JPH0532697A - 合成ヒトオステオカルシンおよびその製造方法 - Google Patents
合成ヒトオステオカルシンおよびその製造方法Info
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- JPH0532697A JPH0532697A JP21325191A JP21325191A JPH0532697A JP H0532697 A JPH0532697 A JP H0532697A JP 21325191 A JP21325191 A JP 21325191A JP 21325191 A JP21325191 A JP 21325191A JP H0532697 A JPH0532697 A JP H0532697A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 反応収率の高い21,24 Ｇｌａヒトオステオカ
ルシンまたは 17,21,24 Ｇｌａヒトオステオカルシンの
製造法、ヒトオステオカルシン測定用標準物質を提供す
ること 【構成】 Ｆｍｏｃでアミノ基が、ＯｔＢｕでγ−カル
ボキシル基が保護された保護Ｌ−γ−カルボキシルグル
タミン酸を用いてγ−カルボキシルグルタミン酸を導入
する21,24 Ｇｌａヒトオステオカルシンまたは
17,21,24 Ｇｌａヒトオステオカルシンの製造法、前記
保護Ｌ−γ−カルボキシルグルタミン酸の製造法。
ルシンまたは 17,21,24 Ｇｌａヒトオステオカルシンの
製造法、ヒトオステオカルシン測定用標準物質を提供す
ること 【構成】 Ｆｍｏｃでアミノ基が、ＯｔＢｕでγ−カル
ボキシル基が保護された保護Ｌ−γ−カルボキシルグル
タミン酸を用いてγ−カルボキシルグルタミン酸を導入
する21,24 Ｇｌａヒトオステオカルシンまたは
17,21,24 Ｇｌａヒトオステオカルシンの製造法、前記
保護Ｌ−γ−カルボキシルグルタミン酸の製造法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、合成ヒトオステオカル
シン、その製造方法およびヒトオステオカルシン測定用
標準物質としてのその用途に関する。
シン、その製造方法およびヒトオステオカルシン測定用
標準物質としてのその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】オステオカルシン〔別名、ｂｏｎｅ ｇ
ｌａ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＧＰ）〕は、骨のビタミンＫ
依存性のカルシウム結合性タンパクである。そん分子量
は、５，８００であり、４９のアミノ酸残基により構成
されている。このタンパクは、オステオブラスト（骨芽
球）から産生され、骨の非コラーゲンタンパクの構成成
分の約２０％を占めている。このタンパクにはγ−ｃａ
ｒｂｏｘｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕ
ｅｓがあり、ハイドロキシアパタイトと強いアフィニテ
イがあり、それゆえに骨マトリックス形成に重要な役割
を有しているものと推定される。
ｌａ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＧＰ）〕は、骨のビタミンＫ
依存性のカルシウム結合性タンパクである。そん分子量
は、５，８００であり、４９のアミノ酸残基により構成
されている。このタンパクは、オステオブラスト（骨芽
球）から産生され、骨の非コラーゲンタンパクの構成成
分の約２０％を占めている。このタンパクにはγ−ｃａ
ｒｂｏｘｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕ
ｅｓがあり、ハイドロキシアパタイトと強いアフィニテ
イがあり、それゆえに骨マトリックス形成に重要な役割
を有しているものと推定される。
【０００３】このオステオカルシンは、ニワトリと牛の
骨から見出されたのが最初であるが〔Ｐｒｏ． Ｎａｔ
ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，７２，３９２５
（１９７５）、同７３，１４４７（１９７６）〕、その
他、人を含めて〔Ｊ．Ｂ．Ｃ．２５５，８６８５（１９
８０）〕種々の動物の骨から見出されており、その構造
の類似性がいわれている。
骨から見出されたのが最初であるが〔Ｐｒｏ． Ｎａｔ
ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，７２，３９２５
（１９７５）、同７３，１４４７（１９７６）〕、その
他、人を含めて〔Ｊ．Ｂ．Ｃ．２５５，８６８５（１９
８０）〕種々の動物の骨から見出されており、その構造
の類似性がいわれている。
【０００４】このような観点からヒトオステオカルシン
は、骨代謝異常の治療薬としての可能性が考えられ、ま
た、ヒトオステオカルシンの測定系のための標準物質と
しても期待されている。
は、骨代謝異常の治療薬としての可能性が考えられ、ま
た、ヒトオステオカルシンの測定系のための標準物質と
しても期待されている。
【０００５】さらに、オステオカルシンは、白血球エス
テラーゼのインヒビター（Ｅｂｓｃｏ Ｍｅｄｉａ，１
９８５，ｐｐ．１４９〜１５８）、破骨細胞へのｃｈｅ
ｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ
ｇ，１１８、ｐｐ．１６３６〜１６４２，１９８６）、
Ｃａ++、Ｍｇ++の誘導タンパク（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ，
２，ｐｐ．８３〜９２，１９８３）などの生物活性を有
する。かかる観点からもオステオカルシンの合成が待た
れていた。
テラーゼのインヒビター（Ｅｂｓｃｏ Ｍｅｄｉａ，１
９８５，ｐｐ．１４９〜１５８）、破骨細胞へのｃｈｅ
ｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ
ｇ，１１８、ｐｐ．１６３６〜１６４２，１９８６）、
Ｃａ++、Ｍｇ++の誘導タンパク（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ，
２，ｐｐ．８３〜９２，１９８３）などの生物活性を有
する。かかる観点からもオステオカルシンの合成が待た
れていた。
【０００６】ヒトオステオカルシンの合成法としては、
特開平３−９０１００号公報にアミノ基がｔ−ブチルオ
キシカルボニル基（Ｂｏｃ）で、γ−カルボキシル基が
シクロヘキシルエステル基（ＯｃＨｅｘ）で保護された
保護Ｌ−γ−カルボキシグルタミン酸またはその塩を用
いてγ−カルボキシグルタミン酸を導入する21,24Glaヒ
トオステオカルシンまたは17,21,24Gla ヒトオステオカ
ルシンの製造方法が開示されている。
特開平３−９０１００号公報にアミノ基がｔ−ブチルオ
キシカルボニル基（Ｂｏｃ）で、γ−カルボキシル基が
シクロヘキシルエステル基（ＯｃＨｅｘ）で保護された
保護Ｌ−γ−カルボキシグルタミン酸またはその塩を用
いてγ−カルボキシグルタミン酸を導入する21,24Glaヒ
トオステオカルシンまたは17,21,24Gla ヒトオステオカ
ルシンの製造方法が開示されている。
【０００７】しかし、この方法を用いると、保護アミノ
酸の結合により得られるペプチド樹脂から合成ヒトオス
テオカルシンを得るには、保護基のついたペプチドをぺ
プチド樹脂から脱離させる工程と保護基を脱離させる工
程を経ることが必要であり、一工程で脱離できる方法に
比し必然的にその反応収率が低い。
酸の結合により得られるペプチド樹脂から合成ヒトオス
テオカルシンを得るには、保護基のついたペプチドをぺ
プチド樹脂から脱離させる工程と保護基を脱離させる工
程を経ることが必要であり、一工程で脱離できる方法に
比し必然的にその反応収率が低い。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、合成の
21,24Glaヒトオステオカルシンまたは17,21,24Gla ヒト
オステオカルシン、それらを高い反応収率で製造するこ
とのできる製造方法およびヒトオステオカルシン測定用
標準物質を提供することを目的とする。
