WO1998046992A1 - Method for detecting s-nitroso compound - Google Patents

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WO1998046992A1
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Takaaki Akaike
Hirohito Nishino
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EICOM CORP
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Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring S-nitrosated nitric oxide (NO) produced in a living body.
  • NO nitric oxide
  • NO is highly reactive, and its existence time as a simple substance is extremely short when it is about 1 to 2 seconds, so it exists as an S-nitroso compound in the vascular system as described above, It is considered to be an N ⁇ source. Therefore, in order to elucidate the behavior of N ⁇ in a living body, it is essential to measure S-nitrosole compounds, but the current methods have many problems in terms of sensitivity or simplicity.
  • the nitroso form has a peak with an absorption peak of 320 nm, and its sensitivity is low even if direct absorption measurement is performed using this characteristic, and the influence of noise and background caused by contaminants cannot be excluded. It is considered impossible to obtain a value.
  • An object of the present invention is to provide an effective and simple method and apparatus for measuring S-nitroso compounds. Is to provide.
  • the present invention firstly injects a sample containing an S-ditroso compound into a mobile phase, passes the sample-injected mobile phase through a separation ram to convert the S-ditroso compound into a mobile phase. separated, the separated S - mercury nitroso compounds, together with a silver or copper salt added including solution to liberate HN 0 2, resulting in liquid even after passing through the free process during or free process obtained by constituting the detection method of the two preparative ⁇ source compound - of HN ⁇ 2 to the addition of Griess reagent generates Jiazo compound, S, which consists of measuring the spectrophotometric corresponding to the density of the generated Jiazo compound is there.
  • the present invention injects a sample containing an S-nitro compound into a mobile phase, passes the sample-injected mobile phase through a separation ram to separate the S-nitro compound, the S - two Toroso mercury compounds, causes away Yu the HN 0 2 solution was added containing silver or copper salt, HN 0 2 obtained in liquid even after passing through the free process during or free process to generate the di ⁇ amino naphthalene or phosphor ⁇ zo compounds by reaction with HN 0 2 by the addition of di ⁇ amino naphthalene fluorescent reagent ing from similar material and consists of measuring the fluorescence intensity S —Constitutes a method for detecting ditroso compounds.
  • an excess mercury salt ( ⁇ ), a silver salt or a copper salt may be added to nitrosoglutathione, nitrosocystine, and an S-nitroso compound such as protein S—NO bonded to the SH group of cysteine.
  • a salt their metal ions liberate HN 0 2 from S- two Toroso compound.
  • the absorbance of the diazo compound generated by the addition of the reagent is measured, and the measurement sensitivity and linearity can be obtained in a wide concentration range.
  • the diazominonaphthalene or diazo compound is obtained. By measuring the fluorescence emission of the phosphor azo compound generated by adding a fluorescent reagent composed of a substance similar to aminonaphthalene, it is possible to detect a sufficiently practical S—2 torso compound.
  • the target substance in the sample is a high-molecular S-nitroso compound
  • For Bumin or nitro hemoglobin rise to absorption have you approximately equal wavelength and the absorption peak (5 4 0 mm) of the body also Jiazo compounds of high molecular compound after liberating HN 0 2 These, ignored in this absorption spectroscopy It becomes an error factor that cannot be performed.
  • Jiazo compounds of high molecular compound after liberating HN 0 2 It becomes an error factor that cannot be performed.
  • the fact that the absorption characteristics are partially overlapped with Jiazo compound polymer compounds, also the fluorescent measurements of the same Ku phosphor ⁇ zo compounds produced from HN 0 2 would negatively affect Is predicted.
  • the present invention is in the first and second methods, trapping polymer compound from a liquid containing HN_ ⁇ 2 was released by adding a metal salt solution, followed by HN O
  • FIG. 1 is a flow path block diagram showing an example of an apparatus configuration that basically implements the first method of the present invention.
  • FIG. 2 is a channel block diagram showing an example of an apparatus configuration for performing the second method of the present invention on a polymer.
  • FIG. 3 is a flow path block diagram showing an example of an apparatus configuration for basically implementing the third method of the present invention.
  • FIG. 4 is a flow block diagram showing an example of an apparatus configuration for performing the fourth method of the present invention on a polymer.
