WO1997043232A1 - Neue substanzbibliothek und damit hergestellte supramolekulare komplexe - Google Patents

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Norbert Windhab
Gerhard Quinkert
Albert Eschenmoser
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    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C07K1/047—Simultaneous synthesis of different peptide species; Peptide libraries

Definitions

  • the present invention relates to a substance library, a method for its production, a method for the production of supramolecular complexes using this substance library and the use of the supramolecular complexes produced by means of the substance library and the use of the substance library itself.
  • Combinatorial strategies are important approaches in the search for new active substances, especially with regard to the discovery of lead structures and their optimization: ensembles of structurally related compounds are synthesized simultaneously and mostly automatically; the resulting mixtures (so-called libraries) contain hundreds, thousands or even millions of individual compounds in small quantities. If the effectiveness of a component is verified by screening in a mixture, the further work of the chemist is limited to the determination of identity, since the synthesis protocol is known.
  • Another object of the present invention is to provide supramolecular complexes which result from the combination of the molecular species contained in the substance library and from the binding interactions with the substrate molecule to be investigated.
  • Such substance libraries and such supramolecular complexes should be suitable for the production of active pharmaceutical ingredients, crop protection active ingredients, catalysts or for the diagnosis of diseases.
  • a substance library obtainable by coupling different or identical molecular species, which are preferably contained in a substance library, to a molecular pairing system.
  • substance library obtainable by coupling different or identical molecular species, which are preferably contained in a substance library, to a molecular pairing system.
  • supramolecular complexes can be produced by exposing the substance library to an interaction with a substrate and identifying and possibly isolating the supramolecular complex formed in the process.
  • the present invention accordingly also relates to the provision of a supramolecular complex produced in this way, which is suitable, for example, for the production of medicinal substances, crop protection agents, catalysts, for the diagnosis of diseases and the production of corresponding diagnosis kits.
  • the precursor of this supramolecular complex namely the substance library according to the invention, is also suitable in the same way for the production of medicinal substances, crop protection agents, catalysts and for the diagnosis of diseases, including for the production of the corresponding diagnosis kits.
  • Molecular species for example linearly constituted molecules such as peptides, in particular proteins, peptoids, linear oligo- or polysaccharides, nucleic acids and their analogues, or for example monomers such as heterocycles, in particular nitrogen heterocycles, or non-linearly constituted molecules such as branched oligo- or polysaccharides or also antibodies.
  • Supramolecular complex arises from the association of two or more molecular species that are held together by non-covalent forces. Pairing systems: Supramolecular systems of non-covalent interactions, which are characterized by selectivity, stability and reversibility and whose properties are preferably thermodynamic, such as. B. by temperature, pH, concentration. Examples are preferably pyranosyl-RNA, CNA, DNA, RNA, PNA.
  • Interactions are preferably hydrogen bonds, salt bridges, stacking, metal ligations, charge-transfer complexes and hydrophobic interactions.
  • Substance library Ensemble of structurally different compounds, preferably oligomeric or polymeric peptides, peptoids, saccharides, nucleic acids, esters, acetals or monomers such as heterocycles, lipids, steroids.
  • Substrate Molecules, preferably drugs and crop protection agents, metabolites, physiological messengers, derivatives of lead structures, substances that are produced in the human or animal body in the case of pathological changes or are produced to an increased extent, transition state analogs or peptides, in particular proteins, peptoids, linear Oligosaccharides or polysaccharides, nucleic acids and their analogues, or for example monomers such as heterocycles, in particular nitrogen heterocycles, or non-linearly constituted molecules such as branched oligosaccharides or polysaccharides or also antibodies and substance libraries, in addition to targets of pharmaceuticals, preferably receptors, voltage-dependent ion channels, transporters, transporters, enzymes and biosyntheses - Units of microorganisms.
  • Transition-state analogues Molecular synthetic species that are structurally similar to the assumed transition state of a chemical reaction, but in contrast are stable. Identification can include isolation or characterization of the supramolecular complex, but preferably differentiation based on the special properties of the supramolecular complex from substance libraries and substrate coupled to pairing systems, preferably different chromatographic, electrophoretic, spectroscopic or signal (labeling) behavior compared to non-complexed species or by covalent (chemical) fixation of the species involved in complex formation.
  • CNA cyclohexyl nucleooligo amide
  • the substance library according to the present invention is preferably characterized in that the pairing system consists of one longer and two shorter base strands, the two shorter strands being complementary to the longer strand at different points, but not complementary to one another, and in the case of base pairing with the longer strand between the shorter strands, a gap of at least one base remains, while in the area of this gap, according to their size, at least one base remains unpaired on the longer strand, with those bases of the two shorter strands that are at the beginning or at the end of the There are mating gaps linked to a molecular species via a linker, while at least one of the unpaired bases of the longer strand is linked to a molecular species via a linker.
  • Peptides of different properties can be controlled in pairs or, for example, by linking to mating oligonucleotide ends Triplets meet reversibly. In this way, due to the multitude of possible combinations, several different binding sites are generated in the experiment than peptides were synthesized.
  • This receptor thus reacts to the presence of the substrate: If this is equated to an antigen, the present system can be regarded in analogy as an "artificial immune system".
  • Fig. 1 shows a schematic diagram of the structure and sequence of the formation of such a receptor: a short peptide chain (as a library) is covalently attached to an oligonucleotide, for example, made up of 13 monomer units, via a linker unit. The same applies to the two End units of the short oligonucleotides proceeded from 6 monomer units.