21,24Glaヒトオステオカルシンまたは17,21,24Gla ヒト
オステオカルシン、それらを高い反応収率で製造するこ
とのできる製造方法およびヒトオステオカルシン測定用
標準物質を提供することを目的とする。
【０００９】本発明は、下記配列番号１のアミノ酸配列
を有する合成21,24Glaヒトオステオカルシンおよびその
製造方法を提供するものである。 （アミノ酸配列中、Gla はγ−カルボキシグルタミン酸
残基を示す。）
を有する合成21,24Glaヒトオステオカルシンおよびその
製造方法を提供するものである。 （アミノ酸配列中、Gla はγ−カルボキシグルタミン酸
残基を示す。）
【００１０】本発明はまた、下記配列番号２のアミノ酸
配列を有する合成17,21,24Gla ヒトオステオカルシンお
よびその製造方法を提供するものである。 （アミノ酸配列中、Gla はγ−カルボキシグルタミン酸
残基を示す。）
配列を有する合成17,21,24Gla ヒトオステオカルシンお
よびその製造方法を提供するものである。 （アミノ酸配列中、Gla はγ−カルボキシグルタミン酸
残基を示す。）
【００１１】前記配列番号１のアミノ配列を有する
21,24Glaヒトオステオカルシンおよび配列番号２のアミ
ノ酸配列を有する17,21,24Gla ヒトオステオカルシン
は、Ｐｏｓｅｒらによれば、ヒトオステオカルシン中
に、９１：９の割合で存在するとされている〔Ｐｏｓｅ
ｒ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，２５５，８６８５〜
８６９１（１９８０）〕、ヒトオステオカルシンを構成
するタンパクである。
21,24Glaヒトオステオカルシンおよび配列番号２のアミ
ノ酸配列を有する17,21,24Gla ヒトオステオカルシン
は、Ｐｏｓｅｒらによれば、ヒトオステオカルシン中
に、９１：９の割合で存在するとされている〔Ｐｏｓｅ
ｒ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，２５５，８６８５〜
８６９１（１９８０）〕、ヒトオステオカルシンを構成
するタンパクである。
【００１２】本発明の合成の21,24Glaヒトオステオカル
シンおよび17,21,24Gla ヒトオステオカルシン（以下、
本発明のヒトオステオカルシンということがある）は、
ヒトオステオカルシンのペプチド合成法において、下記
式（１）
シンおよび17,21,24Gla ヒトオステオカルシン（以下、
本発明のヒトオステオカルシンということがある）は、
ヒトオステオカルシンのペプチド合成法において、下記
式（１）
【化４】
（式中、ｔＢｕはｔｅｒｔ−ブチル基を示す）で示され
る保護Ｌ−γ−カルボキシグルタミン酸またはその塩を
用いてγ−カルボキシグルタミン酸を導入することによ
って製造される。
る保護Ｌ−γ−カルボキシグルタミン酸またはその塩を
用いてγ−カルボキシグルタミン酸を導入することによ
って製造される。
【００１３】ペプチド合成は、公知の方法、例えば、矢
島治明、榊原俊平著、日本生化学会編、生化学実験講座
（Ｉ）：“蛋白質の化学”４巻、東京化学同人発行（１
９７７）；および、泉谷信夫ほか著、“ペプチド合成の
基礎と実験”、丸善発行（１９８５）に記載されている
方法に準じて、液相法または固相法で行うことができ
る。本発明のオステオカルシンの合成法としては固相法
が好ましい。
島治明、榊原俊平著、日本生化学会編、生化学実験講座
（Ｉ）：“蛋白質の化学”４巻、東京化学同人発行（１
９７７）；および、泉谷信夫ほか著、“ペプチド合成の
基礎と実験”、丸善発行（１９８５）に記載されている
方法に準じて、液相法または固相法で行うことができ
る。本発明のオステオカルシンの合成法としては固相法
が好ましい。
【００１４】以下、固相法により本発明のヒトオステオ
カルシンまたはそれらの塩を合成する場合について説明
する。まず、目的とするヒトオステオカルシンのＣ末端
アミノ酸、すなわちＶａｌを保護アミノ酸として不溶性
樹脂に結合させる。このようなＣ末端アミノ酸を不溶性
樹脂に結合させた保護アミノ酸樹脂は市販品を用いるこ
ともできる。次いで、ヒトオステオカルシンのアミノ酸
配列に従ってＣ末端側から保護アミノ酸を順次結合さ
せ、保護ペプチド樹脂を得る。
カルシンまたはそれらの塩を合成する場合について説明
する。まず、目的とするヒトオステオカルシンのＣ末端
アミノ酸、すなわちＶａｌを保護アミノ酸として不溶性
樹脂に結合させる。このようなＣ末端アミノ酸を不溶性
樹脂に結合させた保護アミノ酸樹脂は市販品を用いるこ
ともできる。次いで、ヒトオステオカルシンのアミノ酸
配列に従ってＣ末端側から保護アミノ酸を順次結合さ
せ、保護ペプチド樹脂を得る。
【００１５】不溶性樹脂としては、当該技術分野で知ら
れたいずれでもよく、例えばクロロメチル樹脂、オキシ
メチル樹脂、４−（オキシメチル）フェニルアセタミド
メチル樹脂などを挙げることができる。
れたいずれでもよく、例えばクロロメチル樹脂、オキシ
メチル樹脂、４−（オキシメチル）フェニルアセタミド
メチル樹脂などを挙げることができる。
【００１６】保護アミノ酸とは、官能基が公知の方法に
より保護されたアミノ酸であり、各種の保護アミノ酸が
市販されている。本発明のヒトオステオカルシンを合成
する場合には、以下に示す保護アミノ酸のいずれかを選
択するのが好ましい。まず、アミノ酸のα−アミノ基の
保護基は９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基
（Ｆｍｏｃ）またはＢｏｃである。
より保護されたアミノ酸であり、各種の保護アミノ酸が
市販されている。本発明のヒトオステオカルシンを合成
する場合には、以下に示す保護アミノ酸のいずれかを選
択するのが好ましい。まず、アミノ酸のα−アミノ基の
保護基は９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基
（Ｆｍｏｃ）またはＢｏｃである。
【００１７】Ａｒｇのグアニジン基の保護基はｐ−トル
エンスルホニル基（Ｔｏｓ）、ＮＯ2 または４−メトキ
シ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル基（Ｍ
ｔｒ）である。Ａｓｐ、Ｇｌｕのカルボキシル基の保護
基は、ベンジルオキシ基（ＯＢｚｌ）、ｔ−ブトキシ基
（ＯｔＢｕ）またはＯｃＨｅｘである。Ｃｙｓのメルカ
プト基の保護基はｔＢｕ、４−メチルベンジル基（４Ｃ
Ｈ3 ・Ｂｚｌ）、メトキシベンジル基（ＭＢｚｌ）また
はアセトアミドメチル（Ａｃｍ）である。Ｈｉｓのイミ
ダゾリル基の保護基はトリフェニルメチル（Ｔｒｔ）、
Ｔｏｓ、Ｆｍｏｃまたはジニトロフェニル基（Ｄｎｐ）
である。Ｔｒｐのインドリル保護基はＨＣＯか、あるい
は保護しなくてもよい。Ｔｙｒの水酸基の保護基は２−
ブロモベンジルオキシカルボニル基（ＢｒＺ）、２，６
−ジクロロベンジル基（Ｃｌ2 Ｂｚｌ）、Ｂｚｌ、ｔＢ
ｕであるかあるいは保護しなくてもよい。各保護基は、
ペプチドの合成条件に応じ適切なものを選択する必要が
ある。
エンスルホニル基（Ｔｏｓ）、ＮＯ2 または４−メトキ
シ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル基（Ｍ
ｔｒ）である。Ａｓｐ、Ｇｌｕのカルボキシル基の保護
基は、ベンジルオキシ基（ＯＢｚｌ）、ｔ−ブトキシ基
（ＯｔＢｕ）またはＯｃＨｅｘである。Ｃｙｓのメルカ
プト基の保護基はｔＢｕ、４−メチルベンジル基（４Ｃ
Ｈ3 ・Ｂｚｌ）、メトキシベンジル基（ＭＢｚｌ）また
はアセトアミドメチル（Ａｃｍ）である。Ｈｉｓのイミ
ダゾリル基の保護基はトリフェニルメチル（Ｔｒｔ）、
Ｔｏｓ、Ｆｍｏｃまたはジニトロフェニル基（Ｄｎｐ）
である。Ｔｒｐのインドリル保護基はＨＣＯか、あるい
は保護しなくてもよい。Ｔｙｒの水酸基の保護基は２−
ブロモベンジルオキシカルボニル基（ＢｒＺ）、２，６
−ジクロロベンジル基（Ｃｌ2 Ｂｚｌ）、Ｂｚｌ、ｔＢ
ｕであるかあるいは保護しなくてもよい。各保護基は、
ペプチドの合成条件に応じ適切なものを選択する必要が
ある。
【００１８】本発明の21,24Glaヒトオステオカルシンに
おける２１位および２４位のＧｌａならびに17,21,24Gl
