WO1998020134A1

WO1998020134A1 - Proteine inhibitrice de l'adn gyrase

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Publication number: WO1998020134A1
Application number: PCT/JP1997/004019
Authority: WO
Inventors: Akira Nakanishi; Tadahiro Oshida; Tadahiro Matsushita; Tetsuo Onuki
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1996-11-06
Filing date: 1997-11-05
Publication date: 1998-05-14
Anticipated expiration: 1999-05-06
Also published as: DE69729961T2; EP0974656B1; EP0974656A4; US6511816B1; ATE271608T1; AU4883897A; DE69729961D1; EP0974656A1

Description

明細書

D N Aジャィレース阻害蛋白質技術分野

本発明は、細菌の DN Αジャィレース活性を阻害する蛋白質（DG I ) 及びその製造方法に関する。さらに、 DG Iの活性もしくは発現に対する化合物の作用を検定することにより抗菌薬等をスクリーニングし同定する方法に関する。また、 DG Iをコードする遺伝子のアンチセンス DN A (もしくは RNA) および DG Iに対する抗体に関する。背景技術

ペニシリンの発見以来、種々の抗生物質が細菌感染症の治療に用いられ、医療上大きな貢献をしてきた。現在臨床で使用されている主な抗生物質は、；8—ラクタ厶系抗生物質とニューキノロン系抗生物質である。ニューキノロン系抗生物質の作用機作は、細菌の D N Aジャィレースの阻害であることが知られている。

細菌の D N Aジャィレースは、染色体 D N Aに負の超らせん構造を導入したり、複製終了直後の絡まりあった娘 DN Aをほどいて分離させるなど、細菌の複製及び増殖に必須な酵素であり、 2つのサブユニット（A及び B) から構成されている。

DN Aジャィレース阻害剤には、ニューキノロン系抗生物質以外にノボピオシンやサイクロチアジンなどの化合物が知られているが、蛋白質性の阻害物質は知られていない。

DN Aジャィレースの活性制御に関して、堀内（H o r i u c h i ) らは、大腸菌のプラスミドである F因子上にコードされる L e t D蛋白質は DN Aジャィレー差替え用紙（規則 26) スの不活性化に、 L e t A蛋白質は不活性型ジャィレースの再活性化に、各々関与していると幸 β告している（J o u r n a l o f B i o l og i c a l Ch e m i s t r y、第 267巻、 1 2244— 1 2251頁、 1 992年）。しかし、 Le t D蛋白質による不活性化は全菌体を用いた実験でのみ認められ、イン，ビト口（ i n v i t r o) での再構成実験では不活性化作用は認められていない。また、細菌の染色体上にコードされる DN Aジャィレース阻害蛋白質に関する報告はない。

最近、従来の /3—ラク夕厶系ゃニューキノロン系抗生物質に対する耐性菌の出現が重大な問題となっており、それら耐性菌に対して効力を有する新しい作用機作の抗生物質が望まれている。

本発明の課題は、新しい作用機作の抗生物質の創製に有用な、 DN Aジャィレース阻害蛋白質（DG I ) 及びその製造方法を提供することにある。さらには、 DG Iもしくはその遺伝子を利用して、 DG Iの活性やその発現を変調させるという新しい作用機作の抗菌薬等をスクリーニングし同定する方法を提供することにある。本発明者らは、ノボビ才シン一ァフィ二ティーカラムクロマトグラフィーを用いた大腸菌（E s c h e r i c h i a c o I i ) D N Aジャィレースの精製を実施する過程で、各画分のス一パーコイリング活性を測定するとともに SDS—ポリアクリルアミド電気泳動による解析を行なったところ、 DN Aジャィレースのホロ酵素を含むにもかかわらずスーパーコィリング活性を示さないフラクションが存在し、これらフラクションには共通して約 1 8 k Daの蛋白質が含まれていることを見出した。発明者らは、この約 1 8 k Daの蛋白質が、 DN Aジャィレースの活性（ス一パーコィリング活性）を阻害する作用を有するという全く新しい知見を見出し、この 1 8 k D a蛋白質を DN Aジャィレース阻害蛋白質（DG I ) (G y r Iとも称する）と名付けた。発明者らは、さらに、この蛋白質をコードする遺伝子（d g 差替え用紙（規則 26) i遺伝子）（g y r I遺伝子とも称する）を大腸菌の染色体からクローニングし、 DG Iの製造方法を確立した。また、精製した DG Iを用いて DG I活性の測定系を、 d g ί遺伝子のプロモータ領域を用いて、 DG Iの発現を測定する系を構築した。さらに、 DG Iの活性または発現を変調させることにより、細菌の成長を抑制することができることを見出して、本発明を完成するに至った。発明の開示

すなわち、本発明は、細菌の DN Αジャィレース活性を阻害する蛋白質（DNA ジャィレース阻害蛋白質； DG I ) である。

また、 DG Iをコードする DN Aを含む複製可能な発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及びこの宿主細胞を培養することからなる DG Iの製造方法である。さらには、 DG Iの有する DN Aジャィレース阻害活性を変調させる作用を検定することからなる、医薬化合物の同定方法、及び、 DG Iをコードする遺伝子の発現を変調させる作用を検定することを特徴とする、医薬化合物の同定方法である。また、 DG Iをコードする遺伝子のアンチセンス DN Aもしくはアンチセンス R NA、および DG Iを認識する抗体である。図面の簡単な説明

図 1は、ノボビ才シン一セファロースカラムクロマ卜グラフィ一による DN Aジャィレースの溶出パターンを示した図である。

図 2は、ノボビ才シン—セファロ一スカラムクロマ卜グラフィ一で得られた画分の S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動の図である。

図 3は、フラクション N o. 32による DNAジャィレース活性の消失を示すァガロースゲル電気泳動の図である。

差替え用紙（規則 26) 図 4は、大腸菌での DG Iの大量発現を示す S DS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動の図である。

図 5は、精製した 1 8 k D蛋白質による、 DN Aジャィレーススーパーコィリング活性に対する阻害作用を示したァガロースゲル電気泳動の図である。

図 6は、大腸菌の増殖段階における d g ίプロモーター活性の変化を示した図である。

図 7は、 d g i遺伝子のアンチセンス RN A発現が大腸菌の増殖に及ぼす影響を示した図である。

図 8は、抗 DG I抗体を用いたウエスタンプロッティングによる大腸菌 DG Iの検出を示した電気泳動の図である。発明を実施するための最良の形態

後記配列表の配列番号 1には大腸菌由来 DG Iの N末端（1 6残基）のアミノ酸配列を、配列番号 2及び配列番号 3には大腸菌 DG Iをコードする d g i遺伝子のクローニングに用いた合成プライマー DN Aの塩基配列を、配列番号 4及び配列番号 5には大腸菌 D G I発現用ベクター作製に用いた合成ブライマ一 D N Aの塩基配列を、配列番号 6には大腸菌 d g i遺伝子を含む DN A断片の塩基配列及びその中にコードされる DG Iのアミノ酸配列を、配列番号 7には、大腸菌 DG 1のァミノ酸配列をそれぞれ示した。配列番号 8にはシゲラ属微生物由来の dg i遺伝子を含む DN A断片の塩基配列及びその中にコードされる DG Iのアミノ酸配列を、配列番号 9には、シゲラ属微生物由来の DG Iのアミノ酸配列をそれぞれ示した。本発明の DG I を産生する細菌としては、大腸菌（E s c h e r i c h i a c o I ί ) を好適に用いることができる。具体的な菌株としては、ェシェリシア - コリ（E s c h e r i c h i a c o l i ) KL 1 6株（国立遺伝学研究所、遺差替え用紙（規則 26) 伝実験生物保存研究センタ一 A c c e s s i o n N o. ME8002) 、同 K一 1 2株（Ge n e t i c s 第 38巻、第 51〜 64頁、 1 9 53年）、同 L 1 41 0 (M i c r o b i o l o g y a n d I mmu n o l o g y 第 2 2巻、第 367〜 375頁、 1 978年）、同 ATCC 25922、同 N I H J 」〇ー2、同 J M 1 09株（ATCC 53323) 、同 G I 724 ( I n V i t r 0 g e n社、米国）等があげられる。

また、本発明の DG Iは、大腸菌等のェシエリシァ（E s c h e r i c h i a) 属微生物以外でも、種々の細菌に広く普遍的に存在しており、このような細菌としては、例えば、シゲラ属、シ卜ロバクター属、シユードモナス属、バシラス属、ェンテロコッカス属、スタフイロコッカス属に属する微生物などが挙げられる。具体的な菌株の例としては、シゲラボイディー（S h i g e l l a b o yd i i )

1 I D 627 (N I H J 1 1 30 T y p e 7) (日本細菌学雑誌第 50巻、第 1019- 1031 頁、 1995 年、表 1- 1) 、同 ATCC 35964、同 ATCC 49348、シゲラデイセンテリエ（S h i g e l l a d y s e n t e r i a e) I I D633 (N I H J 1 77249 T y p e 3) (日本細菌学雑誌第 50巻、第 1019-1031 頁、 1995年、表卜 1) 、同 ATCC 1 331 3、同 ATCC23351、同 ATCC49345、シゲラソネィ（ S h i g e I I a s o n n e ί ) T R R L 1 0805、同 ATCC 1 1 060、同 ATCC

29930、シ卜ロバクタ一フロインディー（C i t r o b a c t e r f r e u n d i i ) I I D 976 (N I H 1 7) 、シユードモナスァエルギノーザ

(P s e u d omo n a s a e r u g i n o s a) ATCC27853、ノシラスサチルス（B a c i I I u s s u b t i I i s) ATCC 6633、ェンテロコッカスフエ一力リス (E n t e r o c o c c u s f ae c a l i s) AT CC 2921 2、ス夕フィロコッカス才一レウス（S t a p h y I o c o c c u 差替え用紙（規則 26) s a u r e u s) RN450 (J o u r n a l o f B a c t e r i o l o g y 第 1 74巻、第 4952〜 4959頁、 1 992年）などが挙げられる。

DG Iの精製は、細菌の培養物から、硫安沈殿、ァフィ二ティークロマ卜グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの精製方法を種々組合わせ、その生理活性（D Aジャィレースのスーパーコィリング活性を阻害する作用）を指標として、例えば、以下のように実施できる。

