WO1998054304A2 - Chitinase - Google Patents

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    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01014—Chitinase (3.2.1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2442—Chitinase (3.2.1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates

Definitions

  • the invention relates to a new chitinase, its preparation and its use. Areas of application of the invention are medicine and the food industry.
  • Chitinases break down chitin into smaller oligomeric saccharides.
  • Chitin one of the most common natural polymers alongside cellulose, is made up of N-acetyl-D-glucosamine. It is an essential structural component in the outer skeleton of crayfish and insects and also part of the cell walls of most fungi.
  • Chitinases are widespread in nature and have been found in bacteria, fungi, plants, invertebrates and vertebrates. Chitinases play different roles in these organisms. In vertebrates they are part of the digestive system (small crabs of the sea as food for fish, insects as food for birds). In insects, crabs and fungi, chitinases primarily have morphogenetic functions (insects and crabs: partial degradation of the outer skeleton during the molting processes necessary for growth; fungi: growth of the mycelium). Bacteria secrete chitinases in order to gain energy from the breakdown of chitin. They play an essential role in the recycling of chitin from dead organisms.
  • chitin is not found in plants, chitinases are found in many plants. These occur in plants both constitutively and induced by abiotic or biotic stress. In particular, the finding that infection of plants with fungal pathogens in plants induces the synthesis of chitinases led to the view that chitinases have a role in the defense against such pathogens. It has been shown that such chitinases can inhibit the growth of fungal pathogens both in vitro and in vivo (after constitutive expression in transgenic plants). Given the great importance of fungal pathogens for crops from this point of view there is considerable biotechnological interest in chitinases.
  • chitin The main commercial source for chitin is in the shells of crabs and shrimps, which amount to more than 1 million tons a year from fishing waste. Chitin and its derivatives are of great interest for various applications in medicine, industry and food production.
  • Chitinases for technical applications e.g. the conversion of process waste from shrimp processing to yeast protein, have so far been obtained from bacterial cultures, for which appropriate fermenter systems are required (Muzzarelli, RAA: Chitin, in: The Polysacharides, Vol. III. Publisher Aspinall, GO Academic Press New York, 1985).
  • the invention has for its object to expand the spectrum of the existing chitinases and to provide a new chitinase that can be obtained in good yield from plant material.
  • a chitinase was found in the seeds of the giant bean (Canavalia ensiformis (L.) DC.).
  • the giant bean or jack bean is a legume native to the tropics of South America, which can now be found in the entire tropical and subtropical belt of the world. This crop is used only to a minor extent for nutrition, it is often cultivated as a green manure and cover plant in tobacco, sugar cane, pineapple, cocoa and citrus plantations.
  • the chitinase from the giant bean according to the invention extends the spectrum in that this enzyme is an endo-chitinase, while the microbial chitinases are exo-chitinases.
  • the chitinase of the giant bean is accumulated in the ripe seed. These seeds can be stored for years so that the starting material is readily available.
  • the isolation and purification of the chitinase from the seeds of the giant bean is carried out according to the invention in 4 steps: 1. Extraction of the proteins with buffer solution 2. Precipitation of the majority of the inactive storage proteins 3. Separation of the lectin concanavalin A (second most common protein) 4. Purification of the chitinase by cation and anion exchange chromatography. The purity thus achieved allows the enzyme to crystallize.
  • the molecular weight is 26225, the isoelectric point pH 9.3, the pH optimum for the cleavage of chitin pH 6.0.
  • the complete amino acid sequence was derived from cDNA clones and confirmed by sequencing the N-terminal end and internal peptides.
  • chavinase from Canavalia ensiformis (derived from complete cDNA; sequenced peptides underlined) has the following structure:
  • the amount of enzyme that can be isolated per gram of starting material is thus significantly higher in the case of chitinase from the giant bean than in the two previously known examples.
  • the supernatant from this centrifugation is applied to a Sephadex G-75 column to which the lectin concanavalin A binds. This will remove the second most common protein from the extract.
  • the unbound fraction is concentrated by ultrafiltration and buffered by dialysis in 0.05 M phosphate buffer pH 6.4. This sample is applied to a cation exchange column (-S0 3 ⁇ ). Impurities are removed with the unbound fraction.
  • the chitinase activity sought is eluted with a NaCl gradient at about 0.2 M NaCl. This fraction is again concentrated by ultrafiltration and buffered by dialysis in 0.05 M Tris / HCl buffer pH 9.5.
  • This sample is separated on an anion exchange column (-N * (CH 3 ) 3 ).
  • the pure chitinase is eluted in the unbound fraction, impurities are bound to the column. After concentration, the chitinase can be crystallized by vapor diffusion against ammonium sulfate solution, which gives a very stable form of the enzyme.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine neue Chitinase, ihre Herstellung und ihre Verwendung. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die Nahrungsmittelindustrie. Die neue Chitinase wird aus dem Samen der Riesenbohne Canavalia ensiformis (L.) DC.) gewonnen. Sie ist durch ein Molekulargewicht von 26225, einen isoelektrischen Punkt pH 9,3 und ein pH-Optimum für die Spaltung von Chitin pH 6,0 sowie die Sequenz (a) gekennzeichnet.