  • the receptor After freezing the equilibrium, covalently cross-linking the mating partners, isolating and decomplexing, the receptor is obtained in free form.
  • a process for the production of supramolecular complexes has therefore been developed, characterized in that compound libraries are coupled to pairing systems.
  • the supramolecular complexes produced with the following methods under thermodynamic control and coupled under thermodynamic control are used when molecules or molecular areas are to be recognized.
  • the advantage is that the same libraries in combination can always solve new selection problems very quickly. The main ones are:
  • d. H. Drug design The described method generates highly selective supramolecular complexes which themselves serve as active substances or as models for the development of active substances, for example by binding to and thus stimulating or blocking pharmacological receptors.
  • the supramolecular complexes serve as receptors in drug development, since they can be used to create an interaction profile of the drugs.
  • the pyranosyl RNA is used as the pairing system (see FIG. 2), the production and properties of which are well known [p. Pitsch, S. Wendeborn, B. Jaun, A. Eschenmoser, Helv. Chim. Acta 1993, 76, 2161-2183].
  • the couplable phosphoramidites are prepared as described therein and the desired hexamer or tridecamer sequences are produced using an oligonucleotide synthesizer.
  • the tridecamer has the sequence 2 '- A ATTA AT * ATATAT, one hexamer has the sequence 2'-T * TAATT-4', the other hexamer has the sequence 2'-ATATAT * -4 ', where T * represents the linker nucleotide building block.
  • the linker nucleotide building block is synthesized from the uracil nucleoside using methods known from the literature: iodination [W.-W. Sy, synth. Cons. 1990, 20, 3391-3394], reaction with propargyl phthalimide, hydrogenation [KJ Gibson, SJ Benkovic, Nucleic Acids Res. 1987, 15, 6455-6467] provides the desired building block.
  • tetrapeptides are produced starting from commercially available amino acid monomers with a multiple peptide synthesizer, a cysteine residue being provided as the linker unit.
  • the library is divided into three portions and each is allowed to react with the two hexamer sequences or the tridecamer sequence in aqueous, buffered solution at room temperature to give the desired conjugates, which are purified by reverse phase chromatography [T. Zhu, S. Stein, Bioconjugate Chem. 1994, 5, 31 2-315].
  • the pairing of the complementary units is demonstrated by the decrease in UV absorbance in the pairing experiment.
  • the synthesis of the CNA oligomer was carried out analogously to the peptide or oligonucleotide synthesis, by stepwise incorporation of individual building blocks on a solid phase. The necessary reagents were added in excess and unreacted amounts were removed by simple washing steps.
  • a polyoxyethylene (POE) -polystyrene copolymer (Tentagel S HMB, 0.23 mmol / g) was used as the polymer carrier, which has good swelling properties both in aqueous solution and in organic solvents.
  • the aminoethyl functions of the polymer were derivatized with a hydroxymethylbenzoyl (HMB) linker; the first building block was loaded using a 5-fold excess according to the symmetrical anhydride method (addition of 2.5 eq DIC) and by adding the acylation catalyst DMAP (2.5 eq) within 20 h in DCM. The loading obtained was 0.17 mmol / g.
  • the Boc protecting group of the amino function was removed with 50% TFA in DCM, then the resin was neutralized with 1 M DIEA / DMF. The subsequent cycles consisted of repetitive coupling of the next monomer and elimination of the Boc protective group.
  • the couplings were carried out after preactivation of the monomer unit (3 eq.) With the activation reagent HATU (3 eq.) In DMF (40 ⁇ l) and with the addition of 1 M DIEA / DMF (6 eq.) And 2 M lutidine / DMF ( 12 eq.). The coupling times were 3-4 h at room temperature. After four coupling cycles, the N-terminal Boc protective group was cleaved and the pentamer was cleaved from the resin with 2 N NaOH in methanol within 15 min. The cleavage solution was filtered off from the resin and kept at 55 ° C. for 2 hours.
  • the CNA pentamer described above was extended by a dipeptide library at the N-terminus prior to cleavage from the resin.
  • the sequence is XO-CNA (AATAT).
  • X represents a mixing position in which the five L-amino acids alanine, aspartic acid, leucine, lysine and serine are varied.
  • Boc-Lys (Fmoc) -OH was coupled to the Boc-deprotected CNA pentamer CNA (AATAT) after preactivation of the amino acid building block (6 eq.) With the activation reagent HATU (6 eq.) In DMF and with the addition of 1 M DIEA / DMF (7 eq.). The coupling time was 3 hours. The X position was introduced using the split resin method. After the N-terminal Boc protective group had been split off, the amount of resin (5 mg) was mixed with 100 // I DMF: DCM (1: 1) and divided into five equally large portions of 20 ⁇ each. The coupling of the individual amino acids was carried out in parallel in separate reaction vessels each with about 1 mg of oligomer resin.
  • Boc-protected amino acids Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OFm) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Ser-OH and Boc-Lys (Fmoc) -OH were in 50-fold excess after preactivation coupled with HATU (50 eq.) and with the addition of 1 M DIEA / DMF (100 eq.) for 3 h at room temperature. After the N-terminal Boc protective groups had been split off, the Fmoc protective groups were removed with 40% piperidine / DMF (20 min). The peptide-CNA-oligomer conjugates were each cleaved from the resin with 2 N NaOH in methanol within 15 min.
