H, R5, R4 = CH,).
On effectue la dissolution de 1,5 g de gélatine dans un mélange de 5 ml d'eau et 30 ml de NMP. On y ajoute 1,5 g d'acide succinique. Après évaporation sous vide de l'eau, on obtient une solution anhydre et transparente à base de gélatine. Parallèlement à cela, on prépare une solution de DMT activé, par réaction de 1,18 g de DMT-COOH avec 1,17 g de CDI dans 10 ml de NMP, pendant 60 minutes à température ambiante. Les deux solutions sont ensuite mélangées ensemble pendant 16 heures. Après l'ajout de 30 ml d'eau à pH 2, la solution est dialysée contre l'eau à pH 2, puis lyophilisée, afin d'obtenir un produit blanc déprotégé (1,5 g). La teneur en résidus cystéiques est déterminée par réaction avec le DTNB, puis dosage spectrophotométrique. RÉSULTATS :
[SH] μmol/mg collagène modifié = 0,229, soit environ 2,6 résidus cystéiques pour
100 AA.
EXEMPLE 4 : MODEF1CATION DE GELATINE PAR REACTION AVEC DE L'ACIDE
CARBOXYUQUE-4-TfflAZOLIDINE (R1, R2, R5, R4 ≈ H).
On effectue la dissolution de 1,5 g de gélatine dans un mélange de 5 ml d'eau et 10 ml de NMP. On ajoute à cela 1,5 g d'acide succinique. Après évaporation sous vide de l'eau, on obtient une solution anhydre et transparente à base de gélatine. Parallèlement à cela, on prépare une solution de DMT activée par réaction de 1,0 g de 4-carboxy-thiazolidine (Aldrich) avec 1,17 g de CDI dans 10 ml de pendant 60 minutes à température ambiante. Les deux solutions sont ensuite mélangées ensemble pendant 16 heures. Après l'ajout de 30 ml d'eau à pH 2, la solution est dialysée contre l'eau à pH 2, puis lyophilisée. On récupère enfin un produit blanc déprotégé (1,5 g).
La teneur en résidus cystéiques est déterminée par réaction avec le DTNB, puis dosage spectrophotométrique.
RÉSULTATS :
[SH] μmol/mg collagène modifié = 0,19, soit environ 2,3 résidus cystéiques pour 100 AA.
EXEMPLE 5 : OXYDATION DE COLLAGENE TRIPLE HELICE GREFFE PAR DU DMT AVEC LΕAU OXYGENEE.
Le produit obtenu dans l'exemple 1 est solubilisé en milieu aqueux pH 3 à une concentration de 1 % et on coule la solution dans un moule. On ajoute de l'eau oxygénée pour obtenir une concentration finale de 0,3 % et on laisse reposer pendant 24 heures. Le gel mou est ensuite récupéré, lavé à l'eau et stocké dans une enceinte humide. L'analyse calorimétrique révèle que la température de dénaturation en solution tampon pH 7,4 est de 48° C.
EXEMPLE 6 : OXYDATION DU COLLAGENE TRIPLE HELICE GREFFE PAR DU DMT AVEC ITODE.
Le produit obtenu dans l'exemple 1 est solubilisé en milieu aqueux pH 3 à une concentration de 1 % et on ajoute une solution d'iode (3 % I2-KI). On observe la disparition de la couleur caractéristique de l'iode et la formation d'un gel identique à celui obtenu dans l'exemple 2.
EXEMPLE 7 : FTBRILLOGENESE ET OXYDATION DU COLLAGENE TRIPLE HELICE
GREFFE AU DMT.
Le produit obtenu dans l'exemple 1 est solubilisé à + 4° C en milieu aqueux de pH 2 à une concentration de 3,5 g/1 pendant 24 heures. La solution ainsi obtenue est maintenue à 4° C. On lui ajoute une quantité de 0,2 M de phosphate de potassium (dibasique) pour atteindre un pH de 7,4. La solution est ensuite chauffée pour atteindre 24°C. Elle est maintenue à 24°C pendant 4 heures. Le milieu est ensuite centrifugé pour récupérer les morceaux d'hydrogel, qui sont lavés au tampon phosphate (pH 7,4) puis recentrifugés. L'analyse calorimétrique révèle que la température de dénaturation en solution tampon pH 7,4 est de 48° C. Les morceaux d'hydrogel sont placés dans une solution tamponée (phosphate pH 7,4) à laquelle on ajoute de l'eau oxygénée, pour obtenir une concentration finale de 0,3 %. On laisse ensuite reposer pendant 24 heures. L'hydrogel est récupéré par centrifugation, lavé avec de l'eau tamponée (phosphate pH 7,4) et recentrifugé. L'analyse calorimétrique révèle que la température de dénaturation est comprise entre 55-80° C. EXEMPLE 8 : PROPRIETES MECANIQUES DE COLLAGENE-CYSTEINE ET DE
GELATINE-CYSTEINEE OXYDES PAR LΕAU OXYGENEE.
Les produits obtenus dans les exemples 2 et 3 peuvent être solubilisés en milieu aqueux pH 3-10 à une concentration de 10 %. On obtient un gel physique en refroidissant les solutions. Ensuite, on peut démouler l'objet et on le place dans un bain d'eau oxygénée (à 1 %) refroidi à 4°C pendant 24 heures. Les gels réticulés obtenus sont ensuite récupérés du bain, lavés à l'eau et stockés dans une enceinte humide. Les modules de dureté de la gélatine et du collagène ont été mesurés avec un appareil à compression utilisant un plongeant de section 12,5 mm2 sur une éprouvette de 60 mm de diamètre et 60 mm de profondeur. Module de compressabilité = 1-6 N/mm. Compression maximale à la rupture = 3-10 N.