DG Iが DNAジャィレースと結合して存在するという性質を利用する場合、例えば対数増殖期の菌体抽出液を用い、 DN Aジャィレースの精製方法（Ao y am a An t i m i c r o b i a l Ag e n t s a n d C h emo t h e r & 乂、第32巻、 1 04— 1 09頁、 1 988年）に準じて、核酸除去、硫安沈殿およびノボピオシン一ァフィ二ティーカラムを用いた分画を行う。ノボビ才シンは D N Aジャィレースと結合するため、ノボビ才シン一ァフィ二ティークロマ卜グラフィ一は DN Aジャィレースの分画精製に用いられる。各画分について、 DNA ジャィレースのスーパーコイリング活性を測定すると共に、 S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、 S DS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動で DN Aジャィレースホロ酵素に相当する蛋白の存在が確認できるにもかかわらず、スーパーコィリング活性を示さない画分、すなわち DN Aジャィレースとともに DG Iが混在する画分を採取する。この画分についてセフアデックス G— 75を用いるゲル濾過等を行って DG Iを単離精製することができる。

あるいは、対数増殖期の菌体抽出液を用い、硫安沈殿、 Q—セファロースファーストフローカラム（フアルマシア社）を用いる強陰イオン交換クロマトグラフィー、 TS Kゲルトヨパール HW— 55カラム（東ソ一社）を用いるゲル濾過および S D Sポリアクリルアミド電気泳動により、 DG Iを精製することもできる。

差替え用紙（規則 26) DN Aジャィレースのスーパーコイリング活性は、例えばアンチマイクロビアル ·エージェンッ 'アンド 'ケモセラピー（An t i m i c r o b i a l Ag e n t s a n d Ch emo t h e r a p y) 、第 32巻、第 1 04— 1 09頁、 1 988年記載の方法に準じて測定することができる。 DG 舌性、すなわち、 D N Aジャィレースのスーパーコィリング活性を阻害する作用は、スーパーコィリング活性測定系を利用して測定できる。

大腸菌由来の精製 DG Iは、分子量約 1 8 k Daの蛋白質であった。また、その N末端アミノ酸配列は、後記配列番号 1に示したものである。

核酸配列データバンク（EMB L/Ge n b a n kZDDB J ) を用いてホモ口ジー検索を行ったところ、 DG Iの N末端配列は、大腸菌 K— 1 2株染色体 DNA の s b c B領域（EM B L登録番号 U 00009) 中の仮想産物（hypothetical protein) Y e e Bの N末端アミノ酸配列と一致していた。また、 D G Iの分子量も、仮想産物 Y e e Bのものと一致していた。これらのことから、発明者らは、 Y e e Bが DG Iであり、 DG Iをコードする遺伝子（d g i遺伝子）は Y e e巳の翻訳領域を含む部分にあると考え、 y e e B遺伝子の翻訳領域前後の塩基配列をもとに、大腸菌 d g i遺伝子をクローニングした。

なお、 EM B L登録番号 U 00009には、大腸菌 K— 1 2株染色体 DNAの s b c B領域の塩基配列が記載されており、その配列から登録者らが仮想した構造遺伝子産物のアミノ酸一次配列が記載されている。しかしながら、そのような仮想産物（Y e e Bなど）については、最も重要な情報である生理活性や機能について一切知られておらず示唆するものもなかつたし、実際に細胞内で発現しているか否かさえ知られていなかった。また、 s b c B領域中にあって y e e Bと同じ配列を有する s bmC遺伝子（遺伝子産物 S bmC) が報告されている（EMB L登録番号 X 84885 , 及びモレキュラー ·マイクロバイオロジー（Molecular Micro- 差替え用紙（規則 26) biology) 第 1 8巻、第 30 1—31 1頁、 1 995年）。しかし、 s bmC遺伝子に関しては、ペプチド性抗生物質 Microcin B17 に対する耐性との関連、及び SOS遺伝子の一つと推定されること、等の記載はあるものの、その遺伝子産物がどのような生理活性や機能を有するのかは、やはり明らかにされていなかった。大腸菌 d g I '遺伝子のクローニングは、前記 s b e B領域（巳1\/181_登録番号11 00009) の y e e B翻訳領域前後の塩基配列をもとに設計して合成したプライマーを用い、大腸菌染色体 DN Aをテンプレー卜としてポリメラーゼ連鎖反応 (P CR ； polymerase chain reaction) を実施することにより、クローニングできる。 PCR産物は、必要に応じて適当な制限酵素で切断した後、大腸菌宿主内で複製可能なベクタープラスミドに連結すればよい。

また、大腸菌又は大腸菌以外の細菌由来の d g i遺伝子は、例えば、目的とする細菌の染色体 DNAライブラリーを調製し、大腸菌 d g ί遺伝子の一部もしくは全部を含む DN Α断片を標識したものをプローブとして用いてスクリーニングすることにより、容易にクローニングすることができる。例えば、配列番号 6又は配列番号 8で示される塩基配列からなる d g i遺伝子の DN A断片をプローブとし、この断片とス卜リンジェン卜な条件でハイブリダィズする遺伝子を選択すればよい。得られた陽性クローンの DN A塩基配列を決定することにより、 d g i遺伝子の DN A配列を決定でき、その翻訳領域から DG Iのアミノ酸配列を得ることができる。このような大腸菌以外の細菌由来の d g i遺伝子は、一般に、大腸菌の d g i遺伝子との塩基配列上の相同性が 70%以上、好ましくは 80%以上、より好ましくは 90 %以上のものである。

DN Aライブラリ一は、例えば、「モレキュラー ·クローニング（Mo I e c u I a r C I o n i n g ) J (Sambrook, 丄， Fritsch, E.F.及び Mani atis, T. 著、 Cold Spring Harbor Laboratory Pressより 1989年に発刊) に記載の方差替え用紙（規則 26) 法により調製することができる。あるいは、市販のライブラリ一がある場合はこれを用いてもよい。

d g ί遺伝子など、 DG Iをコードする DN Aを用いて、遺伝子組換え技術により、 DG Iを宿主細胞内で発現させることができる。 DG Iをコードする DN Aを、適当なプロモータ一（例えば大腸菌を宿主とする場合、 λ ρ !_プロモ一夕一、 t r Pプロモー夕一、 I a cプロモーター、 T 7プロモーター等）の下流に接続し、宿主とする微生物中で機能するベクター（例えば大腸菌を宿主とする場合、 P B R 3 22、 pUC 1 8、 pUC 1 9等）に挿入して発現プラスミドを構築する。あるいは、適当なプロモーターを含む発現用ベクターに、 DG Iをコードする DNAを連結してもよい。 DG Iを大量に発現させた場合、宿主細胞の正常な生育が阻害されるため、 DG Iの大量発現を目的とする場合には、発現誘導を制御することができるプロモータを含むベクターを利用することが好ましく、このような発現用べクタ一としては、例えば大腸菌を宿主とする場合、 P L EX (インビ卜ロジェン社製）、 P ET (ノバジェン社製）等が挙げられる。

得られた発現プラスミド（すなわち、 DG Iをコードする DN Aを含む複製可能な発現ベクター）で形質転換された宿主細胞を培養すれば、得られた培養液あるいは菌体から、目的とする DG Iを得ることができる。

DG Iをコードする DN Aとしては、微生物の自然に存在する遺伝子を用いてもよいが、これに限定されるものではない。例えば、大腸菌 DG Iの場合、配列番号 7で示されるアミノ酸配列をコードする DN Aであればよく、シゲラ属微生物の D G Iの場合、配列番号 9で示されるアミノ酸配列をコードする DN Aであればよい。アミノ酸に対応するコドンは公知であるので、ネイティブな d g i遺伝子に限定されることなく、アミノ酸配列に対応する DN Aを設計し、ポリペプチドをコードする DN Aとして用いることができる。ひとつのアミノ酸をコードするコドンは各々差替え用紙（規則 26) 1〜6種類知られており、コドンの選択は任意でよいが、例えば発現に利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い配列を設計することができる。設計した塩基配列をもつ D Aは、化学合成や自然に存在する遺伝子の部分的改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合成才リゴヌクレオチドをプライマーとして利用し、公知の部位特異的変異導入法 (Mark, D. F. et al.、 Proceedi nas of National Academy of Sciences, 第 81巻、第 5662~5666頁（1984年））等によって実施できる。

DG Iを大量発現させた大腸菌では、細胞分裂に異常が観察される。また、 d g ί遺伝子のアンチセンス R N Aを発現させて DG Iの発現を抑制した場合にも、菌の伸長化が観察され、このような形態異常は、ジャィレース阻害剤であるニューキノロン剤で大腸菌を処理した場合にも観察される（西野武志ら、 Ch emo t h e r a p y . 、 41 (s— 5) 、 50— 66、 1 993) 。これらのことから、 DG Iの活性を変調させる（増強又は阻害する）か、あるいは d g i遺伝子の発現を変調させる（増強又は抑制する）医薬化合物は、抗菌剤として有用であると考えられる。

本発明の DG Iを用いることにより、被験化合物が、 DG Iの活性（DNAジャィレース阻害活性）を変調させる作用を有するかどうかを検定することができる。また、本発明の d g ί遺伝子のプロモータを用いることにより、被験化合物が、 d g ί遺伝子の発現を変調させる作用を有するかどうかを検定することができる。このような検定により、例えば抗菌剤として有用な医薬化合物をスクリ一二ングするとともに、同定することができる。

本発明の d g i遺伝子のプロモー夕を用いて、被験化合物が、 DG Iの活性を変調させる作用を有するかどうかを効率よく検定する方法としては、例えば dg ί遺伝子中のプロモーター領域の下流に、インジケータ遺伝子を連結して、 d g i遺伝差替え用紙（規則 26) 子のプロモータの制御下に、インジケータ遺伝子が発現するように設計した組換えプラスミドを用いる方法が挙げられる。得られた組換えプラスミドで宿主細胞を形質転換し、形質転換された宿主細胞中におけるインジケータ蛋白の発現を指標としてプロモー夕活性を効率よく測定することができる。異種間ではプロモータの発現効率が異なるという問題があるので、宿主として用いる微生物と、 d g ίプロモー夕の由来とはできれば同種であることが望ましい。また、インジケータ蛋白（インジケ一夕遺伝子）としては、例えば、 /3—ガラク卜シダーゼ（ I a c Z遺伝子）、ルシフェラーゼ（ I u c遺伝子）、アルカリホスファターゼ（p h o A遺伝子）等が挙げられる。

d g i遺伝子の発現を変調させる物質としては、例えば、 d g i遺伝子のアンチセンス DNA又は RNAが挙げられる。このような DNA又は R NAは例えば化学合成等により取得できる。また、アンチセンス RN Aは、遺伝子の一部を含む断片を発現ベクターに逆向きに（アンチセンス方向に）挿入したプラスミドを宿主内で発現させて取得できる。

また、精製した DG Iを用いて、 DG Iを特異的に認識する抗体（モノクローナルまたはポリクローナル抗体）を取得することができる。例えばポリクローナル抗体は、適当な宿主動物（例えば、ゥサギやマウス等）に精製した DG I、その断片、またはその部分配列を有する合成ペプチド等を接種し、抗血清を回収する等の、通常の方法により製造できる。モノクローナル抗体は、精製した DG しその断片、またはその部分配列を有する合成ペプチド等を抗原として用い、通常のハイプリド一マ法などの技術により製造できる。得られた抗体は、 DG Iの検出、定量、精製などに利用できる。

