WO1997029201A2 - Retroviraler vektor für den gentransfer eines il6-antagonisten in humane hämatopoetische stammzellen - Google Patents

Retroviraler vektor für den gentransfer eines il6-antagonisten in humane hämatopoetische stammzellen Download PDF

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    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Definitions

  • the invention relates to a retroviral vector for the gene transfer of an IL6 antagonist into human hematopoietic stem cells for the treatment of multiple myeloma.
  • Areas of application of the invention are medicine and the pharmaceutical industry.
  • Plasmacytoma Multiple myeloma, or plasmacytoma, is an incurable malignant disease of the antibody-secreting B cell with an annual incidence of 4 new diseases per 100,000 inhabitants in Germany.
  • the main localization of the plasma cytoma cells is bone and bone marrow, where they lead to osteolysis or displacement of the hematopoiesis, with the consequences anemia, leukocytopenia and thrombocytopenia.
  • the median survival after the onset of the disease is 3 years (W. Siegenthaler et al., Textbook of Internal Medicine, 3rd edition (1992), pp. 723-727).
  • interleukin-6 has been characterized as a cytokine that is of crucial importance for the growth of plasma cytoma cells. It has recently been shown that it is not possible to induce plasmacytomas or to propagate already established (syngeneic) plasmacytoma cells in transgenic IL6 "knock-out" mice, that is to say mice that no longer have a functional IL6 gene not - ' ⁇ nock-out "mice was readily possible.
  • IL6 interleukin-6
  • the aim of the invention is to develop a gene therapy strategy for combating multiple myeloma with the aid of IL6 antagonists.
  • the aim of this strategy is to ensure that the biologically active concentration of this antagonist in the bone marrow is sufficiently high in clinical use to neutralize the IL6 present.
  • the invention is therefore based on the object of constructing a vector which, after transfer to autologous hematopoietic stem cells, brings about a strong and stable expression of a suitable IL6 antagonist.
  • the essential basis of the invention is a retroviral starting vector, preferably a MoMLV derivative, particularly preferably the vector pSFlN, which shows a particularly high level of expression for gene transfer into hematopoietic stem and progenitor cells.
  • the gene of an IL6 antagonist and a suicide or a selection gene are incorporated into this vector using methods known per se in genetic engineering.
  • the thymidine kinase gene and the cytosine desaminase gene are the main suicide genes suitable.
  • the puromycin gene, the neomycin acetyltransferase gene or the mdr-1 gene are preferably used as the selection gene.
  • the gene of the IL6 antagonist and the suicide or selection gene are preferably located on the same mRNA, that is to say they are controlled in expression by the same promoter which is particularly suitable for stem cells, and are nevertheless translated separately.
  • the suicide gene unforeseen side effects of the therapeutic gene, e.g. on the normal hematopoiesis of the patient, those cells are produced which produce the IL6 antagonist.
  • stem cells which produce high amounts of mdr-1 under the selection pressure of chemotherapy will also express large amounts of IL6 antagonist at the same time.
  • the selection of the IL6 antagonist is of particular importance for the effect of the vector.
  • all known IL6 antagonists can be used, but preference is given to up to 20 codons over the human interleukin-6 mutant antagonists.
  • Another important embodiment is an IL6 antagonist containing 12 codon mutations
  • ACATGTGTGA 251 AAGCAGCAAA GAGGCACTGG CAGAAAACAA CCTGAACCTT
  • CTCATTCTGC 601 GCAGCTTTAA GGAGTTCCTG atccgCAGCC TGAGGGCTCT
  • SV40 Simian Virus 40 early promoter
  • the vector is packaged using known viral vector packaging lines, which can generate non-replication-capable retroviruses.
  • the selection of the virus envelope used has a significant impact on the efficiency of the gene transfer.
  • the lines FLY13 and GP + envAml2 are particularly suitable.
  • the vector is used in such a way that hematopoietic stem cells from peripheral blood or bone marrow of patients are stimulated by cytokine, the vector is transferred into these stem cells and they are then returned to the patient, preferably by intravenous injection. Since hematopoietic stem cells preferentially ' homen ' in the bone marrow after systemic administration, the expression of the IL6 antagonist is ensured in this organ.
  • the vector according to the invention has a high gene expression rate in hematopoietic stem cells and can therefore be used effectively. It enables a curative approach to the treatment of multiple myeloma, which is potentially superior to previous therapies.
  • the invention will be explained in more detail below by application examples.
  • This vector is a MoLMV derivative and contains regulatory elements of the viruses FUCF and MESV, which lead to the fact that the genes transferred with this vector pSFlN are particularly strongly expressed in hematopoietic stem and progenitor cells.
  • This vector is therefore superior to previous vectors with regard to gene transfer in hematopoietic stem cells and is therefore particularly suitable for a possible gene therapy use of the IL6 antagonist in hematopoietic Staram cells.
  • the antagonist was equipped with a myc tag. In this way it is easily possible to detect the IL6 antagonist expression in the serum or bone marrow of the patient by means of immunological methods (eg ELISA).