  • FIG. 5 shows the elution chromatogram (a) measured when the S-nitroso compound was ditrosoglutinone and the elution chromatogram (b) measured when the compound was nitrosoalbumin.
  • FIG. 1 in order to analyze a relatively low molecular weight compound as an S-nitroso compound, for example, ditrosoglutathione, an apparatus structure shown in a flow path block diagram in FIG. 1 is used.
  • 1 is the liquid reservoir for the mobile phase of the column
  • 2 is the pump for liquid transport
  • 3 is the injector for injecting the sample into the mobile phase in the liquid transport channel
  • 4 is the injector for the mobile phase.
  • a precolumn for removing components that cannot be separated and eluted using the following column 5 for separation of S-nitroso compounds (hereinafter referred to as “separation column”) from the separated sample, and 6 was connected to the elution port of separation column 5 7 is a non-alkaline solution containing ions such as Hg (11), Ag (I) or Cu (II) in the coil flow path from the upstream end of the first coil 6
  • a reaction liquid pump 10 for introducing the reaction liquid is a detector including a photometric system for irradiating the outflow phase from the reaction coil flow path with light and measuring the absorbance at a wavelength corresponding to the product.
  • a solution of pH 5.5) containing 0.5 mM getyltriaminepentaneacetic acid is sent by the pump 2 at a flow rate of 0.5 ml 1 Zmin.
  • the separation column 5 is a reversed-phase column, and the mobile phase can develop a sample and elute nitrosoglutathione.
  • the detector 10 is configured as an absorptiometer that includes a light source containing the wavelength and a light-receiving element, and the magnitude of the absorption peak is measured.
  • the detector 10 is configured as an absorptiometer that includes a light source containing the wavelength and a light-receiving element, and the magnitude of the absorption peak is measured.
  • FIG. 2 In the case of analyzing a relatively high molecular weight so-toalbumin or the like as an S-nitroso compound, an apparatus configuration as shown in FIG. 2 is used.
  • 1 to 7 and 10 are the same as those shown in FIG. 1, but 8 is the second reagent reaction flow path connected to the downstream end of the coil 6.
  • Coil 9 is a second reaction solution pump for introducing a reagent into this coil flow path from the upstream end of the second coil 8, and 12 is HN0 present in the outflow phase from the first coil 6.
  • a 1 OmM acetate buffer (PH 5.5) containing 0.5 mM getyltriaminepentaneacetic acid as the mobile phase was pumped to 0.5 ml It is sent at a flow rate of Zmin.
  • the separation column 5 is a column for gel filtration according to the molecular weight, and the mobile phase can be used to develop a sample and elute soto albumin p
  • the apparatus configuration shown in FIG. 3 is used. Is used. Elements 1 to 9 of this device configuration are the same as elements 1 to 9 in FIG. 2 in their physical functions. However, in this embodiment, the trap for the polymer was not required, and the detector 11 illuminated (excited 365 nm) the outflow phase from the second coil flow path 8, thereby causing It is configured as a fluorometer that measures the light emitted by the phosphor azo compound (450 nm peak at 365 nm excitation, 425 nm peak at 380 nm excitation).
  • the second coil 8 is used as a fluorescence channel for that purpose, and an alkaline liquid as a fluorinating agent, for example, caustic soda 0.4 mol (PH12) is sent from the pump 9 into this coil channel, The peak intensity of fluorescence generated by applying light containing the above-mentioned excitation wavelength to the effluent phase by a photometric system of the detector 10 is measured, and the amount of the S-2-nitroso compound is determined. This ensures that there is linearity response was obtained for S- two Toroso minor compounds (1 0- 9 ⁇ 1 0- 4 M ).
  • FIG. 4 In the second method of the present invention, when analyzing relatively high molecular weight S-nitrosoalbumin or the like, an apparatus configuration as shown in FIG. 4 is used. In this configuration, the same trap 12 shown in FIG. 2 is placed between the first and second coils 6 and 8, and the third coil 1 is placed between the coil 8 and the detector 11. 3 and the reagent pump 14 connected to the upstream side of the coil 13.
  • the separation column 5 can develop the mobile phase containing the sample and elute the eluent containing the band of the S-nitroso compound.
  • the reaction solution from the pump 7, a first coil 6 at a flow rate in this case may also liberate efficiently HN0 2 Hg ( ⁇ ) containing ions 1. 75 mM of HGC 1 2 a 0. 2 m 1 Zm in.
