WO1999005282A1

WO1999005282A1 - Non-b non-c non-g hepatitis virus gene, polynucleotide, polypeptide, virion, method for separating virion, and method for detecting virus

Info

Publication number: WO1999005282A1
Application number: PCT/JP1998/003340
Authority: WO
Inventors: Hiroaki Okamoto; Tsutomu Nishizawa
Original assignee: TAMURA RYOJI
Current assignee: TAMURA RYOJI
Priority date: 1997-07-25
Filing date: 1998-07-27
Publication date: 1999-02-04
Anticipated expiration: 2000-01-25
Also published as: EP1010759A1; DE69837437D1; CA2298103A1; EP1010759B1; AU8358698A; KR20010022220A; EP1010759A4; AU741656B2

Description

非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ウィルス粒子、ゥィルス粒子分離法およびウイルス検出法技術分野

本発明は従来の診断法では原因を特定できなかった血液伝播性肝炎の未知の原因ウィルスを発見したことによつて利用可能となつた遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、抗原、これらを利用したウィルス遺伝子、抗体、抗原の生産 ·検出 '測定方法、ウィルス粒子およびウィルス粒子の分離法に関する。背景技術

現在、血液伝播性肝炎の原因ウィルスとして B型肝炎ウィルス（以下「H B V」と略記する）と C型肝炎ウィルス（以下「H C V」と略記する）が発見されている。両ウィルスに対しては診断法が確立しており、我が国においては早くから輸血用血液のスクリーニングに導入された結果、両肝炎ウィルスについては受血者における新規感染をほとんど皆無にすることができるようになった。

しかしながら、 H B Vおよび H C Vに対する診断法が確立された後も原因不明のウィルス性肝炎と疑われる例が肝炎全体の 5〜 1 0 %に認められている。これらの例については非血液伝播性の肝炎ウィルスである A型肝炎ウィルス、 E型肝炎ウィルス、そしてィンドでのみ報告されその存在に疑問が残る F型肝炎ウィルスおよび欠損型肝炎ウィルスである D型肝炎ウィルスも原因ではないと考えられており、未知の肝炎ウィルスが存在する可能性が示唆されていた。

1 9 9 5年に米国ァボヅト社（Abbott) から、続いて 1 9 9 6年に米国ジーンラブス社（Genelabs Technologies) から相次いでこれら肝炎の原因因子と考えられるウイルスの遺伝子配列が発表され各々 G B V— C、 H G Vと別箇に命名された。しかし、その後配列の比較から、今日では両者は同一のウィルスであると考えられるに至っている（以下「G B V— C/H G Vj と略記する）。我が国でも原因不明のウィルス性肝炎に対する G B V—C/H G Vの関与について精力的な研究が行われている。その結果、現在までのところ G B V— CZH G Vは血液伝播によって感染するものの、感染例での肝炎症状の発現は軽微であり、少なくともこれまで原因不明であった非 B非 C型肝炎の原因の全てではないこと、したがって原因未解明の肝炎には未知のウィルスが存在していると考えられるに至つている。

上記のように、血液伝播性肝炎の原因となる未知の肝炎ゥィルスの存在が示唆されており、この未知の肝炎ウィルスの発見、さらにその遺伝子的、分子生物学的、疫学的特徴の解明が待望されている。それによつて、肝炎に対するより完全な予防法、診断法、および治療法の実現が期待されている。

すなわち、未解明のウィルス性肝炎の診断法および治療法の開発には、該ウイルスの遺伝子情報を解明し、ウィルス特異的な遺伝子配列およびアミノ酸配列の決定、またェピトープ位置の特定、ェピトープを含む生物材料の製造法の確立、抗ウィルス抗体に特異的に反応する抗原の製造法の確立、ウィルスに対する特異的抗体の提供、さらにウィルス粒子の分離回収法の確立、またその生物活性を無力化しつつ免疫活性を保持する処理法の確立、このようにして得たウィルス由来の生物材料を利用した遺伝子検査法、抗体検査法、抗原検査法、中和抗体誘導ヮクチンの製造法の開発が待望されている。発明の開示

本発明の目的は、現在まで原因ウィルスが特定できず、したがって診断、予防および治療手段も解明されていない未知のウィルス性肝炎に対する診断法、治療法を新たに確立することにある。

また、未知である新規肝炎ウィルスの遺伝子を分離し、その遺伝子配列を特定することによって、診断、治療に利用可能な遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリべプチド、ウィルス粒子分離法、ウィルス粒子、ウィルス抗原、抗ウィルス抗体を提供し、さらにウィルスの検出法を提供することにある。

本発明者らは既存の肝炎ゥィルス診断法では原因が究明できなかつた肝炎患者例の血液中には、肝炎の原因となる未知の肝炎ウィルス粒子あるいはその一部が存在していると推定した。これにもとづき血液中からウィルスの遺伝子を単離することを試みた。具体的には、該ウィルス遺伝子は肝炎患者の血液中には存在するが、ヒトゲノム中には存在せず、また多くの正常人の血液中にも存在しない、あるいは肝炎発症前には存在しないが発症後には存在するとの仮説を立て、この仮説に基づいて肝炎患者の血液中に候補となる遺伝子を探求し、これを分離した。こうして得られた候補遺伝子について更に次の諸点を検討し、以下の基準に全部に該当した遺伝子を最終的に新規ウィルス遺伝子と判断した。すなわち、

( 1 ) 複数の原因不明肝炎患者の血液中に存在していること、

(2 ) 輸血前には血液中に該遺伝子が存在しなかったにもかかわらず、該遺伝子陽性血液を輸血したことによって、受血者が該遺伝子陽性となり、かつ輸血後に肝炎を発症した例があること、

( 3 ) 得られた遺伝子配列が既知の肝炎ウィルスおよび他のゥィルスの遺伝子配列に相同でないこと、

(4) ウィルス粒子分離回収法として広く用いられている密度勾配遠心分離法で遺伝子陽性血液を分析した際に、遺伝子陽性分画が一般的なウィルス粒子分画に見つかること、

である。

既知の肝炎ウィルス感染例についても無症候性キヤリア一、すなわちウィルスが陽性であっても肝炎症状を示さず健康と見られる感染例が知られており、同様のことが該ウィルス感染例でも成立することが十分ありうると判断した。この理由から「正常人に該遺伝子が見つからないこと」は判断基準に加えなかった。以上の判定基準に従い本発明の遺伝子を分離し、分離した遺伝子の配列を決定し、 P C Rのプライマ一として利用可能なォリゴヌクレオチド配列を検索した。得られたプライマ一を利用して遺伝子検出法を確立した。さらに遺伝子配列内に存在するオープンリーディングフレームを特定し、アミノ酸配列を特定した。また密度勾配遠心分離法により密度を決定するとともにウイルス回収法を確立し本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、配列番号 5 7に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号 6 0に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる P C R、または配列番号 5 7に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号 6 1に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる P C Rによって、およそ 3 5 0 0塩基からおよそ 4 0 0 0塩基の長さの配列が増幅可能な塩基配列を有する非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子（以下、本発明遺伝子ともいう）を提供する。

本発明遺伝子は、好ましくは、前記 P C Rによって、およそ 3 6 0 0塩基からおよび 3 9 0 0塩基の長さの配列が増幅可能な塩基配列を有する。

また、本発明遺伝子は、前記 P C Rによって増幅される断片の 5 ' 端および 3 ' 端の塩基配列が、配列番号 1記載の塩基配列の塩基番号 3〜3 0 0および塩基番号 2 4 0 2〜 3 7 3 9の塩基配列に対し、それそれ、 7 0 %以上の相同性を有する。さらに好ましくは、前記相同性が 8 0 %以上である。

本発明は、また、下記の（a)及び (b)の非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子を提供する。

(a)配列番号 6に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号 8 に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマ一として用いる P C R によって、およそ 2 0 0塩基からおよそ 3 5 0塩基の長さの配列が増幅可能な塩基配列を有する非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子。

(b)配列番号 7に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号 8 に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマ一として用いる P C R によって、およそ 2 0 0塩基からおよそ 3 5 0塩基の長さの配列が増幅可能な塩基配列を有する非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子。

本発明遺伝子は好ましくは、配列番号 1に記載の塩基配列を有する非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子またはその同種変異体遺伝子である。このような遺伝子として具体的には、配列番号 4 5記載の塩基配列を有する非 B非 C非 G型肝炎ゥィルス遺伝子（遺伝子型 1 ) 、配列番号 4 6記載の塩基配列を有する非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子（遺伝子型 2 ) 、配列番号 4 7記載の塩基配列を有する非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子（遺伝子型 3 ) 、配列番号 4 8記載の塩基配列を有する非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子（遺伝子型 4 ) 、配列番号 4 9記載の塩基配列を有する非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子（遺伝子型 5 ) 、配列番号 5 0記載の塩基配列を有する非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子（遺伝子型 6 ) 、配列番号 5 1記載の塩基配列を有する非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子 (遺伝子型 7 ) 、配列番号 5 2記載の塩基配列を有する非 B非 C非 G型肝炎ウイルス遺伝子（遺伝子型 8 ) 、配列番号 5 3記載の塩基配列を有する非 B非 C非 G 型肝炎ウィルス遺伝子（遺伝子型 9 ) 、および、配列番号 5 4記載の塩基配列を有する非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子（遺伝子型 1 0 ) が挙げられる。

本発明は、本発明遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドも提供する。

本発明は、また、本発明遺伝子の塩基配列内に認められる、前記遺伝子に特異的な塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、本発明オリゴヌクレオチドともいう）を提供する。このようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、配列番号 2記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド（R D 0 3 7 ) 、配列番号 3記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド（R D 0 3 8 ) 、配列番号 4記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド（R D 0 5 1 ) 、配列番号 5記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド（R D 0 5 2 ) 、配列番号 6記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド（N G 0 5 9 ) 、配列番号 7記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド（N G 0 6 1 ) 、配列番^ 8記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド（ N G 0 6 3 ) が挙げられる。

本発明は、さらに、本発明オリゴヌクレオチドをプライマ一として用いて P C Rを行うことを特徴とする非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子検出法を提供する。本検出方法として具体的には、配列番号 2に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号 3に記載の塩基配列を有するオリゴヌクオチド、または、配列番号 4に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号 5 に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて P C R を行うことを特徴とする非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子検出法（第 1検出法）、ならびに、配列番号 6に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号 8に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、または、配列番号 7に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号 8に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマ一として用いて P C Rを行うことを特徴とする非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子検出法（第 2検出法）が挙げられる。また、本発明は、 1の検体に関し上記の第 1検出法および第 2検出法の両方を実施し、両遺伝子検出法により得られた結果を比較することを特徴とする非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子型判別法、ならびに、遺伝子型 1〜6の遺伝子にある各遺伝子型特異的配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてハイプリダイゼーシヨンを行うことを特徴とする非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子型判別法を提供する。

さらに、本発明は、本発明遺伝子の塩基配列に認められるオープンリーデイングフレーム内にコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド（以下、本発明ポリペプチドともいう）を提供する。

本発明ポリぺプチドとして具体的には、配列番号 9記載のァミノ酸配列を有するポリぺプチド、および、配列番号 1 0記載のァミノ酸配列を有するポリべプチドが挙げられる。本発明ペプチドは、配列番号 9または 1 0記載のアミノ酸配列内に認められる非 B非 C非 G型肝炎ウィルス特異的なアミノ酸配列からなるポリペプチドを包含する。本発明ポリペプチドは、好ましくは、非 B非 C非 G型肝炎ウィルス特異的ェピト一プを含むものである。

