WO1996011256A1 - Verfahren zur kontinuierlichen enzymatischen gewinnung hydrophober produkte und dafür geeignete vorrichtung - Google Patents

Verfahren zur kontinuierlichen enzymatischen gewinnung hydrophober produkte und dafür geeignete vorrichtung Download PDF

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Definitions

  • the invention relates to a process for the continuous enzyme-catalytic extraction of hydrophobic products in aqueous solution and to a device suitable therefor.
  • Biotransformations in general and enzymatic processes in particular are becoming increasingly important for the synthesis of optically active substances, but also for bulk chemicals, whereby use is made of the generally extremely selective chemical activity of the enzymes active in the aqueous environment. Difficulties arise when substrates are to be converted and products are created that are poorly water-soluble.
  • Various approaches exist to solve this problem e.g. the use of the enzymes in a form immobilized on a solid support which is suspended in the organic solvent, the use of the enzymes in a homogeneous solution with a water-miscible solvent or the inclusion of enzymes in reverse micelles.
  • organic solvents are dispensed with in the reaction space according to the invention and a substrate concentration corresponding to the maximum solubility thereof is maintained in the reaction space by direct, continuous feeding of the substrate and the resulting hydrophobic product
  • the inventive method of the type mentioned is therefore essentially characterized in that the product is extracted from the product-containing reaction mixture via a product-permeable, microporous membrane in an organic solvent and the product-depleted reaction mixture is recycled for production.
  • Perforated membranes with pore sizes down to a few nm, in particular> 10 nm are understood to be "microporous" here.
  • the upper limit is not critical.
  • the prerequisite is that the phase boundary is stabilized.
  • a safe working method can be achieved with pore sizes of 10 ⁇ m and above.
  • the membrane thickness - especially in the case of very fine-pored membranes - should be as small as possible for an intensive exchange. It is preferable to work with a microporous hydrophobic membrane, especially with a hollow fiber membrane bundle, so that large membrane areas and small
  • Liquid layer thicknesses can be realized, which allow a product separation appropriate to the speed of the enzymatic product formation.
  • DE 40 41 896 C1 discloses a process for the enzymatic synthesis of organic compounds, in which the “organic compound” formed in the reaction space is separated from the enzyme or the enzymes by a solution diffusion membrane, the functional groups with selective interaction to the compound to be separated
  • a solution diffusion membrane for example, sulfonated polymer membranes are provided and the organic
  • rinsing liquid which e.g. methylene chloride, acetic anhydride and alternatively acethyl chloride can be added to separate the cyanohydrin.
  • a selective product separation of a hydrophobic product from a reaction mixture takes place through a modification of the liquid / liquid extraction, in which an interface formed on micropores is continuously renewed, in particular in countercurrent.
  • the invention can be implemented by using membrane cartridges which are used in a production cycle in which the aqueous phase is recycled. In such a configuration, the enzyme comes into contact with the organic at the membrane-stabilized interface
  • a product-depleted reaction mixture with enzymes and cofactors dissolved therein can be recycled by directly feeding in the pure educts and discharging the hydrophobic products, which leads to an increase in the number of cycles and thus to a reduction in costs.
  • Hollow fiber bundles made of hydrophobic materials such as optionally fluorinated hydrocarbon polymers, such as in particular polypropylene and polyethylene, are used particularly advantageously according to the invention, whose relatively high porosity and small wall thickness with a relatively small pore opening are suitable for an appropriate implementation of the invention.
  • Microporous membranes are used, which can be hydrophobic or also hydrophilic, but should preferably be hydrophobic.
  • the organic solvent phase comes into contact with the aqueous phase at the interface formed by the membrane and would (if a hydrophobic membrane is used) pass into its space, which is why a relatively small positive pressure difference between the aqueous and organic phases is ensured.
  • Figure 1 a reaction scheme
  • Figure 2 an extraction module
  • Figure 3 an extraction module integrated in a production plant according to the invention
  • FIG. 4 an arrangement according to FIG. 3 coupled with a continuous extraction agent rectification
  • FIG. 5 a production plant according to the invention with an enzyme membrane reactor upstream of the extraction module.
  • FIG. 1 shows a typical reaction that can be carried out in a plant according to the invention.
  • a hydrophobic substrate S is converted into a hydrophobic product P in a reaction catalyzed by an enzyme 1.
  • This requires a cofactor, here NADH, which reacts to NAD and is regenerated in a second reaction catalyzed by an enzyme 2 (oxidation of formic acid to CO 2 ).