  • the liquid after the release of HN 2 passes through the trap 12 to remove high molecular compounds such as albumin and hemoglobin.
  • the liquid exiting from the trap 12 flows into the second coil 8, and at the same time, an aqueous solution containing a fluorescent reagent comprising diaminonaphthalene or a substance similar to diaminonaphthalene is fed into this coil 8 by the pump 9.
  • the third coil 13 is used as a fluorescing channel for that purpose, so that the pump 13 emits an alkaline liquid as a fluorinating agent.
  • a fluorescent reagent HN0 2 in the liquid allowed to produce a phosphor Toriazo one le compound.
  • the phosphor triazole compound The third coil 13 is used as a fluorescing channel for that purpose, so that the pump 13 emits an alkaline liquid as a fluorinating agent.
  • 0.4 mol (PHI 2) of Kasei Tuda is sent in, and the peak intensity of the fluorescence generated by applying light including the above-mentioned excitation wavelength to the outflow phase by the photometry system of the detector 11 is measured. This is to determine the amount of the ditroso compound.
  • S- nitroso compounds traces (1 0 - 9 ⁇ 1 0- 4 M) is linear response for were obtained.
  • the third coil 13 can have the same capacity as the first coil 6 and the second coil 8.
  • the present invention provides a method and an apparatus for easily and reliably measuring the amount of S-nitrosated N ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ in a living body by online measurement. It is recommended to use the second method of adding a fluorescent reagent similar to aminonaphthalene or diaminonaphthalene, and to use the first absorbance measurement method of adding a grease reagent when stability is important. Is done.
  • an accurate measurement value can be obtained by trapping the high molecular compound after the release of HN 2 .

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Description

明 糸田 書
S—ニトロソ化合物検出方法 技術分野
本発明は、 生体中で生成され、 S -二トロソ化された一酸化窒素 （N O) を測 定するための方法に関するものである。
背景技術
生体内では、 一酸化窒素 （N O) が細胞間伝達物質となることが認識され、 特 に血管系では血管内皮細胞及び支配神経から遊離される N 0がへモグロビンなど の夕ンパク質と結合し、 さらにへモグロビンなどの夕ンパク質から S—ニトロソ 化された N 0が解離して血管拡張作用を発揮するという仮説が提唱され、 注目を 集めている。
周知の通り、 N Oは反応性が強く、 単体としての存在時間が 1〜 2秒程度とき わめて短いため、 特に血管系内では上述したように S —ニトロソ化合物として存 在し、 持続的な N〇源になると考えられている。 そのため、 生体内での N〇の挙 動の解明に当たっては S —二トロソ化合物の測定が不可欠であるが、 現在とられ ている方法は、 感度もしくは簡便性等の点で問題が多い。