さらに、また、本発明は、非 B非 C非 G型肝炎ウィルス粒子が有する密度に基づいて、前記粒子を分離することを特徴とする非 B非 C非 G型肝炎ウィルス粒子の分離法、この方法により分離されたウィルス粒子、および、このウィルス粒子より得られる非 B非 C非 G型肝炎ウイルスべプチドを提供する。

加えて、配列番号 9または 1 0記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列の全部または一部の配列を組み込んだ組換え遺伝子発現ベクター、配列番号 9または 1 0記載のァミノ酸配列をコードする塩基配列の全部または一部の配列を保持する形質転換細胞、この形質転換細胞により発現される非 B非 C非 G型肝炎ウィルス抗原ペプチドまたはその断片、この形質転換細胞を、非 B非 C非 G型肝炎ウイルス抗原べプチドが発現する条件で培養し、発現させた前記べプチドを採取することを特徴とする非 B非 C非 G型肝炎ウィルス抗原べプチドの生産方法を提供する。

さらに、本発明は、本発明ポリペプチド（ウィルス粒子より得られるものを含む）または上記ウィルス粒子を抗原として用いる非 B非 C非 G型肝炎ウィルス抗体の免疫学的検出方法、本発明ポリペプチド（ウィルス粒子より得られるものを含む）または上記ウィルス粒子を免疫原として、動物を免疫することを特徴とする非 B非 C非 G型肝炎ウィルス抗体の作成方法、この作成方法によって得られる抗体、および、この抗体を用いる非 B非 C非 G型肝炎ウィルス抗原の免疫学的検出方法を提供する。

さらに、また、本発明は、配列番号 1記載の塩基配列にあるオープンリーディングフレームにコードされるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列を有し、非 B 非 C非 G型肝炎ウィルス中和抗体のェビト一プ配列を含むポリべプチドを含むヮクチン、及び、上記ウィルス粒子を含むワクチンを提供する。

また、本発明遺伝子は、好ましくは、配列番号 6 2に記載に記載の塩基配列を有する非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子またはその同種変異体遺伝子である。この遺伝子についても、本発明遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、本発明遺伝子の塩基配列内に認められる、前記遺伝子に特異的な塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、このオリゴヌクレオチドをプライマ一として用いて P C Rを行うことを特徴とする非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子検出法、本発明遺伝子の塩基配列に認められるオープンリーディングフレーム内にコードされるアミノ酸配列を有するポリぺプチド、組換え遺伝子発現べクタ一、形質転換細胞、この形質転換細胞により発現される非 B非 C非 G型肝炎ウィルス抗原べプチドまたはその断片、非 B非 C非 G 型肝炎ウィルス抗原べプチドの生産方法、非 B非 C非 G型肝炎ウィルス抗体の免疫学的検出方法、非 B非 C非 G型肝炎ウィルス抗体の作成方法、抗体、非 B非 C 非 G型肝炎ウィルス抗原の免疫学的検出方法、および、ワクチンが提供される。以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、既知の全てのウィルスとは異なる未知のウィルスに関する発明である。本発明の「非 B非 C非 G型肝炎ウィルス」とは、血液による伝播によって感染し肝炎症状を示す原因ウィルスを意味しており、同じ血液伝播性ウィルスである B型、 C型、 G型肝炎ウィルスとは異なる未知のウィルスである。また、非血液伝播性の肝炎ウィルスである A型肝炎、 E型肝炎、 F型肝炎および欠損型ウイルスである D型肝炎ウィルスとも異なるから、結局非 A非 B非 C非 D非 E非 F非 G型肝炎ウィルスと同義である。

肝炎症状とは肝機能値の異常、黄疸の出現等一般に肝炎を示す症状を意味する。本発明においては、本発明ウィルスの発見の由来に基づき本発明ウィルスを肝炎ウィルスの一つと位置づけているが、本発明ウィルスにより引き起こされる主たる疾病が肝炎であることをかならずしも意味しない。

本発明者らは、本発明の遺伝子のうち、配列番号 1に記載の塩基配列を有する非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子およびその同種変異体と認められる遺伝子を有する非 B非 C非 G型肝炎ウィルスを「H N T 2 2ウィルス」と命名した（以下、これを「H N T 2 2」と略記する）。 H N T 2 2は、下記の（a)及び (b)の非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子を有する非 B非 C非 G型肝炎ウィルスと定義することもできる。

(a)配列番号 6に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号 8 に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる P C R によって、およそ 2 0 0塩基からおよそ 3 5 0塩基の長さの配列が増幅可能な塩基配列を有する非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子。

また、上記遺伝子に含まれない遺伝子、すなわち、配列番号 6 2に記載の塩基配列を有する非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子およびその同種変異体と認められる遺伝子を「T U S 0 1ウィルス」と命名した（以下、これを「T U S 0 1」と略記する）。

すなわち、 H N T 2 2および T U S 0 1は、非 A非 B非 C非 D非 E非 F非 G型肝炎ウィルス肝炎患者より分離された未知のウィルスであり、従来原因不明とされていた肝炎患者より分離され、既知の全てのウィルスとはウィルス学的あるいは分子生物学的に相同でないウィルスである。

H N T 2 2および T U S 0 1は、まとめて、 5，端側に配列番号 1に記載の塩基配列の塩基番号 3〜 3 0 0の塩基配列またはそれに高い相同性を有する塩基配列を有し、 3⁵ 端側に配列番号 1に記載の塩基配列の塩基番号 2902〜 373 8の塩基配列またはそれに高い相同性を有する塩基配列を有し、当該 5' 端塩基配列および 3' 端塩基配列を含めた長さがおよそ 3500塩基からおよそ 400 0塩基、好ましくはおよそ 3600塩基からおよそ 3900塩基である遺伝子と定義できる。

本発明では HNT 22が陽性である肝炎を「HNT 22型肝炎」という。また、 TUS 0 1が陽性である肝炎を「TUS 0 1型肝炎」という。

ウィルスは一般に他の高等生物に比べ変異を生じ易く、かっこれが遺伝子内に固定され易いことが知られている。従って、同一種内に多くの株（同種変異体）が存在し、またおおむねの遺伝子配列が共通する遺伝子型が存在する。本発明における HNT 22または TUS 01の用語はこれら多数の株および遺伝子型を含むウィルスの総称として用いられている。

上記したようにウィルスでは変異の頻度が高く、またその変異が遺伝子内に固定される頻度が高いことが知られているから、ウィルスをその遺伝子配列あるいはアミノ酸配列により規定する場合には、当該ウィルスには、例示された配列のものだけでなく、実質上相同な範囲の遺伝子配列およびァミノ酸配列を有するものも含まれるものと認められる。実質上相同の範 Lfflは当該ウィルスに遺伝子配列あるいはアミノ酸配列を他のウィルスと比較した場合に明確に区別できる配列の相同性の割合をもって判断することができる。また、実質上相同の範囲は、既知の同種のウィルスにおいて知られている種内における配列の多様性を参考にして定めることができる。

上記の基準に従い、本明細書に具体的に開示した HNT 22遺伝子または TU S 01遺伝子の塩基配列に 55 %以上、好ましくは 60 %以上、さらに好ましくは 70%以上、より好ましくは 80%以上の相同性を有する塩基配列をもつ遺伝子は本発明の遺伝子と実質的に相同であり、本発明に含まれるものと認められる。実際に本発明の HNT 22遺伝子内の遺伝子の保存性および他ウィルス遺伝子との相同性を検索したところ、 HNT 22遺伝子内の相同性（保存性）は 55% 以上であり、また最も高い相同性を示した他ウィルス例との相同性は 60%未満であった。なお、本明細書において、相同性とは、塩基配列およびアミノ酸配列についての相同性を意味しており、具体的には比較する配列同士を、必要により欠損を設けることを含めて最も一致する様に並べたときに、比較する全体の塩基数またはアミノ酸数中の一致した塩基数またはアミノ酸数の割合を％で表示したものをい

Ό。

さらに、本発明のウィルスと同様に血液伝播性肝炎の原因となる C型肝炎ウイルス（HCV) では、種内の遺伝子配列は 60%以上の相同性を示していた。また、 HCVのうちで同一遺伝子型を示すものとされるものでは一部の高変異領域を除き遺伝子配列で 80%以上の相同性を持つと報告されていた。これらの事実から上記相同性をもって本発明に含まれる遺伝子の範囲を定めることは適切なものと考えられる。

同様に、コードされるアミノ酸配列では、通常には 65%以上、好ましくは 7 0%以上、さらに好ましくは 80%以上、より好ましくは 90%以上相同である例は本発明のウィルスと実質的に相同であり、これに含まれる。

HNT 22遺伝子に存在する遺伝子型については、種々の分類が考えられるが、配列番号 1の 1939〜2160位（以下 ntl939- 2160と表記する) に基づけば、配列番号 45記載の塩基配列を有する HNT 22遺伝子（遺伝子型 1) 、配列番号 46記載の塩基配列を有する HNT 22遺伝子（遺伝子型 2) 、配列番号 47記載の塩基配列を有する HNT 22遺伝子（遺伝子型 3) 、配列番号 48記載の塩基配列を有する HNT 22遺伝子（遺伝子型 4) 、配列番号 49記載の塩基配列を有する HNT 22遺伝子（遺伝子型 5) 、配列番号 50記載の塩基配列を有する HN T 22遺伝子（遺伝子型 6) 、および、配列番号 5 1記載の塩基配列を有する H NT 22遺伝子（遺伝子型 7) を挙げることができる。

このような塩基配列を利用することで、特定の遺伝子型の HNT 22ウィルスを検出もしくは区別することができる。区別するための方法としては、後記実施例に記載した方法により増幅し、配列決定をする方法だけでなく、各遺伝子型に特異的な配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマ一として用いて、当該遺伝子配列のみを増幅する方法、または、このオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて当該遺伝子配列を選択的に検出する方法、または、これらの方法を組み合わせたものを挙げることができる。これらの方法に利用できるオリゴヌクレオチドの選択、反応条件の設定は当業者に公知に方法によって実施できる。例えば、当該各遺伝子型配列を相互に比較することによって各遺伝子型に特徴的な配列部分（以下、遺伝子型特異的配列と称する）を選び出すことは容易である。遺伝子型特異的配列またはその相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであって、他の HNT 22遺伝子型にはハイブリダィズし得ないものを選択し、または当該遺伝子型特異的配列を有するオリゴヌクレオチドが他の遺伝子型配列と実質的にハイブリダィズし得ない条件を選択することは当業者には容易である（蛋白核酸酵素 PCR法最前線 1 9 96、共立出版）。この様に選択したオリゴヌクレオチドをプライマーまたはプローブとして利用して HNT 2 2遺伝子型特異的な増幅または検出をすることができる。

上記のような HNT 22遺伝子は、配列番号 6に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（NG 05 9 ) および配列番号 8に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（NG 063) をプライマ一として用いる P CR、および/または、配列番号 Ίに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（N G 06 1 ) および配列番号 8に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（NG 063) をプライマ一として用いる P CRによって増幅可能な塩基配列を有するものとして検出することが可能である。

特に、配列番号 1の塩基配列をもつ HNT 22遺伝子は、配列番号 2に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（RD 037 ) および配列番号 3に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（RD 038) をプライマ一として用いる PCR、および/または、配列番号 4に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（RD 05 1) および配列番号 5に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（RD 052) をプライマ一として用いる P CRによって増幅可能な塩基配列を有するものとして検出することが可能である。