a ヒトオステオカルシンにおける１７位、２１および２
４位のＧｌａは、前記式（１）で表される保護Ｌ−Ｇｌ
ａとして導入することができる。
おける２１位および２４位のＧｌａならびに17,21,24Gl
a ヒトオステオカルシンにおける１７位、２１および２
４位のＧｌａは、前記式（１）で表される保護Ｌ−Ｇｌ
ａとして導入することができる。
【００１９】この保護Ｌ−Ｇｌａの合成は次の方法によ
り行うことができる。
り行うことができる。
【化５】
（工程ａ〜ｈ中、Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメチルオ
キシカルボニル基を、ｔＢｕはｔ−ブチル基を、Ｂｚｌ
はベンジル基を示す。）
キシカルボニル基を、ｔＢｕはｔ−ブチル基を、Ｂｚｌ
はベンジル基を示す。）
【００２０】すなわち、まずＬ−プロリン（Ｉ）からＬ
−１−Ｆｍｏｃ−プロリネート（II) を合成し（工程
ａ）、次にこれを（２Ｓ）−１−Ｆｍｏｃ−２−（ｔ−
ブチルジメチルシリル）−オキシメチルピロリジン（II
I)となし（工程ｂ）、さらにこれを（２Ｓ）−１−Ｆｍ
ｏｃ−４−ｔ−ブトキシカルボニル−２−（ｔ−ブチル
ジメチルシリル）オキシメチル−５−ピロリジン（IV)
とする（工程ｃ）。
−１−Ｆｍｏｃ−プロリネート（II) を合成し（工程
ａ）、次にこれを（２Ｓ）−１−Ｆｍｏｃ−２−（ｔ−
ブチルジメチルシリル）−オキシメチルピロリジン（II
I)となし（工程ｂ）、さらにこれを（２Ｓ）−１−Ｆｍ
ｏｃ−４−ｔ−ブトキシカルボニル−２−（ｔ−ブチル
ジメチルシリル）オキシメチル−５−ピロリジン（IV)
とする（工程ｃ）。
【００２１】次に工程ｃで得られた化合物（IV) を脱シ
リル化して（２Ｓ）−１−Ｆｍｏｃ−４−ｔ−ブトキシ
カルボニル−２−ヒドロキシメチル−５−ピロリジン
（Ｖ）となし（工程ｄ）、これを（２Ｓ）−１−Ｆｍｏ
ｃ−４−ｔ−ブトキシカルボニル−５−オキソプロリン
ベンジルエステル（VI) となし（工程ｅ）、これにトリ
エチルアミンとｔ−ブチルアルコールを作用させてα−
ベンジル−γ，γ−ジ−ｔ−ブチル−Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｌ
−γ−カルボキシグルタメート（VII)を合成（工程ｆ）
する。さらにこれを還元して、目的とする保護Ｌ−Ｇｌ
ａ（１）を得る（工程ｇ）。
リル化して（２Ｓ）−１−Ｆｍｏｃ−４−ｔ−ブトキシ
カルボニル−２−ヒドロキシメチル−５−ピロリジン
（Ｖ）となし（工程ｄ）、これを（２Ｓ）−１−Ｆｍｏ
ｃ−４−ｔ−ブトキシカルボニル−５−オキソプロリン
ベンジルエステル（VI) となし（工程ｅ）、これにトリ
エチルアミンとｔ−ブチルアルコールを作用させてα−
ベンジル−γ，γ−ジ−ｔ−ブチル−Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｌ
−γ−カルボキシグルタメート（VII)を合成（工程ｆ）
する。さらにこれを還元して、目的とする保護Ｌ−Ｇｌ
ａ（１）を得る（工程ｇ）。
【００２２】前記工程ａは、化合物Ｉと９−フルオレニ
ルメチルクロロフォルメートをＮａＨＣＯ3 の存在下反
応させ、次にメタノール、ＤＣＣ（１，３−ジシクロヘ
キシルカルボジイミド）および４−ＤＭＡＰ（４−ジメ
チルアミノピリジン）を反応させることにより行うこと
ができる。
ルメチルクロロフォルメートをＮａＨＣＯ3 の存在下反
応させ、次にメタノール、ＤＣＣ（１，３−ジシクロヘ
キシルカルボジイミド）および４−ＤＭＡＰ（４−ジメ
チルアミノピリジン）を反応させることにより行うこと
ができる。
【００２３】工程ｂは、化合物IIにＬｉＢＨ4 を反応さ
せ、処理後、ｔ−ブチルジメチルシリルクロライドをＴ
ＥＡ、４−ＤＭＡＰの存在下反応させシリル化したの
ち、これに、ＲｕＯ2 ハイドレートおよびＮａＩＯ4 を
加え反応させ、化合物III を得ることができる。
せ、処理後、ｔ−ブチルジメチルシリルクロライドをＴ
ＥＡ、４−ＤＭＡＰの存在下反応させシリル化したの
ち、これに、ＲｕＯ2 ハイドレートおよびＮａＩＯ4 を
加え反応させ、化合物III を得ることができる。
【００２４】工程ｃはＬＤＡ存在下、化合物III とｔ−
ブチルクロロフォルメートを反応させて実施することが
できる。
ブチルクロロフォルメートを反応させて実施することが
できる。
【００２５】工程ｄは化合物IVとｐ−トルエンスルホン
酸を反応させ、ＮａＨＣＯ3 を加えて行うことができ
る。
酸を反応させ、ＮａＨＣＯ3 を加えて行うことができ
る。
【００２６】工程ｅは、化合物Ｖとピリジニウムジクロ
メートを反応させ、次にベンジルアルコール、ＤＣＣお
よび４−ＤＭＡＰを反応生成物と反応させ、化合物VIを
得ることができる。
メートを反応させ、次にベンジルアルコール、ＤＣＣお
よび４−ＤＭＡＰを反応生成物と反応させ、化合物VIを
得ることができる。
【００２７】工程ｆは、化合物VIにｔ−ブチルアルコー
ルとＴＥＡを加えて反応させることにより行うことがで
きる。
ルとＴＥＡを加えて反応させることにより行うことがで
きる。
【００２８】工程ｇは、化合物VII のエタノール溶液に
Ｐｄ−Ｃを加え、水素を加えながら中圧の還元装置を用
いて実施することができる。
Ｐｄ−Ｃを加え、水素を加えながら中圧の還元装置を用
いて実施することができる。
【００２９】前記工程ａ〜ｇの組合せによる保護Ｌ−Ｇ
ｌａの合成は、Ｌ−プロリン（Ｉ）の光学活性が生成物
である保護Ｌ−Ｇｌａ（１）まで保持されるため、光学
分割の工程を要せず、高い反応収率を保つことができ
る。
ｌａの合成は、Ｌ−プロリン（Ｉ）の光学活性が生成物
である保護Ｌ−Ｇｌａ（１）まで保持されるため、光学
分割の工程を要せず、高い反応収率を保つことができ
る。
【００３０】保護アミノ酸の結合は、例えば、Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ペプチドシンセサイ
ザー４３１Ａ型のようなペプチド合成機により行うこと
ができる。この結果、保護基のついたペプチド樹脂が得
られ、目的とする合成ヒトオステオカルシンを得るに
は、該ペプチド樹脂からペプチドを脱離し、さらに保護
基を脱離させる必要があるが、本発明の保護Ｌ−ＧＬａ
を用いるとこの２つの脱離工程を同時に行うことがで
き、反応収率の向上に寄与することができる利点があ
る。
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ペプチドシンセサイ
ザー４３１Ａ型のようなペプチド合成機により行うこと
ができる。この結果、保護基のついたペプチド樹脂が得
られ、目的とする合成ヒトオステオカルシンを得るに
は、該ペプチド樹脂からペプチドを脱離し、さらに保護
基を脱離させる必要があるが、本発明の保護Ｌ−ＧＬａ
を用いるとこの２つの脱離工程を同時に行うことがで
き、反応収率の向上に寄与することができる利点があ
る。
【００３１】得られた粗製ペプチドは、ペプチド製造の
公知の手段、例えば抽出：再結晶：ゲル濾過、イオン交
換、逆相などの各種クロマトグラフィー：電気泳動：向
流分配などにより単離精製することができるが、逆相高
速クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）による方法が最
適である。
公知の手段、例えば抽出：再結晶：ゲル濾過、イオン交
換、逆相などの各種クロマトグラフィー：電気泳動：向
流分配などにより単離精製することができるが、逆相高
速クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）による方法が最
適である。
【００３２】得られたペプチドである合成21,24Glaヒト
オステオカルシンは、天然のヒトオステオカルシンと同
一の免疫学的挙動を示し、ヒトオステオカルシン測定用
標準物質として有効に使用できる。
オステオカルシンは、天然のヒトオステオカルシンと同
一の免疫学的挙動を示し、ヒトオステオカルシン測定用
標準物質として有効に使用できる。
【００３３】また、合成21,24Glaヒトオステオカルシン
および合成17,21,24Gla ヒトオステオカルシンは、骨代
謝疾患治療薬として有効であると考えられる。かかる治
療薬として使用する場合、合成品である本発明のヒトオ