なお、本発明の DG I としては、その断片もしくはそれらのホモローグも含まれる。このような断片もしくはホモローグは、 DG I と同様（実質的に同種 ·同効）

差替え用紙（規則 26) の生物活性を有するものであるか、或いは、免疫学的同等性を有するものであればよい。具体的には例えば、 DG I としては、配列番号 7又は 9で示されたアミノ酸配列を有するもののほか、例えば配列番号 7又は 9で示されたアミノ酸配列において 1 もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するものが挙げられる。アミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、 DN Aジャィレース活性を阻害する能力が失われない程度であればよく、通常 1〜約 30個、好ましくは 1〜約 1 5個、より好ましくは 1〜約 7個である。このようなタンパク質は、配列番号 7又は 9で示されたアミノ酸配列と通常、 80%以上、好ましくは 90%以上、より好ましくは 95%以上のアミノ酸配列のホモロジ一を有する。

また、本発明の DG Iをコードする遺伝子としては、配列番号 6又は 8で示された塩基配列を有する D N Aのほか、配列番号 6又は 8で示された塩基配列を有する DNAとストリンジェン卜な条件下でハイブリダイズし得る D N Aが挙げられる。このようにハイプリダイズし得る D N Aは、その D N Aにコードされる夕ンパク質が DN Aジャィレース活性を阻害する能力を有するものであればよい。このような DNAは、配列番号 6又は 8で示された塩基配列と、通常、 70%以上、好ましくは 80%以上、より好ましくは 90%以上の塩基配列のホモロジ一を有する。このような DNAとしては、自然界で発見される変異型遺伝子、人為的に改変した変異型遺伝子、異種生物由来の相同遺伝子等が含まれる。

本発明において、ス卜リンジェン卜な条件下でのハイブリダィゼーシヨンは、通常、ハイブリダィゼ一シヨンを、 5 x S S P E (5倍濃度の S S P E) 又はこれと同等の塩濃度のハイブリダィゼーシヨン溶液中、 37〜42°Cの温度条件下、約 1 2~ 1 8時間行い、 5 X S S P E又はこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予備洗浄を行った後、 1 X S S P E又はこれと同等の塩濃度の溶液中、 5 0〜6 5°Cの温度条件下で洗浄を行うことにより実施できる。また、より高いストリンジ

差替え用紙（規則 26) エンシーを得るためには、より低い塩濃度の溶液中、例えば、 0. 1 x S S P E又はこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行えばよい。

以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。

なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、「モレキュラー，クローニンク (Mo l e c u l a r C l o n i n g) 」 (Sambrook, J., Fri tsch, E.F.及び Maniatis, T.著、 Cold Spring Harbor Laboratory Pressより 1989 年に発刊）に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。実施例

実施例〗大腸菌 DN Aジャィレース阻害蛋白質（DG I ) の単離と同定

( 1 ) 菌の培養

菌株としてェシェリシァ ·コリ（ E s c h e r i c h i a c o I i ) K L 1 6株を使用し、培養を以下の通り実施した。（NH₄) ₂S0₄ 1 g、 KH₂P0₄ 3 g、 K₂H P0₄ 5. 25 g、クェン酸ナトリウム二水和物 0. 57 g、 M g S0₄ 0. 1 2 gを 1 000m lの純水に溶解して滅菌後、別滅菌したカゼィン加水分解物とグルコースを 1 %になるように添加して培地を調製した。この培地 (1 50m l ) を 500m l容三角フラスコに入れ、 1 0m lの培養菌液（一夜培養したもの）を加え 37°Cで回転振盪（ 1 60 r pm) を行った。対数増殖後期 (0 D 600約 1. 0 ) 培養液を急冷後、 4 °Cで遠心（5000 r pm x 1 0 m i n) して集菌した。これを T E D緩衝液 (1 Om T r ί s -Η C I ( p H 7. 5) 、 1 mM EDTA、 1 m ジチ才スレイ！ ^一ル）にて 2回洗浄し、湿重量を秤量した後、等量の T E D緩衝液に懸濁し、約 20 m Iずつ分注して— 8

差替え用紙（規則 26) 0°Cで保存した。

(2) 大腸菌 DN Aジャィレースの精製

D N Aジャィレースの精製は、青山（A 0 y am a) らの方法（A n t i m i c r o b i a I Ag e n t s a n d C h em o t h e r a p y、第 3 2巻、 1 04— 1 0 9頁、 1 98 9年）に準じ以下のように行なった。

すなわち、 — 8 0°Cで保存した菌体を室温にて解凍し、 2 0m I当たり 0. 5 M ジチ才スレイ！ ^一ル 0. 5m l、 0. 5 M E DTA 2 m K 0. 5 M KC I 4m l、 3 0mg/m lのリゾチ一厶溶液 2 m Iを順次添加し、室温で 1 5分間ゆっくり振盪した。その後、ブリッジ 58 (シグマ社製）を 0. 5%になるように添加し、氷中で 3 0分間撹拌した。反応液は 4 °Cで、超遠心分離（3 5， 000 r pm x 1 h r ) を行い、上清を分取した。この上清液に 2 0 %ストレブ卜マイシンを最終濃度 2 %になるように添加し、除核酸を行った。その後、氷中で 30 分間撹拌し、 4°Cで遠心分離（1 2， 000 r pm x 1 5 m ί n ) して上清を得た。上清 1 m I にっき 0. 3 9 gの硫酸アンモニゥ厶を添加し、遠心分離（1 2， 000 r pm x 20 m i n ) で沈殿物を得た。沈殿物を 20m Iの T E D緩衝液に懸濁後、 4°Cで 400 Om Iの T E D緩衝液にて透析し粗抽出液（5 0m l ) を得た。粗抽出液は、あらかじめ T E D緩衝液で平衡化させたノボビ才シン—セファロースカラム（ベッドボリューム 3 Om I ) に負荷した。ノボピオシン—セファロースカラムは、スタウデンバウアーとオール（S t a u d e n b a u e r &O r r ) らの方法（N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h、第 9巻、 3 58 9— 3 60 3頁、 1 98 9年）に従って、エポキシ活性化セファロース 6 B (ファルマシア社製）にノボビ才シン（シグマ社製）をカップリングさせたものを使用した。カラムを 6倍量の T E D緩衝液にて洗浄後、 0. 2 M KC I、 2 M KC I , 5 M 尿素、 2 M K C I - 5 M 尿素、 2M KC I - 5 尿素（p H 4. 差替え用紙（規則 26) 0) を各々含む T E D緩衝液で順次溶出し、分画した。溶出液の画分各 3m lを T ED緩衝液— 50 %グリセリンで 4°Cのもとー晚透析した後、各画分のスーパーコィリング活性を、後記参考例記載の方法で測定した。

活性の認められた画分を、 DN Aジャィレースのホロ酵素（サブユニット Aと B の複合体）を含むものとして分取した。活性画分以外のフラクションの一部を採つて、希釈した活性画分をこれに添加し、スーパーコィリング活性が回復するかどうかを検定した。スーパーコィリング活性が回復した画分を、粗精製サブユニット A 画分として分取した。次に、このサブユニット A画分の一部を他の画分に加え、ス —パーコィリング活性が回復するかどうかを検定した。スーパーコィリング活性が回復した画分を、粗精製サブユニット B画分として分取した。ノボビ才シンーセファロースカラムからの蛋白質の溶出パターンを図 1 に示した。 DN Aジャィレースのホロ酵素（サブユニット Aと Bの複合体）、サブユニット A、及びサブユニット Bは各々、 5 M 尿素で溶出した画分、 2M KC Iで溶出した画分、及び 2 M KC I + 5 尿素で溶出した画分中に得られた。

(3) 大腸菌 DN Aジャィレースのサブユニット Aおよび Bの精製

サブユニット Aおよび Bの精製は以下のとおりに行った。前記（2) で得られた粗精製サブユニット A画分（TED緩衝液にて 5倍希釈したもの） 85m lを、 1 0 %グリセリン含有 T E D緩衝液で平衡化したへパリンーセファロース C L一 6 B (フアルマシア社製）カラム（ベッドボリューム 1 5m l ) に負荷した。これを同緩衝液にて洗浄後、 0. 05M KC I、 0. 2M KC I、 2M KC I、 2M KC I - 5 M 尿素、 2 M KC I - 5 M 尿素（ p H 4. 0 ) を各々含む 1 0 % グリセリン含有 T E D緩衝液にて溶出し分画した。各画分（約 5 I ) は、前記 (2) で得られたホロ酵素画分（約 2. 5 I ) を添加してスーパーコィリング活性を測定し、精製サブュニッ卜 Aを含む画分を決定した。差替え用紙（規則 26) P TJP 7 019

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前記（2) で得られたサブユニット B画分（T ED緩衝液にて 5倍希釈したもの） 35m Iを、 1 0%グリセリン含有 TED緩衝液で平衡化したノボピオシン一セファロースカラム（ベッドボリューム 1 Om l ) に負荷した。同緩衝液にて洗浄後、 2 M KC K 2. 5 M 尿素、 5 M 尿素、 2 M KC I - 5 M 尿素、 2 M K C I - 5 M 尿素（pH 4. 0 ) を各々含む 1 0 %グリセリン含有 T E D緩衝液にて溶出し分画した。各画分に、精製サブユニット A画分を加え、スーパーコィリング活性を測定し、精製サブユニット B画分を決定した。各精製サブユニット画分は、 50%グリセリン含有 T ED緩衝液を用いて透析し一 20°Cにて保存した。

(4) 大腸菌 DN Aジャィレース阻害蛋白質の単離前記（2) のノボビ才シンーセファロースカラムクロマトグラフィーで得られた全画分について S DS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動（S D S— PAGE) を行い、活性を示した画分と活性を示さなかった画分の泳動パターンを比較した。その結果、 N o. 32と 33の画分は、木口酵素に相当する蛋白質の泳動像を示したにもかかわらず、スーパーコィリング活性を示さず、これらの画分には、共通して 1 8 k D aの蛋白バンドが認められた（図 2) 。画分 N o. 32 (0. 4m l ) を、 1 0 %グリセロール含有 T E D緩衝液で平衡化したセフアデックス G— 75 (カラム容積 3. 5m l ) に負荷し、ゲル濾過を行なった。 T ED緩衝液で溶出して分画した後、各画分の一部を採って S DS—ポリァクリルアミド電気泳動によって 1 8 k Daの蛋白バンドを確認しつつ、 1 8 k D a蛋白質、すなわち DN Aジャィレース阻害蛋白質（DG I ) が単一バンドになつた画分を精製 DG I として分取した。以上の結果、 26. 5 gの湿菌体から約 1. 5 gの精製 DG Iが得られた。