なお、本発明の HNT 22遺伝子は、本発明者らにより次のような手順によつて得られたものである。

従来知られている肝炎ウィルスマーカーのいずれもが陰性でありながら、明らかな肝炎の症状を呈している例があることが知られていた。かかる症例は従来は知られていない未解明の肝炎ウィルスを原因とする感染例である可能性がある。他方、健康人には該ウィルスが原則的には存在しないと考えられる。しかし、肝炎ウィルス感染患者の中には肝機能にも異常を示さず、一見健康に見えながら無症候性キヤリァーである可能性も否定できない。

このことから、本発明者は未知の肝炎ウィルスを探索するために、原因不明の肝炎症例中に存在し、健常人あるいは肝炎発症前の患者には存在しない遺伝子のスクリ一ニングを試みた。このように比較群の一方のみに存在する遺伝子を検出する方法として、公知のレプレゼンテーショナル ·ディファレンス分析（Represe ntational Difference Analysis ) (Science 259, 946-950, 1993。以下「R D A 法」と略記する）を採用した。

R D A法により得られた候補遺伝子についてその配列を解析し、本発明者らは、その配列が従来既知のゥィルスの配列と相同でないことを確認した。

つぎに、該遺伝子配列の一部を構成するオリゴヌクレオチドプライマ一を利用した遺伝子検出系を構築し、他の原因未解明の肝炎症例中にも本遺伝子が検出されることを確認した。

また、多数の当該遺伝子陽性例の配列を解析 ·比較することにより、当該ウイルスに遺伝子型が存在することを明らかにし、その遺伝子型に特異性を有する配列を用いた遺伝子型判別方法を構築した。

さらに当該遺伝子が健康人の多くには見いだされないことを確認した。また該遺伝子陽性症例の中に、輸血前には該遺伝子が陰性でありながら、該遺伝子陽性血を輸血されたことで感染し、以後持続陽性である例があることも確認した。また、当該遺伝子が宿主由来の遺伝子でないことも証明した。

密度勾配遠心分離法を利用した解析から、当該遺伝子陽性分画が他のウィルス粒子に観察されるように特定の密度に局在することを確認した。

また、逆転写酵素反応工程の有無による解析、 D N A分解酵素を用いた解析、制限酵素処理実験より 1本鎖の D N Aウィルスであることを証明した。

上記全てを検討した結果、該遺伝子が輸血により感染して持続すること、感染例中に肝炎症状が見られること、健常人では陽性者が多くないこと、さらに遺伝子の配列が従来既知のウィルス遺伝子配列と相同でないことを確認した。以上、全てを総合して検討した結果、発明者は、本発明のウィルスが未知の肝炎ウィルス遺伝子であるとの結論を得た。

上記遺伝子は、その構造からウィルス遺伝子の一部であることが推測された。本発明者は該遺伝子配列を手がかりに公知のジーン · ウォーキング（Gene Walkin g)法により、本発明の遺伝子を得た。

以下、 H N T 2 2遺伝子を例にとって本発明の態様を説明するが、 T U S 0 1 遺伝子も同様に使用できることは容易に理解される。

本発明は、 H N T 2 2遺伝子に特異的な配列を有し、また H N T 2 2遺伝子に、ストリンジェン卜な条件で相補的にハイプリダイズすることができるオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを提供する。これらオリゴヌクレオチド/ポリヌクレオチドはその特性により、 H N T 2 2遺伝子の増幅に用いられるプライマ一、あるいは被検体中の H N T 2 2遺伝子を捕捉し、あるいは検出するためにプローブとして有効に使用することができる。

本明細書において「特異的な配列」とは、問題の遺伝子の塩基配列または当該塩基配列から演繹されるアミノ酸配列の中で、問題の配列以外の配列と区別しうる特徴的な配列部分を意味する。特徴的な配列であるか否かは、配列の相同性をもって判定することができる。具体的には、その配列を、それと同一長の当該問題遺伝子の配列以外の公知配列とデータベース等の公知技術を利用して検索、比較したときに、当該公知の配列との相同性がおよそ 1 0 %以下となる長さの配列を意味する。あるいは、その配列を利用して問題の遺伝子を、検出、同定、増幅できるかによつても判定できる。具体的には、塩基配列においては、その配列を有するオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドまたはその相補的配列を有するオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドをプロ一ブもしくはプライマ一として当業者公知の遺伝子検出法や遺伝子増幅法に利用した場合に、問題の遺伝子を、他の遺伝子と比べ統計的に区別して検出、同定、または増幅する配列を問題の遺伝子に特異的であると判定する。アミノ酸配列においても、同様に配列の相同性をもって特異的配列か否かを判定できる。具体的には、公知配列と比較したときに、相同性がおよそ 1 0 %以下となる長さのアミノ酸配列である。あるいは、問題遺伝子にコードされるアミノ酸配列から成る、またはそのアミノ酸配列を含むペプチドを抗原として作製した、当該アミノ酸配列に結合することが証明された抗体が、問題遺伝子由来ではない他の抗原と結合しない場合、もしくはその結合が統計的に有意に弱い場合には、当該アミノ酸配列は問題遺伝子に特的な配列とすることができる。

本発明で使用される「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」の用語は任意の長さを持ったヌクレオチドポリマーを意味し、リボヌクレオチドおよびデォキシリボヌクレオチドを含む、一本鎖 D N A、二本鎖 D N A、ならびに一本鎖および二本鎖の R N Aが含まれる。本用語には未修飾のポリヌクレオチドだけでなくメチル化ゃキャッピングぁるいは酵素標識、蛍光標識等修飾されたポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドが含まれる。

本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドには、ゲノム D N A由来のものだけでなく、公知の方法により合成、複製、転写し、あるいは増幅して得るポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドが含まれる。

本発明におけるポリヌクレオチドには、例示された配列、これに実質上相同な配列、これらに相補的配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。

本発明のオリゴヌクレオチド /ポリヌクレオチドは P C Rによる H N T 2 2遺伝子増幅のプライマーとして使用することができる。この方法では当該プライマ —に挟まれる H N T 2 2遺伝子部分を増幅することが可能であり、これによつて被検体中に H N T 2 2遺伝子部分が存在すること、すなわち H N T 2 2が存在する事を確認することができる。

本発明はまた、ハイブリダィゼーシヨンによって、 H N T 2 2遺伝子を捕捉し、またこれを検出するために有用なオリゴヌクレオチドプローブあるいはポリヌクレオチドプローブを提供する。

遺伝子配列中より捕捉あるいは検出に用いる好適なプロ一ブを選択することは上記ブラィマー選択と同様の方法で行うことができ、選択したプローブに標識体を結合させる方法も公知の方法を用いることができる。前記のプライマーを利用した増幅遺伝子を、上記のプローブにて捕捉することで遺伝子を検出することも可能であり、特に遺伝子型特異的配列からなるプローブを利用することで、 H N T遺伝子型を判別することが可能となる。本発明のオリゴヌクレオチドは、通常には、ポリヌクレオチド中に連続する比較的短い配列をもつヌクレオチドであり、相同性および相補性ポリヌクレオチド中の配列をもつものを含む。その長さは、通常には、 6〜50ヌクレオチド、好ましくは 10〜30ヌクレオチド、さらに好ましくは 15〜20ヌクレオチドである。

上述のように HNT 22遺伝子は多様性を示すので、ウィルス株間で塩基配列が比較的保存されている領域内の塩基配列が遺伝子に特異的な塩基配列となり得る。本明細書に記載された塩基配列に基づいて、このような塩基配列を選択することは当業者であれば容易である。このようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、配列番号 2記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド（RD 037 ) 、西己列番号 3記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド（RD 038 ) 、配列番号 4 記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド（RD 05 1) 、配列番号 5記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド（RD 052 ) 、配列番号 6記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド（NG 059 ) 、配列番号 7記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド（NG06 1) 、配列番号 8記載の塩基配列を有するポリヌクレォチド（NG 063) が挙げられる。

本発明は、さらに、本発明オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて PC Rを行うことを特徴とする HNT 22遺伝子検出法を提供する。

本検出方法として具体的には、配列番号 2に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（RD 037) および配列番号 3に記載の塩基配列を有するオリゴヌクオチド（RD 038) 、または、配列番号 4に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（RD 05 1) および配列番号 5に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（RD 052) をプライマ一として用いて PCRを行うことを特徴とする HNT 22遺伝子検出法（第 1検出法）、ならびに、配列番号 6に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（NG 059 ) および配列番号 8に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（NG 063) 、または、配列番号 7に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（NG06 1) および配列番号 8に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（NG 063 ) をプライマ一として用いて PCRを行うことを特徴とする HNT 22遺伝子検出法（第 2検出法）が挙げられる。

P C Rに用いる試料は、検体から採取された血漿または血清などの生物学的試料から公知の方法により核酸または D N Aを抽出することによって調製される。この調製は市販の抽出キットを用いて行うことができる。

P C Rの条件は、耐熱性 D N Aポリメラ一ゼを用いる公知の P C R方法に従つて適宜選択される。

P C Rによって生じた増幅産物は、電気泳動法などの公知の方法により検出することができ、増幅産物の有無に基づいて H N T 2 2遺伝子を検出することができる。

また、本発明は、 1の検体に関し上記の第 1検出法および第 2検出法の両方を実施し、両遺伝子検出法により得られた結果を比較することを特徴とする H N T 2 2遺伝子型判別法、ならびに、遺伝子型 1〜6の遺伝子にある各遺伝子型特異的配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてハイプリダイゼ一シヨンを行うことを特徴とする H N T 2 2遺伝子型判別法を提供する。

各遺伝子型に特異的な配列は、当業者であれば、本明細書に記載の塩基配列、あるいは、上記の遺伝子検出法に基づいて検出された遺伝子の塩基配列に基づいて選ぶことができる。ハイプリダイゼ一シヨンは公知の方法に従って行うことができる。具体的には、生物学的試料から核酸を調製し、調製した核酸とオリゴヌクレオチドをストリンジェントな条件でハイブリダィズさせ、オリゴヌクレオチドを含むハイプリダイズした産物を検出する。

上記に挙げた具体的オリゴヌクレオチドは、もとより実施例の一つであり、明細書中に開示された H N T 2 2遺伝子の塩基配列と当業者公知の技術とを組み合わせることにより、上記と同じ目的を達成するォリゴヌクレオチドを選択することは容易である。また、明細書中に開示された H N T 2 2遺伝子の塩基配列と T U S 0 1遺伝子の塩基配列と当業者公知の技術とを組み合わせることにより、両遺伝子を検出するのに利用できるオリゴヌクレオチドを選択することは容易である。例えば、配列番号 5 7に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（N G 0 5 4 ) および配列番号 6 0に記載の塩基配列を有するオリゴヌクオチド（N G 0 6 5 ) 、または、配列番号 5 7に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド (NG054) および配列番号 6 1に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（NG021) を挙げることができ、これらをプライマーとして用いて P CR を行うことにより HNT 22遺伝子および T US 0 1遺伝子を検出できる。さらに、同様の観点より HNT 22遺伝子のみ、あるいは TUS 0 1遺伝子のみを検出するのに利用できるオリゴヌクレオチドの選択も当業者には容易に実施できる。さらに、本発明は、本発明遺伝子の塩基配列に認められるオープンリーデイングフレーム内にコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド（以下、本発明ポリペプチドともいう）を提供する。