ステオカルシンは、その分子量が６，０００前後であ
り、天然のヒトオステオカルシンの分子量が１７，００
０前後であるのと比較して低分子量であるため、経鼻投
与などの投与経路によっても吸収効率がよく好適であ
る。
および合成17,21,24Gla ヒトオステオカルシンは、骨代
謝疾患治療薬として有効であると考えられる。かかる治
療薬として使用する場合、合成品である本発明のヒトオ
ステオカルシンは、その分子量が６，０００前後であ
り、天然のヒトオステオカルシンの分子量が１７，００
０前後であるのと比較して低分子量であるため、経鼻投
与などの投与経路によっても吸収効率がよく好適であ
る。
【００３４】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。なお、実施例中、「％」は「重量％」を示す。 実施例１（保護Ｌ−Ｇｌａの合成） Ｌ−プロリン（Ｉ）１１．５ｇ（１００ｍｍｏｌ）を１
２５ｍｌのジオキサンに溶解し、２５６ｍｌの１０％Ｎ
ａＨＣＯ3 を加え混合する。これに、９−フルオレニル
メチルクロロフォルメート２５．９ｇ（１００ｍｍｏ
ｌ）のジオキサン（２５０ｍｌ）溶液を滴下し、氷冷下
４時間、室温８時間攪拌した。その後、１，０００ｍｌ
の水を加えエーテルで洗浄し、氷冷下ｃｏｎｃ．ＨＣｌ
を用いて酸性とした後、４℃で一晩冷却した。そして濾
過を行い得られた残渣３１．４ｇ（９３ｍｍｏｌ）と４
−ジメチルアミノピリジン１１．４ｇ（９３ｍｍｏｌ）
およびメタノール３．８ｍｌ（９３ｍｍｏｌ）をジクロ
ロメタン１５０ｍｌに溶解し、これにＤＣＣ２１．１ｇ
（１０２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２０ｍｌ）
を加え２５℃で８時間攪拌した。その後、ＤＣＵ（Ｎ，
Ｎ−ジシクロヘキシルウレア）を濾過により除き、濾液
を１ＭＫＨＳＯ4 、水、５％ＮａＨＣＯ3 の順で洗浄
し、ＭｇＳＯ4 で乾燥後、溶媒を減圧下留去し、メチル
−Ｌ−１−Ｆｍｏｃ−プロリネート（II）３２．３ｇ
（収率９２％）を得た。
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。なお、実施例中、「％」は「重量％」を示す。 実施例１（保護Ｌ−Ｇｌａの合成） Ｌ−プロリン（Ｉ）１１．５ｇ（１００ｍｍｏｌ）を１
２５ｍｌのジオキサンに溶解し、２５６ｍｌの１０％Ｎ
ａＨＣＯ3 を加え混合する。これに、９−フルオレニル
メチルクロロフォルメート２５．９ｇ（１００ｍｍｏ
ｌ）のジオキサン（２５０ｍｌ）溶液を滴下し、氷冷下
４時間、室温８時間攪拌した。その後、１，０００ｍｌ
の水を加えエーテルで洗浄し、氷冷下ｃｏｎｃ．ＨＣｌ
を用いて酸性とした後、４℃で一晩冷却した。そして濾
過を行い得られた残渣３１．４ｇ（９３ｍｍｏｌ）と４
−ジメチルアミノピリジン１１．４ｇ（９３ｍｍｏｌ）
およびメタノール３．８ｍｌ（９３ｍｍｏｌ）をジクロ
ロメタン１５０ｍｌに溶解し、これにＤＣＣ２１．１ｇ
（１０２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２０ｍｌ）
を加え２５℃で８時間攪拌した。その後、ＤＣＵ（Ｎ，
Ｎ−ジシクロヘキシルウレア）を濾過により除き、濾液
を１ＭＫＨＳＯ4 、水、５％ＮａＨＣＯ3 の順で洗浄
し、ＭｇＳＯ4 で乾燥後、溶媒を減圧下留去し、メチル
−Ｌ−１−Ｆｍｏｃ−プロリネート（II）３２．３ｇ
（収率９２％）を得た。
【００３５】次に、得られた化合物II３０ｇ（８５ｍｍ
ｏｌ）のＴＨＦ溶液（２００ｍｌ）に、氷冷下、攪拌し
ながら、ＬｉＢＨ4 ２．８ｇ（１２８ｍｍｏｌ）を滴下
し、室温で１６時間攪拌した後、再度氷冷しながら、水
と２ＮＨＣｌをゆっくりと加えた。次に反応液を酢酸エ
チルで抽出し、抽出液を飽和食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ
4 で乾燥後、溶媒を減圧下留去し残渣を得た。この残渣
２４．７ｇ（収率９０％）と、ＴＡＥ１２．３ｍｌ（８
８ｍｍｏｌ）および４−ＤＭＡＰ０．４７ｇ（３．８ｍ
ｍｏｌ）をＤＭＦ１００ｍｌに溶解し、攪拌しながらｔ
−ブチルジメチルシリルクロライド１３．３ｇ（８８ｍ
ｍｏｌ）を加え、３時間室温で攪拌した。その後、氷水
と酢酸エチルを加え抽出し、抽出液を５％ＨＣｌ、食塩
水で洗浄し、乾燥後、溶媒を減圧下留去し、シリカゲル
クロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１）
で精製し、続いて、精製物３２．６ｇ（収率９８％）の
酢酸エチル溶液１５０ｍｌにＲｕＯ2ハイドレート３２
０ｍｇと１０％ＮａＩＯ4 ４００ｍｌを加え室温で１時
間反応させた。水層を酢酸エチルで洗浄後、有機層を合
わせシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキ
サン＝１：３）を用いて精製し、（２Ｓ）−１−Ｆｍｏ
ｃ−２−ｔ−ブチルジメチルシリル）オキシメチルピロ
リジン（III)３０．９ｇ（収率９２％）を得た。
ｏｌ）のＴＨＦ溶液（２００ｍｌ）に、氷冷下、攪拌し
ながら、ＬｉＢＨ4 ２．８ｇ（１２８ｍｍｏｌ）を滴下
し、室温で１６時間攪拌した後、再度氷冷しながら、水
と２ＮＨＣｌをゆっくりと加えた。次に反応液を酢酸エ
チルで抽出し、抽出液を飽和食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ
4 で乾燥後、溶媒を減圧下留去し残渣を得た。この残渣
２４．７ｇ（収率９０％）と、ＴＡＥ１２．３ｍｌ（８
８ｍｍｏｌ）および４−ＤＭＡＰ０．４７ｇ（３．８ｍ
ｍｏｌ）をＤＭＦ１００ｍｌに溶解し、攪拌しながらｔ
−ブチルジメチルシリルクロライド１３．３ｇ（８８ｍ
ｍｏｌ）を加え、３時間室温で攪拌した。その後、氷水
と酢酸エチルを加え抽出し、抽出液を５％ＨＣｌ、食塩
水で洗浄し、乾燥後、溶媒を減圧下留去し、シリカゲル
クロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１）
で精製し、続いて、精製物３２．６ｇ（収率９８％）の
酢酸エチル溶液１５０ｍｌにＲｕＯ2ハイドレート３２
０ｍｇと１０％ＮａＩＯ4 ４００ｍｌを加え室温で１時
間反応させた。水層を酢酸エチルで洗浄後、有機層を合
わせシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキ
サン＝１：３）を用いて精製し、（２Ｓ）−１−Ｆｍｏ
ｃ−２−ｔ−ブチルジメチルシリル）オキシメチルピロ
リジン（III)３０．９ｇ（収率９２％）を得た。
【００３６】チッソ置換下、ジイソプロピルアミン１
１．１ｇ（１１１ｍｍｏｌ）とｎ−ブチルリチウム７
３．９ｇ（１１１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ４５ｍｌ中、７８
℃で攪拌し、そこに化合物III ２５ｇ（５５．４ｍｍｏ
ｌ）のＴＨＦ溶液４５ｍｌを温度に注意しながら滴下
し、３０分間攪拌した。次にｔ−ブチルクロロフォルメ
ート１３．８ｇ（１１１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液３０ｍ
ｌを７８℃に冷却下、滴下し、１時間、７８℃で反応さ
せ、さらに１時間室温で反応させた。反応終了後、ＮＨ
4 Ｃｌ水溶液を加え、反応を停止させ、反応液を酢酸エ
チルで抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄後乾燥さ
せ、溶媒を減圧下留去し、得られた残渣をシリカゲルク
ロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：４）で
精製し、（２Ｓ）−１−Ｆｍｏｃ−４−ｔ−ブトキシカ
ルボニル−２−（ｔ−ブチルジメチルシリル）オキシメ
チル−５−ピロリドン（IV) １２．５ｇ（収率４２％）
を得た。
１．１ｇ（１１１ｍｍｏｌ）とｎ−ブチルリチウム７
３．９ｇ（１１１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ４５ｍｌ中、７８
℃で攪拌し、そこに化合物III ２５ｇ（５５．４ｍｍｏ
ｌ）のＴＨＦ溶液４５ｍｌを温度に注意しながら滴下