(5) DG Iの DN Aジャィレース阻害活性

差替え用紙（規則 26) 後記参考例記載の DN Aジャィレースのスーパーコイリング活性測定系、すなわち弛緩型 P BR322 DNA (0. ^ n g) , サブュニッ卜 A ( 1 U) 及びサブュニット B ( 1 U) を含む反応液（ 1 5 I ) に、 N 0. 32画分（ 5 A I ) を添加して反応させたところ、弛緩型プラスミド DN Aはスーパーコィリング型に変換されなかった（図 3) 。このことから N o. 32画分には DN Aジャィレースのスーパーコィリング活性を阻害する物質が含まれていることが確認された。また、前記 (4) で得られた精製 DG Iは、反応液濃度 8 igZm Iにおいて DN Aジャィレースのスーパーコィリング活性を完全に阻害することを確認した。

(6) 大腸菌由来 DG Iの N末端アミノ酸配列の決定

前記（4) で得られた精製 DG Iの N末端アミノ酸配列を、ペプチドシークェンサー L F 3400 (ベックマン社製）を用いて決定した。その結果得られた N末端側 1 6残基のアミノ酸配列を、後記配列表の配列番号 1に示した。実施例 2 大腸菌 d g i遺伝子のクローニングと塩基配列の決定

核酸配列データバンク（EM B L/G e n b a n k/DDB J ) を用いて、前記実施例 1の（6) 項で決定した大腸菌 DG Iの N末端アミノ酸配列について、ホモロジー検索を行った結果、 DG Iの N末端配列は、大腸菌 K一 1 2株染色体 DNA の s b c B領域（EM B L登録番号 U 00009) の中に想定される産物 Y e e B の N末端アミノ酸配列と一致した。また、配列から算出される Y e e Bの分子量は 1 8, 081ダルトンであり、 DG Iの分子量と一致していた。これらのことから、想定された Y e e Bは DG Iであり、 DG Iをコードする遺伝子（d g i遺伝子）は y e e B遣伝子の翻訳領域を含む部分にあると考えられた。

そこで、 E. c 0 I ί K L 1 6株染色体 DNAから、前記 s b e B領域（EM B L登録番号 U 00009) の 5 ' 側 1 89〜1 370番目の塩基に相当する領域

差替え用紙（規則 26) を、ポリメラーゼ連鎖反応（P C R； polymerase chain reaction) によって以下のようにクローニングした。目的とする配列の両端に B amH I認識部位を組み込んだオリゴヌクレオチドプライマー（センスプライマーの配列は後記配列表の配列番号 2に、アンチセンスプライマ一の配列は配列番号 3に各々示した。）を設計し、 DN Α合成機で合成した。 P C Rは、 0. 5mgZm l E. c o l i K L 1 6染色体 DNA、 800 M d N T P混合物（m ί x t u r e ) 、 0. 6 6 μ. M センスプライマー、 1 ; Μ アンチセンスプライマー、 2mM Mg C I ₂、 0. 0 2 5 U/μ. I T a qポリメラ一ゼを添加した P C R緩衝液（組成： 5 0m KC I 、 1 Om T r i s— HC I (p H 9. 0) 、 1 %卜リ卜ン（T r i t o n) X— 1 00) 中にて反応を行い（94°Cで 2分、 5 1 °C 2分、 7 2°C 3分で 3 0サイクル）、 DNAを増幅させた。 P C Rで得られた 1 . 2 k b pの DNA 断片を、適当な制限酵素で切断してベクタープラスミド p UC I 9 (宝酒造製）に連結し、得られた組換えプラスミドを E. c o l i J 1 09株に導入した。これら組換えプラスミドを用いて、蛍光式 DN Aシーケンサ（日立製）によりダイデ才キシ法で、 1 . 2 k b p DN A断片の塩基配列を決定した。得られた塩基配列及びこの中のオープンリーディングフレームにコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号 6に示した。この配列は既に DN A塩基配列のデータバンクに登録されている E. c o l i K— 1 2の s b c B領域（EM B L登録番号 U 00009) の中の配列（y e e B遺伝子）と一致した。また、そのオープンリーディングフレー厶にコードされる蛋白質の N末端アミノ酸配列は DG Iの N末端配列と一致しており、配列番号 6に示された DN A及びアミノ酸配列は、 E. c o l iの d g i遺伝子の DNA配列及び DG Iのアミノ酸配列であると考えられた。

差替え用紙（規則 26) 実施例 3 種々の細菌染色体の d g i遺伝子

DG Iは細菌の生育に重要であり、普遍的に存在することが予想された。そこで、前記実施例 2で得られた d g ί遺伝子の DN A断片を用いて、さまざまな細菌の染色体 D N Aとサザンハイプリダイゼ一シヨンを行った。

サザンハイブリダィゼ一シヨンは、モレキュラー ·クローニング（M o I e c u I a r C l o n i n g) (第 2巻、 6. 2-6. 1 9、 9. 3 1 -9. 46、 1 989年）記載の方法に準じて行った。種々の細菌由来の染色体は、常法により調製後、 E c 0 R Iで消化したものを用いた。また、プローブとしては、上記実施例 2の（6) でクローニングした E. c o I i由来の遺伝子の中の N d e I切断断片を ³² Pで標識して用いた。ハイブリダィゼーシヨンは、通常のストリンジェン卜な条件下で行った。すなわち、 S S P E (1 80mM N aC I、 1 mM E DT A、 1 OmM リン酸ナトリウム（p H 7. 7) ) を含むプレハイブリダィゼーシヨン溶液（5 x S S P E, 5 Xデンハル卜溶液、 0. 5%S DS、 50 %ホル厶ァミド）で 42°C、 4時間振とう後、標識プローブを加えて 42 °Cで 1 4時間ハイブリダィゼーシヨンを行ない、洗浄は、以下の 3種類の条件で行なった。

洗浄条件 1 : 0. 1 %S DS、 0. 1 %S S P E 65 °C

洗浄条件 2 : 0. 1 %S DS、 0. 1 %S S P E 52°C

洗浄条件 3 : 0. 1 %S DS、 1 x S S P E 52°C

ハイブリダイゼーションの強さは、以下のように判定した。

+ + + ；洗浄条件 1で洗浄後才ー卜ラジオグラフィ一を行い、

ハイブリダイズのバンドが明瞭なもの

++ ；洗浄条件 2で洗浄後才ー卜ラジオグラフィーを行い、

ハイブリダイズのバンドが明瞭なもの

差替え用紙（規則 26) + ；洗浄条件 3で洗浄後才ー卜ラジオダラフィ一を行い, ハイプリダイズのバンドが明瞭なものその結果を下記表 1に示した。表 1

l¾ ¾ 八イブりダイズの強さェシエリシァ 'コリ（Escherichia coli) K-12 + + +

ェシェリシ 7 ·コリ（Escherichia coli) ML1410 + + +

ェシエリシァ ·コリ Escherichia coli) ATCC25922 + + +

ェシェリシ 7 ·コリ（Escherichia coli) NIHJ JC-2

シゲラ 'ボイディー（Shigella boydii) IID627 + + +

シゲラ ·ディセンテリエ (Shigella dysenteriae)

IID633

シゲラ ·ソネィ (Shigella sonnei) TRRL10805

シ卜ロバクタ一 ·フロンディー（Citrobacter + + freundii) IID976

シユードモナス 'ァエノレギノーザ (Pseudomonas + aeruginosa) ATCC27853

ノシラス ·サチゾレス（Bacillus subtilis) ATCC6633 +

ェンテロコッカス 'フエ一力リス（Enterococcus + faecalis) ATCC29212

スタフイロコッカス 'オーレウス（Staphylococcus +

aureus) RN450

強いハイブリダィズ、 ++ ；中程度のハイブリダィズ、 + ；やや弱いハイブリダィズ

表 1に示した通り、シゲラ（S h ί g e r a) 属、シ卜ロバクタ一（C i t r o ba c t e r) 属、シユードモナス (P s e u d omo n a s 属、バシラス ( B

差替え用紙（規則 26) a c i 1 i u s ) 属、ェンテロコッカス (E n t e r o c o c c u s) 属、ス夕フイロコッカス（S t a p h y I o c o c c u s) 属微生物では、ェシェリシァ ·コリ（E s c h e r i c h i a c o l i ) 由来の d g i遺伝子断片（配列番号 6の第 255番目〜 81 5番目に相当する N d e I断片と、ストリンジェン卜な条件下でハイブリダイズする断片が認められた。

すなわち、これら微生物では、相同性のある d g i遺伝子が存在すると考えられ、特にシゲラ（S h i g e r a) 属及びシ卜ロバクタ一（C i t r o b a c t e r ) 属由来の遺伝子はェシェリシァ（E s c h e r ί c h ί a) 属由来のものと相同性がきわめて高いものと考えられた。また、このように d g i遺伝子と相同な遺伝子が多くの菌種に分布していることから、 DG Iが細菌の生育に重要であることが示唆される。実施例 4 遺伝子組換えによる大腸菌 DG Iの大量発現と精製

(1 ) DG I発現用ベクターの作製

大量の DG I蛋白質を調製するために、蛋白発現用ベクタープラスミド p L EX (インビ卜ロジェン社製）を用いて、以下のように DG I発現系を構築した。発現用ベクター p L E Xのシステムは、卜リブ卜ファンをインデューサ一とする転写調節によって目的遺伝子の発現を制御するものである。すなわち、卜リブ卜ファンがない場合、 t r pプロモーターのもと λ I遺伝子から c I リブレッサー蛋白が発現され、 c I リブレッサー蛋白は、ベクター上の P Lプロモーターのオペレーター領域と結合し、 P Lプロモーター下流に連結された目的遺伝子の転写を抑制する。一方卜リブ卜ファンが存在すると、卜リブ卜ファン—リプレッサー複合体が形成され、この複合体が t r pオペレーターと強く結合して c I リブレッサー蛋白の発現を阻止し、 c I リブレッサーが P Lプロモーターから解離して、目的遺伝子の転写が起差替え用紙（規則 26) こる。