  • the cleavage solution was filtered off from the resin and kept at 55 ° C. for 2 hours. After neutralization with 2 N HCl, the purification was carried out using C18-RP-HPLC (Hibar finished acid 250-4, RP-18, 5 ⁇ m) with gradient elution (1 ml / min) from 10% B to 40% B in 30 min (solvent A: water + 0.1% TFA, B: acetonitrile + 0.1% TFA).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Substanzbibliothek, ein Verfahren zu deren Herstellung, ein Verfahren zur Herstellung von supramolekularen Komplexen unter Verwendung dieser Substanzbibliothek und die Verwendung der mittels der Substanzbibliothek hergestellten supramolekularen Komplexe sowie die Verwendung der Substanzbibliothek selbst.

Description

Neue Substanzbibliothek und damit hergestellte supramolekulare Komplexe
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Substanzbibliothek, ein Verfahren zu deren Herstellung, ein Verfahren zur Herstellung von supramolekularen Komplexen unter Verwendung dieser Substanzbibliothek und die Verwendung der mittels der Substanzbibliothek hergestellten supramolekularen Komplexe sowie die Verwendung der Substanzbibliothek selbst.
Kombinatorische Strategien sind wichtige Ansätze in der Suche nach neuen Wirkstoffen, besonders im Hinblick auf die Auffindung von Leitstrukturen sowie deren Optimierung: Man synthetisiert Ensembles strukturell verwandter Verbindungen simultan und meist automatisiert; die hierbei anfallenden Gemische (sog. Bibliotheken) enthalten Hunderte, Tausende oder gar Millionen von Einzelverbindungen in jeweils geringer Menge. Wird im Gemisch die Wirksamkeit einer Komponente durch Screening nachgewiesen, so beschränkt sich die weitere Tätigkeit des Chemikers auf die Bestimmung der Identität, da das Syntheseprotokoll ja bekannt ist.
Waren es anfangs vornehmlich Substanzbibliotheken linear konstituierter Moleküle wie Peptide [K.S. Lam, S.E. Salmon, E.M. Hersh, V.J. Hruby, W.M. Kazmierski, R.J. Knapp, Nature 1991 , 354, 82-84], so sind es neuerdings die vor allem im Wirkstoffbereich wichtigen "kleinen" Moleküle wie Heterocyclen [L.A. Thompson, J.A. Ellman, Chem. Rev. 1996, 96, 555-600], die im Mittelpunkt des Interesses stehen. Ziel ist die Erzeugung von molekularer Diversität, um die Auffindung von Leitstrukturen bzw. deren Optimierung zu beschleunigen.
Das Charakteristikum der herkömmlichen kombinatorischen Chemie ist, daß die Synthese unter kinetischer Kontrolle abläuft und daß die Variation durch Synthese von der Selektion getrennt ist. Dies betrifft die in vitro-Evolution von RNA-Aptameren [J.R. Lorsch, J.W. Szostak, Nature 1994, 371 , 31 -36.] ebenso wie die Rezeptorsuche mit kombinatorischen Methoden [Y. Cheng, T. Suenaga, W.C. Still, J. Am. Chem. Soc. 1996, 1 18, 1813-1814], dabei wurden zwei kurze Peptidbibliotheken an einem Steroidgerüst aufgebaut und damit irreversibel verknüpft.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, durch Bereitstellung einer neuen Art von Substanzbibliothek die Zahl der Bindungsstellen für die mittels einer Substanzbibliothek auf deren Bindungseigenschaften untersuchten Liganden bzw. Substratmoleküle durch reversible Kombination jeweils zweier oder mehrerer gleicher oder verschiedener in der Substanzbibliothek enthaltenen molekularen Spezies gegenüber herkömmlichen Substanzbibliotheken um Größenordnungen zu erhöhen, wobei die Kombination der in der Substanzbibliothek enthaltenen molekularen Spezies erst in Gegenwart des zu untersuchenden Substratmoleküls über die entsprechenden bindenden Wechselwirkungen mit den molekularen Spezies erfolgen soll.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, supramolekulare Komplexe bereitzustellen, welche durch die Kombination der in der Substanzbibliothek enthaltenen molekularen Spezies und durch die bindenden Wechselwirkungen mit dem zu untersuchenden Substratmolekül entstehen.
Derartige Substanzbibliotheken und solche supramolekularen Komplexe sollten sich zur Herstellung von Arzneiwirkstoffen, Pflanzenschutzwirkstoffen, Katalysatoren oder zur Diagnose von Krankheiten eignen.
Die eingangs gestellte Aufgabe wird gelöst durch eine Substanzbibliothek, erhältlich durch Koppelung von verschiedenen oder gleichen molekularen Spezies, welche vorzugsweise in einer Substanzbibliothek enthalten sind, an ein molekulares Paarungssystem. Mittels der Substanzbibliothek gemäß der vorliegenden Erfindung lassen sich supramolekulare Komplexe dadurch herstellen, daß man die Substanzbibliothek einer Wechselwirkung mit einem Substrat aussetzt und den dabei gebildeten supramolekularen Komplex identifiziert und gegebenenfalls isoliert.
Die vorliegende Erfindung betrifft demgemäß auch die Bereitstellung eines so hergestellten supramolekularen Komplexes, der sich beispielsweise zur Herstellung von Arzneistoffen, Pflanzenschutz Wirkstoffen, Katalysatoren, zur Diagnose von Krankheiten sowie der Herstellung von entsprechenden Diagnose- Kits eignet.
In gleicher Weise ist auch die Vorstufe dieser supramolekularen Komplexes, nämlich die erfindungsgemäße Substanzbibliothek zur Herstellung von Arzneistoffen, Pflanzenschutzwirkstoffen, Katalysatoren und zur Diagnose von Krankheiten einschließlich zur Herstellung der entsprechenden Diagnose-Kits geeignet.