  • the neomycin resistance gene in the pSFlN was replaced by a puromycin resistance gene and linked to the IL6 antagonist via an IRES sequence.
  • the new vector resulting from the incorporation of the IL6 antagonist is called pSF-IL-6AP.
  • a suicide gene the herpes simplex thymidine kinase, was incorporated into the vector in a further step.
  • This enables the cell genetically modified by the vector to be killed in the patient by systemic administration of ganciclovir.
  • both cDNAs were linked in the vector via an IRES (inter-ribosomal recognition site) sequence.
  • IRES internal-ribosomal recognition site
  • both genes are located on the same mRNA, that is to say they are controlled in expression by the same promoter which is particularly suitable for stem cells, and are nevertheless translated separately.
  • the new vector resulting from the incorporation of the Tk suicide gene is called pSF-IL-6AT.
  • the multidrug resistance gene (radr-1) was additionally incorporated into the vector.
  • chemotherapy which is used in the context of conventional plasmacytoma therapy, can enrich those stem cells in the patient that also carry the IL6 antagonist. This would increase the IL6 antagonist concentration in the patient and increase the therapeutic efficacy of the vector.
  • both cDNAs in the vector were linked via an IRES (inter-ribosomal recognition site) sequence. In this way, both genes are located on the same raRNA, that is to say they are controlled in expression by the same promoter which is particularly suitable for stem cells, and are nevertheless translated separately. Stem cells that express high amounts of mdr-1 under the pressure of chemotherapy will also simultaneously express large amounts of IL6 antagonist.
  • the new vector resulting from the incorporation of the mdr-1 gene is called pSF-IL-6AM.
  • the vector DNA is packaged into viruses using the retroviral packaging cell lines FLY13 and FLYRD18.
  • These packaging lines have the advantage that they generate much higher (100-fold) virus titers than previously used lines (Cosset et al., Journ. Virol. 69: 7430-36, 1995). This leads to an improvement in gene transfer efficiency in hematopoietic stem cells.
  • Another advantage of these lines is that they produce viral vectors that are stable in human serum. Since gene transfer must be carried out in human serum as a cultivation medium in a clinical application, these packaging lines are very well suited for this purpose.
  • the virus-containing supernatant from the packaging lines is used in gene transfer to primary hematopoietic stem cells.
  • the stem cells are previously treated with a cytokine cocktail (Brugger et al., Blood 81: 2579-84, 1993) for 24 hours. The virus supernatant is then added and cultivated for 48 hours. This leads to a gene transfer efficiency of 10-20%. 6)
  • the application of the invention is primarily intended for the treatment of multiple myeloma. Since it has been shown that the cytokine IL6 is an essential growth factor for plasmotytom cells and the withdrawal of this factor leads to the death of the malignant cells, the expression of high concentrations of the IL6 antagonist in the bone marrow by means of gene transfer in stem cells represents a curative approach to the treatment of multiple myeloma and is therefore potentially superior to previous therapy methods.
  • Item 57 (aspartate for leucine), item 59 (phenylalanine for glutamate), item 60 (tryptophan for asparagine).
  • Pos. 75 (tyrosine for glutamine), Pos. 76 (lysine for serine)
  • Steps 2-4 take place analogously to example I.
  • the vector DNA is packaged into viruses using the retroviral packaging line GP + envAml2 (Markowitz et al., Virology 167, 400-406, 1988).
  • This packaging line has the advantage that the titers are not significantly lower than those of the fly
  • the virus envelope used here is particularly suitable for the infection of hematopoietic stem cells (Xu et al., Exp.- Hematology 22 (2), Feb 223-30, 1994).
  • this vector also contains another internal promoter (SV 40 or CMV) for the independent transcription of the resistance gene, in this case the gene for neomycin resistance.
  • This proven vector design allows the in vitro selection of infected stem cells using neomycin or neomycin analogs and has already been used successfully in several stem cell gene therapy studies (e.g.
  • retroviral vectors are packaged analogously to Examples I and II in the packaging cell lines used there, and the infection protocol does not change (with the exception of the use of neomycin as a selection antibiotic).

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen retroviralen Vektor für den Gentransfer eines Interleukin-6(IL6)-Antagonisten in humane hämatopoetische Stammzellen zur Behandlung des multiplen Myeloms. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie. Der erfindungsgemäße Vektor besteht aus einem retroviralen Ausgangsvektor, dem Gen eines IL6-Antagonisten, einem Suizid- bzw. Selektionsgen und ggf. Promotoren zur Transkription der Suizid- bzw. Selektionsgene. Eine bevorzugte Ausführungsform besteht aus dem MoMLV-Derivat pLXSN als retroviralen Ausgangsvektor, dem Gen eines an bis zu 20 Kodons im Vergleich zum humanen Interleukin-6 mutierten IL6-Antagonisten, dem Gen für die Neomycin-Acetyltransferase als Selektionsgen und den viralen immediate-early-Promotoren der CMV und SV40 Viren. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform besteht aus dem MoMLV-Derivat pSF1N als retroviralen Ausgangsvektor, dem Gen eines an 7 Kodons im Vergleich zum humanen Interleukin-6 mutierten IL6-Antagonisten und dem Thymidinkinasegen oder dem Cytosin-Desaminasegen als Suizidgen bzw. dem Puromycingen oder dem mdr-1-Gen als Selektionsgen.