し、３０分間攪拌した。次にｔ−ブチルクロロフォルメ
ート１３．８ｇ（１１１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液３０ｍ
ｌを７８℃に冷却下、滴下し、１時間、７８℃で反応さ
せ、さらに１時間室温で反応させた。反応終了後、ＮＨ
4 Ｃｌ水溶液を加え、反応を停止させ、反応液を酢酸エ
チルで抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄後乾燥さ
せ、溶媒を減圧下留去し、得られた残渣をシリカゲルク
ロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：４）で
精製し、（２Ｓ）−１−Ｆｍｏｃ−４−ｔ−ブトキシカ
ルボニル−２−（ｔ−ブチルジメチルシリル）オキシメ
チル−５−ピロリドン（IV) １２．５ｇ（収率４２％）
を得た。
【００３７】得られた化合物IV２０．０ｇ（３７．１ｍ
ｍｏｌ）のメタノール溶液７０ｍｌにｐ−トルエンスル
ホン酸７．８ｇ（３７．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で２
時間攪拌した。反応液に飽和ＮａＨＣＯ3 溶液を加え、
反応液をアルカリ性とし、クロロホルムで抽出した。抽
出液を飽和食塩水で洗浄し乾燥後、溶媒を減圧下留去
し、シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキ
サン＝１：１）で精製し、（２Ｓ）−１−Ｆｍｏｃ−４
−ｔ−ブトキシカルボニル−２−ヒドロキシメチル−５
−ピロリジン（Ｖ) １２．５ｇ（収率７９％）を得た。
ｍｏｌ）のメタノール溶液７０ｍｌにｐ−トルエンスル
ホン酸７．８ｇ（３７．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で２
時間攪拌した。反応液に飽和ＮａＨＣＯ3 溶液を加え、
反応液をアルカリ性とし、クロロホルムで抽出した。抽
出液を飽和食塩水で洗浄し乾燥後、溶媒を減圧下留去
し、シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキ
サン＝１：１）で精製し、（２Ｓ）−１−Ｆｍｏｃ−４
−ｔ−ブトキシカルボニル−２−ヒドロキシメチル−５
−ピロリジン（Ｖ) １２．５ｇ（収率７９％）を得た。
【００３８】ピリジニウムジクロメート３０．３ｇ（８
０．５ｍｍｏｌ）を化合物Ｖ２０ｇ（２３．３ｍｍｏ
ｌ）のＤＭＦ溶液４５ｍｌに加え、４０℃、１６時間攪
拌した。その後、水を加え、クロロホルムで抽出し、抽
出液を５％酢酸、飽和食塩水で洗浄し乾燥後、溶媒を減
圧下留去し、褐色の油状物を得た。このものに、ベンジ
ルアルコール２．５ｇ（２３．５ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ
５．０ｇ（２４．１ｍｍｏｌ）および４−ＤＭＡＰ０．
３ｇ（２．４ｍｍｏｌ）を加え、ジクロロメタン６０ｍ
ｌを溶媒として室温で３時間反応させた。その後化合物
IIを得たときと同様の処理（ＤＣＵの濾過以降）を行
い、（２Ｓ）−１−Ｆｍｏｃ−４−ｔ−ブトキシカルボ
ニル−５−オキソプロリンベンジルエステル（VI) ８．
３ｇ（収率６８％）を得た。
０．５ｍｍｏｌ）を化合物Ｖ２０ｇ（２３．３ｍｍｏ
ｌ）のＤＭＦ溶液４５ｍｌに加え、４０℃、１６時間攪
拌した。その後、水を加え、クロロホルムで抽出し、抽
出液を５％酢酸、飽和食塩水で洗浄し乾燥後、溶媒を減
圧下留去し、褐色の油状物を得た。このものに、ベンジ
ルアルコール２．５ｇ（２３．５ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ
５．０ｇ（２４．１ｍｍｏｌ）および４−ＤＭＡＰ０．
３ｇ（２．４ｍｍｏｌ）を加え、ジクロロメタン６０ｍ
ｌを溶媒として室温で３時間反応させた。その後化合物
IIを得たときと同様の処理（ＤＣＵの濾過以降）を行
い、（２Ｓ）−１−Ｆｍｏｃ−４−ｔ−ブトキシカルボ
ニル−５−オキソプロリンベンジルエステル（VI) ８．
３ｇ（収率６８％）を得た。
【００３９】化合物VI１０ｇ（１９．３ｍｍｏｌ）にｔ
−ブチルアルコールとＴＥＡを過剰に加えて２４時間還
流した。その後、溶媒を減圧下留去することによりα−
ベンジル−γ，γ−ジ−ｔ−ブチル−Ｎ−Ｆｍｏｃ−γ
−カルボキシグルタメート（VII)１０．３ｇ（収率９０
％）を得た。
−ブチルアルコールとＴＥＡを過剰に加えて２４時間還
流した。その後、溶媒を減圧下留去することによりα−
ベンジル−γ，γ−ジ−ｔ−ブチル−Ｎ−Ｆｍｏｃ−γ
−カルボキシグルタメート（VII)１０．３ｇ（収率９０
％）を得た。
【００４０】さらに、化合物VII １０ｇ（１７ｍｍｏ
ｌ）をエタノール２０ｍｌに溶解し、１０％Ｐｄ−Ｃ１
ｇを加えて、水素を加えながら、中圧の還元装置を用い
て化合物（１）７．８ｇ（収率９０％）を得た。
ｌ）をエタノール２０ｍｌに溶解し、１０％Ｐｄ−Ｃ１
ｇを加えて、水素を加えながら、中圧の還元装置を用い
て化合物（１）７．８ｇ（収率９０％）を得た。
【００４１】実施例２（21,24Glaヒトオステオカルシン
の合成） 配列番号１に示すアミノ酸配列を有する21,24Glaヒトオ
ステオカルシンを合成した。 Ｆｍｏｃ−Ｖａｌの活性化 Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ０．３４ｇ（１．０ｍｍｏｌ）をＮ−
メチルピロリドン（ＮＭＰ）に溶解し、そこに０．４５
Ｍ〔２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−
１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオ
ロフォスフェート〕（ＨＢＴＵ）／ＨＯＢｔ／ＤＭＦ溶
液を０．５ｍｌ加え、攪拌することにより、カルボン酸
の水酸基がＨＢＴＵ基に置き換えられた活性化Ｆｍｏｃ
−Ｖａｌが生成した。
の合成） 配列番号１に示すアミノ酸配列を有する21,24Glaヒトオ
ステオカルシンを合成した。 Ｆｍｏｃ−Ｖａｌの活性化 Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ０．３４ｇ（１．０ｍｍｏｌ）をＮ−
メチルピロリドン（ＮＭＰ）に溶解し、そこに０．４５
Ｍ〔２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−
１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオ
ロフォスフェート〕（ＨＢＴＵ）／ＨＯＢｔ／ＤＭＦ溶
液を０．５ｍｌ加え、攪拌することにより、カルボン酸
の水酸基がＨＢＴＵ基に置き換えられた活性化Ｆｍｏｃ
−Ｖａｌが生成した。
【００４２】保護Ｖａｌと不溶性樹脂との結合
不溶性樹脂を担体として、ペプチドシンセサイザー４３
１Ａ型（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
を使用して21,24Glaヒトオステオカルシンの合成を行っ
た。不溶性樹脂０．２５ｇ（０．２５ｍｍｏｌ）にＮ−
メチルピロリドンに溶解した活性化Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ
１．０ｍｍｏｌを加え攪拌してＲｅｓｉｎ−Ｖａｌ（Ｆ
ｍｏｃ）を合成した。
１Ａ型（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
を使用して21,24Glaヒトオステオカルシンの合成を行っ
た。不溶性樹脂０．２５ｇ（０．２５ｍｍｏｌ）にＮ−
メチルピロリドンに溶解した活性化Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ
１．０ｍｍｏｌを加え攪拌してＲｅｓｉｎ−Ｖａｌ（Ｆ
ｍｏｃ）を合成した。
【００４３】Ｒｅｓｉｎ−Ｖａｌ（Ｆｍｏｃ）（樹
脂）への４８位Ｐｒｏの導入 イ）脱保護および洗浄 Ｒｅｓｉｎ−Ｖａｌ（Ｆｍｏｃ）のＮＭＰ溶液にピペリ
ジン０．５ｍｌを加え攪拌することによりアミノ基の保
護基であるＦｍｏｃ基を脱保護した。次にこの脱保護し
た反応生成物をＣＨ2 Ｃｌ2 で析出させ同時に不要なも