Im folgenden werden die vorgenannten oder nachfolgend zur Erläuterung der Erfindung sowie in den Patentansprüchen verwendeten allgemeinen Begriffe definiert.
Molekulare Spezies: Beispielsweise linearkonstituierte Moleküle wie Peptide, insbesondere Proteine, Peptoide, lineare Oligo- oder Polysaccharide, Nukleinsäuren und deren Analoga, oder beispielsweise Monomere wie Heterocyclen, insbesondere Stickstoffheterocyclen, oder nichtlinearkonstituierte Moleküle wie verzweigte Oligo- oder Polysaccharide oder auch Antikörper.
Supramolekularer Komplex: Entsteht durch Assoziation von zwei oder mehreren molekularen Spezies, die durch nicht-kovalente Kräfte zusammengehalten werden. Paarungssysteme: Supramolekulare Systeme nicht-kovalenter Wechselwirkungen, die durch Selektivität, Stabilität und Reversibilität gekennzeichnet sind und deren Eigenschaften bevorzugt thermodynamisch, wie z. B. durch Temperatur, pH-Wert, Konzentration, beeinflußt werden. Beispiele sind bevorzugt Pyranosyl-RNA, CNA, DNA, RNA, PNA.
Wechselwirkungen sind bevorzugt Wasserstoffbrücken, Salzbrücken, Stapelung ("Stacking"), Metalligandierungen, Charge-Transfer-Komplexe und hydrophobe Wechselwirkungen.
Substanzbibliothek: Ensemble von sich strukturell unterscheidenden Verbindungen, bevorzugt oligomere oder polymere Peptide, Peptoide, Saccharide, Nucleinsäuren, Ester, Acetale oder Monomere wie Heterocyclen, Lipide, Steroide.
Substrat: Moleküle, bevorzugt Arzneistoffe und Pflanzenschutzwirkstoffe, Metaboliten, physiologische Botenstoffe, Derivate von Leitstrukturen, Substanzen, die im menschlichen oder tierischen Körper im Fall von krankhaften Veränderungen produziert oder im erhöhten Maß produziert werden, Übergangszustandanaloga oder auch Peptide, insbesondere Proteine, Peptoide, lineare Oligo- oder Polysaccharide, Nukleinsäuren und deren Analoga, oder beispielsweise Monomere wie Heterocyclen, insbesondere Stickstoffheterocyclen, oder nichtlinearkonstituierte Moleküle wie verzweigte Oligo- oder Polysaccharide oder auch Antikörper sowie Substanzbibliotheken, zudem Angriffspunkte von Pharmaka, vorzugsweise Rezeptoren, spannungsabhängige lonenkanäle,Transporter, Enzyme und Biosynthese- Einheiten von Mikroorganismen.
Übergangszustandanaloga: Molekulare synthetische Spezies, die dem anzunehmenden Übergangszustand einer chemischen Reaktion strukturell ähnlich, aber im Gegensatz dazu stabil sind. Identifizierung kann Isolierung oder Charakterisierung des supramolekularen Komplexes beinhalten, bevorzugt aber Unterscheidung anhand der besonderen Eigenschaften des supramolekularen Komplexes aus an Paarungssystemen gekoppelten Substanzbibliotheken und Substrat, bevorzugt unterschiedliches chromatographisches, elektrophoretisches, spektroskopisches oder Signal- (Markierungs-) Verhalten im Vergleich zu nicht-komplexierten Spezies oder durch kovalente (chemische) Fixierung der an der Komplexbildung beteiligten Spezies.
CNA: Cyclohexylnucleooligo-Amid; stellt eine synthetische Variante der DNA- Struktur dar, bei welcher das Phosphat-Zucker-Rückgrat durch 2-(3- AminocyclohexyD-ethansäureeinheiten ersetzt ist, wobei die Einheiten peptidartig miteinander verknüpft sind und die 3-Amino-Cyclohexylsubstituenten in Position 4 jeweils mit einer Nukleobase versehen sind.
Vorzugsweise zeichnet sich die Substanzbibliothek gemäß der vorliegenden Erfindung dadurch aus, daß das Paarungssystem aus einem längeren und zwei kürzeren Basensträngen besteht, wobei die beiden kürzeren Stränge an unterschiedlichen Stellen komplementär zum längeren Strang, jedoch zueinander nicht komplementär sind und wobei im Falle der Basenpaarung mit dem längeren Strang zwischen den kürzen Strängen eine Lücke von wenigstens einer Base verbleibt, während im Bereich dieser Lücke entsprechend deren Größe auf dem längeren Strang mindestens eine Base ungepaart bleibt, wobei jeweils diejenigen Basen der beiden kürzeren Stränge, die sich am Anfang bzw. am Ende der Paarungslücke befinden, über einen Linker mit jeweils einer molekularen Spezies verknüpft sind, während mindestens eine der ungepaarten Basen des längeren Stranges mit einer molekularen Spezies über einen Linker verknüpft ist.
Peptide unterschiedlicher Eigenschaften können beispielsweise durch Verknüpfung mit paarenden Oligonucleotid-Enden kontrolliert zu Zweier- oder Dreiergruppen reversibel zusammentreten. Damit werden im Experiment durch die Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten um Größenordnungen mehr verschiedene Bindungsstellen erzeugt, als Peptide synthetisiert wurden.