Description

Chitinase
Beschreibung
Die Erfindung betrifft eine neue Chitinase, ihre Herstellung und ihre Verwendung. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die Nahrungsmittelindustrie.
Chitinasen spalten Chitin in kleinere oligomere Saccharide. Chitin, neben Cellulose eines der häufigsten natürlichen Polymere, ist aus N-Acetyl-D-glucosamin aufgebaut. Es ist eine wesentliche strukturelle Komponente im Außenskelett der Krebse und Insekten sowie auch Bestandteil der Zellwände der meisten Pilze.
Chitinasen sind weit verbreitet in der Natur und wurden in Bakterien, Pilzen, Pflanzen, Wirbellosen und Wirbeltieren gefunden. Chitinasen spielen unterschiedliche Rollen in diesen Organismen. In Wirbeltieren sind sie Bestandteil des Verdauungssy- stems (Kleinkrebse des Meeres als Nahrung für Fische, Insekten als Nahrung für Vögel). In Insekten, Krebsen und Pilzen haben Chitinasen vor allem morphogenetische Funktionen (Insekten und Krebse: partieller Abbau des Außenskeletts bei den für das Wachstum nötigen Häutungsvorgängen; Pilze: Wachstum des My- σels). Bakterien sekretieren Chitinasen, um aus dem Abbau des Chitins Energie zu gewinnen. Sie spielen damit eine wesentliche Rolle im Recycling des Chitins abgestorbener Organismen. Obwohl Chitin in Pflanzen nicht vorkommt, findet man in vielen Pflanzen Chitinasen. Diese kommen in Pflanzen sowohl konstitutiv vor als auch induziert durch abiotischen oder biotischen Streß. Insbesondere der Befund, daß die Infektion von Pflanzen mit pilzlichen Pathogenen in Pflanzen die Synthese von Chitinasen induziert, führte zu der Ansicht, daß Chitinasen eine Rolle bei der Abwehr solcher Krankheitserreger haben. Es konnte gezeigt werden, daß solche Chitinasen sowohl in vitro als auch in vivo (nach konstitutiver Expression in transgenen Pflanzen) das Wachstum pilzlicher Erreger hemmen können. Bei der großen Bedeutung pilzlicher Krankheitserreger für Kulturpflanzen besteht also aus dieser Sicht erhebliches biotechnologisches Interesse an Chitinasen.
Die wesentliche kommerzielle Quelle für Chitin liegt in den Schalen der Krabben und Garnelen, die jählich weltweit im Umfang von über 1 Mill. Tonnen als Abfall der Fischerei anfallen. Chitin und seine Derivate sind von großem Interesse für unterschiedliche Anwendungen in der Medizin, der Industrie und der Nahrungsmittelherstellung.
Chitinasen für technische Anwendungen, z.B die Umwandlung von Prozeßabfällen der Garnelen-Verarbeitung zu Hefe-Protein, werden bisher aus Bakterienkulturen gewonnen, wofür entsprechende Fermenteranlagen benötigt werden (Muzzarelli, R.A.A. : Chitin, in: The Polysacharides, Vol. III. Hrsgeber Aspinall, G.O. Aca- demic Press New York, 1985).
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das Spektrum der vorhandenen Chitinasen zu erweitern und eine neue Chitinase zur Verfügung zu stellen, die in guter Ausbeute aus Pflanzenmaterial gewonnen werden kann.
Es wurde eine Chitinase in Samen der Riesenbohne ( Canavalia ensiformis (L.) DC.) gefunden. Die Riesenbohne oder Jackbohne (engl. jack bean) ist eine ursprünglich in den Tropen Südamerikas beheimatete Leguminose, die inzwischen im gesamten tropischen und subtropischen Gürtel der Erde zu finden ist. Diese Kulturpflanze dient nur in untergeordnetem Maße der Ernährung, sie wird häufig als Gründüngungs- und Deckpflanze in Tabak-, Zuckerrohr-, Ananas-, Kakao- und Citrus-Pflanzungen kultiviert.
Die erfindungsgemäße Chitinase aus der Riesenbohne erweitert das Spektrum insofern, daß es sich bei diesem Enzym um eine En- do-Chitinase handelt, während die mikrobiellen Chitinasen Exo- Chitinasen sind. Die Chitinase der Riesenbohne wird im reifen Samen akkumuliert. Diese Samen sind über Jahre lagerfähig, so daß das Ausgangsmaterial leicht verfügbar ist. Die Isolierung und Reinigung der Chitinase aus den Samen der Riesenbohne erfolgt gemäß der Erfindung in 4 Schritten: 1. Extraktion der Proteine mit Pufferlösung 2. Fällung der Hauptmenge der inaktiven Speicherproteine 3.Abtrennung des Lektins Concanavalin A (zweithäufigstes Protein) 4.Reinigung der Chitinase durch Kationen- und Anionenaustau- scherchromatographie. Die damit erreichte Reinheit erlaubt die Kristallisation des Enzymes.