すなわち、 ニトロソ体は 3 2 0 n mの吸収ピークを有する力、 この特性を用い て直接吸光測定しても感度が低く、 挟雑物によるノィズゃバックグラウンドの影 響を排除できないため、 信頼できる測定値を得ることはできないと考えられる。 またニトロソ体の光分解によつて生ずる N〇とオゾンとが反応する際の化学発光 を測定する方法も存在するが、 オゾン発生源を必要とするほか操作が煩雑で、 実 際的ではない。
発明の開示
本発明の目的は、 有効且つ簡便な S -二ト口ソ化合物の測定方法及び装置を提 供することである。
上記の課題を解決するため、 本発明は第 1に、 S -二トロソ化合物を含む試料 を移動相に注入し、 前記試料注入後の移動相を分離力ラムに通じて S —二トロソ 化合物を分離し、 前記分離された S -ニトロソ化合物に水銀、 銀又は銅塩等を含 む溶液を加えて HN 02 を遊離させるとともに、 この遊離工程中又は遊離工程を 経た後において得られた液中の H N◦ 2 にグリース試薬を添加してジァゾ化合物 を生成し、 生成されたジァゾ化合物の濃度に応じた吸光光度を測定することから なる S -二ト πソ化合物の検出方法を構成したものである。
本発明は第 2に、 S—二ト oソ化合物を含む試料を移動相に注入し、 前記試料 注入後の移動相を分離力ラムに通じて S -二トロソ化合物を分離し、 前記分離さ れた S -二トロソ化合物に水銀、 銀又は銅塩等を含む溶液を加えて HN 02 を遊 離させるとともに、 この遊離工程中又は遊離工程を経た後において得られた液中 の HN 02 にジァミノナフタレン又はジァミノナフタレンと類似した物質からな る蛍光試薬を添加して HN 02 と反応させることにより蛍光体ァゾ化合物を生成 し、 その蛍光光度を測定することからなる S —二トロソ化合物の検出方法を構成 したものである。
上記第 1及び第 2の構成において、 ニトロソグル夕チオン、 ニトロソシスティ ン、 システィンの S H基に結合したタンパク S— N O等の S—二トロソ化合物に 、 過剰の水銀塩 （Π) 、 銀塩又は銅塩を加える工程により、 それらの金属イオン が S—二トロソ化合物から HN 02 を遊離させる。 そして第 1の構成では、 試薬 添加により生成されたジァゾ化合物の吸光光度を測定し、 広い濃度範囲において 測定感度及び直線性を得ることが可能となり、 第 2の構成では、 ジ了ミノナフタ レン又はジァミノナフタレンに類似した物質からなる蛍光試薬の添加により生成 された蛍光体ァゾ化合物の蛍光発光を则定することにより十分に実用的な S —二 トロソ化合物の検出が可能となる。
一方、 試料中の目的物質が高分子の S—ニトロソ化合物、 例えばニトロソアル ブミンやニトロヘモグロビンの場合、 これらから HN 02 を遊離した後の高分子 化合物の本体もジァゾ化合物の吸収ピーク （ 5 4 0 mm) とほぼ等しい波長にお いて吸収を生じ、 これが吸光測定における無視できない誤差要因となる。 また、 この高分子化合物の吸収特性がジァゾ化合物と一部重複するという事実は、 同じ く H N 02 から生成される蛍光体ァゾ化合物の蛍光測定に対しても悪影響を与え るであろうことが予測される。
したがって、 本発明は前記第 1及び第 2の方法において、 金属塩の溶液を加え て遊離させた HN〇2 を含む液から高分子化合物をトラップし、 その後で HN O
2 にグリース試薬又は蛍光試薬を加えるようにそれぞれ構成した高分子二ト口ソ 化合物の検出方法を提供するものである。
図面の簡単な説明
第 1図は、 本発明の第 1の方法を基本的に実施する装置構成例を示す流路ブロ ック線図である。
第 2図は、 本発明の第 2の方法を高分子に対して実施する装置構成例を示す流 路ブロック線図である。
第 3図は、 本発明の第 3の方法を基本的に実施する装置構成例を示す流路ブロ ック線図である。
第 4図は、 本発明の第 4の方法を高分子に対して実施する装置構成例を示す流 路ブロック線図である。
第 5図は、 S —二トロソ化合物が二トロソグル夕チォンである場合に測定され た溶出クロマトグラム （a ) と、 ニトロソアルブミンである場合に測定された溶 出クロマトグラム （b ) である。
発明を実施する最良の形態
第 1方法 （吸光測定法） の基本的実施例
この実施例では、 S -二トロソ化合物として比較的低分子の化合物、 例えば二 トロソグルタチオンを分析するために、 第 1図の流路ブロック線図に示す装置構 成を用いる。 第 1図のフロー順において、 1はカラム移動相用の液溜め、 2は送 液用ポンプ、 3は送液流路中の移動相に試料を注入するためのインジェクタ、 4 は移動相に注入された試料から次の S—ニトロソ化合物分離用カラム 5 (以下 「 分離カラム」 という。 ） で分離 ·溶出できない成分を除去するためのプレカラム 、 6は分離力ラ厶 5の溶出口に接続された金属ィォン等反応流路としてのコイル 、 7は前記第 1のコイル 6の上流端よりこのコイル流路に Hg (11) 、 Ag ( I ) 又は Cu (II) 等のイオンを含む非アルカリ性の溶液を導入するための反応液 ポンプ、 1 0は反応用コイル流路からの流出相に光照射し、 その生成物に応じた 波長の吸光光度を測定するための測光系を含む検出器である。
移動相としては 1 OmM酢酸緩衝液/メタノール （=93Z7Vo l. 、 但し
0. 5 mMジェチルトリアミンペンタン酢酸を含む、 PH 5. 5) の液が、 ボン プ 2により 0. 5m 1 Zm i nの流量で送られる。 分離カラム 5は逆相系カラム であつて、 この移動相により試料を展開してニトロソグルタチオンを溶出するこ とができる。
反応液ポンプ 7からは、 この場合、 S—二トロソ化合物のバンドから最も効率 よく HN02 を遊離させうる Hg (II) イオンを含む 1.