  • FIG. 2 shows an extraction module (1) that
  • Formic acid selectively extracted substrate S and product P over a porous membrane (2) using a hydrophobic solvent in countercurrent.
  • the buffer, the cofactor (NAD (H)) and that Cosubstrate (HCOOH) remain in the aqueous phase due to their hydrophilicity.
  • the membrane (2) serves to stabilize the phase interface between the hydrophobic and aqueous phases.
  • the design of the membrane (2) as a hollow fiber bundle is too large
  • the reactor solution upstream of the extraction module (1) contains the cofactors NAD and NADH, the cosubstrate HCOOH, unreacted substrate S and product P produced by the enzyme-catalyzed reaction.
  • the latter are converted into the hydrophobic solvent in the extraction module (1) extracted, which is pumped in countercurrent to the aqueous phase with the extractant pump (6) in the extraction module.
  • Substrate S is again added to the aqueous stream containing the remaining hydrophilic constituents (enzymes, NAD (H), HCOOH) by subsequent dosing at (7).
  • the replenishment at 7 replaces HCOOH consumed by reaction and the loss of cofactor NAD by deactivation.
  • the arrangement shown in Figure 4 corresponds to z.
  • FIG. 1 With extraction module (1) and reactor circuit (3); however, it is expanded by a hexane circuit (8).
  • a continuous rectification column (9) is integrated in this hexane circuit (8), in which the extracted substances (substrate S, product P) are separated from the extractant hexane.
  • Rectified hexane is returned to the extraction module (1) by the extractant pump (6).
  • the effective amount of solvent required for extraction is thus reduced.
  • the arrangement according to the invention shown in FIG. 5 consists of a reactor circuit (3) in which a substrate solution consists of substrate S, cofactors NAD (H) and cosubstrate HCOOH in the reactor circuit pump (4)
  • Enzyme membrane reactor (10) is pumped.
  • the enzyme membrane reactor (10) is designed as a circuit which consists of the
  • the enzymes (5) are immobilized behind a hydrophilic ultrafiltration membrane (13).
  • the unreacted substrate S and the resulting product P are extracted in a continuous hexane stream in the extraction module (1).
  • Hexane stream containing product P is separated in a continuous rectification column (9) into a substrate S / product P mixture and hexane.
  • the hexane is fed back to the extraction module (1) via the hexane circuit (8).
  • the aqueous solution depleted by the extraction of product P can be fed back to the enzyme membrane reactor (10) as a substrate solution by replenishing substrate S and cofactor NAD in (7) and by pH-regulated replenishment of cosubstrate HCOOH in (14).
  • Example 1 In a 50 ml enzyme membrane reactor (EMR) with a
  • Ultrafiltration hollow fiber module (Amicon hollow fiber, type H1P10- 43, cut off: 10000 Da) with an associated circulation pump, the enzymes were:
  • Rhodococcus erythropolis alcohol dehydrogenase 0.9 U / ml EMR vol.
  • the product solution leaving the enzyme membrane reactor was continuously subjected to a liquid / liquid solution equipped with a hydrophobic, microporous polypropylene membrane (membrane area: 0.23 m 2 ; effective pore size: 0.05 ⁇ m).
  • Hexane solution was fed to a continuous rectification and rectified hexane was pumped again to the extraction module.
  • the total volume of the hexane phase was 800 ml.
  • the product-free aqueous solution leaving the extraction module was used again as a reaction solution by means of continuous replenishment of phenylacetone (1.35 mmol / h), pH-regulated replenishment of formic acid and replacement of the cofactor lost by deactivation (0.724 ⁇ mol / h) and again fed to the enzyme membrane reactor .
  • the total volume of the aqueous phase was 450 ml.
  • the space / time yield based on the EMR volume was 64.3 g / ( 1 EMR * d ).
  • the number of changes in the cofactor was 1361 mol p / mol NAD (73% * 1.35 * 1000 / 0.724 ⁇ mol p / ⁇ mol NAD ).
  • the number of changes of the cofactor in the comparison case, ie without continuous product extraction from that to the EMR Recycle recycling stream is 53 mol p / mol NAD (73% * 9, 0/0, 124 mmol p / mmol NAD ).
  • the extractive recycling according to the invention results in a more than 25-fold better utilization of the expensive cofactor.