Das Protein ist hinsichtlich seiner wesentlichen Eigenschaften wie folgt charakterisiert:
Das Molekulargewicht beträgt 26225, der isoelektrische Punkt pH 9,3, das pH-Optimum für die Spaltung von Chitin pH 6,0. Die vollständige Aminosäure-Sequenz wurde aus cDNA-Klonen abgeleitet und durch Sequenzierung des N-terminalen Endes und interner Peptide bestätigt.
Die erfindungsgemäße Aminosäuresequenz der Chitinase aus Canavalia ensiformis (abgeleitet aus vollständiger cDNA; sequenzierte Peptide unterstrichen) hat folgenden Aufbau:
10 20 30 40 50
1 DDVGSVIDAS LFDOLLKHRN DPACEGKGFY SYNAFVTAAR SFGGFGTTGD
51 TNTRKREVAA FLAOTSHETT GGAAGSPDGP YAWGYCFVTE RDKSNKYCDP
101 GTPCPAGKSY YGRGPIQLTH NYNYAOAGRA LGVDLINNPD LVARDAVISF
151 KTAIWFWMTP QGNKPSCHDV ITNRWTPSAA DVAANRTPGF GVITNIINGG
201 IECGRGPSPA SGDRIGFYKR YCDVLHLSYG PNLNCRDQRP FGG
Durch Immundiffusion mit einem Antiserum, das gegen diese Chitinase erzeugt wurde, konnte bestimmt werden, daß diese Chitinase mit einem Anteil von 0,14% im reifen Samen enthalten ist. Praktisch konnten aus 20g reifen Samen 5mg Chitinase gewonnen werden .
Vergleichswerte liegen in der Literatur für Mais und Weizen vor: Aus 2 kg Mais konnten 26 mg einer Chitinase A und 30 mg einer Chitinase B präpariert werden (Huynh, Q.K. et al., J. Biol. Chem. 267, 6635-6640); aus 1 kg Weizenkeimen wurden 32 mg einer Chitinase isoliert (Molano, J. et al . , J. Biol. Chem. 254, 4901-4907, 1979).
Die je Gramm Ausgangsmaterial isolierbare Enzymmenge ist also im Falle der Chitinase aus der Riesenbohne deutlich höher als in den beiden bisher bekannten Beispielen.
Eine wichtige Verwendung der neuen Chitinase besteht im enzyma- tischen Abbau chitinhaltiger Abfälle zur Herstellung von N- Acetyl-D-glucosamin, das sowohl als Nahrungsmittelzusatzstoff als auch in der Medizin bei der Behandlung gastrointestinaler Erkrankungen eine Rolle spielt.
Die Erfindung soll nachfolgend durch ein Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.
Beispiel:
• Reife Samen der Riesenbohne werden in einer Hammermühle bis zu einer Korngröße > 1mm zerkleinert.
• 20 g dieses Mehls werden mit 100 ml 0,1 M Tris/HCl-Puffer pH 9,5 versetzt und mit einem Dispergiergerät (Ulta-Turrax) verteilt. Nach 30 min Rühren bei Raumtemperatur bleibt der Ansatz über Nacht bei ca. 5°C stehen. Danach wird erneut 10 min gerührt und anschließend 15 min bei 27.000 x g zentrifu- giert.
• Der klare Überstand wird gegen 18MΩ - Wasser dialysiert bis die Leitfähigkeit des Dialysates >0,005 mS erreicht hat. Danach wird 1/12 Volumen Mcllvaine-Puffer pH 5,0 zugesetzt und 30 min im Eisbad gerührt. Dabei fällt die Hauptmenge der Samenproteine aus, insbesondere das Reserveprotein Canavalin. Das Präzipitat wird durch Zentrifugation abgetrennt.
• Der Überstand dieser Zentrifugation wird auf eine Sephadex G- 75 Säule aufgetragen, an die sich das Lektin Concanavalin A bindet. Auf diese Weise wird das zweithäufigste Protein aus dem Extrakt entfernt. Die ungebundene Fraktion wird durch Ultrafiltration konzentriert und durch Dialyse umgepuffert in 0,05 M Phosphat-Puffer pH 6,4. Diese Probe wird auf eine Kationenaustauschersäule (-S03 ~) aufgetragen. Verunreinigungen werden mit der ungebundenen Fraktion entfernt. Die gesuchte Chitinaseaktivität wird mit einem NaCl-Gradienten bei etwa 0,2 M NaCl eluiert. Diese Fraktion wird wieder durch Ultrafiltration konzentriert und durch Dialyse umgepuffert in 0,05 M Tris/HCl-Puffer pH 9,5. Diese Probe wird an einer Anionenaustauschersäule (-N*(CH3 ) 3 ) getrennt. Die reine Chitinase wird in der ungebundenen Fraktion eluiert, Verunreinigungen werden an die Säule gebunden. Nach Konzentrierung kann die Chitinase durch Dampfdiffusion gegen Ammoniumsulfatlösung kristallisiert werden, wodurch man eine sehr stabile Form des Enzyms erhält.