Figure imgf000006_0001
8〇 12 を 0. 1 mMの HC 1で調整した溶液と、 グリース試薬とをいずれも 0. 2m 1 7m i n. の流量でコイル 6 (0. 25 mm ø x 4 m) に送り込み、 このコイル 6内で遊離した HN02 は、 同時にグリース試薬と反応してジァゾ化合物を生成 する。 グリース試薬としては、 この場合 1 %のスルファニルアミ ドと 0. 1 %の ナフチルエチレンジァミンを含む 2 リン酸溶液を採用した。 なお、 Hg (II) 溶液と、 グリース試薬の供給量の制御を厳密に行うこと等の理由により、 ポンプ 7からは Hg (II) 溶液のみをコイル 6に送るものとし、 その下流に専用の試薬 ポンプと試薬反応コイルを追加してもよい。 ジァゾ化合物は赤色を呈し 540 n m付近の吸収帯を有するため、 検出器 1 0はその波長を含む光源と受光素子を含 む吸光光度計として構成され、 これによりその吸収ピークの大きさを測定したと ころ、 微量の S—ニトロソ化合物 （ 1 0— 8〜 1 0— 3M) について直線性ある応答 が得られた。 その S—ニトロソ化合物が二トロソグル夕チォンである場合に測定 された溶出クロマトグラムは第 5図 （a) に示す通りである。
第 1方法 （吸光測定法） の高分子に対する実施例
S—二トロソ化合物として比較的高分子の二ト口ソアルブミン等を分析する場 合には、 第 2図に示すような装置構成が用いられる。 第 2図のフロー順において 、 1〜7及び 1 0は第 1図に示したものと同じであるが、 8は前記コイル 6の下 流端に接続された試薬反応流路としての第 2のコイル、 9は前記第 2のコイル 8 の上流端よりこのコイル流路に試薬を導入するための第 2の反応液ポンプ、 1 2 は前記第 1のコイル 6からの流出相中に存在する HN02 遊離後の高分子化合物 を補足するためのトラップである。
S—二トロソ化合物としてニトロソアルブミンを分析する場合、 移動相とし ては 0. 5mMジェチルトリアミンペンタン酢酸を含む 1 OmM酢酸緩衝液 （P H 5. 5) の液が、 ポンプ 2により 0. 5m 1 Zm i nの流量で送られる。 分離 カラム 5はこの場合、 分子量に応じてゲルフィルトレーション用カラムであって 、 この移動相により試料を展開して二ト口ソアルブミンを溶出することができる p
反応液ポンプ 7からは、 この場合、 S—二トロソ化合物のバンドから最も効率 よく HN02 を遊離させうる Hg (II) イオンを含む 1. 75 1\[の^1 〇 12 を 0. 1 mMの HC 1で調整した溶液を送り込み、 これにより第 1のコイル 6 (
0. 25mm0x 4m) を経た液は、 遊離 HN02 と、 その遊離後の高分子化合 物 （アルブミン、 ヘモグロビン等） を含んでおり、 この高分子化合物はトラップ
1 2により吸着 ·除去される。 かく してトラップ 1 2を出た液中の HN〇2 は、 第 2のコイル 8 (0. 25 mm0 X 4 m) 内において試薬ポンプ 9より供給され るグリース試薬と反応してジァゾ化合物を生成する。 グリース試薬は、 先の実施 例と同様に、 1 %のスルファニルアミ ドと 0. 1 %のナフチルエチレンジァミン を含む 2 %リン酸溶液である。 このようにしてジァゾ化合物と同様な 54 0 n m 付近の吸収帯を有するヘモグロビン等、 高分子の妨害成分は除去され、 検出器 1 0は微量の S -二トロソ化合物 （ 1 0_8〜1 0— 3M) について正確かつ直線性あ る応答を示した。 S—二トロソ化合物がニトロソアルブミンである場合に測定さ れた溶出クロマトグラムは第 5図 （b) に示す通りである。
第 2方法 （蛍光測定法） の基本的実施例
