WO1997038309A1 - ANTI-Glu17-OSTEOCALCIN ANTIBODY - Google Patents

ANTI-Glu17-OSTEOCALCIN ANTIBODY Download PDF

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antibody
gla
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Shunpei Sakakibara
Terutoshi Kimura
Shigeto Morimoto
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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    • G01N2333/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]

Definitions

  • the present invention relates to anti-Glu 17 -osteocalcin, which is effective as a reagent for detecting and measuring low carboxylated osteocalcin, particularly Glu 1 osteocalcin (meaning osteocalcin having a glutamic acid [Glu] residue at a position ⁇ from the N-terminus; the same applies hereinafter).
  • the present invention relates to an antibody and a method for measuring Glu 1 osteocalcin in a sample using the same.
  • Factors related to bone loss in regressive women include postmenopausal declines in blood female hormones, changes in vitamin D metabolism, insufficient calcium (Ca) intake, lack of exercise, and smoking (Aloia). J, Cohn S, Vaswani AN, Yeh JK, Yen K, Ellis K. 1985 Risk factors for postmenopausal osteoporosis. Am J Med 1985; 78: 95-100.). Recently, that blood vitamins and K 2 concentration of osteoporotic women complicated by fracture has decreased (Hart JP, Shearer MJ, and lenerman, Catterall A, Reeve J,
  • vitamin K is essential for the carboxylation of Glu residues in osteocalcin, a major non-collagenous protein in the bone matrix (Pr ice PA, Fraser jD, Metz Vu. Molecular coning of matrix Gla protein:
  • osteocalcin exerts its ability to bind to the hydroxyapatite component of bone only after undergoing this "-carboxylation (Hauschka PV, Lian JB, Cole DE, et al. Osteocalcin and matrix Gla protein: vitamin K-dependent protein in bone.
  • Osteocalcin also called Bone Gla Protein (BGP) or vitamin-dependent calcium binding protein
  • BGP Bone Gla Protein
  • osteoblasts molecular weight about 600,000
  • rats consist of 50 amino acids), and are said to be involved in the maintenance of C a homeostasis in living organisms.
  • one of the markers of bone metabolism is hypocarboxylation (or The ability to measure non-carboxylated osteocalcin is useful for determining the risk of fracture due to bone fragility or osteoporosis.
  • JP-A-6-7788708 examined the risk of bone fragility and osteoporotic fracture by measuring the concentration of low carboxylated osteocalcin in a biological sample.
  • concentration of osteocalcin remaining after the adsorption of hydroxyapatite was measured using an antibody.
  • these conventional techniques are methods for indirectly measuring osteocalcin which does not adsorb to hydroxyapatite, and are not methods for directly measuring only low carboxylated osteocalcin.
  • JP-A-6-7 8 7 8 8 There are reports of monoclonal antibodies specific to low carboxylated osteocalcin and measurement systems using monoclonal antibodies as disclosed in 2 There is no description of which site at position 4 is measuring non-carboxylated osteocalcin.For this reason, non-carboxylation at positions 17, 21, and 24 of osteocalcin is dependent on the pathology or physiology of various bone diseases. It is not clear whether it is important for general bone metabolism.
  • the present invention relates to a 1) position 17 Osuteokarushin is Glu 1 7 is Glu residue - characterized by specifically binding the O stearyl Okaru Shin fragment containing Osute Okarushin or position 17 Glu residues Anti-Glu 17 -osteocalcin antibody or a fragment thereof.2) Specific binding to Gla 2 osteocalcin, in which the 21st position of osteocalcin is a Gla residue, or an osteocalcin fragment containing a 21st-position Gla residue.
  • Rukoto 1 wherein the anti-Glu 1 7 - a Osuteokarushin antibody or fragment, 3) characterized in that said to SEQ ID NO: 1 or 2 peptide fragment specifically described coupling 1 )
  • the anti-Glu 1 T -osteocalcin antibody or fragment thereof described above more specifically, Tyr Leu Tyr Gin Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Ar g Specific binding to peptide fragment of Arg Gla Val Cys Gla / Glu Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp Hislie Gly Phe Gin Glu Ala yr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val (SEQ ID NO: 1 or 2) wherein characterized in 1) or 2) above, wherein the anti-Glu 1 7 - a Osuteo force arsine antibody or fragment, 4) characterized in that said not to bind to SEQ ID nO: 3 or 4, wherein the peptide fragment 1 ) to 3) above
  • Glu 1 '- a Osuteokarushin antibody or fragment bets 5) arranged Wherein 1) to 4) Ki ⁇ anti Glu 1 7 to the fragment specifically binds including Bepuchido fragment or Glu residues numbered 5, wherein - Osuteokarushin antibody Or a fragment thereof, specifically, a peptide fragment of Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla 'Val (SEQ ID NO: 5) or a fragment thereof containing a Glu residue.
  • Anti-Glu 17 -osteocalcin antibody or a fragment thereof is a peptide fragment of Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Val (SEQ ID NO: 5) or a fragment thereof containing a Glu residue as an antigen.
  • the present invention relates to a method for measuring Glu 1 osteocalcin in a sample, characterized in that the method is used to detect Glu 1 osteocalcin in a sample.
  • the present invention provides selective binding of Glu 17 -osteocalcin to Gla 1 osteocalcin. It provides an antibody that does not bind to the antibody.
  • Glu 1 7 having a Glu residue at position 17 from the N end of Osuteokarushin - to O stearyl Okaru Shin flag Men Bok and singular coupling comprising O osteocalcin or position 17 Glu residues 3
  • the osteocalcin fragment containing the 17-position Glu residue is preferably a peptide fragment containing the 17-position Glu residue and containing 6 or more amino acids as a whole-more preferably the 21-position Glu residue. This is a peptide fragment containing a Gla residue.
  • Tyr Leu Tyr Gin Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla / Glu Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His lie Gly Phe Gin Glu Ala Tyr Arg Arg It has binding property to the peptide fragment of Phe Tyr Gly Pro Val (SEQ ID NO: 1 or 2), and Tyr Leu Tyr Gin Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Gla Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla / Glu Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp Hislie Gly Phe Gin Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly It is preferred not to bind to the peptide fragment of Pro Val (SEQ ID NO: 3 or 4).
  • Anti Glu 1 7 according to the present invention - Osuteokarushin antibodies, also filed by the polyclonal one monoclonal antibody may be a monoclonal antibody, more as long as it has a reactive, or a fragment of an antibody.
  • the antibody fragment may be F (a) ::, Fab 'or Fab fraction from which Fc' or Fc region has been removed, or a polymer thereof, or a chimeric antibody thereof.
  • the antibody of the present invention can be prepared by using the peptide fragment of SEQ ID NO: 5 or a fragment thereof containing a Glu residue as an antigen peptide (or eptiob).
  • the peptide fragment (Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Val) described in SEQ ID NO: 5 is the position of Gla residue at position 17 of the peptide fragment extending from position 10 to position 22 of osteocalcin. It is a polypeptide consisting of 13 amino acids substituted with ⁇ Glu residues.
  • the fragment containing a Glu residue refers to the peptide fragment of SEQ ID NO: 5, Refers to some fragments containing Glu residues
  • an epitope means an antigenic determinant with a known structure, and is generally composed of at least 6 amino acids in a protein (polypeptide) (polypeptide composed of 6 amino acids).
  • polypeptide polypeptide composed of 6 amino acids.