Claims

REVENDICATIONS :
1 - Biopolymère, en particulier collagène, modifié à l'aide de greffons constitués par des résidus de cystéine ou de ses dérivés ("résidus cystéiques") liés à des fonctions réactives dont est porteur ledit biopolymère et comprenant chacun au moins un groupement soufré et au moins un groupement azoté, tous deux protégés par un seul et même groupement protecteur.
2 - Biopolymère, en particulier collagène, selon la revendication 1, caractérisé en ce que le greffon répond à la formule générale suivante :
Figure imgf000022_0001
dans laquelle :
- x est un nombre entier et lorsque ce nombre entier est supérieur à 1, R' et R2 peuvent être identiques ou différents de carbone à carbone,
- y est un nombre entier,
- R1, R2, R3, R4 sont semblables ou différents et représentent l'hydrogène ou un radical hydrocarboné, de préférence choisi parmi les alkyles linéaires et/ou cycliques et/ou ramifiés, les aryles, les aralkyles, les alcényles, les aralcényles, les alcynes ou les aralcynes, tous ces radicaux étant éventuellement substitués, et les alkyles inférieurs en C,-C6 étant plus particulièrement préférés,
- R5 est l'hydrogène ou un radical hydrocarboné, de préférence choisi parmi les radicaux acyles, alkyloxycarbonyles, aryloxycarbonyles ou aralkyloxycarbonyles, l'hydrogène étant plus particulièrement préféré. 3 - Biopolymère, en particulier collagène, selon la revendication 2, caractérisé en ce que R1 = R2 = H ou CH3 et R3 = R4 = CH3. 4 - Biocopolymère, en particulier collagène, selon la revendication 1, caractérisé en ce que le greffon (I) est fixé sur le biopolymère dans une concentration inférieure ou égale à 3,0 mmol de (I)/g de collagène.
5 - Biopolymère, en particulier collagène thiolé, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir du biopolymère selon la revendication 1.
6 - Biopolymère, en particulier collagène, réticulé par formation de ponts disulfures, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir du biopolymère selon la revendication 1.
7 - Biopolymère, en particulier collagène thiolé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il se présente sous forme de triples hélices non dénaturées et en ce que ces triples hélices sont organisées et alignées en faisceau de manière à former une structure fibreuse.
8 - Procédé de préparation d'un biopolymère, en particulier de collagène, modifié, caractérisé en ce qu'il consiste, essentiellement :
- à mettre le biopolymère de départ en présence d'un solvant, de préférence organique,
- à mettre en oeuvre au moins un greffon constitué par au moins un résidu cystéique comprenant au moins un groupement soufré et au moins un groupement azoté, tous deux protégés par un seul et même groupement protecteur,
- à faire réagir le biopolymère solvaté avec le greffon,
- et à récupérer le biopolymère ainsi modifié.
9 - Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le greffon répond à la formule générale (F) suivante :
Figure imgf000023_0001
- x est un nombre entier et lorsque ce nombre entier est supérieur à 1, R1 et R2 peuvent être identiques ou différents de carbone à carbone,
- y est un nombre entier,
- R1, R2, R3, R4 sont semblables ou différents et représentent l'hydrogène ou un radical hydrocarboné, de préférence choisi parmi les alkyles linéaires et/ou cycliques et ou ramifiés, les aryles, les aralkyles, les alcényles, les aralcényles, les alcynes ou les ara] cy nés, tous ces radicaux étant éventuellement substitués, et les alkyles inférieurs en C,-C6 étant plus particulièrement préférés,
- R5 est l'hydrogène ou un radical hydrocarboné, de préférence choisi parmi les radicaux acyles, alkyloxycarbonyles, aryloxycarbon les ou aralkyloxycarbonyles, l'hydrogène étant plus particulièrement préféré,
- Z = H, halogène, ORs avec R6 = H alkyle, aryle ou aralkyle, imidazole ou autres résidus minéraux ou organiques, aptes à conférer au greffon une réactivité vis-à-vis des fonctions aminés et/ou alcools du biopolymère, afin de former des liaisons covalentes de type ester et/ou amide.
10 - Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le biopolymère de départ est un collagène natif ou un atélocollagène, dénaturés ou non, ou bien encore un mélange d'au moins deux de ces différents collagènes.
11 - Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que R1 = R2 = H et R3 = R4 = CH3 dans le greffon (F).
12 - Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'on active le reste carboxylique du greffon (Y) avant de le faire réagir avec le biopolymère.
13 - Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'on récupère le biopolymère modifié par précipitation et/ou élimination du solvant, ladite élimination s'opérant, de préférence, par filtration, par gradient de densité ou par évaporation.
14 - Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le biopolymère modifié est mis en présence d'un milieu aqueux de déprotection, de façon à obtenir du biopolymère thiolé. 15 - Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'on soumet le biopolymère thiolé à une oxydation apte à amener le biopolymère, en particulier le collagène, à un état au moins partiellement réticulé, par formation de ponts disulfures.
16 - Application du biopolymère, en particulier du collagène, selon la revendication 1, ou de celui obtenu par le procédé selon la revendication 8, dans la fabrication d'articles utilisables en médecine, du type implants, prothèses, peaux artificielles, pansements, revêtements de prothèses, systèmes à libération contrôlée de principe actif, adhésifs ou analogues.
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