Description

Retroviraler Vektor für den Gentransfer eines IL6- Antagonisten in humane hämatopoetische Stammzellen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft einen retroviralen Vektor für den Gentransfer eines IL6-Antagonisten in humane hämatopoetische Stammzellen zur Behandlung des multiplen Myeloms. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.
Das multiple Myelom, oder auch Plasmozytom, ist eine unheilbare maligne Erkrankung der Antikörper-sezernierenden B-Zelle mit einer jährlichen Inzidenz von 4 Neuerkrankungen pro 100 000 Einwohner in Deutschland. Hauptlokalisation der Plasmazytomzellen sind Knochen und Knochenmark, wo sie zu Osteolysen bzw. Verdrängung der Hämatopoese, mit den Folgen Anämie, Leukozytopenie und Thrombozytopenie führen. Trotz der Einführung unterschiedlicher Polychemotherapieprotokolle und der Strahlentherapie besteht für das multiple Myelom nach wie vor kein kurativer Ansatz. Die mittlere Überlebenszeit nach Erkrankungsbeginn beträgt 3 Jahre (W. Siegenthaler et al., Lehrbuch der inneren Medizin, 3. Auflage (1992), S. 723-727).
In den letzten Jahren konnte mit Interleukin-6 (IL6) ein Zytokin charakterisiert werden, das für das Wachstum von Plasmazytomzellen von entscheidender Bedeutung ist. So konnte vor kurzem gezeigt werden, daß es nicht möglich ist, bei transgenen IL6 "knock-out" Mäusen, also Mäusen, die kein funktionelles IL6 Gen mehr besitzen, Plasmozytome zu induzieren oder bereits etablierte (syngene) Plasmozytomzellen zu propagieren, während dies bei nicht-'^nock-out" Mäusen ohne weiteres möglich war. ( Hubert, D.M., M. Kopf, B.A. Mock, G. Köhler, and S. and Rudikoff. 1995. Interleukin-6 is essential for in vivo development of B neoplasms. J. Exp . Med . : 182:243- 248),. Erste klinische Einsätze von IL-6- neutralisierenden Antikörpern führten zu vorübergehenden partiellen Remissionen .( Klein, B., Wijdenes, J. , Zhang, X.G., Jourdan, M. , Boiron, J.M. , Brochier, J. , Liautard, J., Merlin, M. , Clement, C. , Morel-Fournier, B. et al. 1991. Murine anti-interleukin-6 antibody therapy for a patient with plasma cell leukemia. Blood. 78:1198- 1204.3).. Allerdings ist aufgrund der hohen lokalen IL6- Konzentration im Knochenmark nicht zu erwarten, daß die systemische Gabe von Antikörpern zu einer ausreichenden Antagonisierung führt, so daß klinische Versuche in dieser Richtung keinen Erfolg versprechen.
Die Erfindung hat das Ziel, eine gentherapeutische Strategie zur Bekämpfung des multiplen Myeloms mit Hilfe von IL6-Antagonisten zu entwickeln. Mit dieser Strategie soll erreicht werden, daß die biologisch wirksame Konzentration dieses Antagonisten im Knochenmark bei einer klinischen Anwendung ausreichend hoch ist, um das vorhandene IL6 zu neutralisieren.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, einen Vektor zu konstruieren, der nach Transfer in autologe hämatopoetische Stammzellen einen geeigneten IL6- Antagonisten stark und stabil zur Expression bringt.
Die Erfindung wird gemäß Anspruch 1 realisiert, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.
Wesentliche Basis der Erfindung ist ein retroviraler Ausgangsvektor, bevorzugt ein MoMLV-Derivat, besonders bevorzugt der Vektor pSFlN, der für den Gentransfer in hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen eine besonders hohe Expressionsstärke zeigt. In diesen Vektor wird mit in der Gentechnik an sich bekannten Methoden das Gen eines IL6-Antagonisten und ein Suizid- bzw. ein Selektionsgen eingebaut. Als Suizidgen sind vor allem das Thymidinkinasegen und das Cytosin-Desaminasegen geeignet. Als Selektionsgen werden bevorzugt das Puromycin-, das Neomycin-Acetyltransferasegen oder das mdr-1-Gen eingesetzt.