本発明の第 2の方法において、 比較的低分子の S—二トロソ化合物として、 例 えば第 1の基本方法と同じ S—二トロソグル夕チオンを分析する場合には、 第 3 図に示す装置構成が用いられる。 この装置構成の各要素 1〜9はその物理的機能 において第 2図の要素 1〜9と同じである。 しかしながら、 この実施例では高分 子用トラップは必要なく、 検出器 1 1は第 2のコイル流路 8からの流出相に光照 射 （ 3 6 5 nm励起） し、 これによつて流出相中の蛍光体ァゾ化合物が発する光 ( 3 65 nm励起で 45 0 nmピーク、 38 0 nm励起で 425 nmピーク） を 測定する蛍光光度計として構成されたものである。
この方法において、 移動相としては 1 OmM酢酸緩衝液/メタノール （= 9 3 Z7Vo l . 、 但し 0. 5 mMエチレンジァミ ンを含む、 PH 5. 5 ) の液を、 ポンプ 2により 0. 5m 1 i nの流量で送り、 分離カラム 5は第 1図の実施 例と同様、 試料を含む移動相を展開して S—二トロソ化合物のバンドを含む溶離 液を溶出することができる。
反応液ポンプ 7からは、 この場合、 S—二トロソ化合物のバンドから最も効率 よく HN02 を遊離させうる Hg (II) イオンを含む 1. 751^1\1の《：£じ 12 とジァミノナフタレン又はジァミノナフタレンに類似する物質からなる蛍光試薬 を含む水溶液を送り込み、 これにより第 1のコイル 6内で HN02 を遊離すると 同時に、 この HN〇2 にジァミノナフタレン又はジァミノナフ夕レンに類似する 物質からなる蛍光試薬を反応させて蛍光体ァゾ化合物 （トリァブール化合物） を 生成せしめる。 この蛍光体ァゾ化合物はアル力リ化されることにより前述のよう な励起発光特性を実際に発揮する。 従って、 第 2のコイル 8はそのための発蛍光 流路として用いられ、 ポンプ 9からは発蛍光化剤としてのアルカリ性液、 例えば カセイソーダ 0. 4mo l (PH 1 2) をこのコイル流路に送り込み、 その流出 相に対し検出器 1 0の測光系により前記の励起波長を含む光を当て発生する蛍光 のピーク強度を測定し、 S—二トロソ化合物量を決定するものである。 これによ り、 微量の S—二トロソ化合物 （ 1 0— 9〜1 0— 4M) について直線性ある応答が 得られた。
第 2方法 （蛍光測定法） の高分子に対する実施例
本発明の第 2の方法において、 比較的高分子の S -二トロソアルブミン等を分 析する場合には、 第 4図に示すような装置構成が用いられる。 この構成では第 1 およひ第 2のコイル 6、 8間に第 2図に示したものと同じトラップ 1 2が配置さ れるとともに、 コイル 8と検出器 1 1の間に第 3のコイル 1 3を挿入し、 かつコ ィル 1 3の上流側に試薬ポンプ 1 4を接続したものである。
この方法においては、 第 1の方法の高分子への適用の場合と同様、 移動相とし てはジェチルトリアミンペンタン酢酸を含む 1 0 mM酢酸緩衝液の液を、 ポンプ 2により 0. 5m 1 Zm i nの流量で送り、 分離カラム 5は第 2図の実施例と同 様、 試料を含む移動相を展開して S -二トロソ化合物のバンドを含む溶離液を溶 出することができる。
反応液ポンプ 7からは、 この場合も効率よく HN02 を遊離させうる Hg (Π ) イオンを含んだ 1. 75mMの HgC 12 を 0. 2 m 1 Zm i n . の流量で第 1のコイル 6に送り、 コイル 6を出た HN〇2 遊離後の液はトラップ 1 2を通つ てアルブミン、 ヘモグロビン等の高分子化合物を除去される。 トラップ 1 2を出 た液は第 2のコイル 8に流入するが、 同時にこのコイル 8にはポンプ 9によりジ ァミノナフタレン又はジァミノナフタレンに類似する物質からなる蛍光試薬を含 む水溶液を送り込み、 液中の HN02 に蛍光試薬を反応させて蛍光体トリァゾ一 ル化合物を生成せしめる。 