Die Verwirklichung des Prinzips der kombinatorischen Variation und Selektion unter thermodynamischer Kontrolle sowie deren Verknüpfung stellt einen elementaren Technologiesprung in der kombinatorischen Methodik dar: Erst in Gegenwart des Substrats bildet sich durch Kombination der zugehörige Rezeptor.
Dieser Rezeptor reagiert somit auf die Gegenwart des Substrats: Setzt man dieses einem Antigen gleich, so kann das vorliegende System in Analogie als "künstliches Immunsystem" betrachtet werden.
Die Natur hat eine bemerkenswerte Anzahl von Molekülen hervorgebracht, welche die komplexen Prozesse der lebenden Organismen ausführen - von der Immunantwort und Katalyse bis zur Signalübertragung. Dabei greift sie auf eine breite kombinatorische Bibliothek von Vorläufermolekülen zurück und überprüft diese auf die gewünschten Eigenschaften. Das wahrscheinlich bedeutendste Beispiel für diese Strategie stellt das Immunsystem dar, welches eine enorme molekulare Diversität erzeugen kann und diese auf hochaffine und selektive Rezeptoren für fremde Antigene durchsucht. Auch das Zusammentreten an sich nicht oder nur schwach bindender Moleküle zu einem stabilen Bindungskomplex ist ein in der Natur verbreitetes Prinzip (Heteromere [D.E. Clapham, Nature 1996, 379, 297-299]) , dessen Bedeutung für die Anwendung in der kombinatorischen Chemie noch nicht erkannt wurde.
Fig 1 . zeigt schematisiert den Aufbau und den Ablauf der Bildung eines solchen Rezeptors: An einem beispielsweise aus 13 Monomerbausteinen aufgebauten Oligonucleotid wird über eine Linkereinheit eine kurze Peptidkette (als Bibliothek) am Mittelbaustein kovalent angebunden. Analog wird an den beiden Endeinheiten der kurzen Oligonucleotide aus 6 Monomereinheiten vorgegangen.
Wird nun diesen drei Einheiten das Substrat (Ellipse) angeboten, so setzt ein Wettbewerb um die beste Bindung der Peptidteile an das Substrat ein: Die Paarung zwischen den Oligonucleotiden sorgt für räumliche Annäherung der peptidischen Teile. Entscheidend ist die Reversibilität der Einzelschritte, wodurch die einzelnen Peptidbereiche solange ausgetauscht werden, bis der stabilste Komplex gefunden wurde. Dieser unter thermodynamischer Kontrolle ablaufende Vorgang entspricht einem selbsttätigen experimentellen „Molecular Modelling". In einem solchen Experiment wird tatsächlich die Gesamtheit der möglichen transient auftretenden Kombinationen der drei Bibliotheken der Selektion unterworfen. Dieser Austauschvorgang ist temperaturabhängig, d. h. bei höherer Temperatur werden die einzelnen Stränge öfter ausgewechselt, zugleich werden aber auch die Wechselwirkungen der Peptidteile mit dem Substrat schwächer.
Nach Einfrieren des Gleichgewichts, kovalentes Cross-Linking der Paarungspartner, Isolierung und Dekomplexierung wird der Rezeptor in freier Form erhalten.
Es wurde daher ein Verfahren zur Herstellung supramolekularer Komplexe ausgearbeitet, dadurch gekennzeichnet, daß man Verbindungsbibliotheken an Paarungssysteme koppelt.
Die mit den nachfolgenden Verfahren unter thermodynamischer Kontrolle hergestellten und gekoppelt unter thermodynamischer Kontrolle selektionierten supramolekularen Komplexe kommen dann zum Einsatz, wenn Moleküle oder Molekülbereiche erkannt werden sollen. Der Vorteil liegt darin, daß die immer gleichen Bibliotheken in Kombination immer neue Selektionsprobleme sehr schnell lösen können. Diese sind vor allem:
a) Molekulare Erkennung biologisch relevanter Substanzen, d. h. Diagnostik. Gerade die Entwicklung diagnostischer Methoden muß mit der Vielfalt der zu erkennenden Substrate, wie Metaboliten oder z. B. sich ständig mutierenden Erregern, Schritt halten, sodaß der Nutzen dieses Verfahrens offensichtlich wird.
b) Molekulare Erkennung biologisch relevanter Substanzen, d. h. Drug Design. Das beschriebene Verfahren erzeugt hochselektive supramolekulare Komplexe, die selbst als Wirkstoffe oder als Modelle für die Wirkstoffentwicklung dienen, indem sie zum Beispiel an pharmakologische Rezeptoren binden und damit stimulieren oder blockieren. Auf der anderen Seite dienen die supramolekularen Komplexe als Rezeptoren in der Wirkstoffentwicklung, da mit ihrer Hilfe ein Wechselwirkungsprofil der Wirkstoffe erstellt werden kann.
c) Thermodynamisch kontrollierte Konstitution von katalytisch aktiven supramolekularen Komplexen z. B. dadurch, daß man im Sinne der Verwendung als katalytischer Antikörper [L.C. Hsieh-Wilson, X.-D. Xiang, P.G. Schultz, Acc. Chem. Res. 1996, 29, 164-170] Übergangszustandanaloga als Substrate anbietet.