本明細書において「ポリペプチド」の用語はアミノ酸の鎖状連合体を意味しており、長さについては規定しない。従って、本発明ポリペプチドには通常言われるオリゴペプチド、蛋白質、ペプチドが含まれ、その由来も自然に存在するものだけでなく、その断片あるいは化学的合成法や組換え発現等の各種手段により調製されるポリペプチドが包含される。配列については、先述したようにウィルスでは同一種内でも遺伝子配列に差異があり、その結果アミノ酸配列にも同様の差異が生ずることが知られている。したがって、本発明のウィルスのものと判断されるァミノ酸配列の相同性は 65 %以上、好ましくは 70 %以上、さらに好ましくは 80%以上、より好ましくは 90%以上である。

本発明における「オープンリーディングフレーム」（以下「ORF」と略記する）はポリべプチドをコ一ドするヌクレオチド配列領域あるいはその一部を意味する。この配列は適当な調節配列の制御下に置くことで転写され、ポリペプチドに翻訳される。コード配列の境界は 5' 端の開始コドンと 3' 端の終止コドンである。

遺伝子配列から、コードされるァミノ酸配列を解明することは当該技術分野では公知であるが、重要な点は遺伝子配列中の ORFを確定することである。 OR Fの確定は次のようにして行うことができる。

得られた遺伝子配列中にアミノ酸への翻訳が開始する開始コドンとなる 3塩基配列を見いだす。この位置を開始コドンと仮定し、翻訳を開始した時に適当な長さまで翻訳終止のコドンが現われず、ある程度の大きさのポリペプチドをコードする OR Fを求める。このようにして得られるアミノ酸配列の例は、配列番号 9 および 1 0に記載のアミノ酸配列である。

本発明ポリペプチドは、好ましくは、 H N T 2 2に特異的なアミノ酸配列からなる。 H N T 2 2に特異的なアミノ酸配列は、当業者であれば、本明細書に記載の塩基配列にコードされるアミノ酸配列、あるいは、上記の遺伝子検出法に基づいて検出された遺伝子の塩基配列にコ一ドされるアミノ酸配列に基づいて選ぶことができる。

本発明ポリペプチドは、さらに好ましくは、 H N T 2 2特異的ェピトープを含む。

本発明における「ェピトープ」は、抗原決定基を意味する。抗原決定基は抗原分子内にあって抗体と直接結合する部位であり、立体構造の中の少なくとも 3個のアミノ酸より構成され、一般的に 5〜 1 0個のアミノ酸から構成されている。ェピトープ位置の確定方法およびべプチドの立体構造内での配置の決定法は当該技術分野では公知であり、通常の技術を有するものが実施できる。したがって本発明における「H N T 2 2特異的ェピトープ」とは、 H N T 2 2に特異的な抗原決定基を意味しており、 H N T 2 2特有のアミノ酸配列から構成されるェピト一プである。このェビトープは、通常には、連続する 8個以上のアミノ酸から構成される。

本発明における「ェピトープを含む」は、上記に定義されたェピトープ配列をその一部として含むことを意味しており、ェピトープを含むポリペプチドは、具体的にはェピトープ配列にキヤリァーぺプチドあるいはリンカーぺプチドを結合させたものを含む。

本発明ポリぺプチドは抗体検査の抗原あるいは抗ウィルス抗体を作成するための免疫原として有効に用いることができる。ウィルスポリべプチドの中には該ゥィルスに特異的なァミノ酸配列を有しておらず、この部分を抗原として使用した場合には非特異的抗体反応を示す原因となる配列があることが予想される。したがって、本発明においてもアミノ酸の全配列中の抗体検査用として好適な配列を特定することが重要である。かかる特異配列、すなわちェピト一プ配列を見いだす方法としては、配列全域をカバ一する様に一定長のペプチドを合成し、それそれのペプチドの抗ウィルス抗体、すなわち該ウィルスに感染した患者血清との反応の有無および強弱を利用する方法がある。また上記合成法の代わりに、人 g t

1 1を用いたファージライブラリ一を作成し、患者血清によりスクリーニングする方去力⁵ある。

本発明は、また、非 Β非 C非 G型肝炎ウィルス粒子が有する密度に基づいて、前記粒子を分離することを特徴とする非 Β非 C非 G型肝炎ウィルス粒子の分離法、この方法により分離されたウィルス粒子、および、このウィルス粒子より得られる非 Β非 C非 G型肝炎ウィルスぺプチドを提供する。

本発明における「ウィルス粒子」は、通常のウィルス粒子分離法として用いられる密度勾配遠心分離法により特定の密度分画に回収される、本発明遺伝子陽性の分画を意味しており、形態学的に粒子構造を持つもの、あるいは感染性の粒子に限定されない。

ウィルスはその粒子構造に応じた密度を有しており、その密度を利用することで他の共存物を分離することができる。密度を利用したウイルス粒子分離法として最も一般的な方法は密度勾配遠心分離法を用レ、る方法である。これはショ糖等の物質を用いて段階的な密度担体層を遠心管内に作り、ウィルス含有分画を上層に重層したのち超遠心分離を実施する方法である。この解析法は、遠心力で遠心力方向に移動したウィルスがウィルスと同一の密度層に達すると、遠心力と浮力が平衡状態に達し移動を止め、そのためにその分画に集中する現象を利用したものである。

上記方法により得られたウィルス粒子からのポリべプチドの取得は、公知の方法によって行うことができる。例えば、変性剤によりウィルス粒子を処理し、ポリぺプチドを他の成分と分離する。

本発明は、また Η Ν Τ 2 2遺伝子あるいはその一部の配列を組み込んだ遺伝子発現ベクターを提供する。本明細書における「組換え発現ベクター」の用語は外因性のポリヌクレオチドを宿主細胞遺伝子に発現可能な状態で挿入するベクターを意味する。具体的には該ポリヌクレオチドを組み込むことが可能な制御配列を有するベクターである。また、「一部」の用語は、抗原性を示すのに十分なぺプチドをコ一ドする部分を意味する。

この発現べクタ一は免疫活性あるいは生物活性を有するウィルスペプチドを得るのに有効に用いることができる。現在、発現を所望する遺伝子を組み込むべク夕一については様々なものが知られており、さらにベクターを用いて遺伝子を組み込み最終的にペプチドを発現させる宿主細胞についても様々なものが知られている。

本発明で提供する遺伝子発現べクタ一は、 HNT 22ゲノムあるいはその OR Fを有する組換え発現べクタ一であって、該 OR Fが所望の宿主と適合し得る制御配列に対して作動可能なように連結されている組換え発現べクタ一である。この発現べクタ一を用いて組換え遺伝子発現系を構成することができる。

本明細書における「形質転換細胞」の用語は、本発明遺伝子の全部または一部が遺伝子内に組み込まれ、かつ該発明遺伝子にコ一ドされたポリべプチドの全部または一部を発現することが可能な細胞を意味する。

本発明で提供する形質転換細胞は、本発明遺伝子の全部または一部を含むポリヌクレオチドを直接に導入して、または、このポリヌクレオチドを組み込んだ上記組換え発現ベクターを宿主細胞に導入して、宿主細胞を形質転換することによつて得ることができる。本発明では、公知のトランスファ一ベクタ一、宿主細胞を使用することができる。

該形質転換細胞により生産されるポリべプチド（HNT 22ウィルス抗原ぺプチド）は、該形質転換細胞を、 HNT 22ウィルス抗原ペプチドが発現する条件で培養し、発現させたポリぺプチドを採取することによって得ることができる。本発明は、 HNT22粒子、 HNT22ポリペプチド、 HNT22ェピト一プ、 HNT 22ェピト一プを含むポリべプチドを抗原とする HNT 22抗体の免疫学的検出方法を提供する。ぺプチド抗原を使用した抗体検出方法としては免疫比濁法、酵素免疫測定法、ラジオメトリック免疫測定法、凝集法等があり、これらの方法を本発明でも使用することができる。

本発明は、また精製あるいは部分的に精製された HNT 22粒子、 HNT22 ポリペプチド、 HNT22ェピトープ、あるいは HNT 22ェピト一プを含むポリぺプチドを免疫原とする HNT 22抗体作成法ならびに HNT 22抗体を提供する。精製された、あるいは部分的に精製されたウィルス粒子あるいはポリぺプチドを用いた抗体作成方法としては公知の方法を使用できる。本発明は、 HNT 22に特異的に結合する抗体を用いた HNT 22抗原の免疫学的測定法およびキットを提供する。抗体を用いて抗原を測定する方法の一例としては、

( 1 )HNT 22に結合する抗体を固相に結合させた反応容器、あるいは反応担体に試料を作用させ、抗原抗体反応により試料中の抗原を固相に結合した抗体に捕捉させる工程、

(2 )適当な洗浄工程を加えた後に捕捉された抗原に対し、さらに HNT 22と結合しうる適当な標識を施した HNT 22に特異性を有する抗体を作用させる工程、 (3 )適当な洗浄工程を加えた後に標識体の作用を利用して結合抗原を検出するェ程、

からなる方法がある。

また、別の測定の方法としては、

( 1 )測定を所望する試料と一定濃度の HNT 22ェピト一プを有する適当に標識されたポリペプチドを一定時間反応させる工程、

(2 ) ( 1 )の工程を経た試料を HNT 22抗体を固相に結合した反応容器、または反応担体に作用させ、試料中の抗原を固相抗体に十分結合させる工程、

( 3 )反応容器あるいは反応担体に結合した標識と未結合の標識を分離後、結合標識あるいは未結合標識を測定する工程、

からなる方法がある。

その他のゥィルス抗原を測定する方法として使用されている方法、即ち凝集法、逆受身凝集法、酵素免疫測定法、ラジオメトリック免疫測定法、蛍光偏光測定法なども本発明の実施に利用することができる。

本発明は、精製した HNT 22粒子、精製ウィルス粒子から得た中和抗体ェピトープを包含するポリべプチド、組換え体発現を用いて得た HNT 22粒子ならびに中和抗体ェビト一プを包含するポリぺプチド、これら発現ウィルス粒子あるいは発現ポリぺプチドより得た精製ポリべプチドならびに中和抗体ェピトープを包含する断片、該ウイルスの遺伝子配列に基づく化学的に合成した中和抗体ェピトープを包含するポリべプチドよりなるワクチンを提供する。

本発明のワクチンの調製には、本明細書に開示された遺伝子を基に HNT 22 の抗原的に活性な領域をコードする蛋白質を前記の合成法あるいは組換え体発現法により得て、これを用いることができる。従来の例ではエンベロープ抗原のェピトープを含有するべプチド抗原あるいは組換え体抗原が当該活性を有する。また、他の構造蛋白質抗原も単独あるいは他の抗原との組み合わせで当該活性を有する。具体的にはエンベロープ抗原のェピト一プを含有するぺプチド抗原あるいは組換え抗原が当該ェピトープを含有する。他の構造蛋白質抗原も単独あるいは他の抗原との組み合わせで中和抗体ェピトープを含有する。

本発明の遺伝子を利用し発現させた抗原あるいは本発明の分離法により精製された H N T 2 2粒子を用いることによって、複数の中和抗体ェビト一プを含有する多価のワクチンを得ることができる。分離精製粒子を利用する場合には当該ゥィルスを不活性化する必要があるが、例えばホルマリン処理法等の公知の方法によってこれが可能である。

活性成分として免疫原性のポリペプチドを含有するワクチンの調製法についても公知の方法を利用できる。すなわち、注射液として液体あるいは懸濁液として、もしくは注射前に液体に溶解、懸濁するのに適当な固形形態として調製される。この免疫活性成分は適当な賦形剤と混合される。賦形剤としては水、生理食塩水、デキストロ一ス、グリセロール、エタノールなどがある。さらに必要に応じて少量の補助物質が含有され得る。この含有剤としては保湿剤、乳化剤、 p H緩衝剤、あるいはアジュバン卜がある。アジュバン卜の例としては水酸化アルミニウム、 N—ァセチルームラムル一 L—スレオニル一D—ィソグル夕ミン、 N—ァセチル —ムラミル一 L—ァラニル一 D—イソグル夕ミンなどがある。