  • the binding of the peptide to the antibody is disclosed in JP-T-60-500684). Therefore, the anti-Glu 1 7 in the present application - In preparing Osuteokarushin antibodies, not only used as Epito part peptide fragment of SEQ ID NO: 5, wherein it is also possible to prepare a fragment thereof comprising a Glu residue as Epitopu
  • at least 6 or more consecutive peptide fragments are selected. That is, the anti-Glu 1 Osuteokarushin antibodies of the present invention, the Furagume cement containing Glu residues, can also be prepared fragment of at least six or more consecutive peptide fragment as E Pitobu.
  • the peptide fragment of SEQ ID NO: 3 or 4 (Tyr Leu Tyr Gin Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Gla Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla / Glu Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu eu Ala Asp His lie Gly Phe Gin Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val) and Z or peptide fragment of SEQ ID NO: 6 (Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Gla Pro Arg Arg Gla Val) is selected.
  • the antibody according to the present invention can be used for detecting low carboxylated osteocalcin, particularly for detecting Glu 17 -osteocalcin, and is also useful for determining the risk of fracture due to bone fragility or osteoporosis, which has recently become a problem. Useful.
  • the reagent for detecting Glu- 1 osteocalcin according to the present invention can be prepared by including the antibody of the present invention.
  • a reagent include a standard antigen, a solution for diluting an antigen, a color former, a substrate solution, a washing solution, and a reaction stop solution.
  • the desired kit can be prepared by mixing components generally used as a raw material of the detection reagent.
  • the antibody of the present invention has the above-mentioned properties. Among them, particularly preferred antibodies include l) specifically binding to Glu 17 -osteocalcin, 2) Glu 17 and Gia 2 to osteocalcin.
  • peptide of SEQ ID NO: 5 specifically binds to the fragment and does not bind to the peptide fragment of SEQ ID NO: 6, or 5) specifically binds to the peptide fragment of [SEQ ID NO: 1 or 2] and [SEQ ID NO: 5], Antibodies having the property that they do not bind to the peptide fragments described in SEQ ID NO: 3 or 4] and [SEQ ID NO: 6].
  • an antibody having these properties enables the identification of four variant types of undercarboxylated osteocalcin that have a Glu residue at position 17, and further include a Glu residue at position 17 and a 21 It is possible to distinguish between two low carboxylated osteocalcin variant types (Glu residue at position 17, Gla residue at position 21, Gla or Glu residue at position 24) having a Gla residue at the bottom.
  • the antibody of the present invention is prepared by using a peptide fragment of Glu 1 osteocalcin represented by SEQ ID NO: 5 as an antigen, forming a complex with a carrier protein (BSA [bovine serum albumin], OVA [ovalbumin], etc.) if necessary. This is inoculated into animals and immunized.
  • immunization can be performed using a MAP system (Maltiple antigen peptide system) developed by Tam JP (Tam JP, Synthetic Peptide: Approaches to Biological Problems, p3-18, 1989; Tam JP, PNAS USA, 85, 5409, 1988; Tam et al., J. Exp.
  • Examples of the immunizing antigen include a fragment of Glu 17 -osteocalcin, which is naturally or induced by monophalin, a fragment of Glu'-osteocalcin, which is obtained by a genetic recombination technique, and a fragment of natural or recombinantly obtained osteocalcin. Any fragment obtained by thermally or chemically decarboxylating a protein, or a fragment produced by a chemical synthesis technique can be used.
  • the immunizing antigen for Glu 1 7 - Preparation of Fragment base petit de of Osuteokarushin chemical synthesis method a method of decomposing the Yadenko sets ⁇ or natural product is used, conveniently, It can be carried out using a peptide synthesizer by a conventional method.
  • Various condensing agents can be used to prepare the complex of the antigen and the carrier protein, but glutaraldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, and the like can be used.
  • the carrier protein may be a commonly used carrier protein such as bovine serum albumin, thyroglobulin, and hemocyanin, and the coupling method is usually used in a ratio of 1 to 5 times.
  • Animals to be immunized include mice, rats, egrets, and guinea pigs.
  • the inoculation method is subcutaneous, intramuscular, or intraperitoneal.
  • the drug may be administered in admixture with Freund's complete adjuvant (FCA) or Freund's incomplete adjuvant (FIA), usually every 2 to 5 weeks. Performed once each.
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • FIA Freund's incomplete adjuvant
  • Blood is collected from the immunized animal, the serum is separated, and the antibody is purified from the serum by a commonly used method such as ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. to obtain a polyclonal antibody. .
  • Antibody-producing cells obtained from the spleen or lymph nodes of the immunized animal are fused with myeloma cells and isolated as hybridomas.
  • Myeloma cells are derived from mice, rats, humans, etc., and are preferably derived from the same species as the antibody-producing cells, but may be of different species.
  • the operation of cell fusion can be performed according to a known method, for example, the method of Köhler and Milstein (Nature, 256, 495, 1975).
  • fusion promoters include polyethylene glycol and Sendai virus.
  • polyethylene glycol average molecular weight: 1000 to 4000
  • concentration of about 20 to 50% is used at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 30%.
  • the ratio of the number of antibody-producing cells to the number of myeloma cells is usually about 1: 1 to 10: 1, and cell fusion can be performed by reacting for about 1 to 10 minutes. Wear.
  • ELISA using a microplate containing Glu 1 osteocalcin ELISA (enzyme immunoassay), EIA (enzyme immunoassay) using a microplate coated with an anti-immunoglobulin antibody, and Glu 1
  • Western blotting using a ditrocellulose transfer membrane can be used. Cloning is further performed from such a well by, for example, a limiting dilution method to obtain a clone.
  • hybridomas are usually performed in an animal cell culture medium (eg, RP iM 11640) containing 10-20% fetal calf serum with the addition of HAT (hypoxanthine, aminobuterin, thymidine):
  • HAT hypoxanthine, aminobuterin, thymidine
  • the clones obtained in this manner were transplanted into the abdominal cavity of BALB / C mice to which blister had been administered in advance, and 10 to 14 days later, ascites containing a high level of monoclonal antibody was collected, and the antibody was purified. It can be used as a raw material.
  • the clone can be cultured, and the culture can be used as a raw material for antibody purification.
  • Monoclonal antibodies can be recovered by any known method for immunoglobulin purification, such as ammonium sulfate fractionation, PEG fractionation, ethanol fractionation, use of anion exchangers, and affinity chromatography. This can be easily achieved by the following means.
  • the present invention anti-Gi n obtained by '7 - Glu 1 Osuteokarushin (1 ⁇ position of Gla residues having normal Osuteokarushin in a biological sample by an immunological method using an Osuteokarushin antibody decarboxylated to Gl u residues And the metabolism of vitamin K
  • the qualitative and quantification of 17-position non-carboxyl hystereocalcin such as p IVKA at 17-position (including Protein Induced by Vitamin K Absence or Antagonist) of osteocalcin caused by abnormality etc. can be performed.
  • a biological sample can be appropriately processed as needed, for example, blood, plasma, serum, urine, etc. can be used as a sample.
  • samples obtained by performing cell separation and extraction operations can also be used as samples.
  • Known methods such as immunoassay, immunoassay such as immunohistochemical staining, ELI 8-method IA (radioimmunoassay), aggregation, competition, and sandwich can be applied to these samples.
  • the immunohistochemical staining or immunoassay can be performed, for example, by a direct method using a labeled antibody, an indirect method using a labeled antibody to the antibody, or the like.
  • the labeling agent any known labeling substance such as a fluorescent substance, a luminescent substance, a radioactive substance, an enzyme, a metal, and a dye can be used.
  • Glu 1 7 with anti-Glu 1 Osuteokarushin antibody - is a diagram showing a buffer force Rushiumu concentration dependence of the standard curve Osuteokarushin of radios immuno Atsu Si.
  • Glu 17 -osteocalcin (i-49) “ ⁇ ” (circle) or Gla 17 -osteocalcin (1-49) “ ⁇ ” (square) was used as a standard substance.