Das Gen des IL6-Antagonisten und das Suizid- bzw. Selektionsgen liegen bevorzugt auf derselben mRNA, werden also von demselben für Stammzellen besonders geeigneten Promotor in der Expression gesteuert, und werden dennoch getrennt translatiert. Somit könnten im Falle des Suizidgens bei unvorhergesehenen Nebenwirkungen des therapeutischen Gens, z.B. auf die normale Hämatopoese des Patienten, gezielt diejenigen Zellen abgetötet werden, die den IL6- Antagonisten produzieren. Im Falle des mdr-1-Gens werden Stammzellen, die unter dem Selektionsdruck einer Chemotherapie hohe Mengen an mdr-1 produzieren, auch gleichzeitig große Mengen IL6-Antagonist exprimieren.
Von besonderer Bedeutung für die Wirkung des Vektors ist die Auswahl des IL6-Antagonisten. Grundsätzlich können alle bekannten IL6-Antagonisten eingesetzt werden, bevorzugt sind jedoch an bis zu 20 Kodons gegenüber dem humanen Interleukin-6 mutierten Antagonisten.
Eine wichtige Ausführungsform des Vektors ist die Einfügung des Gens des an 7 Kodons mutierten IL6- Antagonisten folgender Sequenz (Mutationen sind durch kleine Buchstaben gekennzeichnet) :
1 CCACGAtCCC AGCTATGAAC TCCTTCTCCA CAAGCGCCTT CGGTCCAGTt
51 GCCTTCTCCC TGCGGCTGCT CCTGGTGTTG CCTGCTGCCT TCCCTGCCCC
01 AGTACCCCCA GGAGAAGATT CCAAAGATGT AGCCGCCCCA CACAGACAGC
51 CACTCACCTC TTCAGAACGA ATTGACAAAC AAATTCGCgA CATCCTCGAC
01 t tCATCTCAG CCCTGAGAAA GGAGACATGT AACAAGAGTA ACATGTGTGA
51 AAGCAGCAAA GAGGCACTGG CAGAAAACAA CCTGAACCTT CCAAAGATGG
01 CTGAAAAAGA TGGATGCTTC CAATCTGGAT TCAATGAGGA GACTTGCCTG
5 1 GTGAAAATCA TCACTGGTCT TTTGGAGTTT GAGGTATACC TAGAGTACCT
0 1 CCAGAACAGA TTTGAGAGTA GTGAGGAACA AGCCAGAGCT GTGCAGATGA
S I GaACAAAAGa CCTGATCCAG TTCCTGCAGA AAAAGGCAAA GAATCTAGAT
0 1 GCAATAACCA CCCCTGACCC AACCACAAAT GCCAGCCTGC TGACGAAGCT
51 GCAGGCACAG AACCAGTGGC TGCAGGACAT GACAACTCAT CTCATTCTGC
0 1 GCAGCTTTAA GGAGTTCCTG atccgCAGCC TGAGGGCTCT TCGGgcAATG
5 1 TAGCATcGat ACC
tt ( Gen 1 ) u
Eine weitere wichtige Ausführungsform ist ein an 12 Kodons Mutationen enthaltender IL6-Antagonist
( zusätzlich myc-Tag) folgender Sequenz (Mutationen sind durch kleine Buchstaben gekennzeichnet) :
1 CCAGGAtCCC AGCTATGAAC TCCTTCTCCA CAAGCGCCTT CGGTCCAGTT 51 GCCTTCTCCC TGGGGCTGCT CCTGGTGTTG CCTGCTGCCT
TCCCTGCCCC 101 AGTACCCCCA GGAGA AGATT CCAAAGATGT AGCCGCCCCA
CACAGACAGC 151 CACTCACCTC TTCAGAACGA ATTGACAAAC AAATTCGGgA
CATCCTCGAC 201 ttCATCTCAG CCCTGAGAAA GGAGACATGT AACAAGAGTA
ACATGTGTGA 251 AAGCAGCAAA GAGGCACTGG CAGAAAACAA CCTGAACCTT
CCAAAGATGG 301 CTGAAAAAGA TGGATGCTTC CAATCTGGAT TCAATGAGGA
GACTTGCCTG 351 GTGAAAATCA TCACTGGTCT TTTGGAGTTT GAGGTATACC
TAGAGTACCT 401 CCAGAACAGA TTTGAGAGTA GTGAGGAACA AGCCAGAGCT
GTGCAGATGA 451 GaACAAAAGa CCTGATCCAG TTCCTGCAGA AAAAGGCAAA
GAATCTAGAT 501 GCAATAACCA CCCCTGACCC AACCACAAAT GCCAGCCTGC
TGACGAAGCT 551 GCAGGCACAG AACCAGTGGC TGCAGGACAT GACAACTCAT
CTCATTCTGC 601 GCAGCTTTAA GGAGTTCCTG atccgCAGCC TGAGGGCTCT
TCGGgcAATG 651 gaacagaaac tgatctccga agaagatctg taatagatcg atacc
( SANT 7 = Gen 2 K)
Eine bevorzugte Kombination der Merkmale des Vektors ist die Verwendung
- des retroviralen Ausgangsvektors pSFlN,
- des Gens des an 7 Kodons gegenüber dem humanen Interleukin-6 mutierten IL6-Antagonisten der Sequenz ( Gen 1"
- und eines Suizid- bzw. Selektionsgens. Eine weitere wichtige Kombination ist ein Vektor
- pLXSN als retroviralem Ausgangsvektor,
- dem Gen 2 als IL 6-Antagonisten,
- dem Gen für Neomycin-Acetyltransferase als Selektionsgen und
- dem Simian Virus 40 early Promotor (SV40) alε internem Promotor zur Transkription des Selektionsgens im Ausgangsvektor.
