WO1998029451A1 - Method for elevating the concentration of free insulin-like growth factor - Google Patents

Method for elevating the concentration of free insulin-like growth factor Download PDF

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WO1998029451A1
WO1998029451A1 PCT/JP1997/004881 JP9704881W WO9829451A1 WO 1998029451 A1 WO1998029451 A1 WO 1998029451A1 JP 9704881 W JP9704881 W JP 9704881W WO 9829451 A1 WO9829451 A1 WO 9829451A1
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Katsuichi Sakano
Nobuyuki Higashihashi
Ryuji Hashimoto
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    • C07K14/4743—Insulin-like growth factor binding protein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a method for effectively utilizing endogenous insulin-like growth factor present in a large amount in a living body.
  • IGF Insulin-like growth factor
  • IGF-1 and IGF-II are composed of 70 amino acids and 67 amino acids, respectively.
  • IGF-1 is composed of IGF-II, the amino acid corresponding to C peptide, which is a partial structure of insulin. There are three more than in. The homology of the amino acid sequence between IGF-1 and IGF-II is about 60%, and that between IGF-I and insulin is about 40%.
  • IGF-I acts not only as endocrine but also as paracrine protein.
  • IGF-1 and IGF-II have specific receptors, IGF-I receptor and IGF-11 / cation-independent mannose 6-phosphate receptor, respectively.
  • IGF-II also binds to the IGF-I receptor, and various biological activities of IGF-II are thought to be mainly mediated by the IGF-I receptor on cell surfaces (Casella, SJ , et al., J. Biol. Chem., 261, 9268 (1986); Sakano, K., et al., J. Biol. Chem., 266, 20626 (1991)).
  • the IGF-1 receptor is homologous to the insulin receptor when viewed from the amino acid sequence And their intracellular signaling mechanisms are similar (Shemer, J., et al., J. Bio
  • IGFBPs IGF binding proteins
  • IDDM Insulin-dependent diabetes mellitus
  • NIDDM non-insulin-dependent diabetes mellitus
  • IGF insulin growth factor
  • hypoglycemic action not only hypoglycemic action, but also cell proliferation action, cell differentiation action and anabolic action have been studied by administering to animals and humans.
  • Local administration of IGF-I to injured peripheral nerves was found to stimulate nerve cells as well as proliferation of related non-neuronal cells.
  • IGF-I receptor is found in spinal cord cells, and it has been reported that IGF-1 administration reduces cell death of motor neurons. It also increases muscle endplates, promotes functional recovery during sciatic nerve injury, (Sjoberg, J., et a 1., Brain Res., 485, 102 (1989)) 0
  • IGF-1 amyotrophic lateral sclerosis and motor neuron degenerative diseases
  • a use of IGF action to promote the survival of neuronal cells found in Alzheimer's disease, stroke, amyotrophic lateral sclerosis, Parkinson's disease, etc. has also been considered (Table 6). No. 510305).
  • the efficacy of IGF-I has also been reported for muscular dystrophy (Vlachopapadopoulou, E., et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 80, 3715 (1995)).
  • IGF-I improves myocardial damage.
  • doxorubicin was administered to rats to create myocardial damage and the cardiac output was examined, it was reported that IGF-1 administration improved the function of damaged myocardium (Ambler , GR, et al., Cardiovasc. Res., 27. 1368 (1993)).
  • IGF-1 has been used to prevent or treat myocarditis, including myocarditis or myocardial infarction, heart disease or acute attacks, and to improve cardiac output by increasing cardiac stroke. Table 6-504286 publication).
  • IGF-1 together with platelet-derived growth factor (hereinafter abbreviated as PDGF) promotes mitosis and protein synthesis of mesenchymal cultured cells, and is cured by PDGF or IGF-1 alone for skin disorders
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • application of both factors together promotes growth of connective and epithelial tissues (Stiles, CD, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1279 (1987 )).
  • tiles CD, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1279 (1987 )
  • other reports indicate that application of individual growth factors to the wound stimulated wound healing (Tsuboi, R., et al., J. Exp. Med., 172, 245 (1990)).
  • IGF-I also has the effect of improving immunity.
  • IGF-1 produced locally in tissues such as the thymus or inflamed sites is thought to be involved in the growth and function of T lymphocytes bearing IGF-1 receptors (Tapson , VF, et al., J. Clin. Invest., 82, 950 (1988)).
  • the IGF 1 nanomolar concentrations has been reported to be a growth-promoting factor for lymphocytes (Schimpff, RM, et al. , Acta Endocrinol. 102, 21 (1983)) 0
  • AIDS patients The use of IGF-1 in immunocompromised patients is also being studied (Japanese Patent Application Publication No. Hei 6-508830).
  • IGF-I is considered to be effective in the treatment of osteoporosis because it has an effect of increasing bone mass (Bennett, AE, et al., J. Clin. Endocrinol. Etab., 59, 701). (1984); Brixen, K., et al., J. Bone. Miner. Res., 5, 609 (1990); Joha nnsson, AG, et al., J. Intern. Med., 234, 553 (1993). ); Johannsson, AG, et al., Lancet, 339, 1619 (1992); Riggs, B. Shishi, Am. J. Med., 95, Sup pl. 5A, 62S, (1993); 235135, U.S. Pat. No. 4,861,757).
  • IGFBP-1 to IGFBP-6 There are six types of IGFBP so far, and they are named IGFBP-1 to IGFBP-6, respectively. These six types of IGFBPs show high homology to each other in the amino acid sequence, particularly in the domain containing a large amount of cysteine on both the N-terminal side and the C-terminal side. There is little homology in some parts. In the case of humans, the positions of 16 cysteines are stored in these six types of IGFBPs. (Note that 18 cysteines are stored in the positions of five types of IGFBPs from IGFBP-1 to IGFBP-5.) (Shimasaki, S., et al., Prog. Growth Factor Res., 3, 243 (1991)).
  • IGFBP-1, IGFBP-2, and IGFBP-3 concentrations of IGFBP-1, IGFBP-2, and IGFBP-3 in the blood of human adults are about 2 n 5, 5 ⁇ , and ⁇ , respectively.
  • IGFBP-3 is the major binding protein to IGF.
  • Baster, RC in Modern Concepts of Insul in-like browth Factors (Spencer, EM, ed) pp371, Elsevier Science Publishing Co., New York-Amsterdara (1991)
  • IGF elution position was confirmed, most of the IGF was eluted at around 150 kDa and existed as a complex of three molecules (Baxter, R., et al. Natl.
  • the complex of these three molecules is composed of IGF-1 (or IGF- ⁇ ) with a molecular weight of about 7.5 kDa, acid-stable 53 kDa IGFBP-3, and an acid-stable 84 kDa subunit protein.
  • IGF-1 or IGF- ⁇
  • IGFBP-3 acid-stable 53 kDa IGFBP-3
  • ALS acid-stable 84 kDa subunit protein.
  • IGFBP is thought to increase the blood half-life of IGF by forming a complex of IGF and IGFBP, and to suppress or promote the physiological activity of IGF (Baxter , RC, et al., Prog. Growth Factor Res., 1, 49
  • ALS is said to not bind to IGF or IGFBP-3 by itself, but recently it has been reported that it exists as a complex of ALS and IGFBP-3 in rat serum (Lee, CY, Endocrinology). , 136, 4982 (1995)).
  • IGF-II producing tumor hereinafter, abbreviated as NICTH
  • big IGF-II in which a sugar chain is added to the E-domain site of IGF-II, mainly exists instead of the normal 7.5 kDa IGF-II.
  • This big IGF-II forms a complex with IGFBP-3, but cannot form a complex of IGFBP-3 and ALS (Baxter, R C., in Modern Concepts of Insul in-Like Growth Factors (Spencer, EM, ed) pp. 371, Elsevier Science Publshing Co., New York-Amsterdam (1991)).
  • Big IGF-II exists mainly in the blood as a complex with IGFBP-3, but this complex blocks the capillary wall. It is said that it can pass (Rechler, MM, Vitam. Horm., 47, 1 (1993)).
  • the complex of big IGF-II and IGFBP-3 is considered to be able to reach the target site.
  • administration of a complex of IGF-1 and IGFBP-3 to a pituitary ablation rat is weaker than administration of IGF-I alone, but an effect of IGF-I was observed. (Zapf, J., et al., J. Clin. Invest., 95, 179 (1995)). Therefore, it is considered that the complex of IGF and IGFBP-3 present in blood has the ability to migrate to the target site and express the activity as IGF.
  • the change in the regulatory mechanism of the complex of IGF and IGFBP includes the presence of the protease of IGFBP.
  • the IGFBP-3 concentration decreases.
  • Examination of what caused the difference by this assay revealed that there was a protease that degrades IGFBP-3 in the blood of pregnant women (Hossenlopp, P., et. Al.). Metab., 71, 797 (1990); Giudice, LC, et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., ⁇ , 806 (1990)). It is thought that the degradation of the protease IGFBP-3 present in blood in this way reduces the affinity between IGF and IGFBP-3, and as a result, increases the affinity of IGF.
  • the activity of IGF originally present in the living body is regulated by IGFBP and ALS.
  • the IGF administered from outside the body is also in a free form, it can be rapidly metabolized, or forms a complex with IGFBP and a complex with IGFBP and ALS. It is thought to be.
  • the expression of the activity is controlled in vivo by the regulatory mechanism of IGF by IGFBP and / or ALS.
  • the present inventors have conducted intensive studies and found that, instead of administering IGF or a substance having an IGF-like activity from outside the body, a substance that increases free IGF in vivo or a combination of IGF and IGFBP exhibiting an IGF-like activity. It has been found that the administration of a substance that increases the complex of the two can exert an IGF action.
  • a substance that converts two complexes of IGF and IGFBP or a complex of three of IGF, IGFBP and ALS to free IGF, and a complex of three of IGF and IGFBP to a complex of two of IGF and IGFBP A substance that converts, a substance that releases IGF or a complex of IGF and IGFBP from a complex of three, or a complex of IGF and IGFBP, or a complex of IGF, IGFBP, and ALS It has been found that the administration of a substance that inhibits body formation can exert an IGF action.
  • the present invention has been made based on such findings, and it is an object of the present invention to effectively utilize endogenous IGF present in a large amount in a living body.
  • an object of the present invention is to provide a method for increasing the concentration of free IGF that converts endogenous IGF in a living body into free IGF having sufficient IGF activity.
  • the present invention also provides a method for increasing the concentration of a complex of IGF and IGFBP, which has a lower IGF activity than free IGF but is higher than a complex of IGF, IGFBP and ALS, and has IGF activity.
  • the purpose is to: DISCLOSURE OF THE INVENTION
  • the present invention provides a method for increasing the concentration of free IGF, which converts endogenous IGF in a living body into free IGF having sufficient IGF activity.
  • It can be carried out by inhibiting the binding between IGF and IGFBP or the binding between IGF and IGFBP and ALS.
  • the present invention also provides a method for increasing the concentration of a complex of IGF and IGFBP, which has a lower IGF activity than free IGF but has a higher IGF activity than a complex of IGF, IGFBP and ALS. This conversion of IGF to IGFBP into a complex
  • the present invention provides the following substances that increase the concentration of free IGF or a complex of IGF and IGFBP in a living body.
  • IGF derivative that binds to IGFBP without substantially binding to both the IGF-1 receptor and the insulin receptor.
  • IGF derivative that binds to IGFBP without substantially binding to both the IGF-I receptor and the insulin receptor, and contains one or more amino acid residues in the amino acid sequence of IGF An IGF derivative in which is added, deleted or substituted.
  • IGF derivative that binds to IGFBP without substantially binding to both the IGF-1 receptor and the insulin receptor, and is a tyrosine residue at position 27 in the amino acid sequence of human IGF-II And the valine residue at positions 4 and 3 IGF derivative substituted with an amino acid residue.
  • An anti-IGFBP antibody that binds to IGFBP without substantially binding to both the IGF-1 receptor and the insulin receptor.
  • An anti-IGFBP antibody that binds to IGFBP-3 without substantially binding to both the IGF-1 receptor and the insulin receptor.
  • the present invention also provides a medicine containing these substances.
  • FIG. 1 is a diagram showing a restriction map of plasmid BP-3 up / p UC19 / ASphI, which is a clone of the 5 ′ region of the rat IGFBP-3 gene.
  • FIG. 2 is a diagram showing a restriction map of plasmid BP-3down / pTVl19N, which is a clone of the rat IGFBP-3 gene 3 'side region.
  • FIG. 3 is a diagram showing a restriction map of a rat IGFBP-3 clone, plasmid BP-3 / pTV119N.
  • FIG. 4 shows a restriction map of plasmid RSV-LTR / rat IGFBP-3 / SV2-Term / SV40-Pro / neo / SV2-Term / + Amp, which is a rat IGFBP-3 expression vector for animal cells;
  • FIG. 5 is a diagram showing a restriction map of a secretory expression vector used for preparing an E. coli expression vector.
  • FIG. 6 is a diagram showing a restriction map of a plasmid having a rat IGFBP-3 gene fragment from which a signal sequence has been deleted.
  • FIG. 7 is a diagram showing a restriction map of plasmid, a rat IGFBP-3 secretion expression vector for Escherichia coli.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of a binding test of Example 10; the affinity of IGF-1 and IGF-II for RBP-3 E. col i (IGFBP-3) and the affinity of RBP-3E. Shows the affinity for IGF-II.
  • FIG. 9A and 9B show the results of various compounds (Table 1) on the binding between IGF-1 and IGFBP-3.
  • FIG. 2 is a view showing an inhibitory activity (Example 11).
  • FIG. 10 is a graph showing the amount of IGFBP-3 bound to immobilized RALS in the presence of IGF-1 or IGF-II, and shows that IGF-I and IGF-II bind to IGF, IGFBP-3, and ALS. The ability to form a complex is shown (Example 12).
  • FIG. 11 shows the results of Example 13 and shows the affinity of ALS for the complex of IGF and IGFBP-3.
  • FIG. 12 shows the results of Example 14 and shows the affinity of ALS for IGFBP-3.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of IGF-1 receptor assay performed in Example 15 using 125 1 -IGF-1 and IGF-I receptor.
  • Example 1 5 is a graph showing the results of the insulin receptor mediation Si with '25 1-Insurin and insulin receptor.
  • FIG. 15 is a diagram showing that the human IGF-II derivative [eu27, Leu43] rIGF-II inhibits binding between IGF and IGFBP-3 (Example 16).
  • FIG. 16 is a view showing that an anti-IGFBP-3 antibody inhibits binding between IGF and IGFBP-3 (Example 17).
  • FIG. 17 shows the total triglyceride concentration in the blood of SD rats 6 hours after administration of IGF-1, IGF-II, IGF-II derivative and anti-IGFBP-3 antibody (Example 18-1). .
  • FIG. 18 is a graph showing the total cholesterol concentration in SD rat blood 6 and 24 hours after administration of IGF-1, IGF-II, an IGF-II derivative and an anti-IGFBP-3 antibody (Example 18). — 1).
  • FIG. 19 is a view showing the total cholesterol concentration in insulin-resistant model rat blood 6 hours after administration of the IGF-1 and anti-IGFBP-3 antibodies (Example 18-2).
  • FIG. 20 is a graph showing the total triglyceride concentration in the blood of an insulin-resistant rat 6 hours after administration of the IGF-1 and anti-IGFBP-3 antibodies (Example 18-2).
  • FIG. 21 is a view showing the concentration of free fatty acids in insulin-resistant model rat blood 6 hours after administration of the IGF-1 and anti-IGFBP-3 antibodies (Example 18-2).
  • FIG. 22 is a diagram showing the concentration of free IGF-1 in the blood of SD rats 1 and 6 hours after administration of the anti-IGFBP-3 antibody (Example 18-3).
  • BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION First, the method for increasing the concentration of free IGF and the method for increasing the concentration of a complex of two of IGF and IGFBP according to the present invention will be described.
  • the method for increasing the concentration of free IGF of the present invention is not achieved by administering IGF or a substance having an IGF-like activity from outside a living body, but is not limited to free IGF originally present in a living body, or a mixture of IGF and IGFBP. It utilizes IGF endogenous in the complex of the two and / or the complex of IGF, IGFBP and ALS.
  • the term “organism” as used herein refers to tissues such as blood, liver, and kidneys of mammals other than humans such as humans, horses, horses, pigs, sheep, and pigs.
  • free IGF refers to not only IGF converted or released from a complex of two or three in vivo, but also a complex of IGF BP or a complex of IGFBP and ALS IGF that does not form a complex.
  • the method for increasing the concentration of free IGF of the present invention is the same as the method for increasing the concentration of free IGF of the present invention.
  • the present method becomes a method of preventing and / or treating a disease which can be prevented and / or treated by the action of IGF.
  • the method of increasing the concentration of the two complexes of IGF and IGFBP of the present invention is as follows.
  • the present method is a method for preventing and / or treating diseases that can be prevented and / or treated by the IGF-like activity of the complex of IGF and IGFBP.
  • the substance of the present invention is different from a substance having an IGF or IGF-like activity that binds to insulin receptor and / or the IGF receptor and expresses its activity. It does not combine.
  • the substance that converts a complex of two of IGF and IGFBP into IGF in the present invention means a substance that acts on the complex of the two and is changed to IGF.
  • administration of a substance that converts the complex to IGF will increase free IGF.
  • the substance capable of releasing IGF from the complex of IGF and IGFBP in the present invention means a substance that acts on the complex of the two to release IGF.
  • the administration of a substance to release increases free IGF.
  • the substance that inhibits the binding between IGF and IGFBP in the present invention means a substance that inhibits formation of a complex between IGF and IGFBP. Therefore, when a substance that inhibits binding is administered, free IGF increases.