Durchführungsbeispiel 1
Als Paarungssystem wird die Pyranosyl-RNA verwendet (s. Fig. 2), deren Herstellung und Eigenschaften wohlbekannt sind [S. Pitsch, S. Wendeborn, B. Jaun, A. Eschenmoser, Helv. Chim. Acta 1993, 76, 2161-2183]. Ausgehend von D-Ribose und den Nucleobasen Adenin und Thymin werden wie darin beschrieben die kopplungsfähigen Phosphoramidite hergestellt und mit einem Oligonucleotidsγnthesizer die gewünschten Hexamer- bzw. Tridecamer- Sequenzen hergestellt. Das Tridecamer hat die Sequenz 2' - A ATTA AT* ATATAT, ein Hexamer hat die Sequenz 2'-T*TAATT-4', das andere Hexamer hat die Sequenz 2'-ATATAT*-4', wobei T* den Linker- Nucleotidbaustein darstellt. Der Linker-Nucleotidbaustein wird nach literaturbekannten Methoden ausgehend vom Uracil-Nucleosid synthetisiert: Jodierung [W.-W. Sy, Synth. Comun. 1990, 20, 3391 -3394], Umsetzung mit Propargylphthalimid, Hydrierung [K.J. Gibson, S.J. Benkovic, Nucleic Acids Res. 1987, 1 5, 6455-6467] liefert den gewünschten Baustein. Hydrazinolyse und Jodacetylierung des Oligonucleotides erfolgt wie in der Literatur beschrieben [T. Zhu, S. Stein, Bioconjugate Chem. 1994, 5, 31 2-315]. Als Verbindungs¬ bibliotheken werden Tetrapeptide ausgehend von kommerziell erhältlichen Aminosäuremonomeren mit einem multiplen Peptidsynthesizer hergestellt, wobei N-terminal als Linker-Einheit ein Cysteinrest vorgesehen wird. Man teilt die Bibliothek in drei Portionen und läßt in wäßriger, gepufferter Lösung bei Raumtemperatur jeweils mit den zwei Hexamer-Sequenzen bzw. der Tridecamer-Sequenz zu den gewünschten Konjugaten reagieren, die mittels Reverse Phase-Chromatographie gereinigt werden [T. Zhu, S. Stein, Bioconjugate Chem. 1994, 5, 31 2-315]. Die Paarung der komplementären Einheiten wird anhand der Abnahme der UV-Extinktion im Paarungsexperiment nachgewiesen.
Durchführungsbeispiel 2
Festphasensynthese eines CNA-Pentamers (Fig. 4)
Die Synthese des CNA-Oligomers erfolgte analog zur Peptid- oder Oligonucleotidsynthese, durch schrittweisen Einbau einzelner Bausteine an fester Phase. Dabei wurden die notwendigen Reagenzien im Überschuß zugesetzt und nicht umgesetzt Mengen durch einfache Waschschritte wieder entfernt. Als polymerer Träger wurde ein Polyoxyethylen-(POE)-Polystyrol- Copolymer (Tentagel S HMB, 0,23 mmol/g) verwendet, das sowohl in wäßriger Lösung als auch in organischen Lösungsmitteln gute Quelleigenschaften besitzt. Die Aminoethylfunktionen des Polymers waren mit einem Hydroxymethyl- benzoyl-(HMB)-Linker derivatisiert; die Beladung mit dem ersten Baustein erfolgte unter Verwendung eines 5-fachen Überschusses nach der Methode des symmetrischen Anhydrids (Zugabe von 2,5 eq DIC) und durch Zusatz des Acylierungskatalysators DMAP (2,5 eq) innerhalb von 20 h in DCM. Die erhaltene Beladung betrug 0, 1 7 mmol/g. Die Boc-Schutzgruppe der Aminofunktion wurde mit 50 % TFA in DCM abgespalten, anschließend wurde das Harz mit 1 M DIEA/DMF neutralisiert. Die nachfolgenden Zyklen bestanden aus repetitiver Kupplung des nächsten Monomeren und Abspaltung der Boc- Schutzgruppe. Die Kupplungen erfolgten nach Voraktivierung des Monomer- Bausteins (3 eq.) mit dem Aktivierungsreagenz HATU (3 eq.) in DMF (40 μl) und unter Zusatz von 1 M DIEA/DMF (6 eq.) und 2 M Lutidin/DMF (12 eq.). Die Kupplungszeiten betrugen 3-4 h bei Raumtemperatur. Nach vier Kupplungszyklen wurden die N-terminale Boc-Schutzgruppe abgespalten und das Pentamer mit 2 N NaOH in Methanol innerhalb von 15 min vom Harz gespalten. Die Abspaltungslösung wurde vom Harz abfiltriert und 2 Std. bei 55 °C gehalten. Nach Neutralisation mit 2 N HCI erfolgte die Aufreinigung mit C18-RP-HPLC (Hibar Fertigsäule 250-4, RP-18,5 /vm) mit Gradientenelution (1 ml/min) von 10 % auf 40 % B in 30 min (Lösungsmittel A: Wasser + 0,1 % TFA, B: Acetonitril + 0, 1 % TFA).
Die Synthese von CNA(AATAT) wurde mit 10 mg (1 ,7 //mol) Tentagel-HMB- Harz durchgeführt, das mit (S)-CNA-Thymin-Monomerbaustein beladen war. Es handelte sich ausschließlich um CNA-Bausteine mit S-Konfiguration. Die Abfolge der Sequenz von links nach rechts entspricht der in der Peptidchemie üblichen Schreibweise von N- zum C-Terminus.
CNA (AATAT): HPLC : Rt = 14,30 min; UV: λmax = 264 nm; ESI-MS: [M + H] + calc 1362,0, [M -f 2H]2 + calc 681 ,0; [M + H] + eχp 1361 ,8, [M + 2H]2 + eχp 681 ,5.