  • FIG. 2 is a graph showing aging changes in plasma Glu 17 -osteocalcin strain in 322 healthy women.
  • FIG. 3 is a graph showing the correlation between osteocalcin concentration and lumbar vertebral bone mineral density Z score in plasma Glu 1 in 322 healthy women.
  • FIG. 4 is a diagram showing the correlation between the plasma Glu 17 -osteocalcin concentration and the absolute value of lumbar spinal bone mineral content in women of each age. Examples The present invention will be described in detail and specifically with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
  • Example 1 Construction of anti-thick peptide
  • the peptide described in SEQ ID NO: 5 as an antigen was synthesized by an automatic peptide synthesizer manufactured by Applied Biosystems, USA.
  • the corresponding protective peptide was synthesized sequentially from the C-terminal by solid phase synthesis using a polymer resin carrier.
  • the desired crude peptide was subjected to acid treatment from the protected peptide resin and purified by reversed-phase high performance liquid chromatography to obtain the desired antigen peptide.
  • This peptide consists of 13 residues of Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Val.
  • the 17th Gla residue is the Glu residue. It is substituted with a group.
  • a cysteine residue was added to the N-terminus for conjugation.
  • the thus synthesized peptide was bound to BSA, OVA, etc. to form a polymer, which was used as an immunogen to immunize mice. Specifically, the above peptide fragment was firstly sampled on day ⁇ before sampling blood for titration of preimmune serum, and two mice (BAL B / C) were prepared with FCA and emulsion. / igZ animals were immunized by intraperitoneal administration of them periodically for 2-3 months.
  • spleen cells were collected and fused with Myeloma cells P3U1. This was cultured and selected in a HAT medium. Among them, it reacts with the peptide fragment of SEQ ID NO: 5 and the low carboxylated osteocalcin (Glu 17 -osteocalcin) of SEQ ID NO: 1 or 2, and reacts with the osteocalcin of SEQ ID NO: 3 or 4 and the osteocalcin of SEQ ID NO: 6. Fusion cells that did not react with the peptide fragment were cloned. Only cells secreting IgG were selected, and IgG in the culture supernatant was purified with protein A or protein G to obtain a purified monoclonal antibody.
  • Glu 17 -osteocalcin Glu 17 -osteocalcin
  • antigen plates were first coated using microplates (H-type, A-type, manufactured by Sumitomo Bei-Client). After blocking with a casein solution, the culture supernatant or purified monoclonal antibody is added at an appropriate stepwise dilution, and an antigen-antibody reaction is performed on the solid phase to form an immune complex. A second antibody (anti-mouse IgG antibody) was reacted. After washing, bound on solid phase The presence or absence of antibody production, titer variation, and specificity were examined by measuring the enzyme activity-The antibody obtained here reacted with the peptide described in SEQ ID NO: 5, but reacted with the peptide described in SEQ ID NO: 6. Showed no cross-reactivity.
  • Glu 17 - Osuteokarushin radio I Takeno assay I of the anti-Glu 1 Osuteokarushin antibody, Glu 17 as a standard - Osuteokarushin (1-49) or The assay was performed using Gla 1 osteocalcin (1-49), and further using 0.5% serum albumin, 5 m Tris-HCl buffer (pH 7.4) as a buffer.
  • calcium chloride was added at a concentration of 0.03 to 10 m to examine the dependence of the calcium concentration in the buffer solution on each radioimmunoassay system. Further, 1 mM EGTA was added under the condition of 0 mM calcium concentration in the buffer. B / F separation was performed by the two-antibody method.
  • FIG. 1 shows the results of examining the dependence of the standard curves of Glu 1 osteocalcin (1-49) and Gla 17 -osteocalcin (1-49) on the calcium concentration in the buffer in the radioimmunoassay system.
  • each of the two standard curves showed dependence on calcium in buffer.
  • Anti Glu 17 obtained in Example 2 as the antibody - Osuteo force Radio I using arsine antibody Takeno assay calcium concentration in the buffer in the I system 0 m standard when M or 0.03 m substance Glu 17 - Osuteokarushin (1 In -49), a good standard curve was obtained. Furthermore, the antibody did not recognize Gla 17 -osteocalcin (1-49) at high concentrations, and was able to separate Glu 17 -osteocalcin (1-49) from Gla 1- osteocalcin (1-49). .
  • the dilution curves of all plasma showed good parallelism with the standard curve of Glu 1 osteocalcin (1-49).
  • the results indicate that Glu 1 osteocalcin immunoreactivity is also present in human blood, and that the present radioimmunoassay system is effective for measuring Glu 1: -osteocalcin in humans.
  • FIG. 2 shows the aging change of the mean plasma Glu 17 -osteosarcin concentration in 322 healthy women.
  • Obesity Degree BMI body mass index
  • Plasma Glu 17 -osteocalcin levels increased with age, indicating a particularly high rate of increase before and after menopause and in the elderly. This increase in plasma Glu 17 -osteocalcin concentration with age was reported by Plantalech et al. (Plantalech L, Guillaumont M,
  • Example II Plasma Glu 17 -osteocalcin concentration in healthy women
  • Figure 4 shows these women in a young group between the ages of 16 and 29, a young group between the ages of 30 and 49,
  • the results are shown in four groups: a postmenopausal group of 50-69 years old and an elderly group of 70-93 years old.
  • the results of examining the correlation between plasma Glu 1 osteocalcin concentration and the absolute value of lumbar vertebral bone mineral content at each age are shown.
  • the postmenopausal group aged 50 to 69 showed a negative correlation between the plasma Glu- 1 osteocalcin concentration and the absolute value of lumbar vertebral bone mineral density.
  • Glu 17 -osteocalcin can be easily detected and measured, which is very useful for diagnosis of a bone disease related thereto.