Der Aufbau der erfindungsgemäßen Vektoren ist in den Abbildungen 1 und 2 schematisch dargestellt.
Die Verpackung des Vektors erfolgt mit Hilfe bekannter viraler Vektor-Verpackungslinien, welche nicht- replikationsfähige Retroviren generieren können. Die Auswahl der verwendeten Virushülle hat erhebliche Auswirkungen auf die Effizienz des Gentransfers. Besonders geeignet sind die Linien FLY13 und GP+envAml2.
Die Anwendung des Vektors erfolgt in der Weise, daß hämatopoetische Stammzellen aus peripherem Blut bzw. Knochenmark von Patienten durch Zytokin stimuliert werden, der Transfer des Vektors in diese Stammzellen erfolgt und sie anschließend, bevorzugt durch intravenöse Injektion, wieder in den Patienten zurückgegeben werden. Da hämatopoetische Stammzellen nach systemischer Gabe bevorzugt im Knochenmark 'homen', ist die Expression des IL6-Antagonisten in diesem Organ gesichert.
Der erfindungsgemäße Vektor hat eine hohe Gen¬ expressionsrate in hämatopoetischen Stammzellen und ist dadurch effektiv einsetzbar. Er ermöglicht einen kurativen Ansatz zur Behandlung des multiplen Myeloms, der bisherigen Therapieverfahren potentiell überlegen ist. Die Erfindung soll nachfolgend durch Anwendungsbeispiele näher erläutert werden.
Beispiel I
1) Die cDNA des in der Literatur beschriebenen humanen IL6- Antagonisten wurde mittels RT-PCR hergestellt. Es wurden dabei auf Grundlage der humanen Interleukin-6 Sequenz Punktmutationen eingeführt, die zu folgenden sieben Aminosäuren-Austauschen führen: Pos 31 (Aspartat für Tyrosin), Pos 35 (Phenylalanin für Glycin), Pos 118 (Arginin für Serin), Pos 121 (Aspartat für Valin) , Pos 175 (Isoleucin für Glutamin) , Pos 176 (Arginin für Serin) , Pos 183 (Alanin für Glutamin) Lit. : Savino, R. , Ciapponi, L. , Lahm, A. , Dematis, A. , Cabibbo, A. , Toniatti, C. , Delmastro, P. , Altamura, S., and Ciliberto, G. 1994. Rational design of a receptor super-antagonist of human IL-6. EMBO.J. 13::5863- 5870.
2) Die cDNA des IL6-Antagonisten wurde im nächsten Schritt in den von Baum et al. beschriebenen retroviralen Vektor pSFlN( Baum, c, Hegewisch.Becker, S., Eckert, H-G., Stocking, C. , and Ostertag, W. 1995. Novel retroviral vectors for efficient expression of the multidrug resistance (mdr-1) gene in early hematopoietic cells. J. Virol . 69: 7541-7547; Patentanmeldung PCT/EP95/03175) kloniert. Dieser Vektor ist ein MoLMV- Derivat und enthält regulatorische Elemente der Viren FUCF und MESV , die dazu führen, daß die mit diesem Vektor pSFlN transferierten Gene besonders stark in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen exprimiert werden. Dieser Vektor ist daher in Bezug auf Gentransfer in hämatopoetische Stammzellen bisherigen Vektoren überlegen und daher für einen möglichen gentherapeutischen Einsatz des IL6-Antagonisten in hämatopoetische Staramzellen besonders geeignet. Um den 116-Antagonisten von endogenem IL6 unterscheiden zu können, wurde der Antagonist mit einem myc-Tag ausgestattet. Auf diese Art und Weise ist es leicht möglich, die IL6-Antagonisten-Expression im Serum oder Knochenmark des Patienten mittels immunologischer Methoden (z.B. ELISA) nachzuweisen. Das Neomycin- Resistenzgen im pSFlN wurde durch ein Puromycin- Resistenzgen ersetzt und über eine IRES Sequenz mit dem IL6-Antagonisten verbunden. Der neue durch den Einbau des IL6-Antagonisten resultierende Vektor wird pSF-IL- 6AP bezeichnet.