  • the three complexes of IGF, IGFBP and ALS are combined with the two complexes of IGF and IGFBP.
  • the substance that converts to a complex means a substance that acts on the complex of the three and converts it into the complex of IGF and IGFBP. Therefore, when a substance that converts to the complex of IGF and IGFBP is administered, the complex of IGF and IGFBP increases.
  • the substance that releases the complex of IGF and IGFBP from the complex of IGF, IGFBP and ALS according to the present invention is a substance that acts on the complex of IGF and IGFBP to act on the complex of IGF and IGFBP.
  • a substance that releases the body Therefore, when a substance that releases the complex of IGF and IGFBP is administered, the complex of IGF and IGFBP increases.
  • the substance that inhibits the binding between the complex of IGF and IGFBP and ALS means a substance that inhibits the formation of the complex of IGF, IGFBP and ALS.
  • the substance that converts a complex of IGF, IGFBP and ALS into IGF means a substance that acts on the complex and is replaced by IGF.
  • administration of a substance that converts the three complexes to IGF will increase free IGF.
  • the substance that releases IGF from the complex of IGF, IGFBP and ALS in the present invention means a substance that acts on the complex of the three to release IGF. Thus, administration of a substance that releases it will increase free IGF.
  • the substance that inhibits the binding between IGF, IGFBP and ALS in the present invention means a substance that inhibits the formation of a complex of IGF, IGFBP and ALS and increases free IGF. Thus, administration of a substance that inhibits binding increases free IGF.
  • the complex of IGF and IGFBP and the complex of IGF, IGFBP and ALS are formed by electrostatic interaction, hydrogen bonding, hydrophobic interaction, etc.
  • the type of IGF, the type of IGFBP, and the like are not particularly limited, and include all types of complexes.
  • a complex of IGF-1 and IGFBP-3 and a complex of IGF-1, IGFBP-3 and ALS can be exemplified.
  • the substance of the present invention When the substance of the present invention is administered, free IGF or a complex of two of IGF and IGFBP increases in the living body, and an IGF action is expressed, so that the substance of the present invention is useful as a medicament. It is useful as a prophylactic and therapeutic agent for diseases that can be prevented and / or treated by IGF.
  • the substance of the present invention may be used, for example, for diabetes, diabetic neuropathy, amyotrophic lateral cord It can be a prophylactic and / or therapeutic agent for sclerosis and osteoporosis.
  • the type of the substance of the present invention can be selected in consideration of the tissue-specific expression of IGFBP and / or the tissue-specific action of IGF.
  • the substance in the present invention is not particularly limited.
  • a substance produced by an organism such as a microorganism, a plant or an animal, a cell of a plant or an animal, or a tissue culture
  • examples include substances produced by the product, extracts of organisms and the like, and chemically synthesized compounds. These may be used alone or as a mixture of two or more.
  • the substances of the present invention include insulin-like growth factor derivatives and anti-insulin-like growth factor binding protein antibodies.
  • An insulin-like growth factor derivative is a derivative of insulin-like growth factor, for example, a compound synthesized by chemically modifying insulin-like growth factor, or an amino acid derivative of insulin-like growth factor using genetic engineering techniques. Examples thereof include one in which one or more amino acid residues are added, deleted or substituted in the acid sequence. Addition, deletion or substitution of amino acid residues can be carried out by the technique described in, for example, Genetic Engineering, 3, 1 (1981); Nucleic Acid Research, 10, 6487 (1982).
  • the insulin-like growth factor derivative of the present invention is preferably a derivative of human insulin-like growth factor-II in which the tyrosine residue at position 27 and the valine residue at position 43 of the amino acid sequence of human insulin-like growth factor-II are each substituted with a mouth isine residue.
  • the method of administering the substance of the present invention may be either parenteral administration or oral administration, but oral administration is preferred in view of simplicity in use.
  • oral administration is preferred in view of simplicity in use.
  • it may be formulated by a generally known method.
  • commonly known additives such as excipients, disintegrants, binders, lubricants, superplasticizers, dispersants, suspending agents, emulsifiers, preservatives and stabilizers are appropriately used. An appropriate amount can be added.
  • Formulations for parenteral administration include ointments, plasters, suppositories, injections, eye drops, nasal drops, ear drops, inhalants, alcoholic beverages, cataplasms, liniments and lotions. And the like.
  • preparation for oral administration include elixirs, capsules, granules, fine granules, pills, suspensions, emulsions, powders, tablets, syrups, mouthwashes, dry syrups, limonade, etc.
  • the dose of the substance of the present invention may be appropriately determined in consideration of the administration method, target disease, patient condition, and the like.
  • the present inventors found that two substances according to the present invention were administered to normal rats and diabetic model rats in vivo, whereby the concentration of free IGF-1 in blood was increased, and It was confirmed that the action was exhibited.
  • any one of IGF, IGFBP, and ALS is directly or indirectly detectably labeled, and the binding between the target compound (for example, IGF) and another binding partner (for example, IGFBP) is inhibited by the addition of the sample.
  • the substance of the present invention is searched for depending on whether or not the label is released from the bound substance (for example, IGF) and the binding substance (for example, IGFBP) by the addition of a sample. can do.
  • a directly detectable label refers to a label whose amount can be directly detected by physical measurement.
  • direct detection of the label by radioactivity measurement Can be. It can also be detected by a method such as Scintillation Proximity Assay (Cook, ND, Drug Discovery today, II, 287 (1996)).
  • Scintillation Proximity Assay Cook, ND, Drug Discovery today, II, 287 (1996).
  • the amount of the labeled substance can be directly detected optically.
  • An indirectly detectable label is a substance that is not physically detectable by itself, but stoichiometrically produces a molecular species (such as a dye or fluorescent dye) that can be directly detected through a chemical reaction. This means that the amount of the labeled substance can be quantified by quantifying the amount.
  • an enzyme substrate may be added to generate a detectable dye or the like, and these may be detected.
  • 1 2 5 I-IGF, 1 2 5 I- IGFBP or 1 2 5 I- The combination of ALS and each appropriate primary antibody complex or IGF two parties of IGF and IGFBP, , IGF BP and ALS can be evaluated for their ability to form a complex.
  • a method such as the Scintillation Proximity Assay can be used to screen multiple samples at high speed.However, the following solid-phase method using an enzyme without using a radioisotope as a labeling substance can be used. It is a convenience.
  • the substance of the present invention that converts a complex of IGF and IGFBP into free IGF or a substance that releases free IGF from a complex of the two is, for example, an IGFBP previously immobilized on a solid phase, a pre-enzyme. Screening is possible by adding a test subject after adding a labeled IGF to form a complex of the two, reacting, washing, and measuring the activity of the enzyme used for labeling. .
  • IGF may be immobilized and IGFBP may be labeled with an enzyme.
  • the substance that inhibits the binding between IGF and IGFBP of the present invention is obtained by simultaneously adding IGF and a test subject, which have been labeled with an enzyme, to immobilized IGFBP, reacting, washing, and washing the enzyme. Screening is possible by measuring the activity.
  • IGF Screening by labeling IGFBP with an enzyme and measuring the enzyme activity a substance that converts the complex of IGF, IGFBP and ALS of the present invention into a complex of IGF and IGFBP, IGF, IGFBP Substances that release the two complexes of IGF and IGFBP from the three complexes of ALS and ALS, substances that convert the three complexes of IGF, IGFBP, and ALS to free IGF, or that of IGF, IGFBP, and ALS
  • the substance that releases IGF from the complex of the three is, for example, the addition of the subject after the formation of the complex of the three by adding IGF and IGFBP previously labeled with the enzyme to the previously immobilized ALS Screening is possible by measuring the activity of the enzyme used for labeling after washing. Those labeled with an enzyme may be replaced by IGF.
  • ALS pre-enzyme-labeled is added to the complex of IGF and IGFBP that has been immobilized beforehand to form a complex of the three, and then the subject is added to carry out the reaction, followed by washing. Subsequently, screening may be performed by measuring the activity of the enzyme used for labeling.
  • IGFBP and ALS previously labeled with an enzyme are added to the previously immobilized IGF to form a complex of the three, and then the test subject is added to carry out the reaction. Screening may be performed by measuring the activity of the enzyme used.
  • the substance obtained by the screening is a substance that converts a complex of IGF, IGFBP and ALS into a complex of IGF and IGFBP, and a complex of IGF, IGFBP and ALS.
  • a substance that releases a complex of IGFBP and IGFBP a substance that converts a complex of IGF, IGFBP, and ALS to free IGF, or that releases a free form of IGF from a complex of IGF, IGFBP, and ALS
  • To determine which of the substances to be released belong to screen the above-mentioned substance that converts the complex of IGF and IGFBP into free IGF or the substance that releases free IGF from the complex of IGF and IGFBP This is possible by applying the method.
  • the substance of the present invention that inhibits the binding between the two complexes of IGF and IGFBP and ALS or the substance that inhibits the binding between IGF and IGFBP and ALS includes, for example, ALS preliminarily immobilized,
  • the reaction is carried out by simultaneously adding the two complexes of the IGFBP labeled with the enzyme and the subject, and after washing, the screening can be performed by measuring the activity of the enzyme used for the labeling. is there. Those labeled with an enzyme may be replaced with IGF.
  • ALS and a subject previously labeled with an enzyme were simultaneously added to a complex of IGF and IGFBP that had been immobilized in advance, and the reaction was performed.After washing, the activity of the enzyme used for labeling was determined. Screening is possible by measuring.
  • IGFBP and ALS previously labeled with an enzyme and a subject are simultaneously added to IGF immobilized in advance, and the reaction is carried out.After washing, screening is performed by measuring the activity of the enzyme used for labeling.
  • screening is performed by measuring the activity of the enzyme used for labeling.
  • the immobilization of IGF, IGFBP or ALS may be performed by a generally known method. That is, a direct solid phase method may be used, or an indirect solid phase method using avidin-biotin, hapten-anti-hapten antibody or the like may be used.
  • a direct solid phase method may be used, or an indirect solid phase method using avidin-biotin, hapten-anti-hapten antibody or the like may be used.
  • the material of the solid phase include glass, plastic mainly composed of polystyrene, polyacrylamide, and cellulose acetate cell.
  • Examples of the form of the solid phase include test tubes, beads, microtiter plates, disks, and chips molded using these materials. Considering high-speed screening of multiple samples using an instrument, it is preferable to use a commercially available multi-well microtiter plate.
  • the enzyme, substrate, buffer, pH, temperature, etc., used for labeling may be appropriately examined, and the measurement may be performed by a commonly known measurement method. And a luminescence method.
  • Enzymatic labeling of IGF, IGFBP or ALS may be performed by a generally known method, and examples thereof include a maleimide method, a periodic acid method, and a dartal aldehyde method.
  • the substrate may be 2-nitrophenyl- ⁇ -D-galactoside, 4-Methyldimethyleryno-D-galactoside and 5-bromo-4-culo-3-indolinole-) 3-D-galactoside.
  • peroxidase 2,2′-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid), 3,3 ′, 5,5′-tetramethyl Benzidine and 1,2-phenylenediamine and the like can be mentioned.
  • alkaline phosphatase examples of the substrate include 4-methyldimbelliferyl phosphate and N-two-terminal phenyl phosphite.
  • Screening is preferably performed in a buffer, which may be one commonly used in measuring enzyme activity, such as sodium phosphate buffer, glycine-sodium hydroxide buffer and Tris-HCl buffer. And the like.
  • the pH of the buffer may be appropriately examined, but pH 6.0 to 7.4 is preferable since the pH may affect the solubility of IGFBP.
  • a salt or a surfactant may be added to the buffer. For example, when sodium chloride is added, its concentration is preferably up to about 0.15M.
  • IGF present in the living body is converted into free IGF or IGF and IGFBP.
  • IGF action can be expressed.
  • the substance of the present invention is useful as a prophylactic and / or therapeutic agent for diseases that can be prevented and / or treated by IGF (such as diabetes, amyotrophic lateral sclerosis, and osteoporosis).
  • Human IGF-1 was purchased from GroPep. Human IGF-II was obtained by the same procedure as the method of Sakano et al. (Sakano, K., et al., J. Biol. Chem., 266, 20626 (1991)). That is, human IGF-II was expressed in Escherichia coli by a genetic recombination technique. After refolding, human IGF- ⁇ extracted from the cells was purified by chromatography using a reversed-phase HPLC column.
  • Example 2 Cloning of rat IGFBP-3 gene
  • Rat IGFBP-3 gene was cloned according to the literature (Shimasaki, S., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., ⁇ 65, 907 (1989)). That is, the rat cDNA cDNA library was made into type III by the PCR method, and the upstream region (5 ′ side) and the downstream region of the IGFBP-3 gene were respectively amplified to obtain each PCR fragment. 5'-side PCR primers for cloning
  • the 5 'clone (BP-3 up / pUC19 / A SphI) was digested with Mulul-Hindlll, and a 250 bp fragment containing BP-3 up was recovered.
  • the 3 'side clone (BP-3 down / pTV119N) was treated with Mul-HindIII / III, and a 250 bp fragment containing BP-3 up was incorporated into this plasmid to produce a rat IGFBP-3 clone (BP -3 / pTV119N: See Figure 3).
  • rat IGFBP-3 clone was cloned into RSV-LTR (raus s arcoma virus long terminal repeat) 3 ⁇ 4r ⁇ plasmid (Nawa, K., et al., Biochem. Biophys. Res. Comraun , 171, 729 (1990)). That is, plasmid BP-3 / pTV119N was digested with Xbal-Hinddlll to obtain a fragment of about 900 bp.
  • RSV-LTR raus s arcoma virus long terminal repeat
  • a secretory expression plasmid using the PhoA signal sequence was prepared and used. That is, a PhoA signal sequence was prepared using a synthetic DNA oligomer, and this was incorporated into the Ncol-Hinddlll portion of pTrc99A (Pharmacia) expression plasmid for Escherichia coli to obtain an expression vector for secretion (see FIG. 5).
  • a PhoA signal sequence was prepared using a synthetic DNA oligomer, and this was incorporated into the Ncol-Hinddlll portion of pTrc99A (Pharmacia) expression plasmid for Escherichia coli to obtain an expression vector for secretion (see FIG. 5).
  • the plasmid BP-3 / pTV119 obtained in Example 2 was used with Nael-Xbal. By cutting, the rat IGFBP-3 gene fragment from which the signal sequence was deleted was recovered.
  • CH0-K1 cells For expression of rat IGFBP-3 in animal cells, CH0-K1 cells were used.
  • the plasmid for animal cell expression of FIG. 4 obtained in Example 3 was introduced into CH0-K1 cells using the calcium phosphate method.
  • Recombinant cells were cloned in a DMEM / F-12 medium containing 0.4 mg / ml G-418.
  • An excellent expression strain was selected and cultured in a T medium containing 1% ITES.
  • the culture supernatant is collected, and an enzyme inhibitor (ImM PMSF / IOU / ml Trasylol I 2mM EDTA) is added to the enzyme inhibitor (2mM), and the mixture is filtered through a filter (CAPSULE FILTER 0.2msterized, Gelman).
  • the ligand affinity column on which IGF-II was immobilized was prepared using a HiTrap affinity column NHS-activated (Pharmacia) according to a conventional method. This column was equilibrated with 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.45 M sodium chloride, and the SP-Sepharose F. F. eluted sample was applied. The buffer was washed with lOmM sodium acetate buffer (pH 7.0) containing 1M sodium chloride and water, and eluted with 0.5M acetic acid. The obtained eluate was collected, lyophilized, dissolved in 0.1% trifluoroacetic acid (hereinafter sometimes abbreviated as TFA), and subjected to reverse phase HPLC.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • Each colony of E. coli (UT5600) expressing rat IGFBP-3 secretion was cultured in LB medium at 37 ° C and 250 rpm, and when Abs reached 3.45, the final concentration of IPTG was reduced to 0. The expression was induced by adding 3 mM. Periplasm was recovered from the collected cells by the osmotic shock method (Nossal, NG et al., J. Biol. Chem., 241, 3055 (1966)), and adjusted to pH 7.2 with phosphate buffer. It was adjusted.
  • Rat A and S were purified from rat serum by the method of Baxter, RC, et al. (Baxter, RC, et al., Endocrinology, 134, 848 (1994)).
  • the tyrosine residue at position 27 and the palin residue at position 43 are simultaneously substituted with a leucine residue to further reduce the affinity of the IGF-I receptor and insulin receptor, and to bind to IGFBP-3.
  • a derivative ([Leu27, Leu43] rIGF-II) with retained affinity was prepared.
  • RBP-3CH0 (rat IGFBP-3 obtained in Example 5) was used as an antigen to immunize egrets (Japanese white, male, 5 birds). Immunization was performed 5 times at 2-week intervals. Protein A column chromatography (PRO SEP-A, manufactured by Bioprocessing) was performed to purify the polyclonal antibody from the obtained antiserum. First, antiserum was diluted 2-fold with PBS, adjusted to pH 7.4, and applied to a Protein A column equilibrated with PBS. After washing with PBS, the column was eluted with a 0.1 M glycine monohydrochloride buffer (pH 3.0), and the obtained eluted fraction was immediately concentrated by ultrafiltration and buffer-exchanged to PBS. Finally, five types of polyclonal antibodies (anti-RBP-3 pAb # 35, # 36, # 88, S89 # 90) were obtained.
  • the test was performed under the following basic conditions.
  • a 96-well microtiter plate manufactured by Costar was used.
  • the basic buffer was 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5), the basic buffer was used for solid phase immobilization, the buffer was supplemented with 0.03% Tween 20 for washing, and the buffer was supplemented with 1% BSA for blocking.
  • buffers supplemented with 0.25% BSA and 0.03% Tween 20 were used, respectively. Washing for each reaction was performed twice at 400 ⁇ l / well.