プラスミド p L EXに組み込む断片として、前記実施例 2で塩基配列を決定した d g ί遺伝子領域（配列番号 6の第 255〜8 1 5番目の塩基に相当する断片）の両端に制限酵素 N d e I認識部位を付加した断片を P C Rにて調製した。 P C Rのテンプレー卜 DN Αとしては、 E. c 0 I i K L 1 6株染色体 DN Aを用い、プライマー（センスプライマーの配列は配列番号 4に、アンチセンスプライマーの配列は配列番号 5に各々示した）は DN A合成機で合成した。得られた P CR産物をベクタープラスミド pT 7 B I u eT (ノバジェン社製）に連結し、 E. c o I i J M 1 09に導入して組換えプラスミドを調製した。得られた組換えプラスミドを N d e Iで切断し、ァガロース電気泳動で分離後、ゲルから 473 b pの Nd e I 断片を精製し、これを p L EXに連結した。これを、エレクトロボレ一シヨン法により E. c o l i G I 724 ( I n v i t r o g e n社、米国）に導入して組換えプラスミドを調製し、挿入断片の挿入方向を、 E c 0 R Vの切断パターンによつて判定して、 d g i遺伝子を含む挿入断片が正しい方向（センス方向）に挿入された組換えプラスミド p C A 1 7を取得した。エレクト口ポレーシヨンは、エレクトロセルマニュプレーター 600 (ビーェ厶機器株式会社製）を用い、電位差 2. 2 5 k V, 電気抵抗 1 29 Ωの条件下で行なった。ベクタープラスミド p L EXに d g ί遺伝子を含む挿入断片が正方向に挿入された組換えプラスミド p C A 1 7で形質転換された G I 724株、すなわち E. c o l i G I 724 (pCA 1 7) 株は、工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3 号）に、受託番号 F E RM B P— 6 1 33として 1 997年 1 0月 6日に寄託されている。

(2) 大腸菌 DG Iの大量発現

差替え用紙（規則 26) 前項（1 ) で得られた E. c o I i G I 724 (pCA 1 7) 株を、アンピシリン 1 0 0 At gZm Iを含む R M培地（ 42 mM N a₂H P〇₄、 22 mM K H₂ P〇₄、 8. 5 mM N aC し 1 8mM N H₄ C I (p H 7. 4) 、 2%力ザミノ酸、 1 %グリセロール、 1 mM Mg C I ₂) 中で振とう培養した。 OD 6 00値が約 0. 5に達した時点で、最終濃度 1 0 O tgZm Iになるよう卜リブ卜ファンを添加して、 DG I蛋白質の発現を誘導した。その後、 37°Cで振とう培養を 5時間続けた。培養液 1 m Iを採取し、遠心して集菌した。得られた菌体を 1 0 0 Iの S D S緩衝液（50mM T r i s -H C I ( p H 6. 8) 、 1 38 mM S DS、 1. 5 M グリセリン、 280mM 2—メルカプトエタノール）に溶解して 95°Cで 5分間加温して溶菌させた後、氷中保存した。その上清 2 I について、 S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動（S DS— PAGE) により、蛋白発現を調べた。その結果（図 4) 、 pCA 1 7による形質転換株には DG I に相当する約 1 8キロダルトンの蛋白質の大量発現が'認められた。一方、 d g ί遺伝子を含む挿入断片が逆方向（アンチセンス方向）に挿入された組換えプラスミド pC A 1 8あるいはベクター p L EXで形質転換した株では、大量発現は認められなかつた。また、 DG Iを大量発現している菌株を顕微鏡観察すると、細長く伸長しており、細胞分裂に異常をきたしていると考えられた。このことから、 DG Iの活性及びまたは発現を増強する薬剤は、抗菌剤として有用であると考えられる。 (3) 大腸菌 DG Iの精製

E. c 0 I i G I 724 (p CA 1 7) 株を前記（2) と同様にして、培養と卜リブ卜ファンによる発現誘導を行なった。遠心分離して得られた菌体を、 A溶液 (30m M T r i s -H C I ( p H 7. 5) 、 3 Om N a C I ) 1 0m lに懸濁し、氷中で超音波破砕した。破砕後、遠心分離（4°C、 8000 r pm、 20 分）し、得られた上清について、 60 %飽和の硫安沈殿を行い、 1 7000 X G、

差替え用紙（規則 26) 20分間遠心分離した。得られたペレツ卜を 3 0m Iの T E D溶液（1 OmM T r i s -H C I p H (7. 5) , 1 mM E DTA、 1 mM DTT) に溶解し同溶液で透析した。透析後、あらかじめ T E D溶液で平衡化した Q—セファロースフアース卜フローカラム（0. 5 5 cm² X 9 c m) (フアルマシア社製）に負荷し、 N a C Iの直線的濃度勾配（0. 02 51/!から0. 8 Mまで）をかけて T E D溶液 1 40m lで蛋白の溶出と分画を行なった（線速度 1 50 cmZh r) 。各画分について S D S— P AG Eを行ない、 1 8 k D aの蛋白質バンドが確^ [された画分を採取した。この画分について、 T ED溶液で平衡化した T S Kゲル卜ョパール HW— 5 5 (2. 2 5 c m² x 3 2 cm) (東ソ一社製）を用いてゲル濾過で分画し、 1 8 k D aの蛋白質バンドが確認された画分を 200 / Iに遠心濃縮した。濃縮液を S D S— P AG E後、ゲルから目的の DG I蛋白を抽出し、再度、 T S Kゲルトヨパール HW— 5 5でゲル濾過を行い、精製 DG I (600 g) を得た。蛋白量は、蛋白質定量用クマシ一ブリリアントブルー色素液を用い、 59 5 η mの吸光度測定によって算出した。実施例 5 DG I活性測定

前記実施例 4で得られた精製 DG Iを用いて DG 舌性、すなわち DNAジャィレース活性（スーパーコィリング活性）に対する阻害活性を測定した。活性測定反応液（2 0mM T r i s— H C I (p H 7. 5) 、 2 OmM KC I 、 4 mM Mg C I ₂、 4mM スペルミジン、 1 . 5mM AT P、 1 mM DTT、 3 0 At g/m I t— R NA、 1 5 n g m I B S A、 0. 1 μ. g, 弛緩型 p B R 3 2 2 D N A) に、 D N Aジャィレースサブュニッ卜 A ( 1 U) 、サブュニッ卜 B ( 1 U ) 各々 5 t Iを加え、これに D G I (蛋白濃度 2 5、 1 2. 5、 6. 2 5、 3. 1 3、 1 . 5 6、 0. 7 8又は 0. 3 9 g Zm I ) を添加して 3 7 °Cで 1時

差替え用紙（規則 26) 間反応させた。プロティナーゼ K ( 1 mg/m I ) 3 / Iを加えさらに 37°Cで 3 0分保温して反応を停止させた後、反液を 0. 8%ァガロースゲル電気泳動にて泳動後、 0. 5 t g/m Iェチジゥ厶ブロマイド溶液で染色し、紫外線照射下で写真撮影した。超らせん型の DN A量をデンシ卜メータ（島津—波長フライングスポッ卜スキャナ CS— 9000、島津製作所製）で測定した。 DG I蛋白添加時の超らせん型 D N A量を、無添加時の超らせん型 D N A量と比較することによって D N Aジャィレース阻害活性の有無を検定した。その結果を図 5に示した。 DG Iを 6 Atg/m I以上の濃度で添加した場合に、 DN Aジャィレースのスーパーコィリング活性を完全に阻害した。これより低濃度では、スーパーコイル型 DN A変換が不完全な状態で終結して、リラックス型 D N Aから薄く尾を引いたようなバンドが検出された。

以上のように、 DG I活性測定系を構築できた。本測定系において、薬物溶液 (もしくは懸濁液）を添加及び無添加で反応を実施して、 DG 舌性を比較すれば、薬物の DG 舌性を変調させる作用（活性増強作用もしくは、活性阻害作用）を検出することができ、従って、 DG 舌性を変調させる薬剤のスクリーニング又は同定を行なうことができる。実施例 6 大腸菌 d g i遺伝子のプロモーター活性測定

(1 ) プロモーター活性測定用プラスミドの作製

E. c o l iの d g ί遺伝子の 5' 上流域には、 s b c Β領域（ E M B L登録番号 U 00009) 中の仮想産物 Y e e Cをコードする領域（y e e C遺伝子）が存在する。両遺伝子は約 1 22 b p離れているが、この両遺伝子の間には、 y e e C の P因子依存性ターミネータ一と考えられるパリンドローム構造と、 d g ί遺伝子のプロモーターと推定される一 1 0、一 35領域の典型的な配列が認められる。そ差替え用紙（規則 26) こで以下のように、 d g i遺伝子のプロモーター領域を含む DN A断片を I a c遺伝子と連結したプラスミドを作製し、 .3—ガラク卜シダーゼ活性を指標として d g iプロモータ一活性を測定できる系を構築した。

d g ί遺伝子のプロモーター領域、転写開始領域及び翻訳領域の 5 '側を含む 1. 21< 0卩の0 断片（配列番号 6の第 3〜1 1 84番目の塩基に相当する断片）の両端に B amH I認識部位を付加した DN Α断片を、 PCRにより調製した。プライマーとしては、目的領域の両端の配列各々に B amH I認識配列を付加した 2 種のオリゴヌクレオチドを合成して用いた。また錶型としては、大腸菌 K L 1 6株の染色体 DN Aを用いた。 PC Rで得られた断片を B amH Iと R s a Iで二重切断して、推定プロモーター領域、転写開始領域及び翻訳領域の 5 '側 33 b pからなる 2 83 b pの D N A断片を調製した。ベクタープラスミド p L G I a c Z 7 (P l a s m i d 第 32巻、第 233~237頁、 1 994年）を B amH Iで切断した後、先に得られた 283 b pの DN A断片とともに末端の平滑化を行い、両者を連結して組換えプラスミドを作製した。かくして、 d g iプロモータを含む断片が I a c Z遺伝子の上流に、同方向で連結された組換えプラスミド、すなわち DG I蛋白の N末端側 1 1アミノ酸残基と )8—ガラク卜シダーゼの融合蛋白を発現するプラスミド P CA 1 5を得た。また、 d g ίプロモータを含む断片が逆方向に挿入された組換えプラスミド PCA 1 6も得た。

(2) d g ίプロモータ活性の測定

E. c 0 I i J M 1 09株に、前記（1 ) で得られた組換えプラスミド p CA 1 5を E. c o l i J M 1 09に導入した形質転換株を用いて以下のように測定した。前記菌株を一晩培養した液を、 50 gZm Iカナマイシンを含む LB培地 1 0m lに、 OD 600値が 0. 1になるように接種して、 37°Cで振とう培養を実施した。 1時間毎に 600 nmの濁度を測定するとともに、培養液を約 0. 3〜差替え用紙（規則 26) 0. 5m I採取した。採取した培養液は、 0 D 600値が 0. 1 になるように希釈した後、 1 m Iを採って遠心（ 1 4000 r pm、 1分間）し、得られた菌体を 1 1のヱ緩衝液（60171|^ N a₂H P〇₄、 40 m M N a H₂ P0₄、 1 0 m M KC し 1 mM Mg S〇₄、 50 mM 3—メルカプトエタノール）に懸濁した。これを超音波破砕した後、遠心して、上清液 6 Ο Ο μ. \を採取してサンプル溶液とし、各サンプル溶液の) 8—ガラク卜シダーゼ活性を以下のように測定した。サンプル溶液 600 Iを 5分間 28°Cで保温したのち、これに反応基質 ON PG (0— ニトロフエニル一；8— D—ガラク卜ピラノシド）の溶液（4mg/m I ) 200 μ. Iを加え、さらに 5分間保温して反応させた後、 1 M炭酸ナトリウムを 500 / I 加えて反応を停止した。反応終了後、 420 nmと 550 n mの吸光度を測定し、サ厶ブルック（S amb r o o k) らの方法（Mo l e c u l a r C l o n i n g ： A L a b o r a t o r y Ma n u a l、第二版、 C o l d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y P r e s s、 P I a i n v i e w_¾ N ew Yo r k, 1 989年）に準じて 3—ガラク卜シダーゼ活性及び蛋白量 1 gあたりの比活性を算出した。サンプル溶液中の蛋白量は蛋白質定量用 CB B色素液を用いて測定した。