3) Um den Vektor für eine mögliche therapeutische Anwendung am Menschen sicherer zu machen, wurde in einem weiteren Schritt ein Suizidgen, die Herpes simplex Thymidinkinase, in den Vektor eingebaut. Dies ermöglicht die Abtötung der durch den Vektor genmodifizierten Zelle im Patienten durch die systemische Gabe von Ganciclovir. Um die gleichzeitige Expression von IL6-Antagonist und Tk-Gen zu gewährleisten, wurden beide cDNAs im Vektor über eine IRES (Inter-Ribosomale-Erkennungsstelle) Sequenz verbunden. Auf diese Art und Weise liegen beide Gene auf derselben mRNA , werden also von demselben für Stammzellen besonders geeigneten Promotor in der Expression gesteuert, und werden dennoch getrennt translatiert. Somit könnten im Falle unvorhergesehener Nebenwirkungen des therapeutischen Gens z.B. auf die normale Hämatopoese des Patienten gezielt diejenigen Zellen abgetötet werden, die den IL6- Antagonisten produzieren. Der neue durch den Einbau des Tk-Suizidgens resultierende Vektor wird pSF-IL-6AT bezeichnet.
4) Um eine in vivo Selektion von Stammzelllen erzielen zu können, wurde das Multidrug Resistenzgen (radr-1) zusätzlich in den Vektor eingebaut. Auf diese Art und Weise können durch eine Chemotherapie, die im Rahmen der konventionellen Plasmozytomtherapie angewendet wird, diejenigen Stammzelllen im Patienten angereichert werden, die auch den IL6-Antagonisten tragen. Dies würde zur Erhöhung der IL6-Antagonisten-Konzentration im Patienten führen und die therapeutische Wirksamkeit des Vektors erhöhen. Um die gleichzeitige Expression von IL6- Antagonist und mdr-1-Gen zu gewährleisten, wurden beide cDNAs im Vektor über eine IRES (Inter-Ribosomale- Erkennungsstelle) Sequenz verbunden. Auf diese Art und Weise liegen beide Gene auf derselben raRNA , werden also von demselben für Stammzellen besonders geeigneten Promotor in der Expression gesteuert, und werden dennoch getrennt translatiert. Somit werden Stammzellen, die unter dem Selektionsdruck einer Chemotherapie hohe Mengen an mdr-1 exprimieren auch gleichzeitig große Mengen IL6- Antagonist exprimieren. Der neue durch den Einbau des mdr-1-Gens resultierende Vektor wird pSF-IL- 6AM bezeichnet.
5) Die Vektor-DNA wird mit Hilfe der retroviralen Verpackungszelllinien FLY13 und FLYRD18 zu Viren verpackt. Diese Verpackungslinien haben den Vorteil, daß sie wesentlich höhere (lθ-100fach) Virustiter erzeugen als bislang verwendete Linien (Cosset et al., Journ. Virol.69: 7430-36, 1995). Dies führt zu einer Verbesserung der Gentransfereffizienz in hämatopoetische Stammzellen. Ein weiterer Vorteil dieser Linien besteht darin, daß sie virale Vektoren produzieren, die in humanem Serum stabil sind. Da bei einer klinischen Anwendung der Gentransfer in humanem Serum als Kultivierungsmedium durchgeführt werden muß, sind diese Verpackungslinien für diesen Zweck sehr gut geeignet. Beim Gentransfer in primäre hämatopoetische Stammzellen wird der virushaltige Überstand der Verpackungslinien verwendet. Die Stammzellen werden vorher 24 Stunden mit einem Zytokin-Cocktail (Brugger et al., Blood 81:2579- 84, 1993) behandelt. Danach wird der Virusüberstand dazugegeben und für 48 Stunden kultiviert. Die führt zu einer Gentransfereffizienz von 10-20%. 6) Die Anwendung der Erfindung ist vor allem zur Behandlung des multiplen Myeloms vorgesehen. Da gezeigt wurde, daß das Zytokin IL6 ein essentieller Wachstumsfaktor für Plasmotytomzellen ist und der Entzug dieses Faktors zum Absterben der malignen Zellen führt, stellt die Expression hoher Konzentrationen des IL6-Antagonisten im Knochenmark mittels Gentransfer in Stammzellen einen kurativen Ansatz zur Behandlung des multiplen Myeloms dar und ist deshalb bisherigen Therapieverfahren potentiell überlegen.
Beispiel II
1. Die c-DNA des Sant 7 ( = /( Gen 2 ) (Lit. Sporeno et al., Blood, Vol. 87 (1996), S. 4510-4519) wurde, wie bereits im Beispiel I beschrieben, mit Hilfe einer RT-PCR mit mutagenen Primern konstruiert. Dadurch entstehen zusätzlich zu den im Beispiel I aufgeführten Änderungen folgende Aminosäure- Austausche:
Pos. 57 (Aspartat für Leucin) , Pos. 59 (Phenylalanin für Glutamat) , Pos. 60 (Tryptophan für Asparagin) . Pos. 75 (Tyrosin für Glutamin), Pos. 76 (Lysin für Serin)
Die Schritte 2-4 erfolgen analog Beispiel I.
5. Die Vektor-DNA wird mit Hilfe der retroviralen Verpackungslinie GP+envAml2 (Markowitz et al., virology 167, 400-406, 1988) zu Viren verpackt. Diese Verpackungslinie hat den Vorteil, daß die Titer nicht wesentlich unter denen der Fly liegen
- die hier verwendete Virushülle besonders zur Infektion hämatopoetischer Stammzellen geeignet ist (Xu et al., Exp.- Hematology 22(2), Feb 223-30, 1994).