  • the horseradish peroxidase label IGF-II (hereinafter sometimes abbreviated as HRP-IGF-II) was produced using a commercially available labeling kit (manufactured by PIERCE) in accordance with an ordinary method.
  • RBP-3 E. coli 150 ng / ml obtained in Example 6 was added to a microtiter plate at 50 // 1 / well, and allowed to stand at 4 ° C for at least- ⁇ to solidify. .
  • HRP-IGF-II final concentration 12,000-fold diluted
  • HRP-IGF-II final concentration 12,000-fold diluted
  • ABTS 2,1 / 2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)
  • ABTS 2,1 / 2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)
  • the absorbance value when no inhibitor was added was set to Bo, and the absorbance value when the inhibitor was added was set to B.
  • the non-specific binding amount (NSB) was defined as the absorbance obtained when RBP-3E. Col was immobilized on a solid without adding a sample (inhibitor). The amount of labeled IGF-II bound to the solidified IGFBP-3 at the time of sample addition (%)
  • a binding inhibition experiment was performed according to Example 10 using each compound described in Table 1 below as a sample.
  • Each compound was dissolved or suspended in a basic buffer containing 5% methanol to a concentration of lmg / ml and diluted 5-fold with a reaction buffer to give 200 jug / ml.
  • the binding amount (%) between IGF-II and IGFBP-3 (RBP-3 E.coli) was measured, and “100 (%) — binding amount (%)” was inhibited by the sample.
  • Activity (%).
  • the measurement was performed twice, and the average value of the inhibitory activities was determined. The results are shown in Figures 9A and 9B.
  • the final concentration of each compound at the time of measurement is 100 g / ml. High inhibitory activities were observed for compound 27 (Ellagic acid), compound 29 (Aclacinomycin A), and compound 31 (Heparin).
  • Vitamin Be Example 1 2 Binding test between IGF, IGFBP-3 and ALS in solid phase system (1) Under the basic conditions described in Example 10, first, 50 ⁇ l of streptavidin (lig / ml) was added to a microtiter plate. 1 / well was added, and the mixture was allowed to stand at ⁇ 4 ° C. or more for solidification. After blocking with a blocking buffer, 50 ⁇ l / ⁇ ⁇ of RALS (rat ALS of Example 7: 50 ⁇ g / ml), which had been biotinylated as usual, was added using a biotinylation kit (manufactured by Amersham). The reaction was performed at 25 ° C for 2 hours.
  • streptavidin lig / ml
  • RBP-3E.coli final concentration 25 ng / ml
  • various concentrations of IGF-1 or IGF-II as samples were added simultaneously to give a total of 50 1 / ⁇ -l at 4 ° C. ⁇ Reacted.
  • the anti-RBP-3 pAb # 35 (3 g / ml) obtained in Example 8 was added at 50 / ⁇ 1 / ⁇ After reacting at 25 ° C for 2 hours, add 50/1 / ⁇ labeled secondary antibody (anti-rabbit IgG, horseradish peroxidase l inked whole antibody, 1,000-fold dilution, manufactured by Amersham). And reacted at 25 ° C for 2 hours.
  • the ABTS solution was added at 100 / Z1 / ul, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 20 minutes, after which the absorbance (Abs405nm) was measured.
  • the value (absorbance) when IGF-I or IGF-II was added as a sample was B, and the value (absorbance) when 300 pM of IGF-II was added as a sample was total bound (100%).
  • the value (absorbance) obtained by assembling without adding biotinylated RALS was defined as the non-specific binding amount (NSB).
  • streptavidin (lg / ml) was first added. 50/1 / well was added to the microtiter plate, and the plate was allowed to stand at 4 ° C for at least 10 minutes to immobilize it. After blocking with a blocking buffer, biotinylated RALS (200 ng / ml) was added at 50 ⁇ l / ml and reacted at 25 ° C for 2 hours. Next, HRP-IGF-II (final concentration 2,000-fold diluted) and RBP-3E. Coli (final concentration 25 ng / ml) were added simultaneously to a final concentration of 50 ⁇ l / ⁇ l, and the mixture was added at 25 ° C. Allowed to react for hours. After washing, the ABTS solution was finally added at 100 zl / Peel, allowed to stand at room temperature for 20 minutes, and then the absorbance (Abs405nm) was measured.
  • HRP-IGF-II 2,000-fold final concentration
  • RBP-3E. Coli final concentration 25 ng / ml
  • RALS competitive concentration
  • the absorbance when no biotinylated RALS was added was defined as the non-specific binding amount (NSB), the absorbance when no inhibitor was added was Bo, and the absorbance when the inhibitor was added was B.
  • the competitive inhibitor (RALS) was added, the binding amount (%) of IGFBP-3 and IGF-II to immobilized RALS was
  • streptavidin (l jug / ml) was added to a microtiter plate in an amount of 50 ⁇ l / well, and then allowed to stand at 4 ° C for at least- ⁇ to solidify. Phased. After blocking with blocking buffer, add 50/1 / ⁇ ⁇ of biotinylated RALS (200ng / ml). The reaction was performed at C for 2 hours. Next, RBP-3E.coll (100 ng / ml) (50 ⁇ l / ml) was added, and the mixture was allowed to react at 4 ° C.
  • the complex of IGFBP-3 and ALS formed by these reactions was added to the anti-RBP-3 pAb # 35 (3 ⁇ g / ml) obtained in Example 9 at 50 ⁇ l / ⁇ 2 hours, then add 50 ⁇ l / ⁇ of secondary antibody The reaction was performed at 25 ° C for 2 hours. Finally, the ABTS solution was added in 100/1/1 / well, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 20 minutes, and then the absorbance (Abs405nm) was measured. In the case of competitive inhibition experiments, RBP-3E.
  • 125 I-IGF-1 (or 125 1-insulin) (manufactured by Amersham) 2 x 10 4 cpm amount and each receptor are incubated, and each of them is added to an Atsushi system that can obtain 50% binding. One amount of the receptor was determined.
  • These receptors I 25 I- IGF-I or 125 1- I insulin (2 X l0 4 cpm), various concentrations of [Leu27, Leu43] rIGF- II was added, with 0.1% BSA and 0.075% Triton X- 100 The reaction solution was adjusted to 300 // 1 with 50 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.4), and reacted at 4 ° C for one hour.
  • IGF-1 receptor-one-assay For comparison, in the case of the IGF-1 receptor-one-assay, the same operation as above was performed except that IGF-1 or IGF-II at each concentration was added as a sample instead of [Leu27, Leu43] rIGF-II. Was. In the case of the insulin receptor assay, the same operation as above was performed except that insulin or IGF-II at each concentration was used instead of [Leu27, Leu43] rIGF-II.
  • NBS nonspecific binding amount
  • Bo the value when no sample was added
  • B the value when the sample was added
  • FIG. 1 3 shows the results of the IGF 1 receptor mediation Si using 1 2 5 I- IGF 1 and the IGF 1 receptor one.
  • IGF-II has the same level of affinity for the IGF-I receptor as IGF-1, whereas [Leu27, Leu43] rIGF-II has the same affinity for the IGF-I receptor. It was confirmed that it was reduced to ⁇ 2%.
  • Figure 1 4 shows the results of the insulin receptacle descriptor one Atsusi with 1 2 5 1 Insurin and insulin receptor.
  • IGF-II has a similar affinity for the insulin receptor as insulin, whereas [Leu27, Leu43] rIGF-II has a reduced affinity for the insulin receptor to 1-2% I was able to confirm that I was doing it.
  • the anti-IGFBP-3 antibody (anti-RBP-3 pAb) obtained in Example 9 and the extent to which the binding between IGF and IGFBP-3 was inhibited were evaluated according to Example 10. That is, the measurement was performed in exactly the same manner as in Example 10 except that an anti-IGFBP-3 antibody was used as a sample (competition inhibitor).
  • antibodies # 35 and # 90 had the strongest binding inhibitory activity, and 0.2632% in molar ratio (2% in weight ratio) when the activity of RBP-3E. Col i (IGFBP-3) was 100%. ) Met.
  • Antibodies # 36 and S89 showed almost the same activity at a molar ratio of 0.0875%, and antibody # 88 had a slightly weaker activity at a molar ratio of 0.0525%, but all antibodies were IGF and IGFBP-3. It was confirmed that the binding was inhibited (see Figure 16).
  • Example 18 Characteristics of human IGF-II derivative and anti-IGFBP-3 antibody in vivo
  • the anti-RBP-3 pAb # 35 (20 mg / head) obtained in Example 9 was intraperitoneally administered to another SD rat group.
  • physiological saline 500 l / head
  • IGF-1 50 / g / kg, 200Mg / kg was subcutaneously administered.
  • Plasma total cholesterol and total triglyceride concentrations were measured by an enzymatic method using Photocella CH02 and TG2 (both manufactured by Daiichi Kagaku) using a Hitachi 7150 automatic analyzer according to the standard measurement method.
  • FIGS. 17 and 18 show the values (%) after administration when various concentrations before administration (0 hour) are taken as 100%, and SEM (Standard Error Means) is indicated by bars.
  • SEM Standard Error Means
  • the plasma free fatty acid concentration was measured by an enzyme method using NEFAC-Test Co. (Wako Pure Chemical Industries) in a 96-well microtiter plate (Costar) at 1/20 scale of the standard operation method. It was determined by measuring the absorbance (Abs550 nm) with Vmax, manufactured by Molecular Devices.
  • a binding inhibitory antibody that is, an anti-IGFBP-3 antibody that inhibits the binding between IGF and IGFBP-3 had the same lipid level lowering effect as administration of IGF.