  • the continuous product removal according to the invention from the reaction liquid, which is otherwise returned as a whole to the enzyme membrane reactor makes the otherwise necessary continuous feeding of cofactor into the EMR (generally together with the substrate solution) practically superfluous; only the losses of a few percent of the required amount (caused by thermal deactivation) have to be compensated.
  • Hydrophobic membranes, in particular in the form of hollow fiber bundles, as explained above, have been known and available per se for a good 10 years without their extraordinarily useful effect for the enzymatic production of hydrophobic products having been used.
  • Example 2 Under the same conditions as in Example 1, 4-phenyl-2-butanone was reduced to (S) -4-phenyl-2-butanol.
  • the number of changes in the cofactor was 158 mol p / mol NAD .
  • the number of changes of the cofactor in the comparison case, ie without extraction and recycling, is 8 mol p / mol NAD .
  • a feed concentration of 6-methyl-5-hepten-2-one in the EMR circuit was set at 10 mmol / L.
  • the stationary NAD (H) concentration was adjusted to 0.2 mmol / L.
  • the number of changes in the cofactor was 747 mol p / mol NAD .
  • the change number is 33 mol p / mol NM) .
  • the utilization was improved by a factor of 23 through the use of the extractive recycling according to the invention.
  • the process according to the invention is of course not limited to purely enzymatic processes, but is in principle suitable for the separation of hydrophobic products from an aqueous reaction mixture which can lead to inhibition of the reaction or to subsequent reactions.

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Abstract

Hydrophobe Produkte werden aus der wäßrigen produkthaltigen Reaktionsmischung (Produktstrom) eines kontinuierlichen enzymkatalysierten Prozesses durch eine produktdurchlässige mikroporöse Membran in ein organisches Lösungsmittel extrahiert, während die produktverarmte Reaktionsmischung zur Produktion rezykliert wird. Die enzymkatalysierte Umsetzung erfolgt insbesondere in einem Reaktor mit darin immobilisiertem Enzym, vorzugsweise im Enzymmembranreaktor. Die produkthaltige Reaktionsmischung wird zur Abtrennung des Produkts vorzugsweise durch ein Hohlfasermembranbündel geschickt, das von außen - insbesondere im Gegenstrom - von Produkt-Lösungsmittel umströmt wird. Die effektive Porengröße der Membran liegt insbesondere im Bereich von 5 bis 500 νm, und es wird insbesondere mit einem Differenzdruck zwischen wäßriger Phase und organischem Lösungsmittel von 0,5 bis 5 bar gearbeitet. Als Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens eignet sich ein Produktionskreis, in den eine Extraktionspatrone - insbesondere in Form eines Holfasermembranbündels - mit produktdurchlässiger poröser Membran einbezogen ist.

Description

Beschreibung
Verfahren zur kontinuierlichen enzymatischen Gewinnung hydrophober Produkte und dafür geeignete Vorrichtung
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur kontinuierlichen enzymkatalytischen Gewinnung hydrophober Produkte in wäßriger Lösung sowie auf eine dafür geeignete Vorrichtung. Biotransformationen im allgemeinen und enzymatische Verfahren im besonderen gewinnen zunehmend an Bedeutung für die Synthese von optisch aktiven Substanzen, aber auch für Bulkchemikalien, wobei von der im allgemeinen äußerst selektiven chemischen Wirksamkeit der im wäßrigen Milieu aktiven Enzyme Gebrauch gemacht wird. Schwierigkeiten entstehen, wenn Substrate umgesetzt werden sollen und Produkte entstehen, die schlecht wasserlöslich sind. Zur Lösung dieses Problems existieren verschiedene Ansätze wie z.B. die Anwendung der Enzyme in auf einem festen Träger immobilisierter Form, der im organischen Lösungsmittel suspendiert wird, der Einsatz der Enzyme in homogener Lösung mit einem wassermischbaren Lösungsmittel oder der Einschluß von Enzymen in Reversmicellen.
Die direkte Gegenwart von organischen Lösungsmitteln (wassermischbar oder nicht wassermischbar) wird nur von wenigen Enzymen vertragen, die zur Klasse der Hydrolasen gehören, (z.B. WO 89/04784) . Solche Enzyme werden dabei in der Regel zweidimensional in einer Membran immobilisiert eingesetzt. Unter dem Gesichtspunkt der besseren Katalysatorausnutzung in Bezug auf Aktivität und produktmengen-spezifischem Verbrauch sowie einer leichteren Handhabung ist ein homogen in Lösung verteilter Katalysator jedoch vorteilhaft.