これらワクチンについては、その効果が得られる投薬処方が適宜定められる。一般的には 1回の投与量は抗原量として 5〃gから 2 5 0 / gであり、その量は投与される個体の体重、免疫的反応能、および所望される抗体誘導の強さにより決まる。投与の回数についても同様の基準により選定される。図面の簡単な説明

図 1〜5は、 H N T 2 2陽性 7 5検体から得られた遺伝子の、 N G 0 0 1 (配列番号 4 0 ) と R D 0 5 2 (配列番号 5 ) に相補的な配列とに挟まれる 3 9 6塩基長の配列（配列番号 1の ntl862- 2257に相当）の比較を示す。

検体配列の最上列に #22 (配列番号 1 1) の該領域（nt78- 299) の全配列を示し、以下検体 1〜75について #22と異なる塩基箇所を塩基を示すアルファべヅ卜で示す。同一塩基の箇所はドット（ ·）で示す。配列（配列番号 1において ntl939- 2160、配列番号 11において nt78- 299位に相当）の相同性より、検体

1〜49までの群（遺伝子型 Iと名付けた）、 50〜73 (遺伝子型 IIと名付けた）の群、検体 74および検体 75の 4群に分類できる。

最上列には実施例 2および 3で使用するプライマーの位置を示した。遺伝子型 II並びに検体 74および 75では RD 037 (配列番号 2) および RD 051

(配列番号 4) のプライマーの 3，端側にミスマッチが共通して存在することが分かる。

図 6は、ジーン · ゥォ一キング（Gene Walking)法を用いた # 22クローン配列の延長（実施例 4) を示す。

図 7は、輸血による HNT 22感染例（実施例 7) における

(1) 輸血血液中の HNT 22遺伝子配列（配列番号 11)

(2)輸血後 2週間目の患者由来 HNT 22遺伝子配列

(3) 輸血後 4週間目の患者由来 HNT 22遺伝子配列

の比較を示す。比較した配列は完全に一致している。

図 8は、 HNT 22遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF) の検索結果（実施例 10) を示す。

上 3フレーム：配列番号 1の塩基配列の鎖における開始コドンと終止コドンの候補位置。短い縦線が閧始コドンを、長い縦線が終止コドンを表す。各フレームは読みとり枠を 1塩基づつずらした場合について示している。 1番目のフレームと 2番目のフレームに長い OR Fが認められた。

下 3フレーム：配列番号 1の塩基配列に相補的な配列の鎖における 3つのフレ —ムについての開始コドンと終止コドンの候補位置。いずれのフレームにおいても長い 0 R Fは認められなかつた。

図 9は、読みとり枠 1および 2にコ一ドされるアミノ酸配列に基づくポリぺプチドの親水性/疎水性スコアを示す。図 10は、実施例 12で得られた H N T 22陽性例からの遺伝子の塩基配列に基づく分子系統樹を示す。

図 11および 12は、実施例 12で得られた H N T 22陽性例からの遺伝子の塩基配列の比較を示す。

図 13は、 TUS01遺伝子の全長の配列決定に使用したプライマーおよびクローンの位置関係を示す。四角内に配列決定したクローン名を示す。四角の左右上に増幅に使用したプライマー名を、括弧内には、 5' 末端先頭の塩基を 1としたときの塩基番号を示す。

図 14は、 TUS 01遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF) の検索結果を示す。

図 15は、 HNT 22遺伝子と TUS 01遺伝子の 5' 端領域配列の比較を示す。

図 16は、 H N T 22遺伝子と T US 01遺伝子の 3 ' 端領域配列の比較を示す。発明を実施するための最良の形態

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、もとより本発明がこれら実施例に限定されるものではない。実施例 1 クローン #22の分離

臨床的に非 A非 B非 C非 D非 G型の輸血後肝炎であることが確定した 3症例

(症例 1ないし 3) について、輸血後肝炎発症時あるいはその後の血液と、輸血前または発症前の同一患者血液とをサンプルとして、 RD A法を利用して輸血後肝炎発症以降の患者の血液サンプルにのみ存在する遺伝子を検索した（サブトラクシヨン）。 RDA法は、前記したように比較群の一方のみに存在する遺伝子を検出する方法であって、被試験体であるテスターと対照体であるドライバ一の間で異なる遺伝子を効率的に探し出す方法である。

本件では臨床的に原因不明の輸血後肝炎例とされた上記 3例中の症例 2 (詳しくは実施例 6参照）の肝炎発症後検体をテス夕一（A) とし、同症例の輸血後の肝炎発症前の検体（B 1) および別患者由来の急性 B型肝炎患者検体（B 2) をドライバ一として輸血後肝炎発症後に初めて患者血液に見られた遺伝子を見いだした。

以下、手順を詳細に説明する。

( 1) 核酸の抽出

上記輸血後肝炎例（症例 2) は、既知肝炎ウィルスマ一カーのいずれもが陰性であった。その血清（症例 2の輸血後 8週および 1 0週目の血清それそれ 5 O JLL 1を混合したもの）を未知肝炎ウィルス陽性テスター（A) とした。

対照とする未知ウィルス陰性例としては（A) を得た同一患者の肝炎発症前 (輸血後 2週目）（B 1) と別患者である急性 B型肝炎患者の血清（B 2) をドライバーとした。まずテス夕一およびドライバーの血清それそれ 1 00〃 1から市販の核酸抽出キット（IS0GEN- LS、日本ジーン社製）を用いて核酸を抽出した。即ち、血清 100〃 1と核酸抽出液 300〃 1を 1. 5mlのエツペンドルフチユーブに取り、 1分間攪拌混合した後、 5分間室温に放置した。さらに遠心分離により壁面に残った液を落とした後、クロロフオルム 80〃 1を添加し 1分間攪拌し、 5分間室温に放置した。反応終了後 1 2 000回転/分で 1 5分間の遠心分離を行い上清を得た。上清 2 1 0〃 1を別のエツペンドルフチューブに取り、これに 2 Omg/mlのグリコーゲン (ベーリンガーマンハイム社製）とイソプロパノール（和光純薬社製） 200〃 1を添加、混合した。 10分間室温に放置して反応させた後、 1 2000回転/分の冷却遠心分離（4°C) を 1 0分間行い沈殿を得、 70%エタノール（和光純薬社製）で洗浄した後風乾した。

(2) cDNAの合成

上記操作により得られた核酸の沈殿を D E P C—水（ジェチルピロカーボネ一ト（シグマ社製）で処理した脱イオン水） 1 0 1を用いて溶解した。この溶解液にランダムへキサマー（ 5 Ong/〃 l) 1〃 1を添加し、 70°Cで 5分間加温し、その後直ちに氷冷した。冷却後、溶解液に 5倍濃度の第 1鎖（ 1 s t s t r and) ノッファーを 4 1、 0. 1Mの DTTを 2〃 1、 1 0mMの dN TPを 1〃 1、：RNA分解酵素阻害剤40U/〃 l (RNasin, PROMEGA社製）を 1〃 1、逆転写酵素 200 υ/ju 1 (Superscript II、 GIBCO- BRL社製）を 1 1加え 3 7°Cで 6 0分間反応させ第 1鎖の cDNA合成を行った。次に、この c D N Aが入ったチューブに DE P C—水を 9 1 / 1、 5倍濃度の第 2鎖（2 nd s t r and) ノソファー 30〃 1、 1 0 mMの d N T Pを 3〃 1、大腸菌 D N Aライゲ一ス（ 1 0 U/ 1) を 1 / 1、大腸菌 DN Aポリメラ一ゼ（ 1 0 U / l) を 4〃 1、大腸菌 RNa s e H ( 2 0 U/ 1) を添加混合し、 1 6 °Cで 2時間反応させた。その後さらに T 4 DNAポリメラーゼ（5 U/ 1) 2 .1を反応液に加え 1 6 °Cで 5分間反応し第 2鎖 c D N Aを合成した。反応は 0. 5Mの ED TAを 5〃 1添加して停止した。その後チューブにフエノール：クロロフオルム（ 1 : 1 ) 混合液を 1 5 0〃 1添加、混合し室温で 1 5 0 0 0回転/分、 5分間の遠心分離を行い蛋白質を沈殿として分離した。得られた上清

( 1 5 6 z l) にグリコ一ゲン（2 Omg/ml ) l z l、 7. 5 M酢酸アンモニゥム（和光純薬社製）を 7 8 / 1、冷エタノール（和光純薬社製）を 5 6 2〃 1加え、直ちに室温で 1 5 0 0 0回転/分で 2 0分間遠心分離し、核酸を沈殿分画として得た。沈殿を冷 7 0%エタノール 6 0 0 z 1で洗浄、風乾した後 5 O j 1の TEバッファー（ 1 0mM T r i s— H C 1、 H 7. 5 - 1 mM ED T A) で溶解した。さらにこの溶解液を Microspin S-400 HR Column (フアルマシァ製）を用いゲル濾過した。得られた溶出液（5 0〃 1) に 1/1 0容積の 3 M酢酸ナトリウム（pH 5. 2) と 2. 5倍容積のエタノールを添加し一 8 0°C で 2 0分間静置の後、 4 °Cで 1 5 0 0 0回転/分の遠心分離を 2 0分間行い、 c DNA/DNA分画を沈殿として回収した。

( 3) S au 3A I消化

上記操作で回収した c D N A/D N A分画を 4 5〃 1の水に溶解した後に、 1 0倍濃度の Hバッファ一（制限酵素 S au 3 A I付属緩衝液）（宝酒造社製） 5 〃 1、 S au 3A I (宝酒造社製）（ 1 2 U/ / 1 ) 4〃 1を添加、混合し 3 7 °Cで 1. 5時間反応させた。反応終了後、反応液にフエノール：クロロフオルム

( 1 : 1 ) 混合液 4 0〃 1を加え、攪拌し、室温、 1 5 0 0 0回転/分の遠心分離を 1 5分間行った。上清（6 0〃 1) に 1/1 0容積の 3M酢酸アンモニゥム、 pH 5. 2と 2. 5倍容積のエタノールを添加後、 — 8 0°Cで 2 0分間静置し、その後 4°Cで 1 5 0 0 0回転/分の遠心分離を 2 0分間行い核酸を沈殿として回収した。

(4) アダプタ一の接続

次に制限酵素 S a u 3 A Iの切断点の塩基配列に適合したアダプタ一 R— B a m24および R— Bam 12を結合させ、断片両端にアダプタ一を導入した。 g口ち上記の操作で得られた核酸分画沈殿を 16. 1 1の水に溶解し、これに 10 倍濃度の T 4ライゲ一スバッファー（NEB社製） 3〃 1とアダプター R— B a m24 ( 10 OD/ml) 6. 0〃1、アダプター R— Bam 12 ( 10 OD/ ml) 3. 0 1を添加してから環境温度を 50°Cから 10°Cへ 1時間かけて下げ、その後 T4ライゲース（400U/〃1) (NEB社製）を 1. 5〃1加え 16 °Cでー晚反応させた。