前述の通り蛍光体トリァゾ一ル化合物をアル力リ化し て実際に励起発光特性を発揮さるため、 第 3のコイル 1 3がそのための発蛍光流 路として用いられ、 このコイル流路の上流側にはポンプ 1 4から発蛍光化剤とし てのアルカリ性液、 例えばカセイツーダ 0 . 4 m o l ( P H I 2 ) が送り込まれ 、 その流出相に対し検出器 1 1の測光系により前記の励起波長を含む光を当て発 生する蛍光のピーク強度を測定し、 S—二トロソ化合物量を決定するものである 。 これにより、 微量の S—ニトロソ化合物 （ 1 0 - 9〜 1 0— 4 M) について直線性 ある応答が得られた。 なお、 第 3のコイル 1 3も第 1のコイル 6及び第 2のコィ ル 8と同様の容量とすることができる。
産業上の利用可能性
本発明は以上のとおり、 生体内において S—ニトロソ化した N〇量をオンライ ン測定により簡便且つ信頼性よく測定するための方法及び装置を提供するもので あり、 感度を重視する場合にはジァミノナフタレン又はジァミノナフタレンに類 似した蛍光試薬を添加する第 2の方法を用い、 安定性を重視する場合にはグリ一 ス試薬を添加する第 1の吸光測定法を用いることが推奨される。
また、 特に高分子の化合物を分析する場合には、 HN〇2 遊離後においてそれ らの高分子等をトラップすることにより、 正確な測定値を得ることができる。

Claims

請 求 の 範 囲 . S -二トロソ化合物を含む試料を移動相に注入し、 前記試料注入後の移動相 を分離力ラムに通じて S —二トロソ化合物を分離し、 前記分離された S —二ト ロソ化合物に水銀、 銀又は銅塩等を含む溶液を加えて HN〇2 を遊離させると ともに、 この遊離工程中又は遊離工程を経た後において得られた液中の HN〇 2 にグリース試薬を添加してジァゾ化合物を生成し、 生成されたジァゾ化合物 の濃度に応じた吸光光度を測定することを特徴とする S —二トロソ化合物の検 出方法。
. S—二トロソ化合物を含む試料を移動相に注入し、 前記試料注入後の移動相 を分離力ラムに通じて高分子 S —二トロソ化合物を分離し、 前記分離された高 分子 S—二トロソ化合物に水銀、 銀又は銅塩等を含む溶液を加えて HN 02 を 遊離させ、 この遊離工程を経た液から高分子化合物をトラップし、 このトラッ プ後の液中に存在する HN 02 にグリ—ス試薬を添加してジァゾ化合物を生成 し、 生成されたジァゾ化合物の濃度に応じた吸光光度を測定することを特徴と する S —二トロソ化合物の検出方法。
. S—二トロソ化合物を含む試料を移動相に注入し、 前記試料注入後の移動相 を分離力ラムに通じて S —二トロソ化合物を分離し、 前記分離された S —二ト ロソ化合物に水銀、 銀又は銅塩等を含む溶液を加えて HN 02 を遊離させると ともに、 この遊離工程中又は遊離工程を経た後において得られた液中の HN O 2 にジアミノナフタレン又はジアミノナフタレンと類似した物質からなる蛍光 試薬を添加して H N 02 と反応させることにより蛍光体ァゾ化合物を生成し、 この蛍光体ァゾ化合物を発蛍光化処理した後これに励起光を当て蛍光光度を測 定することを特徴とする S—ニトロソ化合物の検出方法。
. S -二トロソ化合物を含む試料を移動相に注入し、 前記試料注入後の移動相 を分離力ラ厶に通じて高分子 S —二トロソ化合物を分離し、 前記分離された高 分子 s 二ト口ソ化合物に水銀、 銀又は銅塩等を含む非アル力リ性の溶液を加 えて HN 02 を遊離させるとともに、 この遊離工程を経た液から高分子化合物 をトラップし、 このトラップ後の液中に存在する HN 02 にジァミノナフタレ ン又はジァミノナフタレンと類似した物質からなる蛍光試薬を添加して H N〇 2 と反応させることにより蛍光体ァゾ化合物を生成し、 この蛍光体ァゾ化合物 を発蛍光化処理した後これに励起光を当て蛍光光度を測定することを特徴とす る S —二トロソ化合物の検出方法。
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