Da - wie bereits erwähnt - die Gegenwart größerer Mengen organischer Lösungsmittel im Reaktionsraum zur Desaktivierung bzw. Denaturierung der Enzyme führt, wird erfindungsgemäß auf organische Lösungsmittel im Reaktionsraum verzichtet und durch eine direkte kontinuierliche Einspeisung des umzusetzenden Substrats im Reaktionsraum eine Substratkonzentration entsprechend der maximalen Löslichkeit desselben aufrechterhalten und das sich bildende hydrophobe Produkt
(zusammen mit Substratresten) aus der Reaktionsmischung über einen selektiven Trennvorgang entfernt (unter Anwendung einer entsprechend produktdurchlässigen Membran von ausreichender Fläche) , während die wasserlöslichen Komponenten der Reaktionsmischung unverändert in Lösung bleiben.
Das erfindungsgemäße Verfahren der eingangs genannten Art ist mithin im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß man das Produkt aus der produkthaltigen Reaktionsmischung über eine produktdurchlässige, mikroporöse Membran in ein organisches Lösungsmittel extrahiert und die produkt-verarmte Reaktionsmischung zur Produktion rezykliert .
Als "mikroporös" werden hier perforierte Membranen verstanden mit Porengrößen bis herab zu wenigen nm, insbesondere aber > 10 nm. Die Obergrenze ist nicht kritisch. Voraussetzung ist, daß die Phasengrenze stabilisiert wird. So kann mit Porengrößen von 10 μm und darüber eine sichere Arbeitsweise erreicht werden. Di Membrandicke soll - insbesondere bei sehr feinporigen Membranen - für einen intensiven Austausch möglichst gering sein. Vorzugsweise wird dabei mit einer mikroporösen hydrophoben Membran gearbeitet, speziell mit einem Hohlfasermembranbündel, wodurch große Membranflächen und geringe
Flüssigkeitsschichtdicken realisiert werden können, die eine der Geschwindigkeit der enzymatischen Produktbildung angemessene Produktabtrennung zulassen.
Weitere Besonderheiten ergeben sich aus den Patentansprüchen und der nachfolgenden Beschreibung.
Zwar ist aus der DE 40 41 896 Cl ein Verfahren zur enzymatischen Synthese von organischen Verbindungen bekannt, bei dem die im Reaktionsraum gebildete „organische Verbindung" vom Enzym bzw. den Enzymen durch eine Lösungsdiffusionsmembran abgetrennt wird, die funktionelle Gruppen mit selektiver Wechselwirkung zur abzutrennenden Verbindung enthält. Dabei werden z.B. sulfonierte Polymermembranen vorgesehen und die organische
Verbindung durch pervaporativen oder pertraktiven Austrag von der Membran abgeführt. Im letzteren Falle erfolgt die "Desorption" mit einer sogenannten Spülflüssigkeit, der z.B. zur Cyanhydrin-Abtrennung Methylenchlorid, Essigsäureanhydrid und alternativ Acethylchlorid zugesetzt werden.
Im Zusammenhang mit dieser Variante zu der seit langem bekannten Selektion von Komponenten mit Hilfe von Membranen wird auf die Nichtporosität derselben besonders hingewiesen, insbesondere unter Bezugnahme auf den Enzym-Membran-Reaktor, bei dem ein Reaktionsgemisch vom höhermolekularen Enzym getrennt wird.
Erfindungsgemäß erfolgt dem gegenüber eine selektive Produktabtrennung eines hydrophoben Produkts aus einer Reaktionsmischung durch eine Abwandlung der Flüssig/Flüssig- Extraktion, bei der eine an Mikroporen gebildete Grenzfläche - insbesondere im Gegenstrom - kontinuierlich erneuert wird. Grundsätzlich ist die Erfindung durch Anwendung solcher Membranpatronen realisierbar, die in einen Produktionskreislauf eingesetzt werden, in dem die wäßrige Phase rezykliert. Bei einer solchen Ausgestaltung kommt das Enzym an der membranstabilisierten Grenzfläche mit dem organischen
Lösungsmittel bei Verwendung mikroporöser Membranen in Kontakt, was gegebenenfalls zu einer Beeinträchtigung der Enzymaktivität führen kann. In solchen Fällen wird zweckmäßigerweise für eine Reaktionszone mit darin immobilisiertem Enzym, zweckmäßigerweise in Form eines Enzymmembranreaktors, gesorgt.