  • FIGS. 18, 19 and 20 show the values (%) after administration when various concentrations before administration (0 hour) were set to 100%, and the SEM values were indicated by bars.
  • anti-RBP-3 pAb # 90 40 mg / head
  • saline 500 / xl / head
  • Serial blood collection was performed according to Example 18-1.
  • I- IGF- 1 (7.77X 10 3 cpm / 100M 1), and the antiserum 50 th eq, Standard or by mixing the specimen, mediation Si buffer (0.25% BSA, 0.05% Tween 20 And 0.1% NaN 3 in 25 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5) to make 300 ⁇ l, and reacted at 4 ° C.
  • 75 ⁇ l of 4 mg / ml human ⁇ -globulin and 3751 of 25% PEG 6000 were added, and the mixture was incubated at 4 ° C for 1 hour and centrifuged (3, OOOrpm X 20min, 4 ° C). The centrifugal supernatant was removed, and ⁇ -count (CPM) contained in the precipitate was measured.
  • the ratio of free IGF-1 to total IGF-I concentration was significantly increased 6 hours after administration of anti-RBP-3 pAb # 90 compared to the negative control group. As a result, it was confirmed that the concentration of free IGF-I was increased (see FIG. 22).
  • Fig. 22 shows the value of 1% and 6 hours after administration assuming that the ratio of free IGF-I (free / total) to the total IGF-1 before administration (0 hour) was 100%. Values are indicated by bars.

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Description

明 細 書
遊離型ィンスリン様成長因子の濃度上昇方法 技術分野
本発明は、 生体内に大量に存在している内在性のインスリン様成長因子を有効 に利用する方法に関する。 背景技術
インスリン様成長因子 （以下、 IGFと略する。） には、 分子種が 2種類存在し、 それぞれ IGF - 1と IGF - IIと呼ばれている。 ヒ トの IGF-Iと IGF - IIはそれぞれァミノ 酸 70個と 67個からなり、 このうち IGF- 1は、 インスリンの部分構造である Cぺプ チドに相当する部分のァミノ酸が IGF- IIに比べると 3個多い。 IGF - 1と IGF - II間 のァミノ酸配列の相同性は約 60%であり、 IGF-Iとインスリンとの間では約 40%の 相同性がある。 生体内における IGF-Iの産生場所は、 肝臓 ·腎臓が主と考えられ ていたが、 その後 m R N Aを用いたノーザンプロッティング法による解析の結果 から、 IGF-Iは体組織のほとんどの部位で作られていることが明らかになった （D ' Ercole, A. J.， et al. , Proc. Natl. Acad. Sci . USA. , 81， 935 (1984)； Hum bel, R. E. , et al. , Eur. J. Biochem. , 190, 445 (1990) )。 すなわち、 IGF - 1 はェンドクリンとして作用するばかりでなく、 パラクリンゃォ一トクリンとして も作用している。
IGF- 1と IGF-IIには、 これらにそれぞれ特異的なレセプター、 IGF-Iレセプタ一 および IGF- 11/カチオン非依存性マンノース 6 リン酸レセプターが存在する。 但 し IGF-I Iは IGF-Iレセプターとも結合し、 IGF- IIの種々の生物活性は主に細胞表 面上の IGF-Iレセプターを介した現象であると考えられている （Casella, S. J. , et al. , J. Biol. Chem. , 261, 9268 (1986)； Sakano, K. , et al.， J. Biol. Chem. , 266, 20626 (1991) )。
IGF- 1レセプターはァミノ酸配列から見ると、 インスリンレセプターと相同性 が高く、 その細胞内情報伝達機構も類似している （Shemer, J.， et al. , J. Bio
1. Chem. , 262, 15476 (1987)； Myers, M. G. Jr. , et al. , Endocrinology, 13 2, 1421 ( 1993) )。 動物実験の結果から、 IGFの糖代謝活性はインスリンと異な り、 末梢組織で活発であるので、 レセプターの発現部位の違いによってインスリ ンと IGFの作用部位が異なるものと考えられている （Laager, R. , et al. , J. CI in. Invest. , 92, 1903 (1993) )。
ヒ トの成人の血中には、 IGFは平均約 100nM、 インスリンは約 ΙΟΟρΜ存在してい ると われてレヽる (Baxter, R. C. , in Modern Concepts of Insul in-Like Grow th Factors (Spencer, E. M. , ed) pp. 371， Elsevier Science Publishing Co. ,
New York-Amsterdam (1991) )。 生体内に存在する IGFのほとんどはその特異的 結合タンパク質である IGF結合タンパク質 （以下、 IGFBPと略する。） と複合体を 形成している。 IGFBPと結合していない遊離型 IGFの血糖降下作用はィンスリンの 約 5〜10¾>であるので （Guler, H. P. , et al. , New Engl. J. Med. , 317, 137 (1987) )、単純に血糖降下作用だけをみると、 インスリンの約 50〜100倍のィンス リン様物質が内在していることになる （Baxter, R. C. , in Modern Concepts of
Insulin-Like Growth Factors (Spencer, E. M. , ed) pp. 371, Elsevier Science
Publ ishing Co. , New York-Amsterdam (1991) )。
糖尿病は、 現在その臨床像から WH Oの分類に従って、
(1)ィンスリン依存性糖尿病 (insul in-dependent diabetes mellitus；以下、 IDDMと略する。）、
(2)インスリン非依存性糖尿病 (non insul in dependent diabetes mell itus ； 以下、 NIDDMと略する。）、
(3)その他の糖尿病 （膝疾患に伴うもの、 内分泌疾患に伴うものなど） と 3つに大別されている。
IDDMに関しては、 インスリン療法が主要な治療法であるが、 NIDDMに関しては、 食事療法、 運動療法、 経口血糖降下剤およびインスリン療法等が主に採用されて いる。 近年では、 インスリンを投与しても無効なインスリン抵抗性糖尿病におい て、 IGFによる治療効果が検討されている。 （Kuzuya, H. , et al . , Diabetes, 4
2, 696 ( 1993) )。 また、 NIDDMにおいても IGFによる治療効果が検討されている (Zenobi, P. D.， et al. , J. Cl in. Invest. , 90, 2234 (1992)； Moses, A. C.， et al. , Diabetes, 45, 91 (1996) )。
Gulerらは、 IGF-I 100 μ g/kgを成人に静脈注射したところ、 血糖が経時的に低 下し、 20分後に最低値となる血糖降下作用を認めた （Guler, H. P. , et al. , Ne w Engl. J. Med. , 317, 137 (1987) )。
Takanoらは、 成人に IGF-I 60〜120 g/kgを皮下注射にて投与して血糖降下作 用を認めた。 また、 IGF-I lOO ju g/kgを 6日間連続投与し、 血中尿酸値およびク レアチニン値の低下を認めた （Takano, K.， et al. , Endocrinol. Jpn.， 37. 30 9 (1990) )。
その他、 IGF- 1の投与による血中遊離脂肪酸の低下 （Turkalj. I.， et al. , J. Clin. Endocrinol. Metab. , 75, 1186 (1992) ) およびトリグリセライ ド等の中 性脂肪の低下 （Turkalj, I. , et al. , J. Cl in. Endocrinol. Metab. , 75, 1186 (1992)； Zenobi, P. D. , et al. , J. Cl in. Invest. , 90, 2234 (1992) )、 総コ レステロールの低下 （Zenobi, P. D. , et al.， Diabetologia, 36， 465 (199 3) ) や、 腎血流量および糸球体ろ過率の増加 （Elahi, D. , et al. , in Modern C oncepts of Insul in-Like Growth Factors (Spencer, E. M. , ed) pp219, Elsevie r Science Publ ishing Co. , New York-Amsterdam (1991) ) につレヽての報告もあ る。
また、 IGF- IIの投与が、 難治性糖尿病に対して有効であったという報告もある (Usara, A. , et al. , Diabetes, 44, Suppl. 1, 33A, (1995) )。 さらに、 出血 性ショック時の糖代謝を含めたストレス状態を緩和、 並びに糖輸液の使用による 副作用の軽減、 およびエネルギー供給を目的とした IGF- 1の投与の有効性がモデ ル動物を用いた実験から示唆されている （特開平 7-242565号公報）。
IGFの作用については、 血糖降下作用だけではなく、 細胞増殖作用、 細胞分化 作用、 タンパク質同化作用が動物およびヒ トに投与して検討されている。 損傷し た末梢神経に IGF-Iを局所投与すると、 関連する非神経細胞の増殖とともに神経 細胞も刺激されることが分かった。 脊髄細胞に IGF-Iレセプターが認められ、 IGF - 1投与は運動ニューロンの細胞死を減少させることが報告されている。 また、 筋 肉の終板を増大させたり、 座骨神経損傷時の機能回復を促進したり、 化学療法時 にみられる末梢運動麻痺を予防することが認められている （Sjoberg, J.， et a 1. , Brain Res. , 485, 102 (1989) ) 0
これらの実験結果により、 筋萎縮性側索硬化症や運動ニューロンの変性疾患に IGF- 1の臨床治験が行われている （Lewis, M. E. , et al. , Exp. Neurol. , 124. 73 (1993) )。 同様に、 アルツハイマー病、 卒中、 筋萎縮性側索硬化症およびパー キンソン病等に認められるニューロン細胞の生存を促進するために IGFの作用を 利用することも考えられている （特表平 6-510305号公報）。 さらに筋ジストロフ ィ一についても IGF-Iの有効性が報告されている （Vlachopapadopoulou, E. , et al. , J. Clin. Endocrinol. Metab. , 80, 3715 (1995) )。
糖尿病性神経症に対する IGFの作用についても検討がなされており、 IDDMモデ ノレラッ卜である STZ—rat (streptozotocin— diabetic rat) iこおレヽて、 血糖降下を伴 わない IGF投与量により糖尿病性神経症の改善が見られることが報告されている (Zhuang, H- X. et al. , Exp. Neurol. , 140, ppl98-205 (1996) )。 また NIDDM モデルラットである diabetic obese Zuker (fa/ fa) ratの座骨神経、 脊髄神経及び 脳神経では IGF_IImRNAレベルの低下が見られ、 血糖降下を伴わない量の IGF- Π投 与により糖尿病性神経症の改善が見られることも報告されている （Zhuang, H-X, et al. , J. Pharmacol. Exp. Ther.， 283, pp366 - 374 (1997) )。 これらのこと から糖尿病性神経症治療への I GF療法の有効性が示唆されている。
心機能に関しても IGF-I投与が心筋障害を改善するか否か検討されている。 す なわち、 ラッ トにドキソルビシンを投与して心筋障害を作成し、 心拍出量を検討 したところ、 IGF - 1の投与は障害を受けた心筋の機能を改善したと報告されてい る （Ambler, G. R. , et al. , Cardiovasc. Res. , 27. 1368 (1993) )。 同様に、 心筋炎または心筋梗塞を含む心筋障害、 心臓病または急性発作の予防または治療 のため、 並びに心臓拍動量の増加による拍出量の改善を目的として IGF- 1が使用 されている （特表平 6-504286号公報）。
また、 虚血による急性腎不全の実験動物を作成し、 IGF- 1の効果を検討した報 告がある。 虚血 5日目より IGF- 1を皮下注射で 1 日 3回、 3日間投与したところ、 対照に比し腎機能の改善、 尿細管細胞増殖促進、 タンパク質分解抑制およびタン パク質合成促進が認められ、 全体としてカタボリズムを減少させたと報告されて いる （Ding, H. , et al.， J. Cl in. Invest. , 91, 2281 (1993) )。
皮膚損傷 （外傷、 火傷等） 時に IGF- 1を局所に投与すると、 治癒に至る期間が 縮小することも報告されている。 火傷を受けたラッ トの実験では、 ラット IGF-I の投与により体重、 腸粘膜重量、 粘膜 D N A、 タンパク質量の増加を認め、 腸内 細菌の腸内リンパ腺への移動も減少し、 従って腸管機能も改善し全体として生命 予後に良好な結果をもたらしたと報告されている （Huang, K. F.， et al. , Arch. Surg. , 128, 47 (1993) )。
IGF- 1は血小板由来成長因子 （以下、 PDGFと略する。） と一緒になって間葉培 養細胞の有糸分裂およびタンパク質合成を促進し、 皮膚障害に対する PDGFまたは IGF- 1単独適用では治癒促進しないが、 両因子を一緒に適用すると、'結合組織お よび上皮組織の成長が促進する （Stiles, C. D. , et al. , Proc. Natl. Acad. S c i. USA, 76, 1279 ( 1987) )。 しかし、 他の報告では、 傷への個々の成長因子の 適用によって傷治癒が刺激されたとされている （Tsuboi, R.， et al. , J. Exp. Med. , 172, 245 (1990) )。 そこで、 傷の治癒の促進を目的とした IGFの利用が試 みられている （特開昭 63- 233925号公報、 特表平 3-505870号公報、 特表平 6- 50619 1号公報、 特開平 7- 316066号公報）。
また、 IGF-Iには免疫能力を改善する効果がある。 胸腺または炎症部位などの 組織中で局所的に産生された IGF- 1は、 IGF- 1レセプターを有している Tリンパ球 の増殖および機能の向上に関与していると考えられている （Tapson, V. F. , et al. , J. Cl in. Invest. , 82, 950 (1988) )。 また、 IGF- 1はナノモル濃度では、 リンパ球に対する増殖促進因子であることが報告されている （Schimpff, R. M. , et al. , Acta Endocrinol . 102, 21 (1983) ) 0 従って、 エイズ患者をはじめと する免疫不全患者への IGF- 1の使用も検討されている （特表平 6-508830号公報）。 さらに、 IGF-Iには骨量増加作用があるので骨粗鬆症の治療に効果があると考 えられている （Bennett, A. E.， et al. , J. Cl in. Endocrinol. etab. , 59， 7 01 (1984)； Brixen, K. , et al. , J. Bone. Miner. Res. , 5, 609 (1990)； Joha nnsson, A. G. , et al.， J. Intern. Med. , 234, 553 (1993)； Johannsson, A. G. , et al. , Lancet, 339, 1619 (1992)； Riggs, B. し.， Am. J. Med. , 95, Sup pl. 5A， 62S, (1993)； 特開平 4- 235135号公報、 米国特許第 4， 861, 757号）。
0 一 しかしながら、 IGFはもともと生体内ではほとんどが IGFBPと複合体を形成し、 それらの生理作用が調節されていることが知られている （Rechler, . M. , Vita m. Horm.， 47, 1 (1993)； Clemmons, D. R.， Growth Regul. , 2， 80 (1992) )。
IGFBPは、 今までに 6種類存在することが知られており、 それらは各々 IGFBP- 1 から IGFBP- 6と命名されている。 これら 6種類の IGFBPはアミノ酸配列では、 相互 に高い相同性を示し、 特に N末端側と C末端側のいずれもシスティンを多く含む ドメインでは相同性が顕著であり、 IGFBPのアミノ酸配列上での中間部分では相 同性があまり認められない。 ヒ トの場合、 これら 6種類の IGFBPでは 16個のシス ティンの位置が保存されている （なお、 IGFBP-1から IGFBP - 5の 5種類の IGFBPで は 18個のシスティンが位置的に保存されている。） (Shimasaki, S.， et al.， Pr og. Growth Factor Res. , 3, 243 (1991) )。
ヒ トの成人の血中における IGFBP-1、 IGFBP- 2、 IGFBP- 3の濃度はそれぞれ約 2 n Μ、 5 ηΜ、 ΙΟΟηΜであり、 血中では IGFBP-3が、 IGFに対する主な結合タンパク質で める (Baxter, R. C.， in Modern Concepts of Insul in- Like browth Factors (Spencer, E. M. , ed) pp371, Elsevier Science Publ ishing Co. , New York-Am sterdara ( 1991) )。 しかし、 健常人の血清を中性条件下でゲルろ過し、 IGFの溶 出位置を確認すると、 ほとんどの IGFは 150kDa付近に溶出され 3つの分子の複合 体として存在する （Baxter, R. ， et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6898 (1989) )。 この 3つの分子の複合体は、 分子量約 7. 5KDaの IGF- 1 (又は IGF - Π) と、 酸に安定な 53KDaの IGFBP-3に加え、 さらに酸に不安定な 84KDaのサブュ ニット蛋 白 （Acid Labi le Subunit；以下、 ALSと略する。 α -サブユニッ トとも 呼ばれる） から構成されている。 そして、 IGFが血中の主要な結合タンパク質で ある IGFBP - 3と結合したときにのみ、 これに ALSが結合して、 150KDaの複合体を形 成するものと考えられている。
