WO1996029096A1 - Gene transfer preparation - Google Patents

Description

明細害

遺伝子導入製剤 技術分野

本発明は、 ¾伝子治療用ウィルスベクターの安全で保存安定性に優れた凍結乾 燥製剤の製造方法および該方法で得られる遺伝子導入製剤に関する。 背景技術

遺伝子工学の急速な発展により、 様々な分子生物学的手法の開発が行われてき た。 それにともなって、 遺伝子情報の解析および遺伝子の機能解明においては著 しい進歩がみられ、 そこから得られた成果を実際の治療現場に還元しょうとする 試みが数多く行われている。 その中でも、 最も進歩の著しい分野の 1つとして遗 伝子治療分野があげられる。 種々の遺伝性疾患における原因遺伝子の発見、 解読 が行われる一方、 それらの遺伝子を物理的および化学的手法により細胞内に導入 する方法が開発され、 遺伝子治療は基礎的実験の段階から、 実際の臨床応用が行 われるまでに発展してきている。

遺伝子治療の臨床応用としては、 1989年米国において初めて遺伝子治療の 臨床試験が行われて以来、 すでにイタリア、 オランダ、 フランス、 イギリス、 中 国においても臨床試験が開始されている。 特に米国においては、 1994年 7月 までに 54の滇伝子治療プロトコールが N I Hの組換え DNA委員会 （RAC) で承認され、 先天性免疫不全症 （アデノシンデァミナーゼ欠損症） 、 家族性高コ レステロール血症、 囊胞性線維症等の ¾伝性疾患およびグリオ一マや悪性黒色腫 等の各種瘙に対しての遺伝子治療の試みがなされている。 また、 最近では A I D Sに対する遺伝子治療の基礎的検討も数多くなされるようになつている。

遺伝子治療は、 遺伝子導入する細胞 （標的細胞） の種類により生殖細胞遺伝子 治療 （Ge rm l i n e C e l l Ge n e Th e r a y) と体細胞遗伝 子治療 （S oma t i c C e l l G e n e T h e r a p y ) に分類されて いる。 また、 異常 （原因） 遺伝子をそのままにして、 新しい （正常） 遺伝子を付 け加える付加遗伝子療法 (Au gme n t a t i o n G e n e Th e r a p y) と、 異常遺伝子を正常遗伝子で置き換える置換遺伝子療法 （Re p l a c e me n t Ge n e T h e r a p y ) に分類されているが、 現時点では倫理的 および技術的制約から、 体細胞に対する付加遺伝子治療のみが行われている。 さ らに、 遺伝子治療の方法としては、 まず患者から標的細胞を体外に取り出し、 目 的とする遺伝子を導入した後に再びその細胞を患者の体内に戻すという自家移植 による方法 （e x V i v o遺伝子治療） が現在行われているが、 将来的には遗 伝子を直接患者に投与する方法 （ i n V i v o遺伝子治療） も検討されている _c 以上のような遗伝子治療の臨床応用における大きな技術的課題の 1つとして、 いかにして外来遺伝子を効率良く安全に標的細胞へ導入出来るか、 ということが ある。 1980年代初期にはマイクロインジヱクシヨンなど物理的手法の応用が 試みられたが、 遺伝子の導入効率が低く、 安定に導入することができず、 さらに は当時の大量細胞培養技術の限界等もあり実用化にはつながらなかった。 その後、 外来遺伝子を効率良く標的細胞に導入するためのべクターとなる組換えウィルス (ウィルスベクター） が開発され、 初めて遺伝子治療の臨床応用が可能となった。 ウィルスベクターには以下に示すようにいくつかの種類があるが、 現在おこな われている遺伝子治療において、 最も広く使用されているウィルスベクターは、 マウス白血病ウィルス （MoML V： Mo 1 0 n e y Mu r i n e L e u k e m i a V i r u s) 由来のレ トロウィルスべクターであり、 本ウィルスの增 殖様式の利点を利用したものである。 レ トロウイルスは、 エンベロープをもつ R NAウィルスであり、 そのエンベロープ蛋白と宿主細胞側のレセプターが結合す ることにより細胞内に侵入する。 侵入後、 単一鎖ウィルス RNAが逆転写酵素に より二重鎖 DN Aに変換され、 感染細胞ゲノム DN Aに、 無作為であるが安定的 に組み込まれる。 ただし組み込まれるためには、 細胞が分裂増殖していなければ ならない （D. G. M i l l e r, e t a l. , Mo l e c u l a r a n d C e l l u l a r B i o l o gy, 10, 8, 4239, 1990 ) 。 組み 込まれたレトロウィルス遺伝子はプロウィルスと呼ばれる。 そのプロウィルスか ら RNAが転写され、 ウィルス蛋白が合成される。 それらの蛋白とウィルス RN Aにより、 新しいウィルス粒子がつくられる。 この場合のレトロウィルス遺伝子 を外来遺伝子に組換えたものがレ トロウイルスベクターである （A. D. Mi 1 1 e r , Cu r r e n t To i c s i n Mi c r o b i o l o gy a n d Immu n o l o gy, 158. 1, 1992) 。 レトロウイルスべクタ ―、 特に MoMLVベクターについてはこれまでに非常に多くの研究があり、 そ の安全性についても多くの改良が加えられてきており、 現在まで大きな問題は発 生していない。 しかしながら、 MoMLVベクターにおいては標的細胞のゲノム DN Aへの組み込みがランダムであることや、 ウィルス遺伝子の一部である口ン グターミナルリピート （以下 LTR) が遺伝子発現のためのプロモーション活性 を有するという性質が知られている。 そのため、 これまでに報告はないものの、 ランダムな外来遺伝子組み込みが行われた結果、 偶然その近傍に存在する癌遗伝 子を活性化して標的細胞を癌化させるという可能性を完全に否定することができ ず、 さらに安全なベクターの開発が強く望まれている。 さらに、 MoMLVべク ターにおいて実用的に一番間題となっているのは、 非分裂細胞に遗伝子導入でき ない点である。 そのため、 多くの先天性代謝異常症で問題となる神経細胞の遗伝 子修復が行えない。 それ以外にも、 遠伝子治療の対象細胞となっている造血幹細 胞、 肝細胞、 筋細胞なども、 通常はほとんど静止期にあるために遺伝子導入効率 は低い。 体外に取り出した細胞については、 遺伝子導入効率を高めるために分裂 を促進するような処理が行われているが、 生体内でこれらの細胞に遺伝子導入を 行うことは難しいと考えられ、 今後は非分裂細胞に対しても効率的に遺伝子を導 入できるベクターの開発が必要とされている。