Erfindungsgemäß kann durch direkte Einspeisung der reinen Edukte und Austrag der hydrophoben Produkte eine produktabgereicherte Reaktionsmischung mit darin gelösten Enzymen und Cofaktoren rezykliert werden, was zur Erhöhung der Zykluszahlen und damit zu einer Kostenreduzierung führt.
Besonders vorteilhaft werden erfindungsgemäß Hohlfaserbündel aus hydrophoben Materialien, wie gegebenenfalls fluorierten Kohlenwasserstoffpolymeren, wie insbesondere Polypropylen und Polyäthylen verwendet, deren relativ hohe Porosität und geringe Wandstärke bei relativ kleiner Porenöffnung für eine zweckmäßige Realisierung der Erfindung geeignet sind.
Es werden mikroporöse Membranen angewandt, die hydrophob oder auch hydrophil sein können, vorzugsweise aber hydrophob sein sollten. Die organische Lösungsmittelphase kommt an der durch die Membran gebildeten Grenzfläche mit der wäßrigen Phase in Kontakt und würde (bei Verwendung einer hydrophoben Membran) in deren Raum übertreten, weshalb für eine relativ geringe positive Druckdifferenz zwischen wäßriger und organischer Phase gesorgt wird. Nachfolgend wird die Erfindung anhand der beigefügten Zeichnungen sowie eines Durchführungsbeispiels näher erläutert; es zeigen schematisch:
Figur 1: ein Reaktionsschema; Figur 2: ein Extraktionsmodul;
Figur 3: ein Extraktionsmodul eingebunden in eine erfindungsgemäße Produktionsanlage
Figur 4: eine Anordnung gemäß Fig. 3 gekoppelt mit einer kontinuierlichen Extraktionsmittelrektifikation; und Figur 5: eine erfindungsgemäße Produktionsanlage mit einem dem Extraktionsmodul vorgeschalteten Enzymmembranreaktor.
In Figur 1 ist eine typische Reaktion gezeigt, die in einer erfindungsgemäßen Anlage durchgeführt werden kann. Ein hydrophobes Substrat S wird in einer durch ein Enzym 1 katalysierten Reaktion zu einem hydrophoben Produkt P umgesetzt. Dazu wird ein Cofaktor, hier NADH, benötigt, der zu NAD abreagiert und in einer zweiten, durch ein Enzym 2 katalysierten Reaktion (Oxidation von Ameisensäure zu C02) regeneriert wird. In Figur 2 wird ein Extraktionsmodul (1) gezeigt, das
Bestandteil einer erfindungsgemäßen Anlage sein kann. Hier wird aus einer typischen wäßrigen Produktlösung mit Puffer, nicht umgesetztem Substrat S, durch enzymkatatysierte Reaktion entstandenem Produkt P, Cofaktor in reduzierter (NADH) und oxidierter Form (NAD) und Cosubstrat (in diesem Falle
Ameisensäure (HCOOH) ) über eine poröse Membran (2) mittels eines hydrophoben Lösungsmittels im Gegenstrom selektiv Substrat S und Produkt P extrahiert. Der Puffer, der Cofaktor (NAD(H)) und das Cosubstrat (HCOOH) verbleiben aufgrund ihrer Hydrophilie in der wäßrigen Phase.
Die Membran (2) dient zur Stabilisierung der Phasengrenzfläche zwischen hydrophober und wäßriger Phase. Die Auslegung der Membran (2) als Hohlfaserbündel fährt zu großen
Phasengrenzflächen, was einen schnellen Stoffübergang befördert.