Die weitere Bearbeitung erfolgt gemäß Beispiel I. O 97/29201 PO7DE97/00231
11
Diese zusätzlichen 5 Mutationen im Interleukin 6 Molekül erhöhen die Wirksamkeit des IL6 Rezeptor-Antagonisten etwa um Faktor 60 (Sporeno et al.). Die nun verbesserte Antagonisten-Version kann nun analog Beispiel I in den oben aufgeführten Vektoren zum Einsatz kommen, wobei Position und Größe des IL-6 Rezeptorantagonisten innerhalb des Konstruktes unverändert bleiben.
Ein weiterer Vorteil der Anwendung des Sant 7 ist die Tatsache, daß für diese Variante zum jetzigen Kenntnisstand jede biologische Restaktivität am IL-6 Rezeptor ausgeschlossen werden kann, was für andere Ausführungen nicht gewährleistet sein muß.
Beispiel III
Die c-DNA der in Beispiel I und II eingesetzten IL-6- Antagonisten („Gen 1 und „Gen 2 l) wurde in den retroviralen Vektor pLXSN, ebenfalls ein MoMLV-Derivat, kloniert. Dieser Vektor enthält außer dem viralen Vektor LTR noch einen weiteren internen Promoter (SV 40 oder CMV) für die unabhängige Transkription des Resistenzgens, in diesem Fall das Gen für die Neomycin-Resistenz. Diese bewährte Vektorkonstruktion erlaubt die in-vitro-Selektion infizierter Stammzellen mittels Neomycin oder Neomycin- Analoga und wurde schon mit Erfolg in mehreren Stammzell- Gentherapiestudien eingesetzt (z. B. Xu et al. , Experimental Hematology 22:223-230 (1994)), so daß die Funktion dieses Vektors im oben genannten System gesichert ist, auch wenn er nicht speziell für hohe transkriptioneile Aktivität in humanen hämatopoetischen Stammzellen ausgelegt ist.
Die Verpackung dieser retroviralen Vektoren erfolgt analog zu Beispiel I und II in den dort verwendeten Verpackungszellinien, auch das Infektionsprotokoll ändert sich nicht (mit Ausnahme der Verwendung von Neomycin als Selektionsantibiotikum) .

Claims

Patentansprüche
1. Retroviraler Vektor für den Gentransfer eines IL6- Antagonisten in humane hämatopoetische Stammzellen, bestehend aus
- einem retroviralen Ausgangsvektor,
- dem Gen eines IL6-Antagonisten,
- einem Suizid- bzw. Selektionsgen
- und ggf. Promotoren zur Transkription der Suizid¬ bzw. Selektionsgene.
2. Vektor nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein MoMLV-Derivat als retroviralen Ausgangsvektor.
3. Vektor nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch den retroviralen Ausgangsvektor pSFlN.
4. Vektor nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch den retroviralen Ausgangsvektor pLXSN.
5. Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen eines an bis zu 20 Kodons gegenüber dem humanen Interleukin-6 mutierten IL6-Antagonisten eingesetzt wird.
6. Vektor nach Anspruch 1 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen eines an 5-10 Kodons gegenüber dem humanen Interleukin-6 mutierten IL6-Antagonisten eingesetzt wird.
7. Vektor nach Anspruch 1, 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen des an 7 Kodons gegenüber dem humanen Interleukin-6 mutierten IL6-Antagonisten folgender Sequenz eingesetzt wird: 1 CCAGGAtCCC AGCTATGAAC TCCTTCTCCA CAAGCGCCTT CCGTCCAGTT
5 1 GCCTTCTCCC TGGGGCTGCT CCTGGTGTTG CCTGCTGCCT TCCCTGCCCC
10 L AGTACCCCCA GGAGAAGATT CCAAAGATGT AGCCGCCCCA CACAGACAGC
15 1 CACTCACCTC TTCAGAACGA ATTGACAAAC AAATTCGGgA CATCCTCGAC
201 ttCATCTCAG CCCTGAGAAA GGAGACATGT AACAAGAGTA ACATGTGTGA
251 AAGCAGCAAA GAGGCACTGG CAGAAAACAA CCTGAACCTT CCAAAGATGG
30 1 CTGAAAAAGA TGGATGCTTC CAATCTGGAT TCAATGAGGA GACTTGCCTG
3 5 1 GTGAAAATCA TCACTGGTCτ TTTGGAGTTT GAGGTATACC TAGAGTACCT
40 1 CCAGAACAGA TTTGAGAGTA GTGAGGAACA AGCCAGAGCT GTGCAGATGA
4 S I GaACAAAAGa CCTGATCCAG TTCCTGCAGA AAAAGGCAAA GAATCTAGAT
50 1 GCAATAACCA CCCCTGACCC AACCACAAAT GCCAGCCTGC TGACGAAGCT