ヘルぺスウィルスベクターは神経細胞への外来遺伝子導入が可能なベクターと して期待されている （T. D. P a l e l l a. e t a 1. , M o 1. C e 1 1. B i o l . . 8, 457, 1988) が、 細胞毒性が強く、 さらにウィル ス自体のゲノムサイズが 150 k bと非常に大きいために現在のところ開発は進 んでいない。

H I Vベクターはウィルス自体の宿主特性により、 〇04陽性丁リンパ球に対 して特異的遗伝子導入を可能とするベクターとして開発された （T. S h i ma d a, e t a 1. . J . C l i n. I nv e s t. , 88, 1043. 19 91) 。 リンパ球は先天性免疫不全症、 A I DS、 瘙などの遺伝子治療を行う際 に重要な標的細胞となっているため、 H I Vベクターの有用性には高い期待が寄 せられている。 H I Vベクターには、 最大の欠点として野生株混入の可能性とい う問題があるが、 これらが解決されれば血管内投与法による i n V i vo遗伝 子治療に使用できる可能性がある。

アデノウイルスベクターは非分裂細胞へも遗伝子が導入できること、 またべク ターを容易に 10の 10乗程度まで濃縮できるため最近最も注目を集めている。 最近の研究によりこのアデノウイルスベクターで、 気道上皮細胞、 肝細胞、 筋細 胞などへ i n V i V 0で高率に遺伝子導入できることが示されている （L. D. L a V r e r 0 , e t a l. , Hum. Ge n e Th e r a p y, 1. 2 41. 1990, B. Qu a n t i n, P r o c. Na t l. Ac a d. S c i . U. S. A. , 89, 2581. 1992) 。 その一方で、 本ベクターには 外来遺伝子を細胞内に導入した際にゲノム D N Aに組み込まれないという本質的 な性質があり、 ベクターを檁的細胞に作用させても数週間、 長くても数力月で遗 伝子導入の効果はなくなつてしまう。 そのため遺伝子導入を頻回に繰り返す必要 があり、 患者への肉体的、 精神的な負担の増加、 抗アデノウイルス抗体の出現に よる遗伝子導入効率の低下等が問題となっている。 また、 現在、 囊胞性線維症の 治療のためにアデノウイルスベクターを経気管支鏡的に肺に投与する臨床試験が 開始されているが、 アデノウイルス粒子の免疫原性および細胞毒性に起因すると みられる炎症反応が発生するといわれている。