Um, im Falle einer hydrophoben, porösen Membran das Penetrieren des hydrophoben Lösungsmittels in die wäßrige Phase zu verhindern, muß auf der Seite des wäßrigen Mediums ein Überdruck (P2 > Pi) aufgeprägt werden. Desgleichen muß bei Nutzung einer hydrophilen, porösen Membran ein Überdruck (Px > P2) auf der Seite des hydrophoben Lösungsmittels aufgeprägt werden, um das Austreten der wäßrigen Reaktorlösung in die hydrophobe Phase zu verhindern. Die in Figur 3 skizzierte erfindungsgemäße Anlage bindet das in Figur 1 dargestellte Extraktionsmodul (1) in einen Reaktorkreislauf (3) ein. Die Reaktionslösung wir durch die Umlaufpumpe (4) im Reaktorkreislauf (3) geführt. Neben den Enzymen (5) enthält die Reaktorlösung vor dem Extraktionsmodul (1) die Cofaktoren NAD und NADH, das Cosubstrat HCOOH, nicht umgesetztes Substrat S und durch enzym-katalysierte Reaktion entstandenes Produkt P. Letztere werden im Extraktionsmodul (1) in das hydrophobe Lösungsmittel extrahiert, welches im Gegenstrom zur wäßrigen Phase mit der Extraktionsmittelpumpe (6) in das Extraktionsmodul gepumpt wird. Dem das Extraktionsmodul vorlassenden wäßrigen Strom mit den verbliebenen hydrophilen Bestandteilen (Enzyme, NAD(H), HCOOH) wird durch Nachdosierung bei (7) wieder Substrat S zugesetzt. Ebenfalls wird durch die Nachdosierung bei 7 durch Reaktion verbrauchtes Cosubstrat HCOOH und durch Deaktivierung verlorener Cofaktor NAD ersetzt. Die in Figur 4 gezeigte Anordnung entspricht z. T. Figur 3 mit Extraktionsmodul (1) und Reaktorkreislauf (3) ; sie ist jedoch durch einen Hexankreislauf (8) erweitert. In diesen Hexankreislauf (8) ist eine kontinuierliche Rektifikationskolonne (9) eingebunden, in der die extrahierten Substanzen (Substrat S, Produkt P) vom Extraktionsmittel Hexan getrennt werden.
Rektifiziertes Hexan wird durch die Extraktionsmittelpumpe (6) wieder dem Extraktionsmodul (1) zugeführt. Somit wird die effektive zur Extraktion benötigte Lösungsmittelmenge verringert.
Die in Figur 5 dargestellte erfindungsgemäße Anordnung besteht aus einem Reaktorkreislauf (3) , in dem durch die Reaktorkreislaufpumpe (4) eine Substratlösung bestehen aus Substrat S, Cofaktoren NAD(H) und Cosubstrat HCOOH in den
Enzymmembranreaktor (10) gepumpt wird. Der Enzymmembranreaktor (10) ist als Kreislauf ausgelegt, der aus der
Enzymkreislaufpumpe (11) und dem Ultrafiltrationshohlfasermodul (12) besteht. In diesem Kreislauf sind die Enzyme (5) hinter einer hydrophilen Ultrafiltrationsmembran (13) immobilisiert.
Aus der auf der Filtratseite des Ultrafiltrationshohlfasermoduls (12) den Enzymmembranreaktor (10) verlassenden enzymfreien Produktlösung wird im Extraktionsmodul (1) das nicht umgesetzte Substrat S und das entstandene Produkt P in einen kontinuierlichen Hexanstrom extrahiert. Der Substrat S und
Produkt P enthaltende Hexanstrom wird in einer kontinuierlichen Rektifikationskolonne (9) in ein Substrat S /Produkt P Gemisch und Hexan getrennt. Das Hexan wird über den Hexankreislauf (8) wieder dem Extraktionsmodul (1) zugeführt. Die durch die Extraktion an Produkt P verarmte, wäßrige Lösung kann durch die Nachdosierung von Substrat S und Cofaktor NAD bei (7) und durch ph-geregelte Nachdosierung von Cosubstrat HCOOH bei (14) wieder als Substratlösung dem Enzymmembranreaktor (10) zugeführt werden.
Die in Figur 5 skizzierte Anordnung wurde zur Produktion von (S) -l-Phenyl-2-Propanol verwendet. Die Prozeßbedingungen sind im nachfolgenden Beispiel aufgeführt.
Beispiel 1 In einen 50 ml-Enzymmembranreaktor (EMR) mit einem
Ultrafiltrationshohlfasermodul (Amicon hollow fibre, Typ H1P10- 43, cut off: 10000 Da) mit zugeordneter Kreislaufpumpe wurden die Enzyme:
Alkoholdehydrogenase aus Rhodococcus erythropolis : 0,9 U/ml EMR- Vol.
Formiatdehydrogenase aus candida boidinii .* 1,9 U/ml EMR-Vol. gegeben und als Reaktionsmischung eine wäßrige Lösung von pH 6, 7 mit
Phenylaceton 9 mM NAD 0,124 mM
Natriumformiat 50 mM
Ameisensäure 14,15 mM di-Kaliumhydrogenphosphat 60 mM zugeführt. Bei einer mittleren Verweilzeit von 0,33 h im EMR (Gesamtreaktorumlaufström: 150 ml/h) und einer Reaktionstemperatur von 20 °C betrug der Umsatz bezüglich des Substrates Phenylaceton 73%.