増殖に伴う d g ί プロモーター活性（/3—ガラクトシダーゼの発現を指標とする）の継時的変化を測定した結果を図 6に示した。菌体蛋白量 1 当たりの) 8— ガラク卜シダ一ゼ活性は、培養 2時間後の対数増殖期（OD 600 ： 0. 5) には最も低い値を示し、以後静止期（OD 600 : 1. 2) に達する 6時間後まで上昇することがわかった。

プラスミド pCA 1 5、 p C A 1 6及び p L G I a c Z 7を各々導入した E. c 0 I i J M 1 09株について前記と同様にして、 d g iプロモーター活性を測定した。その結果、培養〗 8時間後の菌体蛋白量〗 tg当たりの) 3—ガラク卜シダー差替え用紙（規則 26) ゼ活性は、各々 21 6、 1 4及び 0 u η ί t s/ igであった。このように、 pC A 1 5を保有する大腸菌では、対照プラスミド（pCA 1 6及び p L G I a c Z 7) と比較して強い /3—ガラクトシダーゼの発現が認められ、このことから、ブラスミド p C A 1 5を用いることにより ; 8—ガラクトシダーゼ活性を指標として容易に d g iプロモーター活性を測定できることが確認できた。

以上のように、 d g iプロモーター活性測定系を構築できた。本測定系において、薬物溶液（もしくは懸濁液）を添加及び無添加で培養を実施し、 d g iプロモー夕一活性を比較すれば、薬物の d g i遺伝子発現を変調させる作用（発現増強作用もしくは、発現阻害作用）を検出することができ、従って、 DG Iの発現を変調させる薬剤のスクリーニング又は同定を行なうことができる。実施例 7 アンチセンス RN Aによる大腸菌 d g i遺伝子の発現制御

(1) アンチセンス RN A発現プラスミドの導入による d g i遺伝子の発現制御 d g i遺伝子の翻訳領域を含む断片（配列番号 6の第 255〜728番目の塩基に相当する断片）を、ベクタープラスミド p L EX (インビ卜ロジェン社製）の卜リブ卜ファン（t r p) プロモーター下流に挿入して、アンチセンス発現ベクターを作製した。

これを E. c o I i G I 724株に導入した。得られたアンチセンス R N A発現株を、卜リブ卜ファン添加又は無添加の条件下で培養し、生菌数および濁度（0 D 600) の継時的推移を測定した。その結果を、図 7に示した。卜リブ卜ファン添加による発現誘導を実施しなかった場合、 24時間後の菌数は 1 X 1 0⁹ c f u /m l、濁度は 1. 0まで増加した。一方、卜リブ卜ファンを添加して d g ί遺伝子アンチセンス RN Αの発現を誘導した場合、生菌数は、添加 8時間後まで、 4 x 1 0⁷ c f uZm Iから 1 x 1 0⁸ c f u/m Iとわずかに増加傾向が見られたが、差替え用紙（規則 26) ,

29

24時間後には、 5 X 1 0⁶ c f uZm I に減少した。また、 0 D 600値は、添加 8時間後に 0. 4まで増加したが、 24時間後でも 0. 5とほぼ一定の値を示した。また、アンチセンス R N A発現株では、菌の伸長化が観察された。このような形態異常は、大腸菌をニューキノロン系ジャィレース阻害剤で処理した場合にも観察されることが報告されている（西野武志ら、 C h emo t h e r a p y、第 41 巻（s— 5) 、第 50— 66頁、 1 993年）。以上の結果から、 d g iのアンチセンス RN A発現を誘導した大腸菌では、 d g ί遺伝子発現が抑制されて、菌の正常な生育が阻害されたと考えられる。すなわち、 d g ί遺伝子発現を抑制する薬剤は抗菌剤として有用であると考えられる。

実施例 8 大腸菌 DG I蛋白質に対するポリクロ一ナル抗体

(1 ) 抗 DG I抗血清の調製前記実施例 3の（4) 項で得られた精製 DG Iの溶液 200 I (1 00 g相当）に、ゲルブアジュバント（ナカライテスク社製） 25 gを加え、 5分間室温にて振とうして完全に混合した後、ゥサギの背中皮下に投与して、初回免疫を行なつた。初回免疫から 1週間後及び 3週間後に、同様に投与してブースター免疫を行なった。免疫後、耳静脈より少量採血を行い、抗体価を確認した。血清抗体価の上昇が確認できた時点で、耳動脈より約 50m I採血した。得られた血液を 37°C1 時間、続いて 4°C1夜静置後、遠心分離して血清を得た。得られた抗血清は、フィルター濾過（ポア径 0. 45 m) 後、分注して— 80°Cにて保存した。

(2) 抗 DG I抗体（ I g G) の精製とドットプロットアツセィ E-Z- S E P (商品名、フアルマシア社製、抗体精製用キット）を用いて、抗血清から I g G画分の精製を行った。精製した抗体の I g G濃度を、希釈ドッ卜ブロット法（抗ペプチド抗体実験プロ卜コール、秀潤社、大海忍、その他著、第 73

差替え用紙（規則 26) ~74頁）により測定したところ、 30 OmgZm Iであった。

また、ドットプロットアツセィにより、この抗体を用いて認識できる最小の抗原蛋白量を検定した。すなわち、二卜ロセルロース膜に 20、 1 0、 5、 2. 5、 1. 25 i g/m Iの濃度の精製 DG Iを 0. 5 t Iスポッ卜し、これを乾燥させた後、 2 Omg/m I B S A含有 T B S (0. 1 5 M N aC I、 20mM T r i s— HC I (p H 7. 5) ) 中でブロッキングした。この膜を、 B S A含有 TBSで希釈した抗 DG I抗体（1 000倍希釈）に浸し、 37 °Cにて 1時間インキュベートした。この膜を洗浄後、西洋ヮサビペル才キシダーゼ（H R P) で標識した抗ゥサギ I g G抗体（G ί b c 0. B R L社製）とともに 37^aCにて 0. 5時間インキュベー卜した後、ジァミノべンジジン（DAB) を基質として用いたペル才キシダーゼ染色で、抗体の結合を検出した。その結果、この抗体が認識できる最小の抗原 (DG I ) 蛋白量は約 5 n gであった。

(3) 大腸菌 DG Iのウエスタンブロッテイングによる検出

DG Iを高発現させた大腸菌（前記実施例 4で得られた E. c o l i G I 72 4 (p CA 1 7) 株）を、超音波破砕後遠心分離して得られた上清液を、 SDS— ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。泳動後のゲルから、 P V D F (polyvinylidene di fluoride) 膜（ミリポア社製）に転写した。転写した PVD F膜をクーマシープリリアン卜ブルーで染色し、蛋白質の泳動パターンを確認した後、メタノールで脱色し、 20mg/m I B SA含有 TB S中でブロッキングした。この膜を B S A含有 T B Sで希釈した抗 DG I抗体（ 1 000倍希釈）に浸して反応させた後、前記（2) のドットプロットアツセィと同様に、 H R P標識抗ゥサギ I g G抗体及び基質 DABを用いてペル才キシダーゼ染色を行なった。その結果、図 8に示したように、 DG Iに相当する分子量 1 8 k Daの蛋白質が特異的に検出できた。このことから、得られた抗 DG I抗体 ( I g G) を用いては DG Iの検

差替え用紙（規則 26) 出 ·定量が可能であると考えられた。参考例 D N Aジャィレースのスーパーコイリング活性測定法

アンチマイクロビアル■エージェンッ 'アンド 'ケモセラピ一（An t i m i c r o b i a I Ag e n t s a n d Ch emo t h e r a p y) 第 32巻、第 1 04~1 09頁、 1 988年記載の方法に準じて以下の通り実施した。

P B R 322 DNA (超らせん型、宝酒造社製） 0. 5 g及び卜ポイソメラーゼ I (宝酒造社製）（6 UZ/ I ) 1 X Iを、反応液（35mM T r i s -HC

1 ( p H 8. 0) 、 72 mM K C I、 5 mM MgC I ₂、 5 mM DTT、 5 mM スペルミジン、 0. 01 %ゥシ血清アルブミン） 20μ Ιに加え、 37°Cで

2時間反応させて、弛緩型 p B R 322 DN Aを調製した。この弛緩型 p B R 32

2 DN A 0. 1 t gを含むスーパーコイリング活性測定用反応液（ 20 m M T r i s -H C I ( p H 7. 5) 、 2 OmM KC I、 4 mM Mg C I ₂、 4 m M スペルミジン、 1. 5mM ATP, 1 mM ジチ才スレイ！ ^一ル、 30 g/m I t一 R N A (酵母由来）、 1 5Atg/m l ゥシ血清アルブミン） 5 Iに、検体溶液 5 n I、 DN Aジャィレースサブュニッ卜 A ( 1 U/1 . 2 5 I ) 5 n Iおよびサブュニッ卜 B ( 1 U/ 1. 25 I ) 5 μ. Iを加え、 37°Cで 1時間反応させた。これにプロティナーゼ K ( 1 mg/m I ) 3μ Ιを加え、さらに 37°C で 30分保温して反応を停止した。反応終了液を、 0. 8%ァガロースゲル電気泳動（泳動緩衝液 T A E； 40 mM T r i s- a c e t a t e, 1 mM EDT A) にて泳動後、ゲルを 0. 5 g/m Iェチジゥ厶ブロマイド溶液で染色した後、紫外線照射下で写真撮影した。検体添加時と無添加時の超らせん型 DN A量を比較することにより、 DN Aジャィレース阻害の有無を検定した。酵素活性としては、弛緩型プラスミド D N A量の 50 %を超らせん型 D N Aに変換させるのに必要な酵差替え用紙（規則 26) 素量を 1単位（U) とした。実施例 9 シゲラ属微生物の d g ί遺伝子のクローニング