(5) PCR増幅

次にこの遺伝子断片に DN Aポリメラ一ゼを作用させ、全長に亘り完全な 2本鎖である遺伝子断片を得、さらにこの遺伝子断片について R— B am24をブライマ一とした PCRを行い、この遺伝子断片を増幅した。即ち、上記作業によりアダプタ一が導入された核酸分画液を 70°Cで 15分間加温し反応液中の T 4ラィゲ一スを失活させた。その後 10倍濃度の TaKaRa EX Taq Polymeraseバッファ一（宝酒造社製） 20〃 1と 2. 5 mMの dNTP24〃l、水 149. 3〃1、 R-B am24 ( 10 OD/ml) 5. 2 1を加えて 70 °Cで 3分間反応させ、その後 TaKaRa EX Taq Polymerase 1 JJL 1を添加して次の条件で P C Rを実施した。 72°C、 5分間処置後、 95°C1分間ー72°C3分間を 1サイクルとする反応を 30サイクル実施し、ついで 72°C7分間処置した後に 4°Cまで冷却した。反応終了後前記の方法と同様にして核酸をフヱノール、クロロフオルムで抽出し、エタノール沈殿させた。さらにこの PCR産物 8本分の沈殿を一つにして 100 1の TEバッファ一に溶解し、前述同様の方法でゲル濾過し溶出液を得て、これをエタノール沈殿させた。

(6) アダプターの除去

ゲル濾過後エタノールで沈殿させた： P CR産物に 90〃 1の水を加えて溶解した。この溶解液に 10倍濃度の Hバッファーを 10〃 1加え、更に Sau3AI を加え 37°Cで 15分間反応させた。その後前記同様の方法で核酸を沈殿として回収してから、前記同様に MicroSpin S-400 HR Columnを用いてゲル濾過し、エタノールで沈殿回収した。その後再溶解し 260 nmの吸光度を測定し、収量を確認した。

(7) テス夕一へのアダプタ一（J-Bam24/J-Baml2) の接続

次にテス夕一の増幅遺伝子断片にのみ Sau3AI配列に適合したアダプター J- Bam24と J- Baml2を接続した。即ち、上記作業により R- Bam24/R- Baml2テス夕一が外された増幅産物のうち、テス夕一由来のものについて 10倍濃度の T 4ライゲ一スバッファ一を P CR産物 1. 0〃に対し3〃1加ぇ、更にアダプター J- Bam24 13. 2〃 1と J- Baml2 6. 6〃1および水 4. 9〃 1を加えて環境温度を 50°Cから 10°Cへ 1時間かけて下げアニーリングさせた。この反応液に T 4DNAライゲ一ス（400U/ / 1) (NEB社製） 1. 0〃1を加え 16°C でー晚反応させ S au 3 A I切断端にアダプタ一を接続した。その後 70°Cで 1 0分間反応させライゲースを失活させた。

(8)作成したアダプタ一付きテス夕一増幅遺伝子断片と、アダプタ一を外したままのドライバ一増幅遺伝子断片のハイブリダイゼーション

上記作業でアダプタ一が接続されたテスター由来の増幅産物と、その前の作業でアダプタ一を取り除いたままにしておいたドライバー由来の増幅産物を熱変性させ、全て 1本鎖 DNAとした後に再会合させた。即ち、まず反応液にフエノール：クロロフオルム混合液（1 : 1) 30〃1を加え、蛋白質を除いた。得られた上清 17 z 1にアダプターを除去したドライバー遺伝子増幅産物 40〃 gを添加し、エタノール沈殿させた。この沈殿に 3倍濃度の EEバッファ一 4〃 1を加えて溶解し、さらに 30 /1のミネラルオイル（シグマ社製）を重層した後、 9 8°Cで 10分間反応させて DNAを変性させた。変性後直ちに氷冷し、 5Mの塩化ナトリウム（和光純薬製） 1〃1を添加した。ついで 67 °Cで約 22時間反応させハイブイリダイゼーシヨンを行った。

上記の作業で、ヒトに由来する遺伝子の様な、テスターとドライバ一の双方に共通して存在する遺伝子については、本来の組み合わせ、即ちテス夕一由来の D NA同士、あるいはドライバー由来の DN A同士が再会合した 2本鎖 DN A (ホモ 2本鎖 DNA) と、テスターとドライバ一の遺伝子を 1本ずつ持つ 2本鎖 DN A (ヘテロ 2本鎖 DNA) が形成される。他方、テス夕一にのみ存在する DNA (外来の遺伝子と考えられる）は、対応する同種遺伝子がドライバ一には存在しないため、ヘテロ 2本鎖 DN Aは形成されずテス夕一由来のホモ 2本鎖 DN Aだけが形成される。またテスター由来の遺伝子鎖を持つ 2本鎖 DN Aのみがァダプ夕一配列を両鎖に有している。

( 9 ) 増幅

上記の作業でハイブリダイゼ一ションした試料に 15〃 1の水を加えてから前記の方法に従って核酸をエタノール沈殿した。この沈殿に 1/2の TEバッファ — (5mM Tri s - HC1、 pH 7. 5— 0. 5 mM ED T A) 20 / 1 を加えて溶解した。さらにこの溶液 2〃 1に対し、 10倍濃度の Ex Taq Polymer aseバッファ一 20 1、 2. 5 mM dNTP240 1、水 147. Ί μΛ TaKaRa EX Taq polymerase 1 JLL 1を添加し 72 で 5分間反応させた。この反応で上記作業で形成された 2本鎖 D N Aの中で 1本鎖のままになっていた部分について DNA合成が行われ末端は平滑端となる。この試料に J- Bam-24 ( 10 0 D/ml) をプライマーとして 5. 3〃1加え、 95°C、 1分一 70°C、 3分を 1サイクルとする反応を 10サイクル繰り返し、その後 70°Cに 7分おいてから 4°Cに放置する条件で P CRを行った。増幅された試料から先述の方法と同様にしてフエノール：クロロフオルム混合液を用いて核酸を抽出し、その後グリコーゲンを共沈剤として使用してエタノール沈殿した。この条件では、 J- Bam24がァダプ夕一として接続されていたテスター由来の遺伝子のみが、加えられた J-Bam2 4をプライマーとして利用し増幅可能である。その結果、テス夕一特異的遺伝子由来のホモ 2本鎖 DN Aに由来する DN Aは共に増幅可能なので、対数的に増幅できる。一方、テス夕一/ドライバーに共通する遺伝子より構成されるへテロ 2 本鎖 DNAに由来する DNAは、テスタ一を銪型とするドライバー遺伝子配列を有する DN A鎖だけが倍数的に増加するに過ぎない。ドライバー遺伝子だけから構成されるホモ 2本鎖 DN Aに由来する DN A鎖は加えられたプライマ一がハイブリダィズできないため増幅することができない。この様な結果として、増幅後の反応液中にはテスター特異的遺伝子配列を有するホモ 2本鎖 DN Aが多数を占めるようになる。 (10) ムング ' ビーン 'ヌクレア一ゼ（Mung Bean Nuclease)処理反応液中に存在する 1本鎖のドライノ一遺伝子配列 DNAを除いてテス夕ー特異的遺伝子のみを得るため（正確には少数のドライバー由来の 2本鎖 DN Aが残る）にムング ' ビーン ·ヌクレアーゼ（以下「MBN」と略記する）処理を行つた。即ちテス夕一 Aとドライバ一 B 1あるいはテスター Aとドラバー B 2でハイブリダィゼ一シヨンさせた試料から沈殿させて得た核酸分画に、それそれ 10 1の 1/2濃度の TEバッファーを加え溶解した。それぞれの溶解液から 5〃 1 を取り、これに 10倍濃度の MBNバッファ一 2〃 1、水 13〃1、 MBN (3 00U/ 1) (宝酒造社製） 0. 5 /1を加え 37°Cで 30分間反応させた。反応終了後 5 OmMT r i s— HC 1 (pH 8. 9) 80〃1を加え、 95 で 5分間反応させヌクレア一ゼを失活させた。上記反応液から 5 1および 10 1をとり、更にヌクレア一ゼ処理を加えなかった上記のハイプリダイゼーシヨン試料 1〃 1にそれそれ 10倍濃度の Ex Taq Polymeraseバッファ一 20〃 1、 2. 5 mM dNTP24 /l、プライマー J- Bam24 と TaKaRa Ex Taq DNA Polymera se 1 zlを加え、さらに水を加えて総量を 200 1として次の条件で PCR を実施した。即ち、 95°C、 1分間— 70°C、 3分間からなる反応サイクルを 2 0回繰り返し、さらに 70°C、 7分間の反応を行った後に 4°Cまで反応温度を下げた。この P CR産物から 10〃 1を取り、 2. 5 %NuSieve 3 : 1ァガロース（FMC BioProducts, USA) のゲル電気泳動（lxTBEバッファ一）を行った。得られた結果は Aと B 1の組み合わせのものと Aと B 2の組み合わせのもので同一であったので、以後は Aと B 1の組み合わせについてのみ述べる。

残った増幅産物から先述のフヱノール：クロロフオルム混合液を用いた抽出法を用いて核酸を抽出、エタノールで沈殿させ回収した。この沈殿に TEバッファ — 45〃 1を加え溶解した。この溶液を先述の MicroSpin S-400 HR Columnを用いてゲル濾過し、その溶出液をエタノール沈殿させた。

(11) アダプターの除去

上記で得た沈殿を 63 1の水に溶解し、 10倍濃度の Hバッファ一 7 1と Sau3AI ( 12 U/〃 1 ) 6 // 1を加え、 37 °Cで 1. 5時間反応させ J- Bam24/J- Baml2アダプタ一部分を切断した。この反応液から先述のフエノール：クロロフオルム混合液を用いて蛋白質を除去した後、核酸をエタノールで沈殿させた。この沈殿を 90〃 1の T Eバッファ一で溶解後、 MicroSpin S-400 HR Columnを用いてゲル濾過して切断されたアダプターを除去し、アダプタ一除去増幅産物である溶出液をエタノール沈殿してから 10〃 1の 1/2濃度の TEバッファ一（ 5 mM Tr i s-HCl, pH7. 5-0. 5 mM EDTA) で溶解した。この溶解液の 260 nmの吸光度を測定して収量を求めた。この分画にはテス夕一特異的遺伝子が含まれていると考えられる。