遊離型 IGFや、 IGFと IGFBPの 2者の複合体は毛細血管壁を通過できるが、 IGFと IGFBP - 3と ALSの 3者の複合体は通過できないとされている （Rechler, M. M. , Vi tarn. Horm. , 47, 1 ( 1993) )。 一方、 IGFのヒ ト血中内半減期は、 遊離型 IGFの場 合は約 10分と短いが、 IGFと IGFBPの複合体では約 3 0分、 また IGF、 IGFBP-3およ び ALSの 3者の複合体では約 15時間である （Zapf， J. , et al. , in Modern Conce pts of Insul in -し ike Growth Factors (Spencer, E. M. , ed) pp. 591, El sevier
Science Publ ishing Co. , New York-Amsterdam (1991) )。
従って、 ALSは、 IGFBP- 3と共に、 IGF、 IGFBP- 3および ALSの 3者の複合体を形 成することで、 IGFの血中半減期を延長させると共に、 IGFの生理活性を抑制する ものと考えられ、 また IGFBPは、 IGFと IGFBPの 2者の複合体を形成することで IGF の血中半減期の延長を図るとともに、 IGFの生理活性を抑制または促進するもの と考えられている （Baxter, R. C. , et al. , Prog. Growth Factor Res. , 1， 49
(1989) )。
ALSの種差はほとんどなく、 ヒ トとラットの ALSの相同性は 78%である （Dai，J.， et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. , 188， 304 (1992) )。 ALSは、 単独では I GFまたは IGFBP-3と結合しないと言われているが、 近年、 ラット血清中では、 ALS と IGFBP - 3の複合体として存在するという報告もある （Lee, C. Y.， Endocrinolo gy, 136, 4982 (1995) )。
生体内に IGFを投与した場合、 主に活性を発現する遊離型 IGFの血中濃度はさほ ど上昇せずに、 IGFBP - 2の血中濃度の上昇が認められることが知られており、 こ のことから生体内には IGFによる IGFBPの発現調節機構が存在すると考えられてい る (Zapf, J. , et al. , in Modern Concepts of Insul in -し i Ke Growth Factors (Spencer, E. M. , ed) pp. 591, Elsevier Science Publ i shing Co. , New York-Ams terdam (1991) )。
また、 IGF、 IGFBP- 3および ALSの 3者の複合体による調節機構の変化として、 低血糖を呈する膝外腫瘍 （IGF - I I産生腫瘍：以下、 NICTHと略する。） の例があ る。 NICTH患者では通常の 7. 5kDaの IGF- I Iの代わりに IGF- I Iの E—ドメイン部位 に糖鎖が付加したいわゆる big IGF- IIが主要に存在している。 この big IGF- IIは IGFBP- 3と複合体を形成するものの、 IGFBP - 3と ALSとの 3者の複合体は形成でき レヽ (Baxter, R C. , in Modern Concepts of Insul in-Like Growth Factors (Spencer, E. M. , ed) pp. 371, Elsevier Science Publ ishing Co. , New York-Am sterdam ( 1991) )。 それにより、 biglGF- I Iによる血糖降下作用が ALSによって妨 害されることなく発現されると考えられている。 big IGF - IIは、 血中では主とし て IGFBP- 3との複合体として存在するものであるが、 この複合体は毛細血管壁を 通過できると言われている （Rechler, M. M.， Vi tam. Horm. , 47, 1 (1993) )。 従 つて、 big IGF - IIと IGFBP-3の複合体は標的部位に到達できるものと考えられる。 また、 IGF- 1と IGFBP-3の複合体を脳下垂体除去ラッ トに投与しても、 IGF-I単独 投与の場合よりも弱いが、 IGF-Iの作用が認められたとの報告もある （Zapf, J.， et al. , J. Clin. Invest. , 95, 179 (1995) )。 従って、 血中で存在する IGFと IGFBP- 3の複合体は標的部位へ移行して IGFとしての活性を発現する能力があるも のと考えられる。
さらに、 IGFと IGFBPの複合体の調節機構の変化として IGFBPのプロテアーゼの 存在が挙げられる。 妊娠後期の妊婦血中 IGFBP-3濃度を分析すると、 抗 IGFBP- 3抗 体を用いた RIAでは軽度上昇が認められるのに対し、 1 2 5 I- IGFを用いたゥエスタ ン リガンド プロッ ト法では、 逆に IGFBP-3濃度は低下する。 この測定法によ る差が何に起因するものかを調べた結果、 妊婦血中には IGFBP- 3を分解するプロ テア一ゼが存在することが明らかにされた （Hossenlopp, P. , et al. , J. Clin. Endocrinol. Metab. , 71, 797 (1990)； Giudice, L. C. , et al.， J. Cl in. End ocrinol. Metab. , Π , 806 (1990) )。 このように血中に存在するプロテア一ゼ 力 IGFBP- 3を分解するため、 IGFと IGFBP-3との親和性が低下し、 その結果 IGFのァ べィラピリティーを増加するものと考えられている。
このように、 もともと生体内に存在する IGFは、 IGFBPおよび ALSによりその活 性が調節されている。 また、 生体外から投与された IGFも遊離型であれば速やか に代謝される力、 あるいは新たに発現してきた IGFBPとの 2者の複合体や IGFBPお よび ALSとの 3者の複合体を形成するものと考えられる。 生体外から IGFまたは IG F様活性を持つ物質を投与しても、 生体內における IGFの IGFBPおよび/または ALS による調節機構により、 その活性の発現は制御されている。
そこで、 本発明者らは鋭意検討した結果、 生体外から IGFあるいは IGF様活性を 持つ物質を投与するのではなく、 生体内において遊離型 IGFを増やす物質や、 IGF 様活性を示す IGFと IGFBPの 2者の複合体を増やす物質を投与することにより、 IG F作用を発現させることができることを見いだした。
すなわち、 IGFと IGFBPの 2者の複合体や IGF、 IGFBPおよび ALSの 3者の複合体 から遊離型 IGFに変換する物質、 3者の複合体から IGFと IGFBPの 2者の複合体に 変換するような物質、 3者の複合体から IGFや IGFと IGFBPの 2者の複合体を遊離 させる物質、 または IGFと IGFBPの 2者の複合体形成や IGFと IGFBPと ALSの 3者の 複合体形成を阻害する物質を投与することにより、 IGF作用を発現させることが できることを見いだした。
本発明はこのような知見に基づきなされたものであり、 生体内に大量に存在し ている内在性の IGFを有効に利用することを目的とする。
すなわち、 本発明は、 生体内に内在している IGFを、 十分な IGF活性を有する遊 離型 IGFに変換する遊離型 IGFの濃度上昇方法を提供することを目的とする。
また本発明は、 遊離型 IGFよりは IGF活性は低いものではあるが、 IGFと IGFBPと ALSの複合体に比べ高レ、 IGF活性を有する IGFと IGFBPとの複合体の濃度上昇方法を 提供することを目的とする。 発明の開示 本発明は、 生体内に内在している IGFを、 十分な IGF活性を有する遊離型 IGFに 変換する遊離型 IGFの濃度上昇方法を提供する。
この遊離型 IGFへの変換は、
IGFと IGFBPの複合体、 又は IGF、 IGFBPおよび ALSの複合体を IGFに変換するこ とにより ；
IGFと IGFBPの複合体から、 又は IGF、 IGFBPおよび ALSの複合体から、 IGFを遊 離させることにより ；或いは、
IGFと IGFBPとの結合、 又は IGFと IGFBPと ALSとの結合を阻害することにより、 行うことができる。
また本発明は、 遊離型 IGFよりは IGF活性は低いものではあるが、 IGFと IGFBPと ALSの複合体に比べ高い IGF活性を有する IGFと IGFBPとの複合体の濃度上昇方法を 提供する。 この IGFと IGFBPとの複合体への変換は、
IGF、 IGFBPおよび ALSの 3者の複合体を、 IGFと IGFBPの 2者の複合体に変換 することにより ；
3者の複合体から、 IGFと IGFBPの 2者の複合体を遊離させることにより ；或 いは
IGFと IGFBPの 2者の複合体と、 ALSとの結合を阻害することにより
行うことができる。
さらに本発明は、 生体内の遊離型 IGF又は IGFと IGFBPとの複合体の濃度を上昇 させる以下の物質を提供する。
1)生体内の IGFと IGFBPの 2者の複合体を遊離型 IGFに変換する物質。
2)生体内の IGFと IGFBPの 2者の複合体から、 遊離型 IGFを遊離させる物質。
3)体内の IGFと IGFBPとの結合を阻害する物質。
4)体内の IGF、 IGFBPおよび ALSの 3者の複合体を、 IGFと IGFBPの 2者の複合体 に変換する物質。
5)体内の IGF、 IGFBPおよび ALSの 3者の複合体から、 IGFと IGFBPの 2者の複合 体を遊離させる物質。
6)体内の IGFと IGFBPの 2者の複合体と、 ALSとの結合を阻害する物質。
7)体内の IGF、 IGFBPおよび ALSの 3者の複合体を遊離型 IGFに変換する物質。
8)体内の IGF、 IGFBPおよび ALSの 3者の複合体から、 遊離型 IGFを遊離させる 物質。
9)体内の IGFと IGFBPと ALSとの結合を阻害することによる遊離型 IGFを遊離さ せる物質。
10) IGF- 1レセプターおよびィンスリンレセプターの両レセプターには実質的に 結合せずに、 IGFBPに結合する物質。
11) IGF- 1レセプターおよびィンスリンレセプターの両レセプターには実質的に 結合せずに、 IGFBPに結合する IGF誘導体。
12) IGF-Iレセプターおよびィンスリンレセプターの両レセプターには実質的に 結合せずに、 IGFBPに結合する IGF誘導体であって、 IGFのアミノ酸配列にお いて 1つまたは 2つ以上のアミノ酸残基が付加、 欠失もしくは置換された I GF誘導体。
13) IGF- 1レセプターおよびィンスリンレセプタ一の両レセプターには実質的に 結合せずに、 IGFBPに結合する IGF誘導体であって、 ヒ ト IGF- IIのアミノ酸 配列の 2 7位のチロシン残基および 4 3位のバリン残基をそれぞれ口イシ ン残基に置換した IGF誘導体。
14) IGF- 1レセプターおよびィンスリンレセプターの両レセプターには実質的に 結合せずに、 IGFBPに結合する抗 IGFBP抗体。
15) IGF- 1レセプターおよびィンスリンレセプターの両レセプターには実質的に 結合せずに、 IGFBP- 3に結合する抗 IGFBP抗体。
本発明は、 また、 これらの物質を含有する医薬を提供する。
さらにまた、 本発明はこれらの物質を探索するためのスクリーニング法を提供 する。 図面の簡単な説明 図 1は、 ラット IGFBP- 3遺伝子 5'側領域のクローンであるプラスミ ド BP-3 up/p UC19/ ASphIの制限地図を示す図である。
図 2は、 ラット IGFBP - 3遺伝子 3 '側領域のクローンであるプラスミ ド BP- 3 dow n/pTVl 19Nの制限地図を示す図である。
図 3は、 ラット IGFBP- 3クローンであるプラスミ ド BP- 3/pTV119Nの制限地図を 示す図である。
図 4は、 動物細胞用ラッ ト IGFBP- 3発現ベクターであるプラスミ ド RSV-LTR/rat IGFBP- 3/SV2- Term/SV40- Pro/neo/SV2- Term/+Ampの制限地図を示す図； 図 5は、 大腸菌発現用ベクター作製に使用した分泌発現べクタの制限地図を示 す図である。
図 6は、 シグナル配列を削除したラット IGFBP-3遺伝子フラグメントを有する プラスミ ドの制限地図を示す図である。
図 7は、 大腸菌用ラット IGFBP- 3分泌発現ベクターであるプラスミ ドの制限地 図を示す図である。
図 8は、 実施例 1 0の結合試験の結果を示す図であり、 IGF- 1と IGF- IIの RBP- 3 E. col i (IGFBP-3) に対する親和性および RBP- 3E. col iの IGF- IIに対する親和性を 示す。
図 9 A， 9 Bは、 IGF - 1と IGFBP- 3との結合に対する各種化合物 （表 1 ) による 阻害活性を示す図である （実施例 1 1)。
図 1 0は、 IGF- 1又は IGF- II共存下における、 固相化 RALSに対する IGFBP-3結合 量を示す図であり、 IGF-I及び IGF- IIの、 IGFと IGFBP - 3と ALSとの複合体の形成能 を示す （実施例 1 2)。
図 1 1は、 実施例 1 3の結果を示す図であり、 IGFと IGFBP - 3との複合体に対す る ALSの親和性を示す。
図 1 2は、 実施例 1 4の結果を示す図であり、 ALSの IGFBP- 3に対する親和性を 示す。
図 1 3は、 実施例 1 5で行った、 1251 - IGF- 1と IGF-Iレセプターを用いた IGF - 1 レセプターアツセィの結果を示す図である。
図 1 4は、 実施例 1 5で行った、 '251-ィンスリンとインスリンレセプターを 用いたインスリンレセプターアツセィの結果を示す図である。
図 1 5は、 ヒ ト IGF- II誘導体 [し eu27, Leu43]rIGF-IIが IGFと IGFBP - 3との結合 を阻害することを示す図である （実施例 1 6)。
図 1 6は、 抗 IGFBP - 3抗体が IGFと IGFBP-3との結合を阻害することを示す図で ある （実施例 1 7)。
図 1 7は、 IGF- 1、 IGF- II、 IGF-II誘導体及び抗 IGFBP-3抗体を投与 6時間後の SDラット血中総トリグリセライ ド濃度を示す図である （実施例 1 8— 1)。
図 1 8は、 IGF- 1、 IGF- II、 IGF- II誘導体及び抗 IGFBP-3抗体を投与 6および 24 時間後の、 SDラッ ト血中総コレステロール濃度を示す図である （実施例 1 8— 1)。
図 1 9は、 IGF- 1及び抗 IGFBP- 3抗体投与 6時間後の、 インスリン抵抗性モデル ラッ ト血中の総コレステロール濃度を示す図である （実施例 1 8— 2)。
図 20は、 IGF- 1及ぴ抗 IGFBP- 3抗体投与 6時間後の、 ィンスリン抵抗性モデル ラット血中の総トリグリセライ ド濃度を示す図である （実施例 1 8— 2)。
図 2 1は、 IGF- 1及び抗 IGFBP-3抗体投与 6時間後の、 インスリン抵抗性モデル ラッ ト血中の遊離脂肪酸濃度を示す図である （実施例 1 8— 2)。
図 22は、 抗 IGFBP- 3抗体投与 1および 6時間後の、 SDラット血中の遊離型 IGF - 1濃度を示す図である （実施例 1 8— 3)。 発明を実施するための最良の形 n まず、 本発明の遊離型 IGFの濃度上昇方法および IGFと IGFBPの 2者の複合体の 濃度上昇方法について説明する。
本発明の遊離型 IGFの濃度上昇方法は、 生体外から IGFまたは IGF様活性を持つ 物質を投与することにより達成するものではなく、 もともと生体内に存在する遊 離型 IGFや、 IGFと IGFBPの 2者の複合体および/または IGF、 IGFBPおよび ALSの 3 者の複合体中に内在する IGFを利用するものである。 ここでいう生体とは、 ヒ ト やゥシ、 ゥマ、 ヒッジ、 ブタといったヒ ト以外の哺乳類等の血液や肝臓、 腎臓と いった臓器等の組織のことをいう。 また、 遊離型 IGFとは、 生体内において 2者 の複合体または 3者の複合体から変換、 あるいは遊離された IGFのみならず、 IGF BPとの 2者の複合体または IGFBPと ALSの 3者の複合体を形成していない IGFのこ とをいう。
本'発明の遊離型 IGFの濃度上昇方法は、
IGFと IGFBPの 2者の複合体中において不活性な IGFを活性型 IGFに変換する、 IGFと IGFBPの 2者の複合体から IGFを遊離させる、
IGFと IGFBPとの結合を阻害する、
IGF、 IGFBPおよび ALSの 3者の複合体中において不活性な IGFを活性型 IGFを 活性型 IGFに変換する、
IGF、 IGFBPおよび ALSの 3者の複合体から IGFを遊離させる、 あるいは IGFと IGFBPと ALSとの結合を阻害する
こと等により、 遊離型 IGFの濃度を上昇させるものである。
また、
IGF、 IGFBPおよび ALSの 3者の複合体を IGFと IGFBPの 2者の複合体に変換す る、
IGF、 IGFBPおよび ALSの 3者の複合体から IGFと IGFBPの 2者の複合体を遊離 させる、 あるいは
IGFと IGFBPの 2者の複合体と ALSとの結合を阻害する
こと等により、 いったん IGFと IGFBPの 2者の複合体の濃度を上昇させ、 次いで IGFと IGFBPの 2者の複合体を IGFに変換する、
IGFと IGFBPの 2者の複合体から IGFを遊離させる
こと等によっても、 遊離型 IGFの濃度を上昇させることができる。 遊離型 IGFの濃 度が上昇し、 IGF作用が発現するので、 本方法は、 IGFの作用により、 予防および /または治療が可能な疾患の予防 ·治療の方法となる。
本発明の IGFと IGFBPの 2者の複合体の濃度上昇方法は、
IGF、 IGFBPおよび ALSの 3者の複合体を IGFと IGFBPの 2者の複合体に変換す る、
IGF、 IGFBPおよび ALSの 3者の複合体から IGFと IGFBPの 2者の複合体を遊離 させる、 あるいは
IGFと IGFBPの 2者の複合体と ALSとの結合を阻害する
こと等により、 IGFと IGFBPの 2者の複合体の濃度を上昇させるものである。 従つ て、 本方法は IGFと IGFBPの 2者の複合体の示す IGF様活性により、 予防および/ま たは治療が可能な疾患の予防 ·治療の方法となる。
以下、 本発明の物質について説明する。
本発明の物質は、 インスリンレセプタ一および/または IGFレセプターに結合し て、 その活性を発現させる IGFまたは IGF様活性を持つ物質とは異なり、 インスリ ンレセプターおよび IGFレセプターの両レセプターには実質的に結合しないもの である。
本発明における IGFと IGFBPの 2者の複合体を IGFに変換する物質とは、 2者の 複合体に作用して、 IGFにかえてしまう物質を意味する。 したがって、 複合体を I GFに変換する物質を投与すると、 遊離型 IGFは増える。
本発明における IGFと IGFBPの 2者の複合体から、 IGFを遊離させる物質とは、 2者の複合体に作用して、 IGFを遊離させる物質を意味する。 したがって、 遊離 させる物質を投与すると、 遊離型 IGFは増える。
本発明における IGFと IGFBPとの結合を阻害する物質とは、 IGFと IGFBPの 2者の 複合体の形成を阻害する物質を意味する。 したがって、 結合を阻害する物質を投 与すると、 遊離型 IGFは増える。
本発明における IGF、 IGFBPおよび ALSの 3者の複合体を、 IGFと IGFBPの 2者の 複合体に変換する物質とは、 3者の複合体に作用して、 IGFと IGFBPの 2者の複合 体にかえてしまう物質を意味する。 したがって、 IGFと IGFBPの 2者の複合体に変 換する物質を投与すると、 IGFと IGFBPの 2者の複合体は増える。
本発明における IGF、 IGFBPおよび ALSの 3者の複合体から、 IGFと IGFBPの 2者 の複合体を遊離させる物質とは、 3者の複合体に作用して、 IGFと IGFBPの 2者の 複合体を遊離させる物質を意味する。 したがって、 IGFと IGFBPの 2者の複合体を 遊離させる物質を投与すると、 IGFと IGFBPの 2者の複合体は増える。