の（未反応のＮＭＰなど）を洗い流した。
脂）への４８位Ｐｒｏの導入 イ）脱保護および洗浄 Ｒｅｓｉｎ−Ｖａｌ（Ｆｍｏｃ）のＮＭＰ溶液にピペリ
ジン０．５ｍｌを加え攪拌することによりアミノ基の保
護基であるＦｍｏｃ基を脱保護した。次にこの脱保護し
た反応生成物をＣＨ2 Ｃｌ2 で析出させ同時に不要なも
の（未反応のＮＭＰなど）を洗い流した。
【００４４】ロ）活性化Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏの調製
Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ０．３４ｇ（０．１ｍｌ）と０．４５
Ｍ ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＭＦ溶液を反応させること
により同様に活性化Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏを得た。
Ｍ ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＭＦ溶液を反応させること
により同様に活性化Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏを得た。
【００４５】ハ）縮合反応
Ｒｅｓｉｎ−Ｖａｌと活性化Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏのそれぞ
れのＮＭＰ溶液を徐々に混合し攪拌して、Ｒｅｓｉｎ−
Ｖａｌ−Ｐｒｏ（Ｆｍｏｃ）を得た。
れのＮＭＰ溶液を徐々に混合し攪拌して、Ｒｅｓｉｎ−
Ｖａｌ−Ｐｒｏ（Ｆｍｏｃ）を得た。
【００４６】４７〜１位の各アミノ酸の導入
と同様にして、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｒｅｓｉ
ｎ（樹脂）に、21,24Glaヒトオステオカルシンの４７位
から１位までの各構成アミノ酸に対応する保護アミノ酸
を順次カップリングさせた。各アミノ酸のα−アミノ基
の保護基としてはＦｍｏｃ基を、Ｔｙｒの水酸基の保護
基としてはｔＢｕ基を、Ａｒｇのグアニジノ基の保護基
としてはＭｔｒ基を、ＧｌｕおよびＡｓｐのカルボキシ
ル基の保護基としてはＯｔＢｕ基を、Ｈｉｓのイミダゾ
リル基の保護基としてはＴｒｔ基を、Ｃｙｓのメルカプ
ト基の保護基としてはｔＢｕ基を用いた。
ｎ（樹脂）に、21,24Glaヒトオステオカルシンの４７位
から１位までの各構成アミノ酸に対応する保護アミノ酸
を順次カップリングさせた。各アミノ酸のα−アミノ基
の保護基としてはＦｍｏｃ基を、Ｔｙｒの水酸基の保護
基としてはｔＢｕ基を、Ａｒｇのグアニジノ基の保護基
としてはＭｔｒ基を、ＧｌｕおよびＡｓｐのカルボキシ
ル基の保護基としてはＯｔＢｕ基を、Ｈｉｓのイミダゾ
リル基の保護基としてはＴｒｔ基を、Ｃｙｓのメルカプ
ト基の保護基としてはｔＢｕ基を用いた。
【００４７】合成方法についてはに従ったが、縮合反
応は３０〜４０分とした。また、各アミノ酸の導入反応
毎に微量のサンプリングを行い、ニンヒドリン反応を行
い、反応の進行を確認した。さらにペプチドシーケンサ
ーによりＮ末端５残基の確認を行った。
応は３０〜４０分とした。また、各アミノ酸の導入反応
毎に微量のサンプリングを行い、ニンヒドリン反応を行
い、反応の進行を確認した。さらにペプチドシーケンサ
ーによりＮ末端５残基の確認を行った。
【００４８】脱保護（ＴＭＳＢｒクリーベッジ法）
保護ペプチド樹脂のＮ末端のＦｍｏｃ基の脱保護をペプ
チドシンセサイザーで行って得たペプチド樹脂４００ｍ
ｇを秤量し、氷冷下、攪拌しながらチオアニソール１．
２ｍｌ、エタンジオール０．６ｍｌ、ｍ−クレゾール
０．２ｍｌ、ＴＦＡ７．５ｍｌ、ＴＭＳＢｒ１．３５ｍ
ｌを温度の上昇に注意しながらゆっくりと加えた。加え
終わった後も氷冷したまま２時間攪拌した。次に、前も
って冷やしておいたジエチルエーテル約５０ｍｌをペプ
チドの沈澱が出なくなるまでフラスコに加え、１時間攪
拌した。析出した沈澱を濾過しエーテルで洗浄した。次
に、残渣に２Ｎ酢酸を加えてペプチドを抽出し、ｐＨを
調整後、ゲル濾過を行い、得られた画分を凍結乾燥する
ことにより粗21,24Glaヒトオステオカルシン２０３ｍｇ
を得た。
チドシンセサイザーで行って得たペプチド樹脂４００ｍ
ｇを秤量し、氷冷下、攪拌しながらチオアニソール１．
２ｍｌ、エタンジオール０．６ｍｌ、ｍ−クレゾール
０．２ｍｌ、ＴＦＡ７．５ｍｌ、ＴＭＳＢｒ１．３５ｍ
ｌを温度の上昇に注意しながらゆっくりと加えた。加え
終わった後も氷冷したまま２時間攪拌した。次に、前も
って冷やしておいたジエチルエーテル約５０ｍｌをペプ
チドの沈澱が出なくなるまでフラスコに加え、１時間攪
拌した。析出した沈澱を濾過しエーテルで洗浄した。次
に、残渣に２Ｎ酢酸を加えてペプチドを抽出し、ｐＨを
調整後、ゲル濾過を行い、得られた画分を凍結乾燥する
ことにより粗21,24Glaヒトオステオカルシン２０３ｍｇ
を得た。
【００４９】逆相ＨＰＬＣによる21,24Glaヒトオステ
オカルシンの精製 得られた粗21,24Glaヒトオステオカルシン１０ｍｇを
０．１Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．０、０．５ｍｌ）に
溶解し、逆相ＨＰＬＣにより精製した。カラムは資生堂
（株）製、Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｃｋを用い、溶離液
は、Ａ液として０．１％ＴＦＡ／ＤＷ、Ｂ液として８０
％ＣＨ3 ＣＮ／（０．１％ＴＦＡ／ＤＷ）を用いて、
Ａ：Ｂ＝２：３（体積比）の条件下で溶出させた。
21,24Glaヒトオステオカルシンに相当する画分を分取
し、凍結乾燥して精製21,24Glaヒトオステオカルシンの
白色粉末５ｍｇ（収率５０％）を得た。
オカルシンの精製 得られた粗21,24Glaヒトオステオカルシン１０ｍｇを
０．１Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．０、０．５ｍｌ）に
溶解し、逆相ＨＰＬＣにより精製した。カラムは資生堂
（株）製、Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｃｋを用い、溶離液
は、Ａ液として０．１％ＴＦＡ／ＤＷ、Ｂ液として８０
％ＣＨ3 ＣＮ／（０．１％ＴＦＡ／ＤＷ）を用いて、
Ａ：Ｂ＝２：３（体積比）の条件下で溶出させた。
21,24Glaヒトオステオカルシンに相当する画分を分取
し、凍結乾燥して精製21,24Glaヒトオステオカルシンの
白色粉末５ｍｇ（収率５０％）を得た。
【００５０】精製21,24Glaヒトオステオカルシンの確
認 イ）分子量の測定 前記精製21,24Glaヒトオステオカルシン０．３ｍｇを炭
酸バッファー０．５ｍｌに溶解し、上記と同様のＨＰＬ
Ｃ条件で溶出し、同時に分子量マーカーとの比較を行
い、４５０ｎｍにおける赤外吸収（ＯＤ）を測定した。
合成21,24Glaヒトオステオカルシンは、分子量約６，０
００のところにピークが得られた。
認 イ）分子量の測定 前記精製21,24Glaヒトオステオカルシン０．３ｍｇを炭
酸バッファー０．５ｍｌに溶解し、上記と同様のＨＰＬ
Ｃ条件で溶出し、同時に分子量マーカーとの比較を行
い、４５０ｎｍにおける赤外吸収（ＯＤ）を測定した。
合成21,24Glaヒトオステオカルシンは、分子量約６，０
００のところにピークが得られた。
【００５１】ロ）硫酸バリウム吸着実験
前記精製21,24Glaヒトオステオカルシンを炭酸バッファ
ーに溶かし、この溶液０．５ｍｌに対しＢａＳＯ4 １ｍ
ｇを加え、４℃で１．５時間反応させた後、ＥＩＡ法に
より21,24Glaヒトオステオカルシンの残存率（ペプチド
残存率）を測定した。比較のため21,24Gluヒトオステオ
カルシンについても同様にしてＢａＳＯ4 の吸着を調べ
た。結果を図１に示す。
ーに溶かし、この溶液０．５ｍｌに対しＢａＳＯ4 １ｍ
ｇを加え、４℃で１．５時間反応させた後、ＥＩＡ法に
より21,24Glaヒトオステオカルシンの残存率（ペプチド
残存率）を測定した。比較のため21,24Gluヒトオステオ
カルシンについても同様にしてＢａＳＯ4 の吸着を調べ