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Description

g 糸田 抗 G 1 u 17—ォステオカルシン抗体 技術分野
本発明は低カルボキシル化ォステオカルシン、 特に Glu1 ォステオカルシン (N端より Π位にグルタミン酸 [Glu]残基を有するォステオカルシンを意味する。 以下同じ。 ） の検出や測定試薬として有効な、 抗 Glu17-ォステオカルシン抗体、 およびそれを用いた試料中の Glu1 ォステオカルシンの測定方法に関する。
從來の技術：
〈発明の背景〉
退行期女性の骨量減少に関与する因子として、 閉経後の血中女性ホルモンの減 少、 ビタミン D代謝の変化、 カルシウム （C a) 摂取不足、 運動不足、 喫煙など が指摘されている （Aloia J, Cohn S, Vaswani AN, Yeh JK, Yen K, Ellis K. 1985 Risk factors for postmenopausal osteoporosis. Am J Med 1985 ;78:95- 100.) 。 最近、 骨折を併発した骨粗鬆症女性の血中ビタミン および K 2濃度が 低下していること （Hart JP, Shearer MJ, lenerman し， Catterall A, Reeve J,
Sambrook PN, Dodds RA, Bitensky し Chayen J. Electrochemical detection of depressed circulating levels of vitamin Ki in osteoporosis. J Clin Endocrinol Me tab 1985:60:1268-1269.； Hodges SJ, Akesson K, Vergnaud P， Obrant K, Delmas PD. Circulating levels of vitamins Ki and 2 decreased in elderly women with hip fracture. J Bone Miner Res 1993; 10: 1241-45. ) 、 ビタミン 2の一種である MK-4を投与することにより退行期女性の骨塩量が増加す ること (Orimo H, Fujita T, Onomura T, Inoue T, Kushida , Shiraki M. , Clinical evaluation of Ea - 0167 (raenatetrenone) in the treatment of osteoporosis. Phase III double-blind multi-center comparative study with alfacalcidol. Clin Eval 1992;20:45-100.) が報告され、 ビタミン K代謝もま た退行 期女性の骨塩量減少に関与することが明らかとなつた。
骨代謝に対するビタミン Κの作用点に関しては各種の報告があるが、 このうち でも骨基質の非コラーゲン性タンパク質のうちの主要タンパク質であるォステオ カルシン中の Glu残基の カルボキシル化に対し、 ビタミン Kは必須であり （Pr ice PA, Fraser jD, Metz Vu. Molecular coning of matrix Gla protein :
Impl ications for substrate recognition by the vitamin K - dependent gamma - carboxylase. Proc Natl Acad Sci USA, 1987 ; 84: 8335-8339. ) 、 γ—カルボキシ ルグルタミン酸残基 （γ -carboxyglutaraic acid： Gla残基） はじ aに対する強い 親和性を有し、 ォステオカルシンはこの" -カルボキシル化を受けて初めて骨の成 分であるハイ ドロキシァパタイ 卜への結合能を発揮することが知られている （Ha uschka PV, Lian JB, Cole DE， et al. Osteocalcin and matrix Gla protein : vi tamin K - dependent protein in bone. Physiol Rev, 1989 ; 69 : 990-1047. ) 。 さらに高齢者とくに骨折例では、 流血中の低カルボキシル化 （または非カルボキ シル化） ォステオカルシン [ 1残基以上の Gla残基が Glu残基となったもの] 量が 增加することが報告されており （Plantalech L, Guillaumont M, Vergnaud P, Leclercq M, Del mas PD. , Impairment of gamma carboxylation of circulating osteocalcin (bone Gla protein) in elderly women. J Bone Miner Res. 1991 ; 6 : 1211-16. ) 、 退行期骨塩量减少に、 ビタミン K作用不全による低カルボキシル 化ォステオカルシンの増加が関与することが示唆されている。
ォステオカルシンは、 Bone Gla Protein (BGP)又は vitamin -dependent calc ium binding proteinとも呼ばれ、 骨芽細胞によって生合成される 4 9〜 5 0 個のァミノ酸からなるタンパク質であり （分子量約 6 0 0 0 ； ヒ ト及びゥシは 4
9個、 ラットは 5 0個のアミノ酸からなる） 、 生体の C aの恒常性の維持に関与 しているといわれている。
ヒ トォステオカルシンは、 配列番号 4 (配列中 Xaaは Gla残基を示す。 以下配列 番号の記載がある場合について同じ。 ） に記載されるアミノ酸配列を有し、 その 分子中に、 N末端から数えて 1 7位、 2 1位及び 2 4位の 3つの Gla残基を有す る。 このように 3個の Gla残基が存在するため、 2 3— 1 = 7通りの低カルボキシ ズレ化ォステオ力ノレシンの variant type力 ΐ存在する。
〈従来の技術〉
以上のように、 骨代謝のマーカ一として、 流血中の低カルボキシル化 （または 非カルボキシル化） ォステオカルシンを測定することができれば、 骨脆弱症や骨 粗鬆症による骨折の危険度を判断するなどの上で有用である。
そのため、 例えばハイ ドロキシァパタイ トに対して正常 （カルボキシル化） ォ ステオカルシンが親和性を持つことを利用し、 これに吸着させた後、 低カルボキ シル化ォステオカルシンを測定する方法 （Plantalech L, Guil laumont , Vergn aud P, し eclercq M, De丄 mas PD. , Impairment of gamma carboxylation of circulating osteocalcin (bone Gla protein) in elderly women. J Bone Miner Res. 1991 ; 6: 1211-16. ) などがとられている。
例えば、 デルマスらは、 J P— A— 6— 7 8 7 8 8において、 生体試料中の低 カルボキシル化ォステオカルシンの濃度を測定することにより、 骨脆弱症や骨粗 鬆症骨折の危険性の検査方法を開示しているが、 この中の実施例で、 ハイ ドロキ シァパタイ 卜吸着後に残ったォステオカルシンの濃度を抗体で測定している。 しかし、 これらの従来技術はハイドロキシァパタイ トに吸着しないォステオ力 ルシンを間接的に測定する方法であり、 低カルボキシル化ォステオカルシンのみ を直接測定する方法ではない。
J P - A - 6 - 7 8 7 8 8に開示されるような低カルボキシル化ォステオカル シンに特異的なモノクローナル抗体及びモノクローナル抗体を使用した測定系の 報告はあるが、 1 7位、 2 1位、 2 4位のどの部位の非カルボキシル化ォステオ カルシンを測定しているかについての記述はなく、 そのためにォステオカルシン の 17位、 21位、 24位のどの部位の非カルボキシル化が各種骨疾患の病態あるいは 生理的な骨代謝に重要であるかは明らかとなつていない。