前記実施例 3で示した通り、シゲラ属（S h i g e I I a属）染色体には、 E. c o l i由来の d g i遺伝子と強くハイブリダィズする E c 0 R I断片が認められ、その断片の大きさは約 7 k bであることがわかった。そこでシゲラディセンテリェ（S h i g e l l a d y s e n t e r i a e) I I D 633の染色体を E c o R I切断しァガロース電気泳動を行い、約 7 k bの DN A断片を回収した。得られた DNA断片を pUC 1 9の E c o R I切断部位に連結し得られた組換えプラスミドを E. c o l i J M 1 09株に導入した。大腸菌由来 d g i遺伝子を含む DN A断片をプローブとして用いてコロニーハイブリダィゼ一シヨンを行い，陽性コロ二一 1 0株を解析した結果、 6株が pUC 1 9上に 7. 5 k bの E c o R I DN A断片を保持していた。この挿入断片について種々の制限酵素で切断し、大腸菌 d g ί遺伝子を含む DNA断片とのハイブリダィゼ一シヨンにより解析した結果、 1. 5 k bの Av a l断片上にシゲラ属 d g ίの遺伝子が存在すると考えられた。

塩基配列決定のため、この DN Α断片を含むプラスミドから種々の欠失プラスミドを調製し、これらのプラスミドを用いて、蛍光式 DNAシーケンサー（日立製、 S Q 5500 ) により、ダイデ才キシ法で塩基配列を決定した。 1 444 b pの配列が決定された。シゲラディセンテリエの 1 444 b pの DN A塩基配列について、大腸菌の d g i遺伝子周辺の配列と比較したところ、全域にわたって 98. 3%という高い相同性が認められ、その第 699番目の塩基から 1 1 69番目の塩基までの領域に相当するオープンリーディングフレーム（OR F) が d g i遺伝子の 0 R Fであると判明した。 0 R Fの上流にプロモーターおよびリボゾーム結合領域と考えられる配列が認められ OR Fに続いてロー非依存性ターミネータ一と推測差替え用紙（規則 26) される配列が認められた。シゲラディセンテリエ由来の d g ί遺伝子を含む 1 4 44 b pの断片の DN A配列、及びこの中にコードされる DG Iのアミノ酸配列を配列番号 8に示した。また、同アミノ酸配列を配列番号 9に示した。シゲラディセンテリエの DG Iは、大腸菌の DG I と同じく 1 57アミノ酸残基よりなるポリペプチドで、分子量は約 1 8キロダル卜ンと推定された。両 DG Iのアミノ酸配列は 96. 8 %という高い相同性を示した。産業上の利用可能性

本発明の DNAジャィレース阻害蛋白質（DG I ) は、その活性またはその発現を変調させることにより細菌の正常な生育を阻害することができる。本発明の D N Aジャィレース阻害蛋白質（DG I ) 及びその遺伝子（d g i遺伝子）を用いることにより、 DG 舌性又は d g ί遺伝子プロモータ活性を測定することができ、これら測定方法は、 DG 舌性や d g i遺伝子の発現を変調させる薬剤のスクリー二ング方法及び同定方法として有用である。これらスクリーニング方法及び同定方法は、新しい作用機作に基づく抗菌剤や農薬の開発に有用である。さらに、 d g i遺伝子に対するアンチセンス RN Aもしくは DNAは、 DG I発現を抑制する薬剤として有用であり、抗 DG I抗体は、 DG Iの検出 '定量に利用できる。

差替え用紙（規則 26) 配列

配列番号： 1

配列の長さ： 1 6

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：タンパク質

フラグメント型： N末端フラグメント

起源

生物名：ェシエリシァコリ（Escherichia coli )

株名： K L 1 6

配列

Met Asn Tyr Glu l ie Lvs Gin Glu Glu Lys Ara Thr Val Ala Gly Phe

5 10 15 16

配列番号： 2

配列の長さ： 3 0

配列の型：核酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 D N A

配列

CTGGATCCAT CAGCGGGTAG GGGAAATTGA 30

配列番号： 3

配列の長さ： 3 0

差替え用紙 (規則 26) 4

35 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 D N A 配列

GTGGATCCCA GACTAACATC AGCGGTAACG 30

配列番号： 4 配列の長さ： 2 4 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 D N A 配列

CACATATGAA CTACGAGATT AAGC 24

配列番号： 5 配列の長さ： 2 8 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 D N A 配列

CACATATGAG CGAAAAAATT GAAAGGCG 28

配列番号： 6 配列の長さ： 1 2 2 4

差替え用紙（規則 26) 配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： genomic DNA

起源

生物名：ェシエリシァコリ (Escherichia co l i )

株名： K L 1 6

配列

CCATCAGCGG GTAGGGGAAA 1TGAACTTTA CGACCGTGAT AAACAGGTGG CGCAC GGCC 60 GCTGGTTACC CTGGAATCTG TCGGGGAAGG CAGCATGTTT TCTCGCCTGA GTGATTATTT 120 CCACCATAAG GCCTGACCTT TCTTTTGCAG CAGA TGGCA GGAGTGCGAG TC GCTCGCA 180 TAATCAACAC TCATTCCTTG TGGTTITAAT TTTGCAACTA TACTGTATAT AAAAACAGTA 240 TCAATGGAGG CGTC 254

ATG AAC TAC GAG ATT AAG CAG GAA GAG AAA CGT ACC GTT GCA GGT 299 Me Asn Tyr Glu lie Lys Gin Glu Glu Lys Arg Thr Val Ala Gly

1 5 10 15

TTC CAT CTC GTT GGC CCG GG GAA CAG ACG GTA AAG AAA GGC ΊΤΤ 344 Phe Hi s Leu Val Gly Pro Trp Glu Gin Thr Val Lys Lys Gly Phe

20 25 30

GAG CAG TTG ATG ATG TGG GTA GAT AGC AAA ΑΆΤ ATT GTG CCG AAG 389 Glu Gin Leu Met Me Trp Val Asp Ser Lys Asn lie Val Pro Lys

35 40 45

GAG TGG GTT GCT G C TAT TAC GAC AAT CCA GAT GAA ACA CCC GCC 434 Glu Trp Val Ala Val Tyr Tyr Asp Asn Pro Asp Glu Thr Pro Ala

50 55 60

GAA AAA TTA CGC GC GAC ACC GTC GTG ACG GTG CCG GGT TAC ΊΤΤ 479 Glu Lys Leu Arg Cys Asp Thr Val Val Thr Val Pro Gly Tyr Phe

65 70 75

差替え用紙（規則 26) ACG CTT CCC GAA AAC AGT GAG GGC GTC ATT CTG ACA GAA ATT ACA 524 Thr Leu Pro Glu Asn Ser Glu Gly Val lie Leu Thr Glu lie Thr

80 . 85 90

GGT GGT CAG TAT GCG GTG GCG GTA GCT CGT GTA GTC GGT GAT GAT 569 Gly Gly Gin Tyr Ala Val Ala Val Ala Arg Val Val Gly Asp Asp

95 100 105

ΊΤΤ GCT AAA CCC TGG TAT CAG TTC T T AAT AGT CTC TTG CAG GAC 614 Phe Ala Lys Pro Trp Tyr Gin Phe Phe Asn Ser Leu Leu Gin Asp

110 115 120

AGT GCT TAT GAA ATG ΤΓΑ CCA AAG CCC TCC TTC GAG GTT TAT TTG 659 Ser Ala Tyr Glu Me Leu Pro Lys Pro Cys Phe Glu Val Tyr Leu

125 130 140

AAC AAT GGC GCG GAA GAT GGG TAC TGG GAT ATC GAA ATG TAT GTT 704 Asn Asn Gly Ala Glu Asp Gly Tyr Trp Asp lie Glu Me Tyr Val

140 1 5 150

GCG GTG CAG CCA AAA CAT CAC 725 Ala Val Gin Pro Lys Hi s His

155 157

TAATTCATCT CAGGGCGGTG GTTAACGCG ATGACCACTC TTTTTTTTGA AAGCGAAAAG 785 AGTAAGATGC GCCTTTCAAT TTTTTCGCTC CTGCCGGGAA ATTACACTGT TCCCGGTTTG 845 TCCGTCGGAT AATTCAGAGG CGCGCCTTCT GGCCGACAGA TGAGTTATGA GCGCTTTTAA 905 TCTCATTACG GAGTTTCTGC CTGCGTGCCG ATAAGTCATT AAGCCCGITT GAAATCCGGG 965 TATACCGCCA TTACCGCATT GTGCATGCTA CTCGGGTCGC GCTGGCATTC CTGCTCACTT 1025 TTCTCATTAT CCGCCTGTTT ACTATCCCGG AAAGCACCTG GCCGCTGGTC ACCATGGTGG 1085 TGATTATGGG GCCAATCTCG TTCTGGGGTA ACGTTGTCCC TCGCGCCTTT GAGCGTATTG 1145 GCGGTACGGT GTTGGGTTCG ATTTTAGCTC TTATCGCTCT GCAACTGGAG TTAATCTCGT 1205 TACCGCTGAT GTTAGTCTG 1224

配列番号： 7

配列の長さ： 1 5 7

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

差替え用紙（規則 26) 配列の種類：タンパク質

起源

生物名：ェシエリシァコリ（Escherichia co l i )

株名： K L 1 6

配列

Met Asn Tyr Glu l ie Lys Gin Glu Glu Lys Arg Thr Val Ala Gly

1 5 10 15

Phe His Leu Val Gly Pro Trp Glu Gin Thr Val Lys Lys Gly Phe

20 25 30 Glu Gin Leu Met Met Trp Val Asp Ser Lys Asn l ie Val Pro Lys

35 40 45

Glu Trp Val Ala Val Tyr Tyr Asp Asn Pro Asp Glu Thr Pro Ala

50 55 60

Glu Lys Leu Arg Cys Asp Thr Val Val Thr Val Pro Gly Tyr Phe

65 70 75

Thr Leu Pro Glu Asn Ser Glu Gly Val l ie Leu Thr Glu l ie Thr

80 85 90

Gly Gly Gin Tyr Ala Val Ala Val Ala Arg Val Val Gly Asp Asp

95 100 105 Phe Ala Lys Pro Trp Tyr Gin Phe Phe Asn Ser Leu Leu Gin Asp

110 115 120

Ser Ala Tyr Glu Met Leu Pro Lys Pro Cys Phe Glu Val Tyr Leu

125 130 135

Asn Asn Gly Ala Glu Asp Gly Tyr Trp Asp l ie Glu Met Tyr Val

140 145 150 Ala Val Gin Pro Lys His His

155 157

配列番号： 8

配列の長さ： 1 4 4 4

差替え用紙（規則 26) 配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： genomic DNA

起源

生物名：シケラティセンテリエ (Shigella dysenteriae)