た。結果を図１に示す。
【００５２】実施例３（17,21,24Gla ヒトオステオカル
シンの合成) １７位のアミノ酸の導入において、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ
（ＯｔＢｕ）に変えてＬ−Ｆｍｏｃ−Ｇｌａ（ＯｔＢ
ｕ）2 を用いるほかは実施例２と同様にして保護ペプチ
ド樹脂９００ｍｇを得、このうち４００ｍｇを用いて、
実施例２と同様にして脱保護し、逆相ＨＰＬＣにて精製
し、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する17,21,24Gl
a ヒトオステオカルシン１９７ｍｇを得た。
シンの合成) １７位のアミノ酸の導入において、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ
（ＯｔＢｕ）に変えてＬ−Ｆｍｏｃ−Ｇｌａ（ＯｔＢ
ｕ）2 を用いるほかは実施例２と同様にして保護ペプチ
ド樹脂９００ｍｇを得、このうち４００ｍｇを用いて、
実施例２と同様にして脱保護し、逆相ＨＰＬＣにて精製
し、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する17,21,24Gl
a ヒトオステオカルシン１９７ｍｇを得た。
【００５３】実施例４（ヒトオステオカルシン測定系の
標準物質としての性能評価） 抗体固定化ビーズの調製 ポリスチレン製ビーズ（直径６ｍｍ）をよく洗浄してか
ら、特願平１−３０００３号明細書記載の抗Ｎ20抗体２
０μｇ／ｍｌの濃度を有するＰＢＳ溶液中に４℃の温度
で１昼夜放置した後、ＰＢＳで洗浄し、１％牛血清アル
ブミン（ＢＳＡ）のＰＢＳ溶液中に、４℃の温度で１昼
夜放置してポストコーテイング処理をして、抗Ｎ20抗体
固定化ビーズを得た。
標準物質としての性能評価） 抗体固定化ビーズの調製 ポリスチレン製ビーズ（直径６ｍｍ）をよく洗浄してか
ら、特願平１−３０００３号明細書記載の抗Ｎ20抗体２
０μｇ／ｍｌの濃度を有するＰＢＳ溶液中に４℃の温度
で１昼夜放置した後、ＰＢＳで洗浄し、１％牛血清アル
ブミン（ＢＳＡ）のＰＢＳ溶液中に、４℃の温度で１昼
夜放置してポストコーテイング処理をして、抗Ｎ20抗体
固定化ビーズを得た。
【００５４】ＨＲＰ標識抗体の調製
先に出願した特願平１−３０００３号明細書の中で作成
したヒトオステオカルシンのＣ末端ペプチド（43Ａｒｇ
−49Ｖａｌ）に対するポリクローナル抗体〔抗Ｏｓｔ−
Ｃ（７）〕の２．０ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液１ｍｌに、
１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．２）１００μｌと、４０μ
ｇのペプシンを２０μｌの同緩衝液に溶解して加え、３
７℃、４時間反応させた。
したヒトオステオカルシンのＣ末端ペプチド（43Ａｒｇ
−49Ｖａｌ）に対するポリクローナル抗体〔抗Ｏｓｔ−
Ｃ（７）〕の２．０ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液１ｍｌに、
１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．２）１００μｌと、４０μ
ｇのペプシンを２０μｌの同緩衝液に溶解して加え、３
７℃、４時間反応させた。
【００５５】反応終了後、ＰＢＳにて平衡化したセファ
デックスＧ２５カラム（φ２ｃｍ×４５ｃｍ）を用いて
分離しＦ（ａｂ′）2 を採取した。Ｆ（ａｂ′）2 の１
ｍｇ／ｍｌ０．０１Ｍリン酸０．１５ＭＮａＣｌ（ｐＨ
７．４）溶液２ｍｌに、ＭＢＳ１０ｍｇ／ｍｌの濃度の
ジメチルホルムアミド溶液５０μｌを添加し、２５℃の
温度で３０分間反応させた。次いでセファデックスＧ２
５を充填したカラムを用い、０．１Ｍリン酸緩衝液
（０．１ＭＰＢ）（ｐＨ６．０）でゲル濾過を行い、マ
レイミド化抗体と未反応ＭＢＳとを分離した。
デックスＧ２５カラム（φ２ｃｍ×４５ｃｍ）を用いて
分離しＦ（ａｂ′）2 を採取した。Ｆ（ａｂ′）2 の１
ｍｇ／ｍｌ０．０１Ｍリン酸０．１５ＭＮａＣｌ（ｐＨ
７．４）溶液２ｍｌに、ＭＢＳ１０ｍｇ／ｍｌの濃度の
ジメチルホルムアミド溶液５０μｌを添加し、２５℃の
温度で３０分間反応させた。次いでセファデックスＧ２
５を充填したカラムを用い、０．１Ｍリン酸緩衝液
（０．１ＭＰＢ）（ｐＨ６．０）でゲル濾過を行い、マ
レイミド化抗体と未反応ＭＢＳとを分離した。
【００５６】一方、ＨＲＰの１０ｍｇ／ｍｌの０．１Ｍ
ＰＢ（ｐＨ６．５）溶液２ｍｌにＳ−アセチルメルカプ
ト無水コハク酸の６０ｍｇ／ｍｌジメチルホルムアミド
溶液１２０μｌを加え、２５℃で２時間反応させた。次
に、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を８０
０μｌ、０．１ＭＥＤＴＡ１６０μｌ、１Ｍヒドロキシ
ルアミン１．６ｍｌを加え、０℃で４分間反応させた。
その後、反応液をコロジオンバッグに入れ、０．１ＭＰ
Ｂ（ｐＨ６．０）、５ｍＭＥＤＴＡ含有溶液を用いて、
４℃で３日間透析し、チオール化ＨＲＰを得た。
ＰＢ（ｐＨ６．５）溶液２ｍｌにＳ−アセチルメルカプ
ト無水コハク酸の６０ｍｇ／ｍｌジメチルホルムアミド
溶液１２０μｌを加え、２５℃で２時間反応させた。次
に、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を８０
０μｌ、０．１ＭＥＤＴＡ１６０μｌ、１Ｍヒドロキシ
ルアミン１．６ｍｌを加え、０℃で４分間反応させた。
その後、反応液をコロジオンバッグに入れ、０．１ＭＰ
Ｂ（ｐＨ６．０）、５ｍＭＥＤＴＡ含有溶液を用いて、
４℃で３日間透析し、チオール化ＨＲＰを得た。
【００５７】次に、マレイミド化抗体２ｍｇとチオール
化ＨＲＰ４ｍｇとを混合し、コロジオンバッグを用いて
氷冷下に４〜１０ｍｇ／ｍｌの蛋白濃度になるまで濃縮
し、１５〜２０℃で一夜放置した。その液を、ウルトロ
ゲルＡＣＡ ４４（ＬＫＢ社）を充填したカラムでゲル
濾過し、ＨＲＰ標識抗Ｏｓｔ−Ｃ（７）抗体を得た。
化ＨＲＰ４ｍｇとを混合し、コロジオンバッグを用いて
氷冷下に４〜１０ｍｇ／ｍｌの蛋白濃度になるまで濃縮
し、１５〜２０℃で一夜放置した。その液を、ウルトロ
ゲルＡＣＡ ４４（ＬＫＢ社）を充填したカラムでゲル
濾過し、ＨＲＰ標識抗Ｏｓｔ−Ｃ（７）抗体を得た。
【００５８】サンドイッチ法ＥＩＡ測定系
で調製した抗Ｎ20抗体固定化ビーズ１個と、実施例２
で得た精製21,24Glaヒトオステオカルシンを０〜２０ｎ
ｇ／ｍｌの範囲で含有する１％ＢＳＡ含有０．０５ＭＴ
ＢＳ（ｐＨ８．０）２００μｌとで作成したＨＲＰ標
識抗体の１％ＢＳＡ含有０．０５ＭＴＢＳ（ｐＨ８．
０）溶液２００μｌとを、各試験管に添加して、２５℃
の温度で２時間インキュベートした。次に試験管内の溶
液を吸引除去した後、０．０５ＭＴＢＳ（ｐＨ８．０）
で洗浄してから、３，３′，５，５′−テトラメチルベ
ンジジン塩酸塩０．０２％およびＨ2 Ｏ2 ２．５ｍＭを
含有する０．１Ｍリン酸／クエン酸緩衝液（ｐＨ４．
３）を０．４ｍｌずつ各試験管に加え、２５℃の温度で
３０分間反応させた後、反応停止剤として１Ｎ硫酸水溶
液を１ｍｌずつ加えて酸素反応を停止させた。次いで、
この溶液を分光光度計を用いて４５０ｎｍの波長におけ
る吸収強度を測定した。
で得た精製21,24Glaヒトオステオカルシンを０〜２０ｎ
ｇ／ｍｌの範囲で含有する１％ＢＳＡ含有０．０５ＭＴ
ＢＳ（ｐＨ８．０）２００μｌとで作成したＨＲＰ標
識抗体の１％ＢＳＡ含有０．０５ＭＴＢＳ（ｐＨ８．
０）溶液２００μｌとを、各試験管に添加して、２５℃
の温度で２時間インキュベートした。次に試験管内の溶
液を吸引除去した後、０．０５ＭＴＢＳ（ｐＨ８．０）
で洗浄してから、３，３′，５，５′−テトラメチルベ
ンジジン塩酸塩０．０２％およびＨ2 Ｏ2 ２．５ｍＭを
含有する０．１Ｍリン酸／クエン酸緩衝液（ｐＨ４．
３）を０．４ｍｌずつ各試験管に加え、２５℃の温度で
３０分間反応させた後、反応停止剤として１Ｎ硫酸水溶
液を１ｍｌずつ加えて酸素反応を停止させた。次いで、
この溶液を分光光度計を用いて４５０ｎｍの波長におけ
る吸収強度を測定した。