本発明における IGFと IGFBPの 2者の複合体と ALSとの結合を阻害する物質とは、 IGF、 IGFBPおよび ALSの 3者の複合体の形成を阻害する物質を意味する。 したが つて、 結合を阻害する物質を投与すると、 IGFと IGFBPの 2者の複合体は増える。 本発明における IGF、 IGFBPおよび ALSの 3者の複合体を IGFに変換する物質とは、 複合体に作用して、 IGFにかえてしまう物質を意味する。 したがって、 3者の複 合体を IGFに変換する物質を投与すると、 遊離型 IGFは増える。
本発明における IGF、 IGFBPおよび ALSの 3者の複合体から、 IGFを遊離させる物 質とは、 3者の複合体に作用して、 IGFを遊離させる物質を意味する。 したがつ て、 遊離させる物質を投与すると、 遊離型 IGFは増える。
本発明における IGFと IGFBPと ALSとの結合を阻害する物質とは、 IGF、 IGFBPお よび ALSの 3者の複合体の形成を阻害し、 遊離型 IGFを増やす物質を意味する。 し たがって、 結合を阻害する物質を投与すると遊離型 IGFは増える。
なお、 本発明において、 IGFと IGFBPの 2者の複合体おょぴ IGFと IGFBPと ALSの 3者の複合体は、 静電的相互作用、 水素結合、 疎水的相互作用等により形成され ているものをいう。 また、 IGFの種類、 IGFBPの種類等に特に限定はなく、 すべて の種類の複合体が含まれる。 例えば IGF- 1と IGFBP - 3の 2者の複合体および IGF - 1、 IGFBP- 3および ALSの 3者の複合体等を挙げることができる。
本発明の物質を投与すると、 生体内で遊離型 IGFまたは IGFと IGFBPの 2者の複 合体が増え、 IGF作用が発現するので、 本発明の物質は医薬として有用なもので あり、 さらには、 IGFにより予防および/または治療が可能な疾患の予防 ·治療剤 として有用なものである。
したがって、 本発明の物質は、 例えば糖尿病、 糖尿病性神経症、 筋萎縮性側索 硬化症および骨粗鬆症等の予防剤および/または治療剤となり得る。
また疾患によっては、 IGFBPの組織特異的発現および/または IGFの組織特異的 作用を考慮に入れて、 本発明の物質の種類の選択ができる。 すなわち、 筋、 骨と いった各種臓器に選択的で、 局所における遊離型 IGF濃度を調節し、 IGFによる効 果を組織特異的に引き出すことが可能な物質を調製することもできる。
本発明の物質が有する機能は上述のとおりだが、 本発明において物質とは、 特 に限定はなく、 例えば、 微生物、 植物もしくは動物等の生物が産生する物質、 植 物もしくは動物の細胞あるいは組織培養物が産生する物質、 生物等の抽出物また は化学合成した化合物等を挙げることができる。 なお、 これらは単独でもよいし、 2種以上の混合物であってもよい。
本発明の物質は、 インスリン様成長因子誘導体および抗ィンスリン様成長因子 結合たんぱく質抗体を包含する。 インスリン様成長因子誘導体とは、 インスリン 様成長因子の誘導体であって、 例えば、 インスリン様成長因子に化学修飾等して 合成したもの、 或いは遺伝子工学的手法を用いて、 インスリン様成長因子のアミ ノ酸配列において 1つまたは 2つ以上のアミノ酸残基を付加、 欠失もしくは置換 させたもの等を挙げることができる。 アミノ酸残基の付加、 欠失もしくは置換は、 又献 (Genetic Engineering, 3, 1 (1981)； Nucleic Acid Research, 10, 6487 (1982) ) 等に記載されている技術により実施することができる。
本発明のインスリン様成長因子誘導体としては、 ヒ ト インスリン様成長因子 - IIのァミノ酸配列の 27位のチロシン残基および 43位のバリン残基をそれぞれ口 イシン残基に置換したものが好ましい。
本発明の物質を投与する方法は、 非経口投与、 経口投与どちらでも構わないが、 使用時の簡便性等を考慮すると経口投与が好ましい。 投与するためには、 通常知 られた方法により製剤化すればよい。 製剤化にあたっては、 賦形剤、 崩壊剤、 結 合剤、 滑沢剤、 流動化剤、 分散剤、 懸濁化剤、 乳化剤、 防腐剤および安定化剤等 の通常知られた添加物を適宜、 適当量加えることができる。
非経口投与するための製剤の形態としては、 軟膏剤、 硬膏剤、 坐剤、 注射剤、 点眼剤、 点鼻剤、 点耳剤、 吸入剤、 酒精剤、 パップ剤、 リニメント剤およびロー シヨン剤等を挙げることができる。 また、 経口投与するための製剤の形態として は、 エリキシル剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 細粒剤、 丸剤、 懸濁剤、 乳剤、 散剤、 錠剤、 シ口ップ剤、 ト口ーチ剤、 ドライシロップ剤およびリモナ一デ剤等を挙げ ることができる。
本発明の物質の投与量は、 投与方法、 対象疾患、 患者の状態等を考慮して適宜 検討すればよい。
本発明者らは、 本発明に係る物質を 2種類見いだし、 これらを正常ラットおよ ぴ糖尿病モデルラッ トに in vivo投与することにより、 遊離型 IGF- 1の血中濃度が 上昇することおよび IGFの作用が発現されることを確認した。
以下、 本発明の物質をスクリーニングするための試験方法を説明する。
IGF、 IGFBP、 ALSのいずれか一つを直接又は間接に検出可能に標識し、 当該標 識物 （例えば、 IGF) と他の結合相手 （例えば、 IGFBP) との結合が、 試料添加に よって阻害されるかどう力、 或いは、 試料添加により、 当該標識物 （例えば、 IG F) と結合相手 （例えば、 IGFBP) との結合物から当該標識物が遊離するかどうか によって、 本発明の物質を探索することができる。
直接に検出可能な標識とは、 その標識物の量が物理的測定により直接検出でき るできるものをいい、 例えばラジオアイソトープ標識の場合には放射能測定によ り、 標識物を直接検出することができる。 また、 Scinti l lation Proximity Assa y (Cook, N. D. , Drug Discovery today, 丄， 287 (1996) ) のような方法でも検出 できる。 また色素や蛍光色素などによって標識した場合には、 光学的に直接標識 物の量を検出できる。
間接に検出可能な標識とは、 それ自体は物理的に検出できないが、 化学的反応 を経ることにより直接検出可能な分子種 （例えば色素や蛍光色素など） を化学量 論的に生成し、 これを定量することのより標識物の量を定量できるようなものを いう。 例えば、 酵素標識した場合には、 試料 （被検物） 共存下の反応後、 酵素基 質を添加して検出可能な色素などを生成させて、 それらを検出すればよい。
ラジオアイソトープを用いたスクリ一二ングを行うには、 従来より汎用されて いる液相法に準拠して行うことができる。 例えば、 1 2 5 1で標識した IGF ( 1 2 51-1 GF) と IGFBPとを反応させた後、 複合体として存在する' 2 51 - IGF (結合型） と複 合体を形成していない' 2 5 I-IGF (遊離型） を、 1 ) 活性炭を用いて分ける方法 （Moses, A. ， et al. , Endocrinology, 104, 536 (1979)； Binoux, M. , et al. , J. Cl in. Endocrinol. Metab. , 59, 453 (1
984)； Scott, C. D.， et al.， Endocrinology, U6, 1094 (1985)； Szabo, L. , et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. , 151. 207 (1988)； Gelato, M. C. , et al. , J. Clin. Endocrinol. Metab. , 70, 879 (1990)； Oh, Y. , et al. , Bio chem. J. , 278, 249 (1991)等）、
2 ) レクチンタンパク質が IGFBPの糖鎖部分を認識することを利用して分ける 方法 (Martin, J. L. , et al. , J. Biol. Chem. , 261, 8754 (1986) )、
3 ) 一次抗体および二次抗体を用いて免疫沈降して分ける方法 （Martin, J. し， et al. , J. Biol. Chem. , 261, 8754 (1986)； Baxter, R. C.， et al. ' J. Biol. Chem. , 264, 11843 (1989)； Baxter, R. C. , Biochem. J.， 271, 773 (19 90)等） 等の汎用方法で分離することができる。
これらの方法を利用して、 1 2 5 I-IGF、 1 2 5 I- IGFBP、 または1 2 5 I- ALSとそれぞれ 適切な一次抗体の組み合わせにより、 IGFと IGFBPの 2者の複合体または IGF、 IGF BPおよび ALSの 3者の複合体の形成能の評価を行うことができる。
ただし、 これらの従来方法は、 取扱いが煩雑で危険であり、 また半減期が短い ラジオァイソ トープを標識物質として用い、 また結合型/遊離型を分離する際に 遠心操作を行うので、 多検体のスクリーニングには不向きである。
高速で多検体のスクリーニングを行うには、 Scinti l lation Proximity Assay のような方法も利用できるが、 標識物質としてラジオアイソトープを使用せずに、 酵素を用いた以下のような固相法によるものも便宜である。
本発明の IGFと IGFBPの 2者の複合体を遊離型 IGFに変換する物質または 2者の 複合体から遊離型 IGFを遊離させる物質は、 例えば、 予め固相化した IGFBPに、 予 め酵素で標識した IGFを加えて、 2者の複合体を形成させた後に、 被験体を添加 して反応を行い、 洗浄後、 標識に用いた酵素の活性を測定することでスクリー二 ングが可能である。 また、 IGFを固相化し、 IGFBPを酵素で標識してもよい。
本発明の IGFと IGFBPとの結合を阻害する物質は、 固相化した IGFBPに、 予め酵 素で標識した IGFおよび被験体を同時に添加して反応を行い、 洗浄後、 標識に用 いた酵素の活性を測定することでスク リーニングが可能である。 また、 IGFを固 相化し、 IGFBPを酵素で標識して酵素活性を測定することによりスクリーニング 本発明の IGF、 IGFBPおよび ALSの 3者の複合体を IGFと IGFBPの 2者の複合体に 変換する物質、 IGF、 IGFBPおよび ALSの 3者の複合体から IGFと IGFBPの 2者の複 合体を遊離させる物質、 IGF、 IGFBPおよび ALSの 3者の複合体を遊離型 IGFに変換 する物質、 または IGF、 IGFBPおよび ALSの 3者の複合体から IGFを遊離させる物質 は、 例えば、 予め固相化した ALSに、 IGFおよび予め酵素で標識した IGFBPを加え て、 3者の複合体を形成させた後に、 被験体を添加して反応を行い、 洗浄後、 標 識に用いた酵素の活性を測定することでスクリーニングが可能である。 また、 酵 素で標識するものを IGFにかえてもよい。
あるいは、 予め固相化した IGFと IGFBPの 2者の複合体に、 予め酵素で標識した ALSを加えて、 3者の複合体を形成させた後に、 被験体を添加して反応を行い、 洗浄後、 標識に用いた酵素の活性を測定することによりスクリーニングしてもよ レ、。
さらには、 予め固相化した IGFに、 IGFBPおよび予め酵素で標識した ALSを加え て、 3者の複合体を形成させた後に、 被験体を添加して反応を行い、 洗浄後、 標 識に用いた酵素の活性を測定することによりスクリーニングしてもよい。 なお、 スクリーニングにより得られた物質が、 IGF、 IGFBPおよび ALSの 3者の複合体を I GFと IGFBPの 2者の複合体に変換する物質、 IGF、 IGFBPおよび ALSの 3者の複合体 から IGFと IGFBPの 2者の複合体を遊離させる物質、 IGF、 IGFBPおよび ALSの 3者 の複合体を遊離型 IGFに変換する物質または IGF、 IGFBPおよび ALSの 3者の複合体 から遊離型 IGFを遊離させる物質のうち、 どれに属するかを確認するには、 前述 の IGFと IGFBP 2者の複合体を遊離型 IGFに変換する物質または 2者の複合体から 遊離型 IGFを遊離させる物質をスクリーニングする方法を適用することにより可 能である。
本発明の IGFと IGFBPの 2者の複合体と ALSとの結合を阻害する物質または IGFと IGFBPと ALSとの結合を阻害する物質は、 例えば、 予め固相化した ALSに、 IGFと予 め酵素で標識した IGFBPの 2者の複合体および被験体を同時に添加して反応を行 い、 洗浄後、 標識に用いた酵素の活性を測定することでスク リーニングが可能で ある。 また、 酵素で標識するものを IGFにかえてもよい。
あるレ、は、 予め固相化した IGFと IGFBPの 2者の複合体に、 予め酵素で標識した ALSおよび被験体を同時に添加して反応を行い、 洗浄後、 標識に用いた酵素の活 性を測定することでスク リ一二ングが可能である。
さらには、 予め固相化した IGFに IGFBPと予め酵素で標識した ALSおよび被験体 を同時に添加して反応を行い、 洗浄後、 標識に用いた酵素の活性を測定すること によりスク リーニングしてもよレ、。 なお、 スクリーニングにより得られた物質が、 IGFと IGFBPの 2者の複合体と ALSとの結合を阻害する物質または IGFと IGFBPと ALS との結合を阻害する物質のどちらに属するかを確認するには、 前述の IGFと IGFBP との結合を阻害する物質をスクリーニングする方法を適用することにより可能で ある。
IGF、 IGFBPまたは ALSを固相化するには、 通常知られた方法で行えばよい。 す なわち、 直接固相法でもよく、 またアビジン一ピオチン、 ハプテン一抗ハプテン 抗体等を用いた間接固相法でもよい。 固相の素材としては、 例えばガラス、 ポリ スチレンを主としたプラスチック、 ポリアクリルアミ ドおよび酢酸セル口一ス等 を挙げることができる。 固相の形態としては、 これらの素材を用いて成型した試 験管、 ビーズ、 マイクロタイタープレート、 ディスクおよびチップ等を挙げるこ とができる。 機器を用いて高速で多検体をスクリーニングすることを考慮すると、 市販されている多穴マイクロタイタープレートを利用するのが好ましい。
酵素活性を測定するには、 標識に用いる酵素、 基質、 緩衝液、 pH、 温度等を適 宜検討し、 通常知られた測定法で行えばよく、 測定法としては、 例えば比色法、 蛍光法および発光法等を挙げることができる。
IGF、 IGFBPまたは ALSを酵素標識するには、 通常知られた方法で行えばよく、 例えば、 マレイミ ド法、 過ョーソ酸法およびダルタルアルデヒ ド法等を挙げるこ とができる。
また、 標識に用いる酵素と基質は適宜組み合わせを考慮すればよく、 例えば、 酵素として ]3 - D-ガラク トシダーゼを用いる場合には、 基質としては、 2-ニトロ フェニル- β -D-ガラク トシド、 4 -メチルゥムべリフエリノレ- - D -ガラク トシドぉ よび 5-ブロモ -4 -ク口ロ- 3-ィンドリノレ- )3 - D-ガラク トシド等を挙げることができ る。 また、 酵素としてペルォキシダーゼを用いる場合には、 基質としては、 2，2' -アジノ-ビス （3-ェチルベンズチアゾリン- 6-スルフォニック アシッド）、 3, 3 ' , 5， 5' -テトラメチルベンジジンおよび 1， 2 -フエ二レンジアミン等を挙げること ができる。 さらに、 酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、 基 質としては、 4-メチルゥムベリフェリルフォスフエ一トおよび N-二ト口フエニル フォスフエ一ト等を挙げることができ 。
スクリ一二ングは緩衝液中で行われるのが好ましく、 緩衝液は酵素活性の測定 において通常用いられるものでよく、 例えば、 リン酸ナトリウム緩衝液、 グリシ ン—水酸化ナトリウム緩衝液およびトリスー塩酸緩衝液等を挙げることができる。 緩衝液の pHは適宜検討すればよいが、 pHが IGFBPの溶解性に影響を与えることが あるので、 pH6. 0〜7. 4が好ましい。 また、 緩衝液には、 塩や界面活性剤を添加し てもよく、 例えば塩化ナトリウムを添加する場合には、 その添加濃度としては 0. 15M程度までが好ましい。
産業上の利用可能性 本発明の方法によれば、 生体外から IGFあるいは IGF様活性を持つ物質を投与す るのではなく、 生体内に内在している IGFを遊離型 IGFや IGFと IGFBPの 2者の複合 体に変換等することにより、 IGF作用を発現させることができる。
本発明の物質を in vivo投与することにより、 遊離型 IGFの濃度が上昇し、 IGF の作用が認められた。 したがって、 本発明の物質は IGFにより予防および/または 治療可能な疾患 （糖尿病、 筋萎縮性側索硬化症および骨粗鬆症等） の予防剤およ び/または治療剤として有用なものである。
以下に、 本発明を実施例により詳細に説明するが、 本発明はこれらに限定され るべきものではない。 実 施 例 実施例 1 ヒ ト IGF - 1およびヒ ト IGF-I Iの調製
ヒ ト IGF - 1は GroPep社より購入したものを用いた。 ヒ ト IGF-IIは、 Sakanoら の方法 （Sakano, K. , et al. , J. Biol. Chem. , 266, 20626 (1991) ) と同じ操 作により得た。 すなわち、 遺伝子組換え手法により、 大腸菌でヒ ト IGF-IIを発現 させた。 菌体から抽出したヒ ト IGF-Πは、 リフォールデイングの後、 逆相 H P L Cカラムを用いたクロマトグラフィ一にて精製した。 実施例 2 ラット IGFBP-3遺伝子のクローニング
ラッ卜 IGFBP - 3遺伝子は文献 (Shimasaki, S.， et al. , Biochem. Biophys. R es. Commun. , ^65, 907 (1989) ) に従い、 クローニングした。 すなわち、 P C R 法によりラッ ト滕臓 c D N Aライブラリーを铸型とし、 IGFBP - 3遺伝子の上流領 域 （5'側） と下流領域とをそれぞれ増幅して各 P C Rフラグメントを得た。 5'側 クローニング用の P C Rプライマーには、
5' -CGCCATGCATCCCGCGCGCC-3'、
5' -ACGCCGCACGCGTCGCCTTC-3'
を使用した。
3'側クローニング用の P C Rプライマーには
5' -GCGCGGGCCCCGTGGTGCGCTGCGAACCGT-3'
5' -TGCTGATCACGTTGTTGGC-3'
を使用した。
回収された各 P C Rフラグメントは、 それぞれ平滑化、 リン酸化した後、 pUCl 9 (Sall/Blunting/BAP) に組み込み、 クローニングした （5'側： BP- 3 up/pUC19, 3，側： BP- 3 downん UC 19)。
5'側クローン BP-3 up/pUC19について、 転写開始コ ドン （A T G ) よりさらに 上流にある Sphl部位を削除して、 プラスミ ド BP- 3 up/pUC19/ A SphIを得た （図 1 参照）。 次に 3'側クロ一ン BP- 3 down/pUC19を BamHI- Pstlで消化後、 BP - 3 downを 含むフラグメントを回収し、 平滑化し pTV119N (HincII/BAP) に組み込み、 lac Z プロモーターに対し同一方向に組み込まれたプラスミ ドを得た （BP- 3 down/pTVl 19N： 図 2参照）。
5'側クローン （BP- 3 up/pUC19/ A SphI) を Mlul- Hindl llで切断し、 BP- 3 upを 含む 250bpのフラグメントを回収した。 3'側クローン （BP- 3 down/pTV119N) を Ml ul- HindIII/ΒΑΡ処理し、 このプラスミ ドに BP-3 upを含む 250bpフラグメントを組 み込み、 ラッ ト IGFBP- 3クローンを作製した （BP- 3/pTV119N：図 3参照）。 実施例 3 ラット IGFBP- 3遺伝子の動物細胞発現用ベクターの構築
動物細胞発現用として、 得られたラット IGFBP- 3クローンを、 RSV- LTR (raus s arcoma virus long terminal repeat) ¾r¾ τるプラスミ ド (Nawa, K. , et al. , Biochem. Biophys. Res. Comraun. , 171, 729 (1990) ) に組み込んだ。 すなわち、 プラスミ ド BP - 3/pTV1 19Nを Xbal- Hindlllで切断し、 約 900bpのフラグメントを得 た。 これを発現用プラスミ ド （SV2-Term/SV40- Pro/neo/SV2- Term/+Amp) に組み 込みんだ後、 さらに Hindlll部位に、 RSV - LTRを Hindlllにてフラグメント化した 約 600bpを組み込んだ （RSV- LTR/rat IGFBP- 3/SV2_Term/SV40-Pro/neo/SV2- Term/ +Amp) (図 4参照）。 実施例 4 ラッ ト IGFBP- 3遺伝子の大腸菌発現用ベクターの構築