Nach Entsalzung des CNA-Pentamers CNA (AATAT) wurden auf einem Perkin Eimer Lambda 2 UV-VIS Spektrometer die temperaturabhängigen Extinktionen bei 265 nm bei sechs verschiedenen Konzentrationen über einen Bereich von 0 bis 80°C gemessen (1 ,5-50 μM in TrisHCI Puffer bei pH 7,0). Die erste Ableitung dieser reversiblen, sigmoiden Umwandlungskurven ergibt die Schmelztemperatur (Tm = 42°C bei 13 μM) (Fig. 5).
Festphasensynthese eines Peptid-CNA-Konjugates
Das oben beschriebene CNA-Pentamer wurde vor der Abspaltung vom Harz um eine Dipeptidbibliothek am N-Terminus verlängert. Die Sequenz lautet XO-CNA( AATAT). X stellt eine Mischposition dar, in der die fünf L- Aminosäuren Alanin, Asparaginsäure, Leucin, Lysin und Serin variiert werden. O stellt eine definierte Position dar, wobei für diese Subbibliothek 0 = L-Lysin gewählt wurde. Die Kupplung von Boc-Lys(Fmoc)-OH an das Boc-entschützte CNA- Pentamer CNA(AATAT) erfolgte nach Voraktivierung des Aminosäure-Bausteins (6 eq.) mit dem Aktivierungsreagenz HATU (6 eq.) in DMF und unter Zusatz von 1 M DIEA/DMF (7 eq.). Die Kupplungszeit betrug 3 h. Die Einführung der X- Position erfolgte nach der Split-Resin-Methode. Nach Abspaltung der N- terminalen Boc-Schutzgruppe wurde die Harzmenge (5 mg) mit 100 //I DMF:DCM (1 : 1 ) versetzt und in fünf gleichgroße Portionen zu je 20 μ\ aufgeteilt. Die Kupplung der einzelnen Aminosäuren erfolgte parallel in separaten Reaktionsgefäßen mit je ca. 1 mg Oligomerharz. Die einzelnen Boc- geschützten Aminosäuren, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OFm)-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Ser-OH und Boc-Lys(Fmoc)-OH wurden in 50-fachem Überschuß nach Voraktivierung mit HATU (50 eq.) und unter Zugabe von 1 M DIEA/DMF (100 eq.) 3 h bei Raumtemperatur gekuppelt. Nach Abspaltung der N-terminalen Boc-Schutzgruppen wurde die Fmoc-Schutzgruppen mit 40 % Piperidin/DMF (20 min) entfernt. Die Peptid-CNA-Oligomerkonjugate wurden jeweils mit 2 N NaOH in Methanol innerhalb von 15 min vom Harz gespalten. Die Abspaltungslösung wurde vom Harz abfiltriert und 2 Std. bei 55 °C gehalten. Nach Neutralisation mit 2 N HCI erfolgte die Aufreinigung mit C18-RP-HPLC (Hibar Fertigsäure 250-4, RP-18, 5 μm) mit Gradientenelution (1 ml/min) von 10 % B auf 40 % B in 30 min (Lösungsmittel A: Wasser + 0, 1 % TFA, B: Acetonitril + 0, 1 % TFA).
HPLC: Ala-Lys-CNA(AATAT)Rt = 15,47 min
Asp-Lys-CNA(AATAT)Rt = 15,30 min
Leu-Lys-CNA(AATAT)Rt - 1 6,08 min
Lys-Lys-CNA(AATAT)Rt = 1 5,34 min
Ser-Lys-CNA(AATAT)Rt = 15,29 min
ESI-MS: Ala-Lys-CNA(AATAT) [M + H] + calc 1561 ,6; [M + H] + βχp 1561 ,4
Asp-Lys-CNA(AATAT) [M + H] + calc 1 605,7; [M + H] + βχp 1605,3 Leu-Lys-CNA(AATAT) [M + H] + calc 1 603,8; fM + H] + eχp 1603,4 Lys-Lys-CNA(AATAT) [M + H] + ca|c 1619,3; [M + H] + eχp 1 619,0 Ser-Lys-CNA(AATAT) [M + H] + calc 1577,7; [M + H] + βχp 1578,7
Nach Charakterisierung der Einzelkomponenten wurden die HPLC-Fraktionen vereinigt. Nach Entsalzung der Peptidbibliotheks-CNA-Oligomeren XLys-CNA(AATAT) wurden auf einem Perkin Eimer Lambda 2 UV-VIS Spektrometer die temperaturunabhängigen Extinktionen bei 265 nm bei 50 μM über einen Bereich von 0-60°C gemessen (in TrisHCI Puffer bei pH 7,0). Die erste Ableitung dieser Temperaturkurve ergibt die Schmelztemperatur (Tm = 7°C bei 50 μM) (Fig. 6). Die UV-Spektren von XLys-CNA(AATAT) bei 0°C und 60°C unterscheiden sich in qualitativ gleicher Weise wie das Pentamer ohne Bibliothek CNA(AATAT). Die Wellenlänge des Absorptionsmaximums verschiebt sich von 261 ,4 nm (E = 0,3427) bei 0°C zu 263,8 nm (E = 0,3626) bei 60°C und belegt damit die Existenz der supramolekularen Komplexe, d.h. einer äquilibrierenden kombinatorischen Bibliothek (Fig. 7.).