株名： I I D 6 3 3

配列

CCGAGTTTTA TCATATGTAC AGTGAGAAAA GTCTCACCTG GAACGGTATC ACCCAGCAAA 60 ACCGTAACGG GTTATTGTGG GATAAAACCA TCAATGT GA CGGCCTGAAA ACGGGTCATA 120 CTTCTGG GC CGGGTTTAAT CTCATTGCTT CGGC GTCGA TGGGCAGCGT CGTCTCATTG 180 CAG GGTAAT GGGGGCTGAC AG GCAAAAG CTCG GAGGA AGAGGCAAGA AAATTACTGC 240 GT GGGGGCA ACAAAACTTT ACTACGG GC AAATTTTGCA CCGTGGGAAA AAGGTCGGTA 300 CGGAACGCAT CTGGTATGGC GATAAAGAAA ATATCGACCT GGGAACGGAA CAAGAGTTCT 360 GGATGG GCT ACCGAAAGCC GAAATTCCAC ATATCAAAGC CAAATATACC CTTGA GGTA 420 AAGAGCTCAC CGCGCCAATT AGCGCCCATC AGCGGGTAGG GGAAATTGAA CTTTACGACC 480 GTGATAAACA GGTGGCGCAC GGCCX3C GG 1TACCCTGGA ATCTCTCGGG GAAGGCAGCA 540 TGTTTTCTCG CCTGAGTGAT TATTTCCACC ATAAGGCCTG ACCTTTCTTT TGCAGCAGAC 600 TGGCAGGAGT GCGA.GTCTGC TCGCATAATC AACACTCATT CCTTGTGGTT TTAATATCGC 660 AATTATACTG TATATAAAAA CAGTGITGAT GGAGCGTC 698 ATG AAC TAC GAG ATT AAG CAG GAA GAT AAA CGT ACC GTT GCA GGT 743 Met Asn Tyr Glu lie Lys Gin Glu Asp Lys Arg Thr Val Ala Gly

1 5 10 15

TTC CAT CTC GTT GGC CCG GG GAA CAG ACG GTA AAG AAA GGC ΊΤΤ 788 Phe His Leu Val Gly Pro Trp Glu Gin Thr Val Lys Lys Gly Phe

20 25 30

GAG CAG TTG ATG ATG TGG CTA GAT AGC AAA AAT ATT GTG CCG AAG 833 Glu Gin Leu Met Met Trp Val Asp Ser Lys Asn lie Val Pro Lys

35 40 45

差替え用紙（規則 26) GAG TGG GTT GCT GTC ITT TAC GAC AAT CCA GAT GAA ACA CCC GCC 878

Glu Trp Val Ala Val Phe Tyr Asp Asn Pro Asp Glu Thr Pro Ala

50 - 55 60

GAA AAA TTA CGC TGC GAC ACC GTC GTG ACG GTG CCG AAT AAC TTT 923 Glu Lys Leu Arg Cys Asp Thr Val Val Thr Val Pro Asn Asn Phe

65 70 75

ACG CTC CCC GAA AAC AGT GAG GGC GTC ATT CTG ACA GAA ATT TCA 968 Thr Leu Pro Glu Asn Ser Glu Gly Val lie Leu Thr Glu lie Ser

80 85 90

GGT GGT CAG TAT GCG GTT GCG GTG GCT CGT GTA GTC GGT GAT GAT 1013 Gly Gly Gin Tyr Ala Val Ala Val Ala Arg Val Val Gly Asp Asp

95 100 105

TTT GCT AAA CCC TGG TAT CAG TTC TTT AAT AGC CTC TTG CAG GAC 1058 Phe Ala Lys Pro Trp Tyr Gin Phe Phe Asn Ser Leu Leu Gin Asp

110 115 12 0

AGT GCT TAT GAA ATG TTA CCA AAG CCC TGC TTC GAG GTT TAT TTG 1103 Ser Ala Tyr Glu Me Leu Pro Lys Pro Cys Phe Glu Val Tyr Leu

125 130 135

AAC AAT GGC GCG GAA GAT GGG TAC TGG GAT ATC GAA ATG TAT GTT 1148 Asn Asn Gly Ala Glu Asp Gly Tyr Trp Asp lie Glu Met Tyr Val

140 145 150

GCG GTG CAG CCA AAA CAT CAC 1169 Ala Val Gin Pro Lys Hi s Hi s

155 157

TAATTCATCT CAGGGCGG G TGTTAACGCG ATGACCACTC TTTT TTGAA AGCGAAAAGA 1229 GTAAGATGCG CCTTTCAATT TTTTGGCTCC TGCCGGGAAA TTACACTGTT CCCGGTTTGT 12 89 CCGTCGGATA AT CAGAGGC GGGCCTTCTG GCCGACAGAT GAGTTATGAG CGCTTTTAAT 1349 CTTCATTACG GAGTTTC GC GTGCGTGCCG ATAAGTCATT AAGCCCGTTT GAAATCCGGG 1409 TATACCGCCA TTACCGCATT GTGCATGG A CTCGG 1444

配列番号： 9

配列の長さ： 1 5

差替え用紙（規則 26) 配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：タンパク質

起源

生物名：シ Tラティセンテリエ (Shigella dysenteriae)

株名： I I D 6 3 3

配列

Met Asn Tyr Glu l ie Lys Gin Glu Asp Lys Arg Thr Val Ala Gly

1 5 10 15 Phe His Leu Val Gly Pro Trp Glu Gin Thr Val Lys Lys Gly Phe

20 25 30

Glu Gin Leu Met Met Trp Val Asp Ser Lys Asn l ie Val Pro Lys

35 40 45

Glu Trp Val Ala Val Phe Tyr Asp Asn Pro Asp Glu Thr Pro Ala

50 55 60

Glu Lys Leu Arg Cys Asp Thr Val Val Thr Val Pro Asn Asn Phe

65 70 75

Thr Leu Pro Glu Asn Ser Glu Gly Val lie Leu Thr Glu lie Ser

80 85 90 Gly Gly Gin Tyr Ala Val Ala Val Ala Arg Val Val Gly Asp Asp

95 100 105

Phe Ala Lys Pro Trp Tyr Gin Phe Phe Asn Ser Leu Leu Gin Asp

110 115 120

Ser Ala Tyr Glu Met Leu Pro Lys Pro Cys Phe Glu Val Tyr Leu

125 130 135

Asn Asn Gly Ala Glu Asp Gly Tyr Trp Asp lie Glu Met Tyr Val

140 145 150 Ala Val Gin Pro Lys His His

155 157

差替え用紙（規則 26)

Claims

請求の範囲

1. 細菌の DNAジャィレース活性を阻害する蛋白質。

2. 細菌の染色体上の遺伝子にコードされる請求の範囲第 1項記載の蛋白質。

3. 分子量が約 1 8キロダル卜ンである請求の範囲第 1項記載の蛋白質。

4. 配列番号〗で示される N末端側アミノ酸配列を有する請求の範囲第 3項記載の蛋白質。

5. ェシェリシァ属に属する微生物由来である請求の範囲第 1項記載の蛋白質。

6. シゲラ属に属する微生物由来である請求の範囲第 1項記載の蛋白質。

7. シ卜ロバクター属、シユードモナス属、バシラス属、ェンテロコッカス属又はスタフイロコッカス属に属する微生物由来である請求の範囲第 1項記載の蛋白質。

8. 配列番号 6又は配列番号 8で示される塩基配列からなる D N A断片とス卜リンジェン卜な条件下でハイブリダィズする遺伝子でコードされるものである請求の範囲第 1項記載の蛋白質。

9. (1 ) 配列番号 7で示されるアミノ酸配列、又は（2) 配列番号 7で示されるアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列からなり、かつ、細菌の DN Aジャィレース活性を阻害する能力を有する蛋白質。

1 0. (1 ) 配列番号 9で示されるアミノ酸配列、又は（2) 配列番号 9で示されるアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列からなり、かつ、細菌の DNAジャィレース活性を阻害する能力を有する蛋白質。

1 1. 配列番号 6または配列番号 8で示される塩基配列からなる DNA断片とストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、かつ、細菌の DNAジャィレース活性を阻害する能力を有する蛋白質をコードする D N Aからなる、請求の範囲第 1項記載の蛋白質の遺伝子。

1 2 . 請求の範囲第 1項〜第 1 0項のいずれかに記載の蛋白質をコードする D N A を含む複製可能な発現ベクターで形質転換された宿主細胞。

1 3 . 請求の範囲第 1 2項記載の宿主細胞を培養することからなる、請求の範囲第 1項記載の蛋白質の製造方法。

1 4 . 配列番号 7または 9で示されるアミノ酸配列をコードする D N Aを含む複製可能な発現ベクターで形質転換された宿主細胞。

1 5 . 請求の範囲第 1 4項記載の宿主細胞を培養することからなる、請求の範囲第 1項記載の蛋白質の製造方法。

1 6 . 請求の範囲第 1項記載の蛋白質の有する D N Aジャィレース阻害活性を変調させる作用を検定することからなる、医薬化合物の同定方法。

1 7 . 請求の範囲第 1項記載の蛋白質をコードする遺伝子の発現を変調させる作用を検定することを特徴とする、医薬化合物の同定方法。

1 8 . 請求の範囲第 1項記載の蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター活性に対する医薬化合物の作用を測定することにより、遺伝子の発現を変調させる作用を検定するものである請求の範囲第 1 7項記載の方法。

1 9 . 医薬化合物が抗菌作用薬である請求の範囲第 1 6項又は第 1 7項記載の方法。

2 0 . 請求の範囲第 1 6項又は第 1 7項記載の方法により選択され、同定された抗菌作用薬。

2 1 . 請求の範囲第 1項記載の蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター、及び該プロモータの制御下に発現するように連結されたインジケータ遺伝子を含むベクタ一で形質転換された宿主細胞を用い、該形質転換された宿主細胞中におけるインジケ一夕蛋白の発現を指標としてプロモーター活性を測定することからなる、請求の範囲第 1項記載の蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター活性の測定方法。

22. 請求の範囲第 1項記載の蛋白質をコードする遺伝子のプロモーターが、配列番号 6または配列番号 8で示される遺伝子のプロモータである、請求の範囲第 21 項記載の測定方法。

23. 請求の範囲第 1項記載の蛋白質をコードする遺伝子のアンチセンス DN Aもしくはアンチセンス RN A。

24. 請求の範囲第 1項記載の蛋白質をコードする遺伝子のアンチセンス DN Aもしくはアンチセンス R N Aを発現する複製可能な発現ベクター。

25. 請求の範囲第 1項記載の蛋白質をコードする遺伝子のアンチセンス DN Aもしくはアンチセンス R N Aを発現する複製可能な発現ベクターで形質転換された宿主細胞。

26. 細菌の DN Aジャィレース活性を阻害する蛋白質を認識する抗体。