5 S 1 GCAGGCACAG AACCAGTGGC TGCAGGACAT GACAACTCAT CTCATTCTGC
60 1 GCAGCTTTAA GGAGTTCCTG atccgCAGCC TGAGGGCTCT TCGGgcAATG
65 L TAGCATcGa t ACC
( ; Gen l ' )
8. Vektor nach Anspruch 1 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen eines an 12 Kodons gegenüber dem humanen Interleukin-6 mutierten IL6-Antagonisten (zusätzlich myc-Tag) eingesetzt wird: U
1 CCAGGAtCCC AGCTATGAAC TCCTTCTCCA CAAGCGCCTT CGGTCCAGTT 51 GCCTTCTCCC TGGGGCTGCT CCTGGTGTTG CCTGCTGCCT
TCCCTGCCCC 101 AGTACCCCCA GGAGAAGATT CCAAAGATGT AGCCGCCCCA
CACAGACAGC 151 CACTCACCTC TTCAGAACGA ATTGACAAAC AAATTCGGgA
CATCCTCGAC 201 ttCATCTCAG CCCTGAGAAA GGAGACATGT AACAAGAGTA
ACATGTGTGA 251 AAGCAGCAAA GAGGCACTGG CAGAAAACAA CCTGAACCTT
CCAAAGATGG 301 CTGAAAAAGA TGGATGCTTC CAATCTGGAT TCAATGAGGA
GACTTGCCTG 351 GTGAAAATCA TCACTGGTCT TTTGGAGTTT GAGGTATACC
TAGAGTACCT 401 CCAGAACAGA TTTGAGAGTA GTGAGGAACA AGCCAGAGCT
GTGCAGATGA 451 GaACAAAAGa CCTGATCCAG TTCCTGCAGA AAAAGGCAAA
GAATCTAGAT 501 GCAATAACCA CCCCTGACCC AACCACAAAT GCCAGCCTGC
TGACGAAGCT 551 GCAGGCACAG AACCAGTGGC TGCAGGACAT GACAACTCAT
CTCATTCTGC 601 GCAGCTTTAA GGAGTTCCTG atccgCAGCC TGAGGGCTCT
TCGGgcAATG 651 gaacagaaac tgatctccga agaagatctg taatagatcg atacc
( ( Gen 2 l>)
9. Vektor nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch das Thymidinkinasegen als Suizidgen.
10. Vektor nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch das Cytosin-Desaminasegen als Suizidgen.
11. Vektor nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch das Puromycingen als Selektionsgen.
12. Vektor nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch das mdr-1-Gen als Selektionsgen.
13. Vektor nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch das Neomycin-Acetyltransferasegen als Selektionsgen.
14. Vektor nach Anspruch l, dadurch gekennzeichnet, daß die viralen immediate-early-Promotoren des humanen Zytomegalievirus (CMV) und Simian Virus 40 early Promotor (SV40) als interne Promotoren zur Trans¬ kription der Suizid- bzw. Resistenzgene in den Ausgangs¬ vektoren eingesetzt werden.
15. Vektor nach Anspruch 1 bis 3, 6, 7 und 9-13, gekennzeichnet durch
- den retroviralen Ausgangsvektor pSFlN,
- das Gen des an 7 Kodons gegenüber dem humanen Interleukin-6 mutierten IL6-Antagonisten der Sequenz Gen l"
- und einem Suizid- bzw. Selektionsgen.
16. Vektor nach Anspruch 1, 2, 4, 5, 8 und 14, gekennzeichnet durch
- den retroviralen Ausgangsvektor pLXSN,
- das Gen des an 12 Kodons gegenüber dem humanen Interleukin-6 mutierten IL 6-Antagonisten der Sequenz /(Gen 2'',
- dem Gen für Neomycin-Acetyltransferase als Selektionsgen,
- dem viralen Simian Virus 40 early Promotor (SV40) als interner Promotor zur Transkription des Selektionsgens im Ausgangsvektor.
17. Vektor nach Anspruch 1-3, 5, 8 und 9-14, gekennzeichnet durch
- den retroviralen Ausgangsvektor pSFlN,
- das Gen eines an 12 Kodons gegenüber dem humanen Interleukin-6 mutierten IL 6-Antagonisten der Sequenz Gen 2 ',
- und einem Suizid- bzw. Selektionsgen.
18. Vektor nach Anspruch 1-17, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen des IL6-Antagonisten und das Suizid- bzw. das Selektionsgen auf derselben mRNA, getrennt durch eine interribosomale Erkennungsstelle, angeordnet sind.
19. Verfahren zur Anwendung der Vektoren nach Anspruch 1-13, dadurch gekennzeichnet, daß hämatopoetische Stammzellen aus peripherem Blut bzw. Knochenmark von Patienten durch einen Zytokin-Cocktail stimuliert werden, der Transfer des Vektors in diese Stammzellen erfolgt und sie anschließend, bevorzugt durch intravenöse Injektion, wieder in den Patienten zurückgegeben werden.
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