—方、 A A V (Ad e n o - a s s o c i a t e d v i r u s ) ベクターは、 外来遺伝子が標的細胞ゲノム DNA内に組み込まれること、 病原性、 細胞毒性が ないこと (N. Mu z y c z k a, Cu r r e n t To i c s i n M i c r o b i o l o gy a n d I mmu n o l o gy, 158, 97. 199 2) などを特徴としている。 さらに、 ウィルス粒子へのパッケージングやゲノム DN Aへの遗伝子組み込みに必要な I TR ( I n V e r t e d T e r m i n a 1 Re e a t) は遺伝子発現のためのプロモーション活性がないことから、 目的に合った内部プロモーターを設定することにより、 遺伝子発現のオン オフ や組織特異的プロモーターの使用が可能となると同時に、 宿主範囲が広く様々な 標的細胞 Z疾患に対応できるため、 Mo ML Vベクターに代わる新しいウィルス ベクターとして期待されている。 また、 野生型の AAVは第 19染色体の特定の 位置に組み込まれることも発見され （M. S uwa do go a n d R. G. Ro e d e r, P r o Na t l . Ac a d. S c i. U. S. A. . 82. 4394, 1985) 、 遺伝子組み込み位置をターゲティングできるベクターと して注目されている。

しかしながら、 いずれのウィルスベクターにおいても、 それらを安定に保管し 均一性を保っための製剤学的検討は行われていない。 現在のところ、 ウィルスべ クタ一は凍結保存されて使用されているが、 保存期間に制限があり、 時間の経過 とともにウィルスベクターの力価が低下することが観察されている。 そのため、 実際の臨床研究においては各試験ごとにベクターを製造すると同時に、 治療前に は保管期間中の遺伝子導入効率の低下について試験を行う必要がある。 このよう な試験は、 方法が非常に複雑であると同時に、 桔果がでるまでにかなりの時間を 要するため、 より均一な性能で安定化されたウィルスベクターの供給方法の確立 が強く望まれている。

MoMLVベクターの凍結乾燥については試みられた例 （H. Ko t a n i e t a 1. Huma n Ge n e T h r a p y , 5, 19. 1994) も 存在するが、 安定化剤としてゼラチンが用いられている。 ゼラチンは通常ブタな どの動物由来のものを使用しており、 それゆえこれを生体に i n V i v o投与 した際には免疫原となりうる可能性が高く、 必ずしも安全な方法であるとはいえ ない。

現在行われている遺伝子治療の臨床研究においては、 用いられるベクターの種 類および治療用遺伝子の薬理効果に関しては詳細に検討がなされている。 しかし、 ウィルスベクターは遺伝子治療用の製剤であるため、 今後より多くの遺伝子治療 が行われるにあたっては、 安全で均一な性能のベクタ一を安定に供給する技術、 すなわちベクターの安定な保管方法の開発が必要不可欠とされている。 しかしな がら、 そのような分野に関する検討例は非常に少ない。 発明の開示

上記した課題を解決するために鋭意研究した結果、 本発明者らは安全で均一な 性能のウィルスベクターを安定に供給する技術、 すなわちウィルスベクターの安 定な保管方法を開発することに成功した。 これによつて、 各種ウィルスベクター を、 遗伝子導入効率を低下させずに凍結乾燥することが可能になる。

従来いくつかの種類のウィルスは、 凍結乾燥を行っても感染性を失わないこと が知られてきた。 その際、 添加剤としてはゼラチンおよび糖が加えられるのがー 般的である。 一方、 ウィルスと類似のウィルスベクターにおいても、 上述のよう に凍結乾燥の試みがなされている。 しかし、 その場合も添加剤としてはゼラチン および糖が加えられており、 生体に i n v i v o投与した際には免疫原となり うる可能性が高く、 必ずしも安全な方法であるとはいえない。

そこで本発明においては、 ゼラチン等の免疫原となりうる成分を含有せず、 し かも医薬品添加物としてすでに使用前例がある低分子物質のみを添加剤として用 いて、 遺伝子導入効率を高く保つ凍結乾燥方法の開発を行った。