【００５９】天然ヒトオステオカルシンおよび21,24Glu
ヒトオステオカルシンについても同様にして吸収強度を
測定した。その結果を図２に示す。図２から本発明の合
成21,24Glaヒトオステオカルシンが、天然ヒトオステオ
カルシンと免疫学的に同一の反応性を示すことがわか
る。
ヒトオステオカルシンについても同様にして吸収強度を
測定した。その結果を図２に示す。図２から本発明の合
成21,24Glaヒトオステオカルシンが、天然ヒトオステオ
カルシンと免疫学的に同一の反応性を示すことがわか
る。
【００６０】
【発明の効果】本発明は、反応収率の高い21,24Glaヒト
オステオカルシンおよび17,21,24Glaヒトオステオカル
シンの合成法ならびにヒトオステオカルシンの測定用標
準物質を提供することができる。
オステオカルシンおよび17,21,24Glaヒトオステオカル
シンの合成法ならびにヒトオステオカルシンの測定用標
準物質を提供することができる。
【００６１】
【配列表】配列番号：１
配列の長さ：４９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro
1 5 10 15
Arg Arg Gla Val Cys Gla Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His Ile
20 25 30 35
Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val
40 45 49
【００６２】配列番号：２
配列の長さ：４９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Gla Pro
1 5 10 15
Arg Arg Gla Val Cys Gla Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His Ile
20 25 30 35
Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val
40 45 49
【図１】本発明の合成21,24Glaヒトオステオカルシンの
硫酸バリウム吸着を示すグラフである。
硫酸バリウム吸着を示すグラフである。
【図２】本発明の合成21,24Glaヒトオステオカルシンの
免疫学的反応性を示すグラフである。
免疫学的反応性を示すグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 窪田 貴明
東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人
株式会社東京研究センター内
(72)発明者 岡田 昌宏
東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人
株式会社東京研究センター内
(72)発明者 細田 健治
東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人
株式会社東京研究センター内
(72)発明者 今泉 厚
東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人
株式会社東京研究センター内
Claims (6)
- 【請求項１】 下記配列番号１のアミノ酸配列を有する
合成21,24Glaヒトオステオカルシン。 （アミノ酸配列中、Gla はγ−カルボキシグルタミン酸
残基を示す。） - 【請求項２】 下記配列番号２のアミノ酸配列を有する
合成17,21,24Gla ヒトオステオカルシン。 （アミノ酸配列中、Gla はγ−カルボキシグルタミン酸
残基を示す。） - 【請求項３】 ヒトオステオカルシンのペプチド合成法
において、下記式（１） 【化１】 （式中、ｔＢｕはｔｅｒｔ−ブチル基を示す）で示され
る保護Ｌ−γ−カルボキシグルタミン酸またはその塩を
用いてγ−カルボキシグルタミン酸を導入する請求項１
記載の21,24Glaヒトオステオカルシンまたはその塩の製
造方法。 - 【請求項４】 ヒトオステオカルシンのペプチド合成法
において、下記式（１） 【化２】 （式中、ｔＢｕはｔｅｒｔ−ブチル基を示す）で示され
る保護Ｌ−γ−カルボキシグルタミン酸またはその塩を
用いてγ−カルボキシグルタミン酸を導入する請求項２
記載の17,21,24Gla ヒトオステオカルシンまたはその塩
の製造方法。 - 【請求項５】 ヒトオステオカルシンの免疫学的測定法
における標準物質用の請求項１記載の合成21,24Glaヒト
オステオカルシン。 - 【請求項６】 下記工程ａ〜ｈの組合せ 【化３】 （工程ａ〜ｈ中、Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメチルオ
キシカルボニル基を、ｔＢｕはｔ−ブチル基を、Ｂｚｌ
はベンジル基を示す）による請求項３記載の式（１）で
示される保護Ｌ−γ−カルボキシグルタミン酸の製造方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21325191A JPH0532697A (ja) | 1991-07-31 | 1991-07-31 | 合成ヒトオステオカルシンおよびその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21325191A JPH0532697A (ja) | 1991-07-31 | 1991-07-31 | 合成ヒトオステオカルシンおよびその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0532697A true JPH0532697A (ja) | 1993-02-09 |
Family
ID=16636012
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21325191A Withdrawn JPH0532697A (ja) | 1991-07-31 | 1991-07-31 | 合成ヒトオステオカルシンおよびその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0532697A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997038309A1 (en) * | 1996-04-10 | 1997-10-16 | Eisai Co., Ltd. | ANTI-Glu17-OSTEOCALCIN ANTIBODY |
| US6599940B2 (en) | 2000-09-13 | 2003-07-29 | Georgetown University | Synthesis of 2-hydroxymethylglutamic acid and congeners thereof |
| WO2008108395A1 (ja) * | 2007-03-06 | 2008-09-12 | Takara Bio Inc. | オステオカルシン含有抽出物の製造方法 |
-
1991
- 1991-07-31 JP JP21325191A patent/JPH0532697A/ja not_active Withdrawn
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997038309A1 (en) * | 1996-04-10 | 1997-10-16 | Eisai Co., Ltd. | ANTI-Glu17-OSTEOCALCIN ANTIBODY |
| US6599940B2 (en) | 2000-09-13 | 2003-07-29 | Georgetown University | Synthesis of 2-hydroxymethylglutamic acid and congeners thereof |
| WO2008108395A1 (ja) * | 2007-03-06 | 2008-09-12 | Takara Bio Inc. | オステオカルシン含有抽出物の製造方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 19981008 |