以上の問題点を解決するために、 本発明者らは抗低カルボキシル化ォステオ力 ルシン抗体について鋭意研究した結果、 17位の" -カルボキシル化グルタミン酸 残基の非カルボキシル化が他の部位の非カルボキシル化に比し生理的な条件下で 容易に起こることを明らかにし、 低カルボキシル化ォステオカルシンの 7つの va riant typeの中でも、 特に 17位に Glu残基を有するォステオカルシンが低カルボ キシル化ォステオカルシンの本態として重要であることを示した （Nakao M, Nishiguchi Y, Nakata , Kimura T, Sakakibara S. Synthesis of human osteocalcins : g-carboxyglutamic acid at position 17 is essential for a calcium - dependent conformational transi tion. , Peptide Res 1994; 7: 171- 174. ) 。 このような知見の下、 配列番号 5記载のペプチド断片を抗原として得ら れた抗 Glu 1 7-ォステオカルシン抗体が、 Glu 1 '-ォステオカルシンと Gla ' 7-ォステ ォカルシンに対し優れた選択結合性を有することを見いだし、 本発明を完成した。 発明の開示 すなわち本発明は、 1)ォステオカルシンの 17位が Glu残基である Glu 1 7-ォステ ォカルシンもしくは 17位 Glu残基を含むォステオカルシンフラグメントと特異的 に結合することを特徴とする抗 Glu1 7 -ォステオカルシン抗体またはそのフラグメ ントであり、 2)ォステオカルシンの 21位が Gla残基である Gla2 ォステオカルシ ンもしくは 21位 Gla残基を含むォステオカルシンフラグメン卜と特異的に結合す ることを特徴とする前記 1)記載の抗 Glu 1 7-ォステオカルシン抗体またはそのフラ グメントであり、 3)配列番号 1または 2記載のぺプチド断片と特異的に結合する ことを特徴とする前記 1)または 2)記载の抗 Glu1 T-ォステオカルシン抗体またはそ のフラグメント、 詳細に述べれば、 Tyr Leu Tyr Gin Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla/Glu Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His lie Gly Phe Gin Glu Ala yr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val (配列番号 1または 2 ) のペプチド断片と特異的に結合すること を特徴とする前記 1)または 2)記載の抗 Glu 1 7-ォステオ力ルシン抗体またはそのフ ラグメントであり、 4)配列番号 3または 4記載のぺプチド断片と結合しないこと を特徴とする前記 1)ないし 3)記載の抗 Glu 1 7-ォステオカルシン抗体またはそのフ ラグメント、 詳細に述べれば、 Tyr Leu Tyr Gin Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Gla Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla/Glu Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His lie Gly Phe Gin Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val (配列番号 3または 4 ) のペプチド断片と結合しないことを特徴と する前記 1)ないし 3)記載の抗 Glu 1 '-ォステオカルシン抗体またはそのフラグメン トであり、 5)配列番号 5記載のベプチド断片もしくは Glu残基を含むそのフラグ メントと特異的に結合する前記 1)ないし 4)記载の抗 Glu 1 7-ォステオカルシン抗体 またはそのフラグメント、 詳細に述べれば、 Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla 'Val (配列番号 5) のべプチド断片もしくは Glu残基を含むその フラグメン卜と特異的に結合する前記 1)ないし 4)記載の抗 Glu'7-ォステオカルシ ン抗体またはそのフラグメントであり、 6)配列番号 5記載のベプチド断片もしく は Glu残基を含むそのフラグメントと結合し、 配列番号 6記载のべプチド断片と 結合しないことを特徴とする前記 L)ないし 5)記载の抗 Glu1 ォステオカルシン抗 体またはそのフラグメント、 詳細に述べれば、 Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Val (配列番号 5) のぺプチド断片もしくは Glu残基を含む そのフラグメントと結合し、 Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Gla Pro Arg Arg Gla Val (配列番号 6) のペプチド断片と結合しないことを特徴とする前記 i)ない し 5)記載の抗 Glu17-ォステオカルシン抗体またはそのフラグメントであり、 7)配 列番号 5記載のぺプチド断片もしくは Glu残基を含むそのフラグメントを抗原とし て得られた前記 1)ないし 6)記截の抗 Glu17-ォステオカルシン抗体またはそのフラ グメント、 詳細に述べれは-、 Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Val (配列番号 5) のペプチド断片もしくは Glu残基を含むそのフラグメント を抗原として得られた前記 1)ないし 6)記載の抗 Glu17-ォステオカルシン抗体また はそのフラグメントであり、 8)抗体がモノクローナル抗体である前記 1)ないし 7) 記載の抗 Glu17-ォステオカルシン抗体またはそのフラグメン卜であり、 9)前記 1) ないし 8)記載の抗 Glu1 ォステオカルシン抗体またはそのフラグメントを含有す る Glu17-ォステオカルシン検出試薬であり、 lO)Glu17-ォステオカルシンを蛍光も しくは発光物質、 酵素、 またはラジオアイソトープで標識 （ラベル） し、 前記 1) ないし 8)記載の抗 Glu1しォステオカルシン抗体またはそのフラグメントを用いて、 競合法により検出することを特徴とする、 試料中の Glu1 ォステオカルシンの測 定方法に関する。 発明の詳細な説明 以下本発明を詳細に説明する。
本発明は、 Glu17-ォステオカルシンに選択的に結合し、 Gla1 ォステオカルシ ンとは結合しない抗体を提供するものである。
本発明抗体は、 ォステオカルシンの N端より 17位に Glu残基を有する Glu 1 7 -ォ ステオカルシンもしくは 17位 Glu残基を含むォステオカルシンフラグメン卜と特 異的に結合する 3
17位 Glu残基を含むォステオカルシンフラグメントとは、 17位 Glu残基を含み、 全体として 6残基以上のアミノ酸を含むぺプチドフラグメン卜であることが望ま しい- より好ましくは 21位の Gla残基を含むペプチドフラグメントである。 さら に、 Tyr Leu Tyr Gin Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla/Glu Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His l ie Gly Phe Gin Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val (配列番号 1 または 2 ) のペプチド断片と結合性を有し、 Tyr Leu Tyr Gin Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Gla Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla/Glu Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His lie Gly Phe Gin Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val (配列番号 3または 4 ) のペプチド断片と結合しない ことが好ましい。
本発明にかかる抗 Glu 1 7-ォステオカルシン抗体は、 ポリクロ一ナル抗体であつ ても、 モノクローナル抗体であってもよく、 さらにはその反応性を有する限り、 抗体のフラグメントであっても良い。
この抗体のフラグメントとは、 F c ' あるいは F c領域を除去した F (a ）：:、 F a b ' あるいは F a b画分、 あるいはその重合体であってもよく、 また、 その キメラ抗体であってもよレ
本発明抗体は、 配列番号 5記载のぺプチド断片もしくは Glu残基を含むそのフ ラグメントを抗原ペプチド （またはェピトーブ） として用いることにより作成す ることができる。
ここで、 配列番号 5に記載されたペプチド断片 （Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Val) とは、 ォステオカルシンの 10位から 22位にわたる ペプチドフラグメントのうち、 17位の Gla残基力 ^Glu残基に置換された 1 3個のァ ミノ酸からなるボリべプチドである。
Glu残基を含むそのフラグメントとは、 配 列番号 5記載のペプチド断片中、 Glu残基を含むその一部のフラグメントをいう つ
また、 ェピト一プとは構造既知の抗原決定基を意味し、 タンパク質 （ポリべプ チド） においては、 一般に少なくとも 6個のアミノ酸で構成される （6個のアミ ノ酸で構成されるポリべプチドが抗体と結合することは特表昭 60-500684号公報 に開示されている） 。 そのため、 本願における抗 Glu 1 7-ォステオカルシン抗体の 作成にあたっては、 配列番号 5記載のぺプチド断片をェピト一ブとして用いるだ けでなく、 Glu残基を含むそのフラグメントをェピトープとして調製することも 可能であり、 好ましくは少なく とも 6以上の連続したペプチド断片が選択される。 即ち、 本発明の抗 Glu 1 ォステオカルシン抗体は、 Glu残基を含むそのフラグメ ントが、 少なくとも 6個以上の連続したぺプチド断片からなるフラグメントをェ ピトーブとして調製することもできる。