Claims

Patentansprüche
1. Neue Chitinase, gewonnen aus dem Samen der Riesenbohne ( Canavalia ensiformis (L.) DC).
2. Neue Chitinase nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht von 26225, einen isoelektrischen Punkt pH 9 , 3 und ein pH-Optimum für die Spaltung von Chitin pH 6,0.
3. Neue Chitinase nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Sequenz
1 DDVGSVIDAS LFDQLLKHRN DPACEGKGFY SYNAFVTAAR SFGGFGTTGD
51 TNTRKREVAA FLAQTSHETT GGAAGSPDGP YAWGYCFVTE RDKSNKYCDP
101 GTPCPAGKSY YGRGPIQLTH NYNYAQAGRA LGVDLINNPD LVARDAVISF
151 KTAIWFWMTP QGNKPSCHDV ITNRWTPSAA DVAANRTPGF GVITNIINGG
201 IECGRGPSPA SGDRIGFYKR YCDVLHLSYG PNLNCRDQRP FGG
4. Verfahren zur Herstellung der Chitinase nach Anspruch 1-3, gekennzeichnet durch folgende 4 Schritte
- Extraktion der Proteine mit Pufferlösung
- Fällung der Hauptmenge der inaktiven Speicherproteine
- Abtrennung des Lektins Concanavalin A
- Reinigung der Chitinase durch Kationen- und Anionenaus- tauscherchromatographie .
5. Verwendung der neuen Chitinase nach Anspruch 1-3 zum enzy a- tischen Abbau chitinhaltiger Abfälle zur Herstellung von N- Acetyl-D-glucosamin .
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