大腸菌発現には、 PhoAシグナル配列を用いた分泌発現プラスミ ドを作製して、 これを用いた。 すなわち、 PhoAシグナル配列を合成 D N Aオリゴマーを用いて作 製し、 これを大腸菌用発現プラスミ ド pTrc99A (Pharmacia社製） の Ncol- Hindll l 部分に組み込んで分泌用発現ベクターとした （図 5参照）。 大腸菌でラッ ト IGF BP-3を発現させるためにはラット IGFBP-3前駆体からシグナル配列を削除する必 要があるので、 実施例 2で得たプラスミ ド BP- 3/pTV119を Nael-Xbalで切断するこ とにより、 シグナル配列を削除したラット IGFBP- 3遺伝子フラグメントを回収し た。
得られたフラグメントを、 プラスミ ド BP - 3/pTV119を NcoI/Klenow/Xbal/BAP処 理したものに、 組み込んで、 図 6のプラスミ ドを作製した。 このプラスミ ドは Nc ol部位が復活しているので、 このプラスミ ドを Ncol - EcoRIで切断し、 次いで Mun g Bean Nucleaseで平滑化し、 シグナル配列を削除したラッ ト IGFBP- 3遺伝子フ ラグメントを回収した。 これを図 5の分泌用発現ベクター （Hindlll/lQenow/BA P) に導入してラッ ト IGFBP- 3分泌用発現プラスミ ドを作製した （図 7参照）。 実施例 5 ラット IGFBP- 3の動物細胞での発現おょぴ精製
ラット IGFBP-3の動物細胞での発現には CH0-K1細胞を用いた。 実施例 3で得た 図 4の動物細胞発現用プラスミ ドをリン酸カルシウム法を用いて CH0-K1細胞に導 入した。 組み換え細胞は 0. 4mg/ml G-418を含む DMEM/F- 12培地にてクローニング を行った。 優良発現株を選定し、 1% ITESを含む T培地にて培養した。 培養上清 を回収し、 これに酵素阻害剤 （2mMへ"ンス"アミに I lmM PMSF / lOOU/ml Trasylol I 2mM EDTA) を加え、 フィルターろ過 （CAPSULE FILTER 0. 2 m steri l ized, G elman Science社製） した後、 1M 酢酸ナトリウム溶液を加えて pH6. 0に調整した。 これを 0. 15M 塩化ナトリウムを含む 10mM 酢酸ナトリウムバッファー （pH6, 0) で 平衡化した SP-Sepharose F. F. カラム （Pharmacia社製） にアプライした。 同バ ッファー、 続けて 0. 5M 塩化ナトリウムを含むバッファーで洗浄後、 1M塩化ナト リゥムを含むバッファーで溶出した。 この溶出液を 2倍に希釈してリン酸ナトリ ゥム溶液にて最終的に pH7. 0となるよう調整した。
IGF- IIを固定化したリガンドアフィニティーカラムは HiTrap affinity column NHS-act i vated (Pharmacia社製） を用い、 常法に従って調製した。 このカラム を 0. 45M 塩化ナトリウムを含む 50mM リン酸ナトリウムバッファー （pH7. 0) で平 衡化した後、 先の SP- Sepharose F. F. 溶出サンプルをアプライした。 同バッファ 一、 1M 塩化ナトリ ウムを含む lOmM 酢酸ナトリ ウムバッファー （pH7. 0)、 そし て水で洗浄後、 0. 5M 酢酸にて溶出した。 得られた溶出液を回収し、 凍結乾燥後、 0. 1% トリフルォロ酢酸 （以下、 TFAと略することもある。） に溶解し、 逆相 HPLC に供した。
逆相 HPLCカラム (CAPCELLPAK C18 SG300、 250 X 4. 6mm I. D.、 SHISEID0社製） を用いて、 流速 l ml/min、 ァセトニトリル直線濃度勾配にて溶出し、 ラッ ト IGF BP - 3画分を分取した。 最後に、 分取したラッ ト IGFBP- 3 (以下、 RBP- 3CH0と略す る。） を凍結乾燥して使用するまで保存した。 実施例 6 ラット IGFBP- 3の大腸菌での発現および精製
ラッ ト IGFBP- 3分泌発現大腸菌 （UT5600) の各コロニーを L B培地にて、 37°C、 250rpmといいう条件で、 培養し、 Abs=3. 45に達したときに、 IPTGを終濃度 0. 3mM となるように添加して発現誘導を行った。 集菌した菌体から、 浸透圧ショック法 (Nossal, N. G. et al.， J. Biol. Chem. , 241, 3055 (1966) ) によりペリプラ ズムを回収し、 リン酸バッファ一にて pH7. 2に調整した。
次に、 IGF- IIを固定化したリガンドアフィニティ一カラムに、 pH7. 2に調整し たサンプルをアプライし、 前述した RBP- 3CH0の精製 （実施例 5参照） と同じ操作 を行い、 0. 5M 酢酸にて溶出した画分を凍結乾燥した。 凍結乾燥にて得られた粉 末を 0, 1% TFA 10mlに溶解し、 逆相 HPLCカラム （YMC-PACK PR0TEIN_RP、 250 X 4. 6 mm I. D.、 YMC社製） を用いて流速 1 ml/min、 ァセトニトリル直線濃度勾配にて ラット IGFBP-3を溶出し、 分取した。 最後に、 分取したラット IGFBP- 3 (以下、 RBP-3E. col iと略する。） を凍結乾燥して使用するまで保存した。 実施例 7 ラット血清からのラット ALSの精製
ラット Aし Sは Baxter, R. C.らの方法 (Baxter, R. C. , et al. , Endocrinology, 134, 848 (1994) ) にてラッ ト血清から精製した。 ただし、 リガンドアフイエテ ィーカラムとして前述の実施例 5の IGF- IIを固定化した HiTrap afinity column NHS- activated (Pharmacia社製) と前記実施例 6の RBP- 3E. col iを用いた点と、 最終精製段階で DEAE- 5PWカラム （75 X 7. 5mm I . D .、 T0S0H社製） を用いた点 で、 文献とは異なる。
DEAE- 5PWカラムによる最終精製は、 まずカラムを 50mM塩化ナトリゥムを含む 1 OmM リン酸ナトリウムバッファー （pH8. 0) で平衡化し、 サンプルをアプライし た後、 同バッファーの塩化ナトリウム直線濃度勾配にてラッ ト ALS (以下、 RALS と略する） を溶出し、 分取して使用するまで凍結保存した。 実施例 8 ヒ ト IGF-Π誘導体 （[Leu27， Leu43] rIGF-II) の作製
ヒ ト IGF-I Iの 27位のチロシン残基をロイシン残基に置換した [Leu27] rIGF - I I およびヒ ト IGF- IIの 43位のパリン残基をロイシン残基に置換した [Leu43] rIGF- 1 Iは、 IGF-II/カチオン非依存性マンノース 6リン酸レセプターには結合するが、 生物活性発現に重要な IGF-Iレセプターおよびィンスリンレセプターへの結合活 性をほぼ消失しており、 さらに実際細胞増殖活性も大きく減弱していることが知 られている (Sakano, K. , et al.， J. Biol. Chem. , 266, 20626 (1991) )。 さ らに、 これらの誘導体の IGFBP- 3との結合能は野生型とほぼ同等であることが知 られている (Bach, L. A. , et al. , J. Biol. Chem. , 268. 9246 (1993) )。
そこで、 27位のチロシン残基と 43位のパリン残基を同時にロイシン残基に置換 し、 IGF-Iレセプターおよびィンスリンレセプタ一^ ·の親和性をさらに低下させ、 且つ、 IGFBP- 3への親和性は保持した誘導体 （[Leu27, Leu43] rIGF-II) を作製し た。
すなわち、 Sakanoらのヒ ト IGF - Π作製方法 （Sakano, K. , et al. , J. Biol. C hem. , 266, 20626 (1991) ) に準拠して、 誘導体 （[Leu27, Leu43] rIGF- II) を作 製した。 すなわち、 変異導入用合成 D N Aオリゴマーとして [Leu27] rIGF- IIおよ び [Leu43] rIGF-IIを作製したときに使用するものと同じもの （5' - CTGGAAAAGAGGA AACCTCTG-3' , 5， - TTCTTCGAGGATACCTC - 3' ) を用いる他は、 Sakanoらの方法と同様 に、 ヒ ト IGF - IIをコ一ドする D N Aクローンを铸型として常法に従って変異を導 入後、 大腸菌にて発現させ、 精製した。 実施例 9 抗ラッ ト IGFBP-3抗体の作製
RBP-3CH0 (実施例 5で得たラッ ト IGFBP- 3) を抗原とし、 ゥサギ （日本白色種、 雄、 5羽） に免疫した。 免疫は 2週間間隔で計 5回行った。 得られた抗血清から ポリクローナル抗体を精製するために Protein Aカラムクロマトグラフィー （PRO SEP- A、 Bioprocessing社製） を行った。 まず、 抗血清を PBSで 2倍に希釈し、 pH7. 4となるように調製し、 PBSにて平衡化した Protein Aカラムにアプライした。 PBS で洗浄後、 0. 1M グリシン一塩酸バッファー （pH3. 0) で溶出し、 得られた溶出画 分を直ちに限外ろ過により濃縮と同時に PBSへバッファー交換した。 最終的に 5 種類のロッ 卜のポリクロ一ナル抗体 （ant i- RBP- 3 pAb #35、 #36、 #88、 S89 #9 0) が得られた。 実施例 1 0 固相系における IGFと IGFBP- 3との結合試験
次の基本条件のもとに試験を行った。
96穴マイクロタイタープレートは Costar社製のものを使用した。 基本バッファ 一を 50mM リン酸ナトリウムバッファー （pH6. 5) とし、 固相化には基本バッファ 一、 洗浄には 0. 03% Tween 20を添加したバッファー、 ブロッキングには 1% BSAを 添加したバッファ一、 そして反応には 0. 25% BSAおよび 0. 03% Tween 20を添加し たバッファーをそれぞれ用いた。 各反応毎の洗浄は 400 μ 1/ゥュルで 2回行うこ ととした。 西洋ヮサビペルォキシダーゼラベル IGF - II (以下、 HRP-IGF - IIと略す ることもある。） は市販の標識用キッ ト （PIERCE社製） を用い、 常法に従って作 製した。
この基本条件は、 特に断らない限り後述の実施例 1 1〜1 7 (いずれも in vit ro系） でも同じである。
まず、 実施例 6で得た RBP-3 E. col i (150ng/ml) をマイクロタイタ一プレート に 50 // 1/ゥエル添加し、 4 °Cでー晚以上静置して固相化した。 ブロッキング後、 HRP-IGF-II (終濃度 12, 000倍希釈） を 50 μ 1/ゥュル添加し、 25°Cで 2時間反応さ せた。 最後に 2，2' -アジノ-ビス （3-ェチルベンズチアゾリン- 6-スルフォニック ァシッ ド） （以下、 ABTSと略する） 溶液 （Kirkegaard & Perry Laboratories社 製） を 100 1/ゥュル添加して 20分間、 室温静置後にプレートリーダー （Vmax、 M olecular Devices社製） にて吸光度 （Abs405nm) を測定した。
検体による競合阻害実験の場合は、 ブロッキング後、 HRP- IGF- II (終濃度 12， 0 00倍希釈） と各種検体 （競合阻害物質） （各濃度） を 50 /^ 1/ゥュルとなるように 同時に添加して、 同様の反応を行った。
阻害物質を加えないときの吸光度値を Boとし、 阻害物質を加えたときの吸光度 値を Bとした。 RBP- 3E. col iを固相化しないゥエルに検体 （阻害物質） を加えず にアツセィしたときの吸光度を非特異的結合量 （NSB) とした。 検体添加時の固 相化 IGFBP- 3に対する標識 IGF-IIの結合量 （％) は
(B-NSB) I (Bo - NSB) X 100
の計算式から算出した。 検体として、 IGF - 1、 IGF-I I及び RBP - 3E. col i (IGFBP - 3) を用いてトリプリケートで測定した。 その平均値をプロットして、 SD値をバーで 示した （図 8参照）。
この結合試験を用いれば、 例えば各種 IGFおよび IGFBP誘導体の IGFBPに対する 親和性の評価、 さらに IGFと IGFBPの結合を阻害する物質等のスクリーニングが可 能である。 実施例 1 1 IGFと IGFBP- 3との結合に対する各種化合物の阻害実験
下記の表 1に記載の各化合物を検体として、 実施例 1 0に従い結合阻害実験を 行った。 各化合物は、 5%メタノール含有基本バ 00000ッファーにて lmg/mlとな るように溶解又は懸濁し、 これを反応バッファ一にて 5倍希釈して、 200jug/ml とした。 これを検体として添加した時の、 IGF-IIと IGFBP-3 (RBP-3 E.coli) の 結合量（％)を測定し、 「100(%) — 結合量（％)」 を検体の阻害活性 （％) とし た。 測定は 2回行い、 その阻害活性の平均値を求めた。 結果を図 9A， 9 Bに示 す。 測定時の各化合物の最終濃度は lOOj g/mlである。 化合物 27 (Ellagic aci d)、 化合物 29(Aclacinomycin A), 化合物 31 (Heparin)において高い阻害活性が 認められた。
表 1 番号 化合物名
1 SamarospOrin
2 Hydroxy aspergillic acid
3 Kidamycin
4 Siccanin
5 Comenic acid
6 Kinetin
7 2 - Chloro- 4， 6 - bisethylamino - 5 - triazine
8 Methyl hesperidine
9 Oxypertin
10 Protionamide
11 Quercetin
12 Flavone
13 Glycyrrhizin
14 Naringenin
15 2-Hydroxychalcone
16 N- (Methylamino) -succinamide
17 D-(+)-Catechin
18 2 - Carbethoxy - 5， 7- dihydroxy - 4 - methoxyisof lavone
19 (-) -Epicatechin
20 Betulin
21 a -naphtof lavone
22 Curcumin
23 Tamarixetin-7-rutinoside
24 Aescin
25 Ursolsaure
26 Fisetin
27 Ellagic acid
28 Oleano丄 saure
29 Aclacinomycin A
30 Sulfonazo III
31 Heparin
32 Chondroitin sulfate
33 Vitamin Bi
34 Vitamin Be 実施例 1 2 固相系における IGFと IGFBP- 3と ALSとの結合試験 （1 ) 実施例 1 0に記載の基本条件下で、 まず、 ストレプトアビジン （l i g/ml) を マイクロタイタープレートに 50 μ 1/ゥエル添加し、 4 °Cでー晚以上静置して固相 化した。 ブロッキングバッファーでブロックした後、 ピオチン化キット （Amersh am社製） を用いて、 常法通りにピオチン化した RALS (実施例 7のラット ALS： 50η g/ml) を 50 μ 1/ゥヱル添加して 25°Cで 2時間反応させた。 次に RBP- 3E. coli (終 濃度 25ng/ml) と、 検体として各種濃度の IGF - 1又は IGF- IIとを計 50 1/ゥ-ルと なるように同時に添加し、 4 °Cでー晚反応させた。 これらの反応により形成され た IGFと IGFBP - 3と ALSの 3者の複合体に、 実施例 8で得た ant i-RBP- 3 pAb #35 ( 3 g/ml) を 50 /ζ 1/ゥエル添加し、 25°Cで 2時間反応させ、 続いて標識 2次抗 体 (anti-rabbit IgG, horseradish peroxidase l inked whole antibody, 1, 000 倍希釈、 Amersham社製） を 50 / 1/ゥ ル添加し、 25°Cで 2時間反応させた。 最後 に ABTS溶液を 100 /Z 1/ゥュル添加して 20分間、 室温静置後に吸光度 （Abs405nm) を測定した。
検体として IGF-I又は IGF - IIを加えたときの値 （吸光度） を Bとし、 検体として IGF-II 300pM加えたときの値 （吸光度） を total bound ( 100%) とした。 ビォチ ン化 RALSを加えずにアツセィしたときの値 （吸光度） を非特異的結合量 （NSB) とした。 結合量 （％) は
(B-NSB) I (total bound— NSB) X 100
の計算式から算出した。 測定は n = 3で行い、 その平均値をプロットし、 SD値を バーで示した （図 1 0参照）。
この結合試験を用いれば、 例えば IGFや各種 IGF誘導体等による、 IGFBPと ALSと の 3者の複合体の形成能を評価することができる。 また IGFと IGFBPと ALSの複合 体形成を阻害する物質は、 上記測定系で、 RBP - 3E. col iと、 IGF - 1又は IGF- IIと を添加する際に同時に （又はその前後に） 添加することにより、 スク リーニング することも可能である。 実施例 1 3 固相系における IGFと IGFBP - 3と ALSとの結合試験 （2 )
実施例 1 0に記載の基本条件下で、 まず、 ストレプトアビジン （l g/ml) を マイクロタイタ一プレートに 50 / 1/ゥエル添加し、 4 °Cで一晚以上静置して固相 化した。 ブロッキングバッファーでブロックした後、 ピオチン化 RALS (200ng/m 1) を 50 μ 1/ゥ-ル添加して 25°Cで 2時間反応させた。 次に HRP-IGF- II (終濃度 2, 000倍希釈） と RBP - 3E. col i (終濃度 25ng/ml) を 50 μ 1/ゥエルとなるように同時 に添加し、 25°Cで 2時間反応させた。 洗浄後、 最後に ABTS溶液を 100 z 1/ゥエル 添加して 20分間室温静置した後に吸光度 （Abs405nm) を測定した。
競合阻害実験として、 ピオチン化 RALSの反応の後に HRP- IGF- II (終濃度 2, 000 倍希釈）、 RBP-3E. col i (終濃度 25ng/ml)、 そして競合阻害物質として RALS (各 濃度） を 50 μ 1/ゥエルとなるように同時に添加して、 同様の反応を行った。
ビォチン化 RALSを加えないときの吸光度を非特異的結合量 （NSB) とし、 阻害 物質を加えないときの吸光度を Boとし、 阻害物質を加えたときの吸光度を Bとし た。 競合阻害物質 （RALS) 添加時の、 固相化 RALSへの IGFBP- 3及び IGF- IIの結合 量 （％) は
(B-NSB) I (Bo -NSB) X 100
の計算式から算出した。 測定は n = 3で行い、 その平均値をプロットし、 SD値を バーで示した （図 1 1参照）。
この結合試験を用いれば、 例えば ALSや各種 ALS誘導体の IGFと IGFBP - 3との複合 体に対する親和性の評価、 さらに IGF、 IGFBP- 3および ALSの 3者の複合体の形成 を阻害する物質、 IGFと IGFBP- 3の 2者の複合体と ALSとの結合を阻害する物質等 のスクリーニングが可能である。
実施例 1 4 固相系における IGFBP - 3と ALSとの結合試験