Die den Enzymmembranreaktor verlassende Produktlösung wurde kontinuierlich einem mit einer hydrophoben, mikroporösen Polypropylenmembran (Membranfläche: 0,23 m2; effektive Porengröße: 0,05 μm) ausgestatteten Flüssig/Flüssig-
Hohlfaserextraktionsmodul (Liqui-Cel Phasenkontakt-Labormodul 5PCM - 106 der Hoechst Celanes Corp.) zugeführt. Hier wurde durch einen kontinuierlichen Hexangegenstrom (1000 ml/h) aus der Produktlösung kontinuierlich (S) -l-Phenyl-2-Propanol und das nicht umgesetzte Phenylaceton extrahiert . Die produkthaltige
Hexanlösung wurde einer kontinuierlichen Rektifikation zugeführt und rektifiziertes Hexan erneut zum Extraktionsmodul gepumpt. Das Gesamtvolumen der Hexanphase betrug 800 ml.
Das Penetrieren von Hexan durch die hydrophobe Membran wurde durch das Aufprägen eines Überdruckes von 0,5 bar auf der wäßrigen Seite verhindert.
Die das Extraktionsmodul verlassende produktfreie wäßrige Lösung wurde mittels kontinuierlicher Nachdosierung von Phenylaceton (1,35 mmol/h) , ph-geregelter Nachdosierung von Ameisensäure und Ersetzen des durch Deaktivierung verlorenen Cofaktors (0,724 μmol/h) wieder als Reaktionslösung verwendet und erneut dem Enzymmembranreaktor zugeführt.
Das Gesamtvolumen der wäßrigen Phase betrug 450 ml.
Die Raum/Zeit-Ausbeute betrug bezogen auf das EMR-Volumen 64,3 g/(1EMR*d) .
Die Wechselzahl des Cofaktors betrug 1361 molp/molNAD (73%*1, 35*1000/0, 724 μmolp/μmolNAD) .
Die Wechselzahl des Cofaktors im Vergleichsfall, d.h. ohne kontinuierliche Produktextraktion aus dem zum EMR zurückführenden Rezyklierungsstrom beträgt 53 molp/molNAD ( 73 %* 9 , 0/0 , 124 mmolp/mmolNAD) .
Somit ergibt die erfindungsgemäße, extraktive Rezyklierung eine mehr als 25-fach bessere Ausnutzung des teuren Cofaktors. Die erfindungsgemäße kontinuierliche Produktentnahme aus der Reaktionsflüssigkeit, die ansonsten insgesamt zum Enzymmembranreaktor zurückgeführt wird, macht die sonst notwendige stetige Einspeisung von Cofaktor in den EMR (im allgemeinen zusammen mit der Substratlösung) praktisch überflüssig; es müssen lediglich die bei wenigen Prozent der erforderlichen Menge liegenden (durch thermische Deaktivierung hervorgerufenen) Verluste ausgeglichen werden. Hydrophobe Membranen, insbesondere in Form von Hohlfaserbündeln, wie vorstehend erläutert, sind an sich seit gut 10 Jahren bekannt und erhältlich, ohne daß von ihrer außerordentlich nutzbringendem Wirkung für die enzymatische Gewinnung hydrophober Produkte Gebrauch gemacht worden wäre.
Beispiel 2 Unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 wurde 4-Phenyl- 2-butanon zu (S) -4-Phenyl-2-butanol reduziert.
Durch kontinuierliche Substratzugäbe wurde eine Zulaufkonzentration an 4HPhenyl-2-butanon in den EMR-Kreislauf von 12 mmol/L eingestellt. Um einen genügend hohen Umsatz zu erzielen, mußte die NAD(H) -Konzentration auf 1,2 mmol/L angehoben werden.
Bei einer Verweilzeit von 0,33 Std. im EMR betrug der mittlere Umsatz 80 % bei einer Raum Zeit-Ausbeute von 103,8 g/(l x d) . Entsprechend der Desaktivierung des Cofaktors wurde dieser mit 9,1 μmol/Std. nachdosiert.
Die Wechselzahl des Cofaktors betrug 158 molp/molNAD.
Die Wechselzahl des Cofaktors im Vergleichsfall, d.h. ohne Extraktion und Rückführung, beträgt 8 molp/molNAD. Die im
Vergleich zum Beispiel 1 niedrigeren Werte für die Wechselzahl beruhen auf der notwendigen höheren Konzentration des Cofaktors von 1,2 mmol/L.