Hierbei bedeuten
Boc tert.-Butyloxycarbonyl
DCM Dichlormethan
DIC Diisopropyl-Carbodiimid DIEA Diisopropylethylamin
DMAP Dimethylaminopyridin
DMF Dimethylformamid
Fmoc Fluorenylmethyloxycarbonyl
HATU O-[7-Azabenzotriazol-1 -yl]-1 , 1 ,3,3-
Tetramethyluroniumhexafluorophosphat
TFA Trifluoressigsäure

Claims

Patentansprüche:
1 . Substanzbibliothek, erhältlich durch Koppelung von verschiedenen oder gleichen molekularen Spezies an ein molekulares Paarungssystem.
2. Substanzbibliothek nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die molekularen Spezies in einer Substanzbibliothek enthalten sind.
3. Substanzbibliothek nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Paarungssystem eine Nukleinsäure ist.
4. Substanzbibliothek nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Paarungssystem eine DNA ist.
5. Substanzbibliothek nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Paarungssystem eine RNA ist.
6. Substanzbibliothek nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Paarungssystem eine Pyranosyl-RNA ist.
7. Substanzbibliothek nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Paarungssystem eine PNA ist.
8. Substanzbibliothek nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Paarungssystem eine CNA ist.
9. Substanzbibliothek nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die molekularen Spezies linearkonstituierte Moleküle sind.
10. Substanzbibliothek nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die molekularen Spezies Peptide sind.
1 1 . Substanzbibliothek nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die molekularen Spezies Peptoide sind.
12. Substanzbibliothek nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die molekularen Spezies Oligo- oder Polysaccharide sind.
13. Substanzbibliothek nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die molekularen Spezies Nukleinsäuren oder deren Analoga sind.
14. Substanzbibliothek nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die molekularen Spezies Monomere sind.
15. Substanzbibliothek nach einem oder mehreren der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Paarungssystem aus einem längeren und zwei kürzeren Basensträngen besteht, wobei die beiden kürzeren Stränge an unterschiedlichen Stellen komplementär zum längeren Strang, jedoch zueinander nicht komplementär sind und wobei im Falle der Basenpaarung mit dem längeren Strang zwischen den kürzen Strängen eine Lücke von wenigstens einer Base verbleibt, während im Bereich dieser Lücke entsprechend deren Größe auf dem längeren Strang mindestens eine Base ungepaart bleibt, wobei jeweils diejenigen Basen der beiden kürzeren Stränge, die sich am Anfang bzw. am Ende der Paarungslücke befinden, über einen Linker mit jeweils einer molekularen Spezies gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 , 2 und 9 bis 14 verknüpft sind, während mindestens eine der ungepaarten Basen des längeren Stranges mit einer molekularen Spezies gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 , 2 und 9 bis 14 über einen Linker verknüpft ist.
16. Verfahren zur Herstellung eines supramolekularen Komplexes, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Substanzbibliothek gemäß einem der Ansprüche 1 bis 1 5 einer Wechselwirkung mit einem Substrat aussetzt und den dabei gebildeten supramolekularen Komplex identifiziert und gegebenenfalls isoliert.
17. Verfahren nach Anspruch 1 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat ein Peptid ist.
18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Subtrat ein Peptoid ist.
19. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat ein Oligo- oder Polysaccharid ist.
20. Verfahren nach Anspruch 1 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat eine Nukleinsäure oder deren Analogon ist.
21 . Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat ein Arzneistoff ist.
22. Verfahren nach Anspruch 1 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat ein Pflanzenschutzwirkstoff ist.
23. Verfahren nach Anspruch 1 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat ein Analogon eines oder mehrerer Moleküle im Übergangszustand einer chemischen Reaktion ist.
24. Verfahren nach Anspruch 1 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat ein Metabolit ist.
25. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat ein physiologischer Botenstoff ist.
26. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat eine Substanz ist, welche im menschlichen oder tierischen Körper im Fall von krankhaften Veränderungen produziert oder im erhöhten Maße produziert wird.
27. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat Angriffspunkte von Pharmaka, bevorzugt Rezeptoren, spannungsabhängige lonenkanäle, Transporter, Enzyme und Biosynthese- Einheiten von Mikroorganismen ist.
28. Supramolekularer Komplex, erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 6 bis 27.
29. Verwendung eines supramolekularen Komplexes gemäß Anspruch 28 zur Herstellung eines Arzneiwirkstoffes.
30. Verwendung eines supramolekularen Komplexes gemäß Anspruch 28 zur Herstellung eines Pfianzenschutzwirkstoffes.
31 . Verwendung eines supramolekularen Komplexes gemäß Anspruch 28 zur Herstellung eines Katalysators.
32. Verwendung eines supramolekularen Komplexes gemäß Anspruch 28 zur Diagnose von Krankheiten.
33. Verwendung eines supramolekularen Komplexes gemäß Anspruch 28 zur Herstellung eines Diagnose-Kits.
34. Diagnose-Kit enthaltend einen supramolekularen Komplex gemäß Anspruch 28.
35. Verwendung einer Substanzbibliothek gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 15 zur Diagnose von Krankheiten.
36. Verwendung einer Substanzbibliothek gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 15 zur Herstellung eines Diagnose-Kits.
37. Verwendung einer Substanzbibliothek gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 15 zur Herstellung eines Katalysators.
38. Verfahren zur Herstellung einer Substanzbibliothek gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man molekulare Spezies, die verschieden oder gleich sein können, an ein Paarungssystem koppelt.
39. Cyclohexylnucleooligo-Amid enthaltend Aminocyclohexylethansäure- einheiten.
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