実施例 1 0に記載の基本条件下で、 まず、 ストレプトアビジン （l ju g/ml) を マイクロタイタ一プレー卜に 50 μ 1/ゥエル添加後、 4 °Cでー晚以上静置して固相 化した。 ブロッキングバッファーでブロックした後、 ピオチン化 RALS (200ng/m 1) を 50 / 1/ゥヱル添加して 25。Cで 2時間反応させた。 次に RBP- 3E. col i ( 100ng/ ml) 50 μ 1/ゥュル添加し、 4 °Cでー晚反応させた。 これらの反応により形成され た IGFBP-3と ALSの複合体を、 実施例 9で得た anti-RBP- 3 pAb #35 ( 3 μ g/ml) を 50 μ 1/ゥエル添加し、 25°Cで、 2時間、 続いて 2次抗体を 50 μ 1/ゥ： ル添加し、 25°Cで、 2時間反応させた。 最後に ABTS溶液を 100// 1/ゥュル添加して 20分間、 室温静置後に吸光度 （Abs405nm) を測定した。 競合阻害実験の場合は、 ピオチン 化 RALSの反応の後に RBP- 3E. coli (終濃度 100ng/ml) と競合阻害物質として RALS (各濃度） を 50μ1/ゥエルとなるように同時に添加して、 同様の反応を行った。 ピオチン化 RALSを加えないときの値を非特異的結合量 （NSB) とし、 阻害物質 を加えないときの値を Boとし、 阻害物質を加えたときの値を Bとした。 競合阻害 物質 （RALS) 添加時の、 固相化 RALSに対する RBP- 3 E. coliの結合量 （％) は
(B-NSB) I (Bo-NSB) X 100
の計算式から算出した。 測定は n= 3で行い、 その平均値をプロットし、 SD値を バーで示した （図 1 2参照）。
この結合試験を用いれば、 例えば ALSや ALS誘導体の IGFBP - 3に対する親和性の 評価および IGFBP- 3と ALSの複合体を阻害する物質等のスクリ一二ングが可能であ る。 実施例 1 5 in vitroにおけるヒ ト IGF - II誘導体 （[Leu27, Leu43]rIGF-II)
の特性 （1 )
実施例 8で得た [Leu27, Leu43]rIGF- IIが、 IGF-Iレセプター及びインスリンレ セプターへの親和性をどの程度消失しているかを、 ヒ ト胎盤から精製した IGF- 1 レセプターまたはィンスリンレセプターを用いたラジオレセブターアツセィ （Le Bon, T. R. , et al. , J. Biol. Chem. , 261. 7685 (1986)； Fujita-Yamaguchi, Y.， et al. , J. Biol. Chem. , 258, 5045 (1983)) にほぼ準拠して、 評価した。 まず、 125I- IGF- 1 (または1251-インスリン） （Amersham社製） 2 X 104cpm量 と各レセプターをィンキュベーションし、 50%の結合が得られるアツセィ系に添 加する各レセプタ一量を求めた。 これらレセプターと I 25I- IGF-Iまたは1251-ィ ンスリン （2 X l04cpm) に、 各濃度の [Leu27, Leu43]rIGF- IIを加え、 0.1% BSA および 0.075% Triton X- 100を含む 50mM トリス—塩酸バッファー （pH7.4) で反 応液を 300//1とし、 4°Cで、 一晚反応させた。 反応後、 75 /1のヒ ト γ _グロブ リン （4mg/ml) と 375 μ 1の 20% PEG 6000 (pH7.0) を同時に加え、 さらに 4°Cで、 1時間反応させ、 遠心 （3, 000rpmX30min、 4°C) した。 遠心上清を除去し、 沈 殿中に含まれる y - count (CPM)を測定した。
比較のため、 IGF- 1レセプタ一アツセィの場合には、 [Leu27, Leu43] rIGF- IIの 代わりに、 各濃度の IGF- 1又は IGF - IIを検体として添加した他は上記と同じ操作 を行った。 またインスリンレセプターアツセィの場合には、 [Leu27, Leu43] rIGF -IIの代わりに、 各濃度のィンスリン又は IGF- IIを検体とした他は上記と同じ操 作を行った。
レセプターを加えないときの値を非特異的結合量 （NSB) とし、 検体を加えな いときの値を Boと し、 検体を加えたときの値を Bと した。 レセプター結合量 (%) は
(B-NSB) I (Bo-NSB) X 100
の計算式から算出した。 測定は n = 3で行い、 その平均値をプロットし、 SD値を ノく一で示した。
図 1 3は、 1 2 5 I- IGF- 1と IGF- 1レセプタ一を用いた IGF- 1レセプターアツセィの 結果を示す。 IGF- IIには、 IGF- 1と同程度の IGF-Iレセプターに対する親和性が認 められるのに対し、 [Leu27， Leu43] rIGF-IIの IGF-Iレセプターへの親和性は、 そ の 1〜 2 %にまで減少していたことが確認できた。
図 1 4は、 1 2 51-ィンスリンとインスリンレセプターを用いたインスリンレセ プタ一アツセィの結果を示す。 IGF- IIには、 インスリンと同程度のインスリンレ セプターに対する親和性が認められるのに対し、 [Leu27, Leu43] rIGF- I Iのイン スリンレセプターへの親和性は、 その 1〜 2 %にまで減少していたことが確認で きた。 実施例 1 6 in vitroにおけるヒ ト IGF- II誘導体 （「し eu27, Leu43] rIGF-II) の 特性 （2 )
[Leu27, Leu43] rIGF-IIが、 IGFと IGFBP-3の結合を阻害するか否かを実施例 9 にしたがって、 評価した。
その結果、 [Leu27， Leu43] rIGF-IIは、 ほぼ IGF- IIと同程度の濃度で、 標識 IGF - IIと固相化 IGFBP - 3の結合を阻害することが確認された （図 1 5参照）。 実施例 1 7 抗 IGFBP-3抗体の特性
実施例 9で得た抗 IGFBP- 3抗体 （ant i - RBP- 3 pAb) 、 IGFと IGFBP-3の結合を どの程度阻害するかを実施例 1 0にしたがって、 評価した。 すなわち、 検体 （競 合阻害物質） として、 抗 IGFBP - 3抗体を用いた他は実施例 1 0と全く同様にして 測定を行った。
その結果、 抗体 #35と #90が最も結合阻害活性が強く、 RBP-3E. col i ( IGFBP - 3) の活性を 100%としたとき、 モル比で 0. 2632% (重量比で 2 %) であった。 抗体 #36と S89はほぼ同じ活性を示してモル比で 0. 0875%、 抗体 #88はやや活性が弱くモ ル比で 0. 0525%であったが、 いずれの抗体も IGFと IGFBP - 3の結合を阻害すること が確認された （図 1 6参照）。 実施例 1 8 in vivoにおけるヒ ト IGF- II誘導体及び抗 IGFBP-3抗体の特性
本発明の方法または本発明の物質が、 実際に in vivoで IGFの有効性を発現でき るか否かを調べる必要がある。 そのために
( 1 ) 本発明の物質の投与により、 IGF投与と同様な効果が認められるか、
( 2 ) 本発明の物質の投与により、 ラットでの血中主要 IGFである遊離型 IGF- 1の 濃度の上昇が認められる力 の 2つの点について評価を行った。
IGF投与時に認められる効果として、 血中脂質レベルの低下が知られている。 具体的には、
( a ) 遊離脂肪酸レベルの低下 （Turkalj. I. , et al.， J. Cl in. Endocrinol. etab. , 75, 1186 (1992) )、
( b ) トリグリセライ ドレベルの低下 （Turkalj. I. , et al. , J. Clin. Endocr inol. Metab. , 75, 1186 (1992)； Zenobi, P. D. , et al. , J. Clin. Invest. , 90, 2234 (1992) )、
( c ) LDL-コレステロールレベルの低下に伴う総コレステロールの低下 （Kazumi, Τ· , Metabol ism, 35, 1024 (1986)； Zenobi, P. D.， et al. , Diabetologia, 3
6, 465 (1993) ) 等である。
そこで、 実施例 8および実施例 9で得た結合阻害物質の投与により、 このよう な効果が認められるか否かを調べた。 実施例 1 8— 1 血中脂質レベルの評価 （ 1 )
SDラッ ト （n = 3、 8週齢、 雄、 平均体重 300g、 日本チャールズ . リバ一社よ り購入） に非絶食条件下、 実施例 8で得た [Leu27， Leu43]rIGF- II (1,000// g/k g) を皮下投与した。 また別の SDラッ ト群に、 実施例 9で得た anti- RBP- 3 pAb #3 5 (20mg/head) を腹腔内投与した。 陰性対照群としては生理食塩水 （500 l/hea d) を皮下投与した。 陽性対照群としては IGF- 1 (50/ g/kg、 200Mg/kg) を皮下 投与した。 経時的に尾静脈から EDTAをコートしたガラスチューブに約 500μ 1の血 液を採取し、 採血後 30分以上経過した時点で遠心 （3, 500rpmX12min、 25°C) し、 上清の血漿を回収してアツセィまで— 80°Cにて保存した。 血漿総コレステロール、 総トリグリセライ ド濃度はォ一トセラ CH02および TG2 (いずれも第一化学薬品社 製） を用いた酵素法により、 日立 7150形自動分析装置で標準測定法に準じて測定 した。
その結果、 投与 6時間後の総トリグリセライ ド濃度は、 陰性対照群と比較して IGF-I (50Mg/kg) と anti- RBP - 3 pAb #35投与により有意に低下し、 [Leu27, Leu 43]rIGF-IIでも低下傾向が認められた （図 1 7参照）。 また、 総コレステロール 濃度は、 陰性対照群と比較して、 IGF-I (200^g/kg) 投与 6および 24時間後で有 意に低下した。 [Leu27, し eu43]rIGF-IIでは 24時間後で有意に低下しており、 ant i-RBP-3 pAb #35投与でも低下傾向が認められた （図 1 8参照）。
以上の結果から、 これらの結合阻害物質を投与することにより IGF-I投与と同 様の脂質レベル低下作用が確認された。
なお、 図 1 7および図 1 8は、 投与前 （0時間） の種々濃度を 100%としたとき の、 投与後の値 （％) を示し、 SEM (Standard Error Means) をバーで示した。 実施例 1 8— 2 血中脂質レベルの評価 （2)
ィンスリン抵抗性モデルとして知られている Zucker fatty rat (n = 7〜 9、 6〜11週齢、 雄、 東京実験動物社より購入） を投与開始前日より 20時間絶食後、 実施例 9で得た anti- RBP-3 pAb #36 (40mg/head、 n = 5) を皮下投与した。 陰 性対照群としては生理食塩水 （500/i l/head、 n =18) を皮下投与した。 陽性対 照群として IGF - 1 (300 M g/kg, n=8) または IGF - II (1, 200 μ §Λ§, η = 8 ) およ び （600 // g/kg、 n = 8 ) を皮下投与した。 いずれの群も投与 6時間後に採血し た。 血漿総コレステロールおよび総トリグリセライ ド濃度測定は、 実施例 1 8—
1に準拠して行った。 血漿遊離脂肪酸濃度は NEFAC-テス トヮコー （和光純薬社 製） を用いた酵素法により、 標準操作法の 1/20スケールで 96穴マイクロタイター プレート （Costar社製） 内で反応後、 プレートリーダー （Vmax、 Molecular Devi ces社製） で吸光度 （Abs550nm) を測定することにより求めた。
その結果、 総コレステロール濃度では陰性対照群に比べ、 投与 6時間後におい て全ての投与群で有意な低下がみられた （図 1 9参照）。 また総トリグリセライ ド濃度でも投与 6時間後において全ての投与群で有意な低下がみられた （図 2 0 参照）。 同様な傾向は遊離脂肪酸濃度変化にも観察された （図 2 1参照）。
以上の結果から、 結合阻害抗体 （すなわち、 IGFと IGFBP- 3の結合を阻害する抗 IGFBP - 3抗体） を投与することにより IGF投与と同様の脂質レベル低下作用が確認 された。
なお、 図 1 8、 図 1 9および図 2 0は、 投与前 （0時間） の種々濃度を 100%と したときの、 投与後の値 （％) を示し、 SEM値をバーで示した。 実施例 1 8— 3 血中遊離型 IGF- 1レベルの評価
SDラット （n = 7、 8週齢、 雄、 平均体重 300g、 日本チャールズ . リバ一社よ り購入） に非絶食条件下、 実施例 9で得た anti- RBP- 3 pAb #90 (40mg/head) を 腹腔内投与した。 陰性対照群としては生理食塩水 （500 /x l/head) を皮下投与し た。 経時的採血は実施例 1 8— 1に準拠して行った。
血漿遊離型 IGF-Iは逆相カートリッジ (Sep-Pak C18 cartridge) 法 (Hizuka, N. , et al. , Growth Regulat ion, 1 , 51 (1991) )、 血漿総 IGF- 1はギ酸/ァセト ン抽出法 （Bowsher, R. R. , et al . , Endocrinology, 128, 805 (1991) ) に準じ てそれぞれ調製した。
' " I-IGF-Iとソマトメジン - C抗血清 （抗 IGF- 1抗体） は栄研化学社製を、 また スタンダードのラッ ト IGF- 1は GroP印社製を用い、 常法に従ってラッ ト IGF- 1ラジ オイムノアツセィを行った （Moses, A. に， et al.， Eur. J. Biochem. , 103， 4 01 (1980)； Daughaday, W. H. , Methods Enzymol. , 146, 248 (1987))。 まず、 12 5I- IGF- 1 (7.77X 103cpm/100M 1) と、 抗血清 50 目当量と、 スタンダードまた は検体とを混合して、 アツセィバッファー （0.25% BSA、 0.05% Tween 20および 0. 1% NaN3を含む 25mM リン酸ナトリウムバッファ一 （pH7.5)) にて 300μ1に調製 し、 4°Cでー晚反応させた。 次に 75μ 1の 4mg/ml ヒ ト γ—グロブリンと 375 1 の 25% PEG 6000を加えて 4 °C、 1時間反応後に遠心 （3， OOOrpm X 20min、 4°C) した。 遠心上清を除去し、 沈殿中に含まれる γ -count (CPM)を測定した。
その結果、 遊離型 IGF - 1と総 IGF-I濃度の比率は、 陰性対照群と比較して anti - R BP - 3 pAb #90投与後 6時間において有意な上昇が認められ、 結合阻害抗体投与に より遊離型 IGF-I濃度が上昇していることが確認された （図 22参照）。
なお、 図 22は、 投与前 （0時間） の総 IGF- 1量に占める遊離型 IGF-I量 （free /total) の比率を 100%とし、 投与 1および 6時間後の値を示し、 SEM値をバーで 示した。

Claims

請求の範囲 生体内のィンスリン様成長因子とインスリン様成長因子結合たんぱく質の
2者の複合体を、 インスリン様成長因子に変換することによる遊離型インス リン様成長因子の濃度上昇方法。
生体内のィンスリン様成長因子とインスリン様成長因子結合たんぱく質の
2者の複合体から、 インスリン様成長因子を遊離させることによる遊離型ィ ンスリン様成長因子の濃度上昇方法。
生体内のインスリン様成長因子とインスリン様成長因子結合たんばく質と の結合を阻害することによる遊離型ィンスリン様成長因子の濃度上昇方法。 生体内のインスリ ン様成長因子、 インスリ ン様成長因子結合たんぱく質お よび酸に不安定なサブュニットの 3者の複合体を、 インスリン様成長因子と インスリン様成長因子結合たんぱく質の 2者の複合体に変換することによる、 インスリン様成長因子とインスリン様成長因子結合たんぱく質の 2者の複合 体の濃度上昇方法。
生体内のィンスリン様成長因子、 インスリン様成長因子結合たんぱく質お よび酸に不安定なサブュニッ トの 3者の複合体から、 インスリン様成長因子 とインスリン様成長因子結合たんぱく質の 2者の複合体を遊離させることに よる、 インスリン様成長因子とインスリン様成長因子結合たんぱく質の 2者 の複合体の濃度上昇方法。
生体内のインスリン様成長因子とインスリン様成長因子結合たんぱく質の 2者の複合体と、 酸に不安定なサブュニットとの結合を阻害することによる、 インスリン様成長因子とインスリン様成長因子結合たんぱく質の 2者の複合 体の濃度上昇方法。
生体内のィンスリン様成長因子、 インスリン様成長因子結合たんぱく質お よび酸に不安定なサブュニッ トの 3者の複合体を、 インスリ ン様成長因子に 変換することによる遊離型ィンスリン様成長因子の濃度上昇方法。
生体内のインスリ ン様成長因子、 インスリ ン様成長因子結合たんばく質お よび酸に不安定なサブュニッ 卜の 3者の複合体から、 インスリ ン様成長因子 を遊離させることによる遊離型ィンスリン様成長因子の濃度上昇方法。
生体内のインスリン様成長因子とインスリン様成長因子結合たんぱく質と 酸に不安定なサブュニットとの結合を阻害することによる遊離型ィンスリ ン 様成長因子の濃度上昇方法。
. 生体内のインスリン様成長因子とインスリン様成長因子結合たんぱく質 の 2者の複合体を遊離型インスリン様成長因子に変換する物質。
. 生体内のインスリ ン様成長因子とインスリ ン様成長因子結合たんぱく質 の 2者の複合体から、 遊離型ィンスリン様成長因子を遊離させる物質。
. 生体内のィンスリン様成長因子とインスリン様成長因子結合たんぱく質 との結合を阻害する物質。
. 生体内のインスリン様成長因子、 インスリ ン様成長因子結合たんぱく質 および酸に不安定なサブュニットの 3者の複合体を、 インスリン様成長因子 とインスリン様成長因子結合たんぱく質の 2者の複合体に変換する物質。. 生体内のインスリン様成長因子、 インスリン様成長因子結合たんぱく質 および酸に不安定なサブュニッ トの 3者の複合体から、 インスリン様成長因 子とインスリン様成長因子結合たんぱく質の 2者の複合体を遊離させる物質。. 生体内のインスリ ン様成長因子とインスリ ン様成長因子結合たんぱく質 の 2者の複合体と、 酸に不安定なサブュニットとの結合を阻害する物質。 . 生体内のィンスリン様成長因子、 インスリン様成長因子結合たんぱく質 および酸に不安定なサブュニッ トの 3者の複合体を遊離型ィンスリン様成長 因子に変換する物質。
. 生体内のィンスリン様成長因子、 ィンスリン様成長因子結合たんぱく質 および酸に不安定なサブュニッ トの 3者の複合体から、 遊離型インスリ ン様 成長因子を遊離させる物質。
. 生体内のィンスリン様成長因子とインスリン様成長因子結合たんばく質 と酸に不安定なサブュニッ トとの結合を阻害することによる遊離型ィンスリ ン様成長因子を遊離させる物質。
. ィンスリン様成長因子レセプタ一およびィンスリンレセプターの両レセ プターには実質的に結合せずに、 ィンスリン様成長因子結合たんぱく質に結 合する物質。
. インスリン様成長因子レセプターおよびィンスリンレセプターの両レセ プターには実質的に結合せずに、 インスリン様成長因子結合たんぱく質に結 合するインスリン様成長因子誘導体。
. インスリン様成長因子レセプターおよびィンスリンレセプターの両レセ プターには実質的に結合せずに、 インスリン様成長因子結合たんぱく質に結 合するインスリン様成長因子誘導体であって、 インスリン様成長因子のァミ ノ酸配列において 1つまたは 2つ以上のアミノ酸残基が付加、 欠失もしくは 置換されたィンスリン様成長因子誘導体。
. インスリン様成長因子レセプターおよびィンスリンレセプターの両レセ プターには実質的に結合せずに、 インスリン様成長因子結合たんぱく質に結 合するインスリン様成長因子誘導体であって、 ヒ トインスリン様成長因子一 I Iのアミノ酸配列の 2 7位のチロシン残基および 4 3位のバリン残基をそ れぞれロイシン残基に置換したィンスリン様成長因子誘導体。
. インスリン様成長因子レセプターおよびィンスリンレセプターの両レセ プターには実質的に結合せずに、 インスリン様成長因子結合たんぱく質に結 合する抗ィンスリン様成長因子結合たんぱく質抗体。
. インスリン様成長因子レセプターおよびィンスリンレセプターの両レセ プターには実質的に結合せずに、 インスリン様成長因子結合たんぱく質一 3 に結合する抗ィンスリン様成長因子結合たんぱく質抗体。
. 請求の範囲第 1 0〜 1 9項のいずれか 1項に記載の物質を含有する医薬。 . 請求の範囲第 2 0〜 2 2項のいずれか 1項に記載のィンスリン様成長因 子誘導体を含有する医薬。
. 請求の範囲第 2 3項又は第 2 4項に記載の抗インスリン様成長因子結合 たんぱく質抗体を含有する医薬。
. インスリ ン様成長因子、 インスリ ン様成長因子結合たんばく質および酸 に不安定なサブュニッ トからなる群のうちいずれか 1つを直接又は間接に検 出可能に標識したことを特徴とする請求の範囲第 1 0〜第 1 9項のいずれか
1項に記載の物質のスクリーニング法。
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