Dennoch ergibt sich auch hier durch die erfindungsgemäße extraktive Rezyklierung eine 20-fach bessere Ausnutzung des Cofaktors.
Beispiel 3
Unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 wurde 6-Methyl- 5-hepten-2-on(S) -6-Methyl-5-hepten-2-ol ( (S) - (+) -Sulcatol) reduziert. (S) -(+) -Sulcatol ist das männliche Pheromon der
Borkenkäfer Gnathotrichos sp. und kann als Lockstoff in Fallen zur Schädlingsbekämpfung eingesetzt werden.
Durch kontinuierliche Substratzugabe wurde eine Zulaufkonzentration an 6-Methyl-5-hepten-2-on in den EMR- Kreislauf von 10 mmol/L eingestellt. Die stationäre NAD(H)- Konzentration wurde auf 0,2 mmol/L eingestellt.
Bei einer Verweilzeit von 0,33 Std. im EMR betrug der mittlere Umsatz 67 % bei einer Raum Zeit-Ausbeute von 60 g/(l x d) .
Entsprechend der Desaktivierung des Cofaktors wurde dieser mit 1,5 μmol/Std. nachdosiert.
Die Wechselzahl des Cofaktors betrug 747 molp/molNAD.
Für den Vergleichsfall, d.h. ohne Extraktion des Produktes und Rückführung, beträgt die Wechselzahl 33 molp/molNM). Durch die Anwendung der erfindungsgemäßen extraktiven Rezyklierung wurde die Ausnutzung um den Faktor 23 verbessert.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist selbstverständlich nicht auf rein enzymatische Verfahren beschränkt, sondern prinzipiell für die Abtrennung hydrophober Produkte aus wäßriger Reaktionsmischung geeignet, die zu Reaktionshemmungen führen oder Folgereaktionen eingehen können.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur kontinuierlichen enzym-katalysierten Gewinnung hydrophober Produkte in wäßriger Lösung, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß man das Produkt aus der produkthaltigen Reaktionsmischung über eine produktdurchläseige mikroporöse Membran in ein organisches Lösungsmittel extrahiert und die produktverarmte Reaktionsmischung zur Produktion rezykliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß eine hydrophobe Membran verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß eine Cofaktor-abhängige enzymatische Umsetzung mit Cofaktor-regenerierung durchgeführt wird.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man die enzym-katalysierte Umsetzung in einem Reaktor mit darin immobilisiertem Enzym durchfuhrt.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man die Umsetzung in einem Enzymmembranreaktor durchführt
6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man die produkthaltige Reaktionsmischung zur Abtrennung des Produkts durch ein Hohlfasermembranbündel schickt, das von außen von organischem Lösungsmittel umströmt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6 , d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß das Hohlfasermembranbündel vom organischen Lösungsmittel im Gegenstrom zur Reaktionsmischung umströmt wird.
8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß mit einer mikroporösen Membran mit einer effektiven Porengröße von 5 - 500 μm und mit einem Differenzdruck zwischen wäßriger Phase und organischem Lösungsmittel von 0,5 - 5 bar gearbeitet wird.
9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, g e k e n n z e i c h n e t d u r c h die Produktion chiraler Alkohole, Amine, Cyanhydrine.
10.Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, g e k e n n z e i c h n e t d u r c h einen Rezyklierungskreis für das organische Lösungsmittel, in den die Produktextraktion einbezogen ist.
11.Verfahren nach Anspruch 10, g e k e n n z e i c h n e t d u r c h eine damit verbundene Produktisolierung und Rückführung von Substrat zur Produktion.
12.Vorrichtung zur kontinuierlichen Gewinnung hydrophober Produkte aus wäßriger Reaktionsmischung, geeignet zur Durchführung des Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, g e k e n n z e i c h n e t d u r c h einen Produktionskreis, in den eine Extraktionspatrone mit produktdurchlässiger, mikroporöser Membran einbezogen ist.
13.Vorrichtung nach Anspruch 12, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß die Extraktionspatrone ein Hohlfasermembranbündel aufweist.
14.Vorrichtung nach Anspruch 12 oder 13, g e k e n n z e i c h n e t d u r c h
Mittel zur Erzeugung eines Differenzdrucks zwischen wäßriger und organischer Phase in der Patrone.
15.Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 - 14, g e k e n n z e i c h n e t d u r c h eine EMR-Anordnung für die enzymatische Umsetzung im Produktionskreis.
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