すなわち、 本発明は、 アルギニン、 グルタミン酸 （またはそのナトリウム塩） 、 セリ ン、 グルコース、 イノシ トール、 ラク トース、 マンニトール、 ソルビトール、 卜レハロースおよびキシロースから選択される 1以上の添加剤を組換えウィルス ベクターに添加し、 凍結乾燥することからなる遺伝子導入製剤の製造方法を提供 する。

本発明はまた、 上記方法によって製造される遺伝子導入製剤を提供する。 図面の簡単な説明

図 1は、 各種の添加剤を 5 %濃度で加えたときの遺伝子導入の効率を示すグラ フである。

図 2は、 各種の添加剤を 2 . 5 %および 5 %濃度で加えたときの遺伝子導入の 効率を示すグラフである。

図 3は、 2 . 5 %濃度の 2種の添加剤を組み合わせて加えたときの遺伝子導入 の効率を示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態

本発明の方法が使用できるウィルスベクターは、 上記した M o M L V (マウス 白血病ウィルス） ベクター、 ヘルぺスウィルスベクター、 アデノウイルスベクタ 一、アデノ随伴ウィルス （A A V) ベクター、 ヒ 卜免疫不全ウィルス （H I V) ベクターなどの遺伝子治療に用いられるいかなるウィルスベクターであってもよ い。 このようなウィルスベクターを D M E M培地などの培地、 あるいは P B Sに 溶解してウィルスベクター原液を調製する。 ウィルスベクター原液の濃度はいか なるものであってもよい。

本発明の方法は上記ウィルスベクター原液に添加剤を加えて、 これを凍結乾燥 することによって達成される。 本発明において使用できる添加剤は免疫原性の低 い物質が好ましく、 低分子のアミノ酸およびその誘導体、 糖およびその誘導体で ある。

アミノ酸およびその誘導体としてはアルギニン、 グルタミン酸 （またはそのナ トリウム塩） およびセリンが好ましく、 特に、 グルタミン酸またはそのナトリウ ム塩が好ましい。

糖およびその誘導体としてはグルコース、 イノシトール、 ラク トース、 マンニ トール、 ソルビトール、 トレハロースおよびキシロースが好ましく、 特にダルコ ースが最も好ましい。

使用するウィルスベクターの種類、 ウィルスベクター溶液の濃度などにより、 これらのァミノ酸および糖から選択される 1以上を自由に組み合わせて添加剤と することができる。 アミノ酸のみの組み合わせ、 糖のみの組み合わせ、 アミノ酸 と糖との組み合わせから選択できる。 グルタミン酸ナトリウムとグルコースとの 組み合わせが高い遺伝子導入効率 （ウィルスベクター力価） を保持する点から最 も好ましい。

ァミノ酸および糖から選択される各添加剤のベクター溶液に対する重量比はそ れぞれ約 1〜約 1 0 %であり、 好ましくはそれぞれ約 1 . 5〜約 7 %であり、 も- とも好ましくは約 1 . 5〜約 5 %である。

さらには、 ァスコルビン酸、 ポリエチレングリコール、 ポリビニルピロリ ドン、 ポリビニルアルコールや、 保存料を添加してもよい。 また、 ウィルスベクター溶 液は等張であることが好ましく、 このためウィルスベクター溶液にバッファーを 加えて浸透圧を調整することができる。 このようにして得られた各種添加剤を加えたゥィルスべクタ一溶液を凍結乾燥 する。 凍結乾燥は公知の方法を用いることができ、 例えば、 液体窒素で凍結後、 凍結乾燥機 （フィンアクア社製） により行うことができる。 凍結乾燥した遺伝子 導入製剤はバイアル中に封入し、 好ましくは低温で使用時まで保管する。 本発明 の遺伝子導入製剤は使用時に水で再生することができる。 以下の実施例で示すよ うに、 水で再生したゥィルスベクターは高 t、遺伝子導入効率を保持していた。 本発明によって、 ゼラチン等の免疫原となりうる成分を含有せず、 しかも医薬 品添加物としてすでに使用前例がある低分子物質のみを添加剤として用いて、 遗 伝子導入効率を高く保つ遺伝子導入製剤を得ることができる。 本発明の遺伝子導 入製剤は保管が容易で、 かつ安定した力価を保持することができ、 あらゆるウイ ルスベクター製剤に用いることができ、 その応用範囲は極めて広い。 実施例