(12) 再サブトラクシヨン

上記の作業で得たテス夕一特異的遺伝子の候補 DNA分画 1〃gについて 10 倍濃度の T 4 DNAライゲ一スバッファー 3 1とアダプタ一 N- Bam24 13. 2 l、 N- Baml2 6. 6〃 1を加え、更に水で総量を 28. 5/ 1としてから温度を 50°Cから 10°Cまで 1時間かけて低下させた。次に T 4DNAライゲース（400U/〃1) を 1. 5〃 1添加し 16°Cで一晩反応させアダプターを接続した。その後 70°Cで 10分間反応させて T 4 DN Aライゲ一スを失活させ、さらに常法に従いフヱノール：クロロフオルム混合液で蛋白質を除去後、ェタノ —ルで沈殿させた。この上清 17〃1 (DNA量として約 0. 5〃g) にドライバー B 1 DNAを 40〃g添加し、混合後エタノールで沈殿させた。この沈殿に 3倍濃度の TEバッファーを 4〃 1加え溶解し、さらに 30〃 1のミネラルオイル（シグマ社製）を重層した後、 98°Cで 1分間加熱処理して DNAを熱変性させた。変性後直ちに氷冷し、 5Mの塩化ナトリウム（和光純薬社製）を添加し、 67°Cで約 21時間反応させハイブリダィゼーシヨンを行った。ハイプリダイゼーションして得た試料から先述同様の方法で核酸をエタノール沈殿させた。この沈殿に 1/2濃度の TEバッファ一 20〃 1を加えて溶解し、さらにこの溶液 2〃 1に対して 10倍濃度の EX Taq DNA polymeraseバッファー 20 1、 2. 5 mM dNTP240 l、水 147 l、 TaKaRa Ex Taq DNA polymerase 1 μ.1を添加し 72 °Cで 5分間反応させ平滑末端化した。この試料に N- Bam24 ( 10 OD/ml) をプライマ一として 5. 3〃1加え、 95°C、 3分一70°C、 3分を 1サイクルとする反応を 10サイクル繰り返し、その後 70°Cに 7分おいてから 4°Cに放置する条件で PCRを行った。増幅された試料から先述の方法と同様にしてフエノール：クロロフオルム混合液を用いて核酸を抽出し、その後グリコーゲン添加してからエタノールで核酸を沈殿させた。この核酸分画に 1 0 1の 1/2濃度の T Eバッファーを加えて溶解した。溶解液から 1〃 1を取り、これに 1 0倍濃度の TaKaRa Ex Taq DNA polymerase 1 ju.1を加えて次の条件で P CRを実施した。即ち、 9 5°C、 1分間一 7 0°C、 3分間からなる反応サイクルを 2 0回繰り返し、さらに 70°C、 7分間の反応を行った後に 4°Cまで反応温度を下げた。上記作業によりテス夕一特異的遺伝子が更にスクリーニングされた。今回の作業で回収された DN A分画からアダプタ一を再度外し、さらに J- Bam24 /J-Baiil2をアダプタ一として利用して同一作業をもう一度繰り返し最終的なテス夕一特異的遺伝子クローン # 2 2の候補を得た。

( 1 3) クロ一ン# 2 2の分離

上記作業で得たテスター特異的遺伝子候補について以下の方法でその塩基配列を決定し、新規ウィルス遺伝子クローン # 2 2を分離した。すなわち、 # 2 2はいずれも両端に Sau3AI切断配列を有している。この配列を利用して pT7B lueTベク夕一（Navagen社製）にクローン化した。このクロ一ンを大腸菌 T G— 1にトランスフエクシヨンし、形質転換細胞をスクリーニングした。さらに得られた形質転換細胞のプラスミド DNAの解析を行った。即ち合計 6 0のクロ一ンについて、プラスミド DN Aを調製し、それそれの DN Aについて Thermo Sequencer Fluor escent-labelled primer cycle sequencing kit(Amersham International pic. Buckinghamshire, England) を用いて正逆両方向の塩基配列を決定した。この塩基配列に基づいてクローンを分類した。その結果、同一の塩基配列を有するクロ —ンが 1 3個得られた。このクローンの配列をアラインメントし、共通配列を探索した結果、配列番号 1 1記載の配列が得られた。本配列を有するクローンをクローン # 2 2と命名した。クローン # 2 2の全長は 5 0 0塩基長であった。実施例 2 HNT 2 2遺伝子検出法（ 1 )

実施例 1で得られた HNT 2 2クローン # 2 2の塩基配列を構成する 2 0塩基長のオリゴヌクレオチドを複数作成し、遺伝子増幅用のプライマ一としての有用性について様々な組み合わせについて検討を行った。即ち、当該遺伝子を分離した、該遺伝子陽性であるサンプルを対象に PCRを実施して当該遺伝子を効率よく増幅する配列とその組合わせを検索した。その結果配列番号 2 (プライマ一名： RD 037) および配列番号 3 (プライマ一名： RD 038) 、さらに配列番号 4 (プライマー名： RD 051) および配列番号 5 (プライマー名： RD 05 2 ) に示す配列を有するオリゴヌクレオチドが遺伝子増幅用プライマーとして効率的に利用できることが判明した。 RD 037および RD 051はセンスプライマーであり、 RD 038と RD 052はアンチセンスプライマーである。増幅はセンスプライマーとアンチセンスプライマーを一組として実施する。

遺伝子を検出した方法の詳細は以下の通りである。

核酸は、血清あるいは血漿 100〃 1から市販の核酸抽出キット（EX R&D、住友金属工業製）を用いて抽出した。後述するように HNT 22ウィルスは DNA ウィルスであることが判明していることから（実施例 8) 、本作業はウィルス遺伝子を DN Aとして取り扱つている。抽出した DNAを TE緩衝液 10 / 1に溶解し、その全量を試料とした。 P CR専用チューブに 10倍濃度の AmpliTaq DNA polymeraseバッファ一（Perkin Elmer社製） 5. 0 /1、 10 mM dNTP l. 0/ Is プライマ一 RD 037および RD 038をそれぞれ 0. 5 1 (10 OD/m 1 ) 、耐熱性 DNAポリメラーゼ（AmpliTaq DNA Polymerase :Perkin E lmer社製） 0. 25〃 1を加え、更に蒸留水を加え全量を 50〃 1とした。本反応液は用事調製とした。

この反応液の入ったチューブに上述の抽出 DN A試料 1 を加え、更に 5 0 1のミネラルオイルを重層し攪拌後、冷却遠心分離装置で 6000 r pm、 30秒間遠心した。遠心後、チューブをサーマルサイクラ一に装着し、 PCRを行った。 P CRの条件は 95°C、 2分 30秒の処置をます行った後に、 94°C、 30秒— 55°C、 30秒一 72°C、 45秒のサイクルを 35回繰り返し、最後に 72°C、 7分の反応を行い終了した。

さらに増幅を行う場合には、別の PCR専用チューブに 10倍濃度の AmpliTaq DNA polymeraseバッファ一（Perkin Elmer社製） 5. 0〃1、 1 OmM d N TP 1. 0 1、先述のプライマ一： RD 037と RD 038より内側の塩基配列より選別したプライマ一 RD 051と RD 052をそれそれ 0. 5〃1 (10 OD/ml) 、耐熱性 DN Aポリメラ一ゼ（AmpliTaq DNA Polymerase :Perkin E lmer社製） 0. 25〃 1を加え、更に蒸留水 37. 5〃 1を加え全量を約 45 1とした。これに上記増幅産物 5〃 1を加えて反応液とした。本反応液は用事調製とした。

反応液調製後、 50 1のミネラルオイルを重層して攪拌し、冷却遠心分離装置で 6000 rpm、 30秒間遠心した後、チューブをサ一マルサイクラ一に装着し、 P CRを行った。 PCRの条件は、 94°C、 30秒— 55° ( 、 30秒— 7 2°C、 30秒のサイクルを 25回繰り返し、最後に 72°C、 7分の反応を行うものであった。

増幅した遺伝子の検出は電気泳動法により行った。即ち、上記条件で増幅して得た増幅産物より 10〃 1を取り、ァガロース（2.5% NuSieve:ァガロース E P = 3 : 1) 電気泳動を実施した。泳動後ァガロースゲルをェチジゥムプロマイドで染色し、紫外線下で増幅産物の有無を確認した。增幅産物はプライマー RD 0 37/RD 038のみを用いた場合には 270 bpの位置のバンドとして、さらにプライマ一 RD 05 1/RD 052を用いて単独、あるいは追加の増幅を行つた場合には 197 b pの位置のバンドとして検出できる。実施例 3 HNT 22遺伝子検出法（ 2 )

実施例 2の HNT 22遺伝子検出法により Π本人における HNT 22ウィルス感染例を十分に検出することができたが、その後該增幅域の保存性を検討する目的で、多数の検体について該領域を含む範囲の配列を、後述の実施例 7記載のプライマ一 NG 001/RD 038 ( 1 s t PCR) と NG00 1/RD 052 (2 nd P CR) を用いる方法で増幅し検討したところ、 HNT 22ウィルスには主要な 2つの遺伝子型 Iおよび II (後述の実施例 1 2に記載したように本発明者らによって名付けられた名称）を含む複数の遺伝子型が存在していることが判明した。さらにそのうちの遺伝子型 IIと名付けた遺伝子型では、実施例 2で使用したプライマ一 RD 037および RD 05 1の配列内にミスマッチが散在し、特に 3' 側に存在することが判明した（図 1〜図 5) 。このミスマッチ配列を避けることにより、より特異的で高感度の遺伝子検出法が開発できると考え、より保存性の高い配列を検索し、配列番号 6 (プライマ一名： NG 059) 、配列番号 7 (NG06 1) 、配列番号 8 (NG 063 ) の配列を有するオリゴヌクレオチド（図 1〜図 5) が遺伝子増幅用のプライマ一として利用できることを見いだし、これを利用した新しい HNT 22遺伝子検出法を完成させた。

遺伝子を検出する方法の詳細は以下の通りである。

実施例 2と同様にして血清あるいは血漿 50〃 1から DNAを抽出した。抽出した DNAを 20〃 1の蒸留水に溶解した後、 95°Cで 15分間処理し、その後直ちに氷中で 2分間冷して測定用の試料を調製した。 P CR専用チューブに 10 倍濃度の AmpliTaq DNA Polymeraseバッファー（Perkin Elmer社製） 5. 0〃 1、 2. 5mMの dNTP 4 z l、プライマー N G 059および N G 063をそれそれ ( 10 OD/m 1 ) ずつ、耐熱性 DNAポリメラ一ゼ（AmpliTaq DNA Polymerase: Perkin Elmer社製） 0. 25〃 1を加え、さらに蒸留水 29. 75 1を加え全量を 40 / 1とした。これに上記調製した試料のうちの 10 1を加え、 50〃 1のミネラルオイルを重層し攪拌、冷却遠心分離装置で 600 0 rpm、 30秒間遠心してから、チューブをサ一マルサイクラ一に装着し P C Rを行った。？（ 11の条件は94°( 、 30秒— 60 、 45秒ー72° 45秒からなるサイクルを 35回繰り返し、最後に 72°C、 7分間の反応を行い終了した。

さらに増幅を行う場合は、別の P CR専用チューブに 10倍濃度の AmpliTaq D NA Polymeraseバッファ一（Perkin Elmer社製） 5. 0〃 1、 2. 5mMのdNT Pを 4 / 1、プライマー NG06 1および NG 063をそれそれ 0. 5〃1 ( 1 0 OD/m 1 ) ずつ、耐熱性 DNAポリメラ一ゼ（AmpliTaq DNA Polymerase: P erkin Elmer社製） 0. 25〃 1を加え、さらに蒸留水 37. 75〃 1を加え全量を 48 / 1とした。これに上記増幅した試料のうちの 2〃 1を加え、 50 / 1 のミネラルオイルを重層し攪拌、冷却遠心分離装置で 6000 r pm、 30秒間遠心してから、チューブをサ一マルサイクラ一に装着し P CRを行った。 PCR の条件は 94° ( 、 30秒— 60°〇、 45秒—72° 45秒からなるサイクルを 25回繰り返し、最後に 72°C、 7分間の反応を行い終了した。増幅した遺伝子は実施例 2記載のァガロース電気泳動方法と同様にして検出した。ただし、本例では最初のプライマー NG 059と NG 063を用いた P C Rにて増幅する H N T 22遺伝子は 286 bpの位置のバンドとして、さらにプライマー NG06 1 と NG 063を用いた PCRでは 27 1 bpの位置のバンドとして検出できる。尚、言うまでもなく本例で実施した 2段階 PCRを構成する各 P CRは、それそれ単独で実施してもかまわない。

さらに、実施例 3の遺伝子検出法では遺伝子型 Iおよび IIを含む多くの異なつた遺伝子の HNT 22遺伝子の増幅に利用できること、実施例 2記載の遺伝子増幅法が遺伝子型 1に特異性を有する増幅が可能であることから、同一の検体について実施例 2および 3記載の遺伝子検出を試み、その検出のパターンより遺伝子型を分類することができる（図 1〜図 5) 。実施例 4 解明遺伝子の配列の延長