このように調製された抗体の中から、 特に好ましくは配列番号 3または 4記載 のぺプチド断片 （Tyr Leu Tyr Gin Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Gla Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla/Glu Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu し eu Ala Asp His l ie Gly Phe Gin Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val) および Zまたは配列番号 6記載のペプチド断片 （Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Gla Pro Arg Arg Gla Val) と結合しないものが選択される。
本発明にかかる抗体は、 低カルボキシル化ォステオカルシン検出用試薬、 特に Glu 1 7-ォステオカルシンの検出に利用することができ、 近年問題となっている骨 脆弱症や骨粗鬆症による骨折の危険性の判断にも有用である。
本発明にかかる Glu 1 ォステオカルシンの検出試薬は、 本発明抗体を含むこと により調製することができ、 例えば標準抗原、 抗原希釈用溶液、 発色剤、 基質溶 解液、 洗浄液、 反応停止液などの他、 一般に検出試薬の原料として用いられる成 分を配合して目的とするキットとすることができる。
血液、 血漿、 血清、 尿などの試料中の Glu 1 ォステオカルシン量を測定するに は、 蛍光もしくは発光物質、 ペルォキシダ一ゼなどの酵素、 または1 2 5 Iなどの ラジオアイソ トープで標識 （ラベル） した Glu 1 7-ォステオカルシンを、 試料中の 抗原と本発明抗体に対して競合させることにより、 試料中の Glu 1しォステオカル シンを測定することができる。 本発明抗体は、 以上のような性質を有するものであるが、 その中でも特に好ま しい抗体を挙げると、 l)Glu17-ォステオカルシンに特異的に結合する、 2)Glu17, Gia2にォステオカルシンに特異的に結合する、 3)配列番号 1または 2記載のべブ チド断片と特異的に結合し、 配列番号 3または 4記載のぺブチド断片と結合しな い、 4)配列番号 5記載のペプチド断片と特異的に結合し、 配列番号 6記載のべプ チド断片と結合しない、 または 5) [配列番号 1または 2〕および [配列番号 5]記载 のべプチド断片と特異的に結合し、 己列番号 3または 4]および [配列番号 6]記 載のぺプチド断片と結合しないなどの性質を有する抗体が挙げられる。
したがってこれらの性質を有する抗体を使用すれば、 17位に Glu残基を有する 4つの低カルボキシル化ォステオカルシンの variant typeを識別することができ、 さらに、 その中で 17位に Glu残基および 21位に Gla残基を有する 2つの低カルボキ シル化ォステオカルシンの variant type (17位 Glu残基、 21位 Gla残基、 24位 Glaま たは Glu残基） を識別することが可能となる。
発明の実施の形態：
本発明抗体の調製は配列番号 5記載の Glu 1 ォステオカルシンのぺプチドフラ グメントを抗原とし、 必要に応じてキャリア一タンパク質 （B S A [bovine serum albumin]や OVA [ovalbumin]など） との複合体を作り、 これを動物に接種 し て免疫する。 また、 Tam JPによって開発された MA P系 （Maltiple antigen peptide system) を使用して免役することもできる （Tam JP， Synthetic Peptide ： Approaches to Biological Problems, p3-18, 1989; Tam JP, PNAS USA, 85， 5409, 1988; Tam et al. , J. Exp. Med. , 171,299, 1990; Tam and Lu. , PNAS USA, 86,9084, 1989) 3 上記免疫動物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細胞を骨髄 腫細胞と融合し、 配列番号 5記载のべプチド断片および低カルボキシル化ォステ ォカルシン （Glu17-ォステオカルシン） に強い特異性を示す抗体を産生するハイ プリ ドーマを選択することにより調製される。 その操作は従来既知の方法に準ず ればよい 3
免疫抗原としては天然もしくはヮ一ファリンによって誘発された Glu 17 -ォステ ォカルシンのフラグメント、 遺伝子組換手法により得られた Glu' -ォステオカル シンのフラグメント、 天然もしくは遺伝子組換えによりえられたォステオカルシ ンを熱的もしくは化学的に脱カルボキシル化の操作をしたもののフラグメント、 または化学合成手法により生産したものなどいずれも使用できる。
しかし、 天然物の Glu w -ォステオカルシンを免疫用抗原とするために分離 ·精 製することは、 その生体試料中濃度がとても低いことから実用的ではない （例え ば血中の含量は pg/mlのオーダ一であり、 免疫に供する量を確保するには数トン の血液が必要である） 。 もし大量に試料を使うことができるのであれば、 公知の 分離 ·精製法を適宜組み合わせて実施することができる。 これらの公知の方法と しては塩析、 溶媒沈殿法、 透析ゲルろ過法、 電気泳動法、 イオン交換クロマトグ ラフィ—、 ァフィ二ティクロマ トグラフィー、 逆相髙速液体クロマトグラフィー などが挙げられる。
従って実用的には、 免疫抗原用 Glu 1 7 -ォステオカルシンのフラグメントべプチ ドの調製は化学合成法、 上記遣伝子組换法あるいは天然物を分解する方法などが 用いられるが、 簡便には、 常法によりペプチドシンセサイザ一を用いて行うこと ができる。
抗原とキヤリアタンパク質の複合体の調製は種々の縮合剤を用いることができ るが、 グルタルアルデヒ ド、 カルボジイミ ド、 マレイミ ド活性エステル等が使用 できる。
キャリアタンパク質は牛血清アルブミン、 サイログロブリン、 へモシァニン等 の常用されているものでよく、 通常 1〜 5倍量の割合でカップリングさせる方法 が用いられる。
免疫される動物としてはマウス、 ラット、 ゥサギ、 モルモッ トなどがあげられ、 接種方法は皮下、 筋肉あるいは腹腔內に投与される。 投与に際しては完全フロイ ントアジュノくンド （F C A ： Freund' s complete adjuvant) や不完全フロイント ァシュバンド （F I A： Freund' s incomplete adjuvant) と混和して投与しても よく、 投与は通常 2〜 5週毎に 1回ずつ行われる。 免疫された動物より血液を採 取し、 血清を分離し、 血清より抗体を硫安塩析、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二テイクロマトグラフィ一など常用されている方法で精製してポリクロ一 ナル抗体とする。 また、 免疫された動物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗 体産生細胞は骨髄腫細胞と細胞融合させられハイブリ ドーマとして単離される- 骨髄腫細胞としてはマウス、 ラット、 ヒ ト等由来のものが使用され、 抗体産生細 胞と同種由来のものであることが好ましいが、 異種間においても可能な場合もあ る。
細胞融合の操作は既知の方法、 たとえばケ一ラーとミルスタインの方法 (Nature, 256, 495, 1975) に従い実施できる。 融合促進剤としてはポリエチレ ングリコールやセンダイウィルスなどが挙げられる力；、 通常 20〜50%程度の濃度 のポリエチレングリコール （平均分子量 1000~4000) を用いて 20〜40°C、 好まし くは 30~37°Cの温度下、 抗体産生細胞数と骨髄腫細胞数の比は通常 1 ： 1〜1 0 ： 1程度、 約 1〜10分問程度反応させることにより細胞融合を実施することがで きる。 抗 Glu 1 7-ォステオカルシン抗体産生ハイブリ ド一マのスクリーニングに は種々の免疫化学的方法が使用できる。 たとえば、 Glu 1 ォステオカルシンをコ 一卜したマイクロプレー卜を用レヽる E L I S A enzy.me - l inked immunosorbent assay) 法、 抗免疫グロブリン抗体をコートしたマイクロプレートを用いる E I A (enzyme immunoassay) 法、 Glu 1しォステオ力ノレシンを含むサンプルを電気泳動 後二トロセルロース転写膜を用いるウェスタンブロット法などがあげられる。 このようなゥエルから更に例えば限界希釈法によってクローニングを行いク口 ーンを得る。 ハイプリ ドーマの選別、 育種は通常 H A T (ヒポキサンチン、 アミ ノブテリン、 チミジン） を添加して、 10〜20%牛胎児血清を含む動物細胞用培地 (例、 R P iM 1 1640) で行われる： このようにして得られたクローンはあらかじ めブリスタンを投与した B A L B / Cマウスの腹腔内へ移植し、 10〜14日後にモ ノク口一ナル抗体を高溏度に含む腹水を採取し、 抗体精製の原料とすることがで きる。 また、 該クローンを培養し、 その培養物を抗体精製の原料とすることもで きる。 モノクローナル抗体の回収は免疫グロブリンの精製法として既知の方法を 用いればよく、 たとえば、 硫安分画法、 P E G分画法、 エタノール分画法、 陰ィ オン交換体の利用、 さらにァフィニテイクロマトグラフィなどの手段により容易 に達成することができる。