以下、 実施例を示してこの発明をさらに詳しく説明するが、 この発明は以下の 例に限定されるものではない。

実施例 1 ：組換え MoML Vベクターの調製

直径 9 cmの細胞培養用ディッシュに、 ネオマイシン耐性遺伝子を含んだ組換 え MoML Vベクターの産生細胞である P A311/β- 19 (日本医科大学島 田教授より供与） を播種し、 ゥシ胎児血清 （ギブコ社製） 10%含有 DMEM (ギブコ社製） 中で、 80%コンフルェン卜まで通常の条件 （37°C、 二酸化炭 素濃度 5%) で培養する。 細胞が 80%コンフルェントまで培養した後、 培地を 交換し、 12時間後に組換え MoML Vベクターを含んだ培地を回収し、 これを ベクター原液とする。 実施例 2 ：組換え MoML Vベクター溶液の調製および凍結乾燥

実施例 1で得られたベクター原液に、 図 1〜図 3に記載するアミノ酸、 糖、 ま たはこれらの組み合わせを添加剤として、 最終濃度 5%または 2. 5%となるよ うに加えた。 液体窒素で凍結後、 凍結乾燥機 （フィ ンアクア社製） により、 一昼 夜凍結乾燥を行った。 凍結乾燥品は使用するまで一 40°Cに保管した。 また、 添 加剤を加えないものも調製し、 それをコントロールとして用いた。 なお、 すべて の添加剤は和光純薬社製のものを用いた。 実施例 3 ：組換え MoMLVベクターの力価 （遗伝子導入効率） 測定方法

直径 6 cmの細胞培養用ディッシュに、 3T 3細胞 （大日本製薬社製） を播種 し、 ゥシ胎児血清 （ギブコ社製） 1 0%含有 DMEM (ギブコ社製） 中で 80% コンフルェン卜まで通常の条件 （37て、 二酸化炭素濃度 5%) で培養を行った _c 細胞が 80%コンフルェントまで培養した後、 力価測定に用いた。

実施例 2において得られた凍結乾燥品に注射用蒸留水 （大塚製薬製） を加え、 凍結乾燥前と同容積のベクター再懸濁液を調製した。 得られたベクター再懸濁液 1 0 u \ とゥシ胎児血清 1 0%含有 DMEM990 \を加えて混合し、 力価測 定用ベクター溶液を調製した。 80%コンフルェン卜まで培養した 3 Τ3細胞の 培地を取り除き、 そこに力価測定用ベクター溶液 1000 1を加え、 通常の条 件で培養を行った。 4時間後、 ゥシ胎児血清 1 0%含有 DMEM3m 1を加え、 さらに 24時間培養を継铳した。 その後、 ネオマイシンのアナログである G 4 1 8 (ギブコ社製） を 800 g/m 1の濃度で含有するゥシ胎児血清 1 0%含有 DMEMで培養を銃け、 生成した薬物耐性コロニーの数を力価 （c f uZm 1 ) とした。 実施例 4 ：組換え MoMLVベクターの力価測定

各種添加剤を 5%'濃度で用いた場合の結果を図 1に示す。 グルコース、 グルタ ミン酸ナトリウム、 マンニトール、 トレハロースにおいて力価が高いことが明ら かとなつた。 それらの 2. 5%添加時および 2種類の添加剤を混合して用いた場 合の結果を図 2および図 3に示す。 以上の結果より、 グルコースとグルタミン酸 ナトリウムを添加剤として用いることにより、 高い力価を有するウィルスベクタ 一の凍結乾燥品が得られることが明らかとなつた。

Claims

講求の範囲

1 . アルギニン、 グルタミン酸 （またはそのナトリウム塩） 、 セリン、 グルコ一 ス、 イノシトール、 ラク トース、 マンニトール、 ソルビトール、 トレハロースお よびキシロースから選択される 1以上の添加剤を組換えウィルスベクターに添加 し、 凍結乾燥することからなる遗伝子導入製剤の製造方法。

2. 各添加剤のベクター溶液に対する重 Jt比がそれぞれ約 1〜約 1 0 %である請 - 求項 1記載の方法。

3. 添加剤がグルタミン酸 （またはそのナトリウム塩） とグルコースの組み合わ せである請求項 1記載の方法。

4. 請求項 1の方法によって製造される遺伝子導入製剤。