本発明によって得られた抗 Gi n ' 7 -ォステオカルシン抗体を用いる免疫学的方法 により生体試料中の Glu 1 ォステオカルシン （正常ォステオカルシンが有する 1ァ 位の Gla残基が脱カルボキシル化して Gl u残基になったものや、 ビタミン Kの代謝 異常等により生じたォステオカルシンの 17位の p I V K A体（Protein Induced by Vitamin K Absence or Antagonist)などの 17位非カルボキシルイヒオステオカル シンなどが含まれる） の定性、 定量を行うことができる。
免疫学的方法としては、 生体試料を必要に応じて適切に処理、 たとえば血液、 血漿、 血清、 尿などを試料とすることができる。 また、 細胞の分離、 抽出操作な どした試料についても試料とすることができる。 これらの試料について、 免疫組 織染色法、 E L I 八法ゃ尺 I A (radioimmunoassay) 法などの免疫測定法、 凝 集法、 競合法、 サンドイッチ法など既知の方法を適用することができる。 免疫組 織染色法あるいは免疫測定法は、 例えば標識化抗体を用いる直接法、 該抗体に対 する抗体の標識化されたものを用いる間接法などにより行いうる。 標識化剤とし ては螢光物質 '発光物質、 放射性物質、 酵素、 金属、 色素など公知の標識物質は いずれも使用できる。
図面の簡単な説明
図 1は、 抗 Glu 1 ォステオカルシン抗体を用いた Glu 1 7 -ォステオカルシンのラ ジオイムノアツセィの標準曲線の緩衝液中力ルシゥム濃度依存性を示す図である。 標準物質としては Glu 1 7 -ォステオカルシン（i-49) 「〇」 （丸） あるいは Gla 1 7 - ォステオカルシン（1-49) 「◊」 （四角） を用いた。
図 2は、 健常女性 322例における血漿 Glu 1 7-ォステオカルシン漉度の加齢変化を 示す図である。
図 3は、 健常女性 322例における血漿 Glu 1にォステオカルシン濃度と腰椎骨塩量 Z scoreの相関を示す図である。
図 4は、 各年代女性における血漿 Glu 1 7 -ォステオカルシン濃度と腰椎骨塩量の 絶対値との相関を示す図である。 実施例 以下の実施例により本発明を詳細に且つ具体的に説明するが、 本発明はこれら の実施例に限定されるものではない。
実施例 1 . 抗厚ぺプチドの舍成 抗原とする配列番号 5記載のぺプチドを米国 Applied Biosystems社製のぺプチ ド自動合成機で合成した。 合成法としては、 高分子樹脂担体を用いる固相合成法 により C端より逐次合成を行い、 相当する保護べプチド榭脂を合成した。 保護べ プチド樹脂から酸処理にて目的とする粗ぺブチドは逆相高速液体クロマトグラフ ィ一で精製を行い目的とする抗原用のぺプチドを得た。
このぺプチドは、 Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Valの 1 3残基で、 正常なォステオカルシンの 10位から 22位にわたるペプチドフラグメ ントのうち、 17位の Gla残基が Glu残基に置換されたものである。 N末端にコンジ ユゲーションのためにシスティン残基を付加した。
実施例 2. 抗体の調製 - - 1 2
このように合成したベプチドを B S A、 OVAなどに結合させて高分子とし、 これを免疫原としてマウスに免疫した。 具体的には、 前記のペプチド断片を、 ま ず◦日目に免疫前血清の力価測定用血液をサンプリングした後、 マウス （BAL B/C) 2匹に F CAとェマルジヨンを作り、 5 0 /igZ匹を腹腔に 2〜3ヶ月 間定期的に投与して免疫した。
その後脾臓細胞を採取し、 Myeloma細胞 P3U1と融合した。 これを培養し、 HAT培 地で選択した。 このうち、 配列番号 5に記載のペプチド断片および配列番号 1ま たは 2記載の低カルボキシル化ォステオカルシン （Glu17-ォステオカルシン） と 反応し、 配列番号 3または 4記載のォステオカルシンおよび配列番号 6に記載の ペプチド断片と反応しない融合細胞をクローニングした。 I g Gを分泌する細胞 のみを選択し、 培赛上清中の I g Gを protein Aまたは protein Gで精製して精製 モノクローナル抗体を得た。
実施例 3. 力価検定など
抗体の性質や力価の検定は E L I S A法で検討した。
E L I S Aは、 マイクロプレート （住友べ一クライ ト社製； Hタイプ、 Aタイ プ） を用い、 まず、 抗原ペプチドをコーティングした。 カゼイン溶液でブロッキ ングした後、 培桊上清あるいは精製モノクローナル抗体を適当に段階的に希釈し て加え、 固相上で抗原抗体反応を行わせて、 免疫複合体を形成させ、 さらに酵素 摞識第 2抗体 （抗マウス I g G抗体） を反応させた。 洗浄後、 固相上に結合した 酵素活性を測定することで抗体の産生の有無、 力価変動、 特異性を検討した- ここで得られた抗体は、 配列番号 5記載のペプチドとは反応したが、 配列番号 6記載のベプチドとは交差反応を示さなかった。
実施例 4. Glu17-ォステオカ^^シン のラジオィムノアッセィ
Glu1 ォステオカルシンを酵素法にて1251で標識し標識物質とした後、 Glu17 - ォステオカルシンのラジオィムノアッセィを、 抗 Glu1 ォステオカルシン抗体、 標準物質として Glu17-ォステオカルシン（1-49)あるいは Gla1 ォステオカルシン (1-49)を用い、 さらに 0.5%ゥシ血清アルブミン、 5 m Tris-塩酸緩衝液（pH 7.4) を緩衝液として用いることにより行った。
また各ラジオィムノアッセィ系における緩衝液中カルシウム濃度依存性を検討 するため、 塩化カルシウムを 0.03〜10 m の濃度にて添加した。 さらに緩衝液中 カルシウム濃度 0 mM の条件には EGTA 1 mM を添加した。 B/F 分離は二抗体法 にて行った。
ラジオィムノアッセィ系における Glu1 ォステオカルシン（1-49)および Gla17 - ォステオカルシン（1-49)の標準曲線の緩衝液中カルシウム濃度依存性を検討した 結果を図 1に示す。
いずれのラジオィムノアッセィ系においても各 2種の標準曲線は緩衝液中カル シゥム澳度依存性を示した。 抗体として実施例 2で得られた抗 Glu17-ォステオ力 ルシン抗体を用いたラジオィムノアッセィ系では緩衝液中カルシウム濃度が 0 m M あるいは 0.03 m のときに標準物質 Glu17-ォステオカルシン（1-49)では良好な 標準曲線が得られた。 さらに、 同抗体は Gla17-ォステオカルシン（1-49)を高濃度 まで認識せず、 Glu17-ォステオカルシン（1-49)と Gla1 ォステオカルシン（1-49) を分離識別することが可能であった。
実施例 5. ヒ ト血漿 Glu1 ォステオカルシン濃度の測定
ヒ ト血漿 Glu17-ォステオカルシン濃度のラジオィムノアッセィに、 抗 Glu17 -ォ ステオカルシン抗体を用い、 測定緩衝液としては 0.5%ゥシ血清アルブミン、 1 m M EGTA, 5 mM Tris-塩酸緩衝液 （pH 7.4)を用いた。
いずれの血漿の希釈曲線も Glu1 ォステオカルシン （1-49) の標準曲線と良好 な平行関係を示した。 この結果よりヒ 卜血中にも Glu1 ォステオカルシン免疫活性が存在することを 示すとともに、 ヒ 卜の体内における Glu1 :-ォステオカルシンの測定に本ラジオィ ムノアツセィ系が有効であることが示された。
以下のヒ ト血漿 Glu17-ォステオカルシン濃度測定時には全ての血漿検体につき 希釈曲線を作成し標準曲線の上下端 20%に入る測定値は除外し、 標準曲線の中央 80%に位置する希釈の血漿検体の値のみを採用した。
実施例 6. 女性における血漿 Glu17-ォステオカルシン濃度の加齢変化
健常女性 322例における血漿 Glu 17 -ォステオ力ルシン濃度の平均値の加齢変化 を図 2に示した。
肥満度 BMI (body mass index) が正常範囲 （18~26) を示す健常かつ歩行可能 な 16歳〜 93歳の女性 322例を対象とし、 早朝空腹時に EGTAチューブに採血し直ち に血漿を分離したものを、 - 20°Cにて保存した後測定に供した。
血漿 Glu17-ォステオカルシン濃度は加齢とともに上昇し、 特に閉経前後および 高齢者での上昇率が高いことが窺えた。 この血漿 Glu17 -ォステオカルシン濃度の 加齢による上昇は Plantalechらの報告 (Plantalech L, Guillaumont M,
Vergnaud P, し eclercq , Delmas PD. , Impairment of gamma carboxylation of circulating osteocalcin (bone ula protein) in elderly women. J Bone Miner Res. 1991;6:1211-16. ) と類似するものである。
実施例 Ί . 健常女性における血漿 Glu 17-ォステオカルシン濃度と )1要椎骨塩量との 腿
女性における血漿 Glu1しォステオカルシン 濃度と、 二重 X線吸収骨量測定 (Lunar社製 DPXを使用） にて測定した第二〜第四腰椎骨塩量との相関を検討した: その結果として、 対象とした全 322例の女性の血漿 Glu1 ォステオカルシン濃 度と、 各年齢における日本人の腰椎骨塩量の平均値を 0とし標準偏差を 1として 各個人の骨塩量が各年齢の日本人平均値よりどのく らい解離しているかを示す値 である Z score との相関を図 3に示した。 全女性においては血漿 Glu17-ォステオ カルシン 濃度が高値を示す例ほどこの腰椎骨塩量 Z score は低下しており、 両 値の間には pく 0.001 の負の相関関係を認めた。
さらに、 図 4にはこれらの女性を 16歳〜 29歳の若年群、 30歳〜 49歳の壮年群、 50〜69歳の閉経後群、 70〜93歳の高齢群の 4群に分け、 それぞれの年代での血漿 Glu1 ォステオカルシン 濃度と腰椎骨塩量の絶対値との相関を検討した結果を 示す。 各年代群の中では 50歳〜 69歳の閉経後群において血漿 Glu1しォステオカル シン 濃度と腰椎骨塩量絶対値との問に負の相関を認めた。
上記のように、 健常女性の血漿 Glu17_ォステオカルシン濃度と腰椎骨塩量 Z scoreの間に pく 0.001 の有意の負の相関関係を認め、 全年齢を通じて年齢相応 よりも骨塩量が低下している例において血漿 Glu1しォステオカルシン 濃度は高値 を 呈することが示された。 また女性における年代別での血漿 Glu1T-ォステオカル シン 澳度と腰椎骨塩量の絶対値との相関の検討では各 50歳〜 69歳の閉経後群にお いて血漿 Glu17-ォステオカルシン濃度と腰椎骨塩量絶対値との間に負の相関を 認め、 この時期の女性の著しい骨量減少、 すなわち閉経後骨粗鬆症に血漿 Glu17- ォステオカルシン濃度高値が関与することが推察された。 今回の検討においては 健常女性を対象としたが、 罹患頻度が極めて高い骨粗鬆症以外にも、 多種の骨疾 患における低カルボキシル化ォステオカルシンの病態生理的意義の解明およびビ タミン K作用の解明に本測定系が有用であると考えられる。
以上のように、 本発明抗体を用いることにより、 Glu17-ォステオカルシンを容 易に検出 ·測定することができ、 それが関連する骨疾患の診断などに非常に有用 である。
配列表 配列番号： 1
配列の長さ ： 4 9
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類： タンパク質
起源
生物名 ： ヒ 卜
配列の記述
Tyr Leu Tyr Gin Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu
1 5 10 15
Glu Pro Arg Arg Xaa Val Cys Glu Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu
20 25 30
Ala Asp His l ie Gly Phe Gin Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro
35 40 45
Val 配列番号： 2
配列の長さ ： 4 9
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類： タンパク質
起源
生物名 ： ヒ ト
配列の記述
Tyr Leu Tyr Gin Trp Leu Gl y Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu
1 5 10 15
Glu Pro Arg Arg Xaa Val Cys Xaa Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu 20 25 30
Ala Asp His l ie Gly Phe Gin Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro
35 40 45
Val 配列番号： 3
配列の長さ ： 4 9
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類： タンパク質
起源
生物名 ： ヒ ト
配列の記述
Tyr leu Tyr Gin Tr し eu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu
1 5 10 15
Xaa Pro Arg Arg Xaa Val Cys Glu Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu
20 25 30
Ala Asp His He Gly Phe Gin Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro
35 40 45
Val 配列番号： 4
配列の長さ ： 4 9
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類： 質
起源
生物名 ： ヒ ト
配列の記述 Tyr し eu Tyr Gin Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro し eu
1 5 10 15
Xaa Pro Arg Arg Xaa Val Cys Xaa Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu
20 25 30
Ala Asp His l ie Gly Phe Gin Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro
35 40 45
Val 配列番号： 5
配列の長さ ： 1 3
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類： タンパク質
起源
生物名 ： ヒ ト
配列の記述
Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Xaa Val
1 5 10 配列番号： 6
配列の長さ ： 1 3
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類： タンパク質
起源
生物名 ： ヒ ト
配列の記述
Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Xaa Pro Arg Arg Xaa Val
1 5 10

Claims

請求の範囲
1. ォステオカルシンの 17位が Glu残基である Glu17-ォステオカルシンもしくは 17位 Glu残基を含むォステオカルシンフラグメントと特異的に結合することを特徴 とする抗 Glu1'-ォステオカルシン抗体またはそのフラグメント。
2. ォステオカルシンの 21位が Gla残基である Gla2にォステオカルシンもしくは 21位 Gla残基を含むォステオカルシンフラグメントと特異的に結合することを特徴 とする請求項 1記載の抗 Glu1'-ォステオカルシン抗体またはそのフラグメント。
3. 配列番号 1または 2 (配列中 Xaaは Gla残基を示す） 記載のぺプチド断片と 特異的に結合することを特徴とする請求項 1または 2記载の抗 Glu17 -ォステオ力 ルシン抗体またはそのフラグメント。
4. 配列番号 3または 4 (配列中 Xaaは Gla残基を示す） 記載のペプチド断片と 結合しないことを特徴とする請求項 1ないし 3記載の抗 Glu17 -ォステオカルシン 抗体またはそのフラグメント。
5. 配列番号 5 (配列中 Xaaは Gla残基を示す） 記載のペプチド断片もしくは Glu残基を含むそのフラグメン卜と特異的に結合する請求項 1ないし 4記載の抗 Glu17-ォステオカルシン抗体またはそのフラグメント3
6. 配列番号 5 (配列中 Xaaは Gla残基を示す） 記載のベプチド断片もしくは Glu残基を含むそのフラグメントと結合し、 配列番号 6 (配列中 Xaaは Gla残基を示 す） 記載のベプチド断片と結合しないことを特徴とする請求項 1ないし 5記載の 抗 Glu1しォステオカルシン抗体またはそのフラグメント。
7. 配列番号 5 (配列中 Xaaは Gla残基を示す） 記載のペプチド断片もしくは Glu残基を含むそのフラグメントを抗原として得られた請求項 1ないし 6記載の抗 Glu1 ォステオカルシン抗体またはそのフラグメント。
8. 抗体がモノクローナル抗体である請求項 1ないし 7記載の抗 Glu17-ォステ ォカルシン抗体またはそのフラグメント。
9. 請求項 1ないし 8記載の抗 Glu1'-ォステオカルシン抗体またはそのフラグ メントを含有する Glu17-ォステオカルシン検出試薬。
1 0. Glu17-ォステオカルシンを蛍光もしくは発光物質、 酵素、 またはラジオ アイソ卜ープで標識し、 請求項 1ないし 8記載の抗 Glu1:-ォステオカルシン抗体 またはそのフラグメントを用いて、 競合法により検出することを特徴とする、 試 料中の Giu17-ォステオカルシンの測定方法。
1 1. Glu残基を含むそのフラグメントが、 少なくとも 6個以上の連続したべプ チド断片からなるフラグメントである請求項 1〜 7のいずれか一項に記載の抗 Glu17-ォステオカルシン抗体またはそのフラグメント。
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