クローン # 22を基に解明遺伝子配列を延長した。即ち、実施例 2および 3で確立した、 RD 037と RD 038をプライマ一のペア一とする P CRと、 RD 05 1と: D 052をプライマーのペア一とする P CRとを組み合わせた 2段階の PCR、および、 NG 059と NG 063をプライマーのペア一とする P CR と、 NG06 1と NG063のプライマーをペア一とする P C Rとを組み合わせた 2段階の PCRで HNT 22ウィルスタイ夕一を測定して高力価（ 10⁴— ⁵倍に希釈しても HNT 22遺伝子が検出可能なもの）を示す、肝機能異常を示した供血者（34歳、男性、 ALT (ァラニンアミノトランスフェラ一ゼ）値 106 国際単位）の検体（血漿）を用いて、ウォーキング法により # 22配列をさらに 5，方向および 3' 方向に延長した。なお、得られた塩基配列（配列番号 1) を有するウィルス株を T 278と名付けた。

本例で実施したウォーキング法の実際は以下の通りである（図 6) 。

(1)クローン T 4および T 6の配列の決定

クローン #22の塩基配列に特異的なセンスおよびアンチセンスブラィマーおよび配列番号 12から 15記載の 41塩基長の塩基配列をもつ非特異的プライマ ― (S SP— G、 S SP— A、 S S P— Tおよび S S P— C) を用いて 2段階のシングル 'サイデド（single- sided)P CRを行った。 5，方向の延長には特異的アンチセンスプライマ一 RD 038あるいは RD 0 52と上記非特異的プライマーのいずれかの 1つと組合わせによる 2段階のシングル ·サイデド P CRを行った。 1段階目の PCR ( l s t ?〇10 は94° 30秒一42° (、 45秒ー72 、 2分からなる反応サイクルを 5回繰り返し、その反応産物を SizeSep- 400 Column (Pharmacia Biotechnology社製) で精製した後、さらに 94°C、 30秒—55° 45秒_72° 2分からなる反応サイクルを 35回繰り返し増幅した。 2段階目の PCR (2 nd PCR) は 1 s t PCR産物の 1/1 0量を用いて、 94°C、 30秒— 55° (、 30秒— 72° (：、 2分からなる反応サイクルを 30回繰り返して実施した。 P CRは TaKaRa Ex Ta q DNA Polymerase (宝酒造社製）を使用して実施した。実施例 1記載の方法と同様にして pT7BlueTベクタ一にクローン化し、 3クローン以上のクローンについて両鎖の塩基配列を決定し、配列番号 1 6記載の（配列番号 1の ntl455-2257に相当する）配列（クローン T 4) 、および配列番号 17記載の（配列番号 1の nt2 061- 3265に相当する）配列（クローン T 6) を得た。配列番号 1 6記載の配列はプライマー S SP— Aと RD 052を組み合わせた P C R増幅の産物より、配列番号 17記載の配列はプライマー RD 05 1と S S P_ Cの組み合わせの増幅産物より得た。

(2) クロ一ン T 7， T 9， T 1 1 , T 1 3の配列の決定

新たに判明したクローン T 6および T 4を用いて、さらにクローン T4より 5 ，側の配列、およびクロ一ン T 6より 3 ' 側の塩基配列について上記（ 1) と同様の方法を用いて解明した。即ち 5' 側の配列については、クローン T 4の 5，端側に特異的な配列を有する配列番号 18と 19記載の塩基配列をもつ特異的ァンチセンスプライマー（NG012と NG013) ならびに配列番号 12から 1 5および 20記載の塩基配列をもつ非特異的プライマーを用いた 2段階のシングル ·サイデド P C Rを実施してその増幅産物をクローン化し実施例 1記載の方法にてその配列を決定した。具体的には、アンチセンスプライマー N GO 12と上記非特異的プライマーのいずれか一つの組み合わせによる第一段階目の P CRを実施した。？〇1条件は94° 30秒ー 55° 30秒_72 、 2分からなる反応サイクルを 5回繰り返し、その反応産物を SizeSep- 400 Column (Pharmaci a Biotechnology社製）で精製した後、さらに 94。 30秒— 5 5°C、 45秒 — 72°C、 2分からなる反応サイクルを 35回繰り返した。 2段階目の増幅は、上記 1段階目の増幅産物の 1/10量を用いて、特異的アンチセンスプライマ一に NG 0 13を用いて 94°C、 30秒一 55° 30秒ー72 、 2分からなる反応サイクルを 30回繰り返し実施した。増幅産物を実施例 1記載の方法と同様にして pT7BlueTベクターにクローン化し、 3クローン以上について両鎖の配列を決定して配列番号 2 1記載の（配列番号 1の nt945- 1575に相当する）配列（クローン T 9) を決定した（図 6) 。

3 ' 側の配列については、クローン T 6の 3' 端側に特異的な配列を有する配列番号 22と 23の特異的センスプライマ一 NG 006ならびに NG 010と配列番号 12から 15および 20記載の非特異的プライマ一を用いた前記同様の 2 段階のシングル 'サイデド P CRを用いた配列増幅、 pT7blueTベクタ一へのクローニング、ならびに配列解析によって、配列番 24記載の（配列番号 1の nt 3126-3739に相当する）配列（クローン T 7) を決定した（図 6) 。

さらに 5' 側の配列については、上記のクローン T 9の配列を用いて同様の操作を繰り返し、配列番号 25記載の（配列番号 1の nt723- 1024に相当する）配列 (クローン T 1 1 ) を、さらにクローン T 1 1の ¾列を川いて配列番号 26記載の（配列番号 1の nt卜 831に相当する）配列（クローン T 1 3) を得た。これらの各クローンの配列をァラインメントし配列番 1 載の HNT 22の配列を得た。クローン T l 1を得るために配列番号 27 載の塩基配列をもつオリゴヌクレオチド（プライマー名： NG03 1 ) を第 1段階のシングル 'サイデド P C Rのアンチセンスプライマーとして、配列番号 28記載の塩基配列をもつオリゴヌクレオチド（プライマー名： N G 032 ) を第 2段階目のシングル 'サイデド PCRのアンチセンスプライマーとして使用した。クローン T 13を得るためには、配列番号 29記載の塩基配列をもつオリゴヌクレオチド（プライマー名： N G 045) を第 1段階目のシングル ·サイデド P CRのアンチセンスプライマーとして、そして配列番号 30記載のオリゴヌクレオチド（プライマー名： NG0 39) を第 2段階目のシングル ·サイデド P CRのアンチセンスプライマ一として使用した。非特異的プライマ一には、上記同様、配列番号 1 2から 1 5および配列番号 20記載のオリゴヌクレオチドを使用した（図 6) 。

配列を確定するために、上記作業で解明された配列内の ntll09- 1575 (配列番号 3 1 ：クローン T 10) 、 ntl2-759 (配列番号 32 ：クローン T 14) 、ならびに nt3119- 3315 (配列番号 33 ：クローン T 8) に相当する配列については、それそれ配列番号 34 (プライマ一名： NG 0 13) および 35記載（プライマ一名： NG 025 ) の塩基配列をもつオリゴヌクレオチド、配列番号 36 (ブライマ一名： NG040) および 37 (プライマ一名： NG 046 ) 記載の塩基配列をもつオリゴヌクレオチド、配列番号 38 (プライマ一名： RD 057) および 39 (プライマ一名： RD 058 ) 記載の塩基配列をもつオリゴヌクレオチドをプライマ一ペアとして増幅し、増幅産物を上記同様にクローニング後、配列を分析した（図 6) 。

得られた各クローンの配列を結合して配列番号 1記載の全長 3739bpの配列を得た。なお、配列を構築するにあたって、クローン間で重複する配列において変異が認められる（クロ一ン間で異なる）場合には、出現頻度の多い塩基を優先した。得られた配列の内の、 ntl455- 3054の配列についてデータべ一ス（DDBJ、国立遺伝学研究所、検索プログラム： B LASTおよび FAST A) を用いて既知遺伝子配列との相同性検索を実施した。相同率が高い上位 20位の遺伝子の内、ウイノレス（'こ由来するもの ίま Simian cytomegalovirus major immediate early tra nscription unit IE94のみで、その相同性は最も高い相同率を示した 383塩基長の断片についてでも 50. 7%に過ぎなかった。

このことから、本発明に開示する遺伝子配列と全長に渉り高い相同性を示すゥィルス遺伝子は知られていないこと、本発明によって見いだされた遺伝子が新規な配列を有するものであることが確認された。実施例 5 非 B非 C非 G型肝炎ウィルスマーカー陰性のァラニンアミノトランスフェラーゼ値異常供血者および慢性肝炎患者例からの HNT 22遺伝子の検出日本人の供血者に見いだされた既知肝炎ウィルスマーカーが陰性でァラニントランスフェラ一ゼ（ALT) の活性が 100国際単位（I U/1) 以上であった 207名およびァ—グル夕ミルトランスべプチダ一ゼ（ァ— GTP) の活性が 5 00 IU/1以上であった 26名、ならびに非 B非 C型慢性肝炎の症例 1 5名について、実施例 2記載の遺伝子検出法を用いて HNT 22遺伝子の有無を調べた。対照として肝機能が正常な供血者 88名と C型慢性肝炎患者例 22名についても調べた。

その結果、 ALT異常高値の供血者 207名中 1 6名（7. 7%) 、ァ _GT P異常高値の供血者 26名中 4名（ 1 5. 4%) 、非 B非 C型慢性肝炎例 15名中 3名（20%) に HNT 22遺伝子が認められた。

他方、肝機能正常の供血者例では、 88名中 3名（3. 4%) 、慢性 C型肝炎例では 22名中 2名（9. 1 %) に HNT 22遺伝子が認められた。実施例 6 輸血後肝炎例からの H N T 22遺伝子の検出

既知肝炎ウィルスマーカーが陰性であった輸血後肝炎例について、輸血前、輸血後肝炎発症前、肝炎発症後の患者血液、および（可能な場合には）輸血血液の各々について実施例 2の方法を用いて HN T 22遺伝子の存在および出現時期を調べた。

( 1) 症例 1

63歳の男性の輸血後肝炎例。

HB V、 H C Vおよび GB V— C/HGVのマーカーは本検討期間を通じていずれの時点も陰性であった。肝機能マ一カーである ALTは輸血前に正常値を示していたが輸血後 8週目、 9週目に異常値を示した。この症例の輸血前（輸血後 0週と表示）、輸血後 6， 8, 9, 10, 1 1 , 12， 15， 24週目の患者血液について HNT 22遺伝子を測定した。その結果、輸血前にも HNT 22遺伝子が患者血清から検出された（表 1) 。本例に輸血された血液は 4単位であった。この輸血血液について HNT 22遺伝子の有無を確認したところ、その内の 1単位から HNT 22遺伝子が検出された。表 1

N T：未試験

(2) 症例 2

58歳の男性の輸血後肝炎例。

HBV、 HCVおよび GB V—C/HGVのマーカーは本検討期間を通じていずれも陰性であった。肝機能マー力一である A L Tは輸血前に正常値を示していたが輸血後 10週前後に異常値を示した。この症例の輸血後 2， 6， 8, 10週目の患者血液について HNT 22遺伝子を測定した。その結果、 1段階増幅の 1 s t P CRでは輸血後 6週および 8週および 10週目の血液から HNT 22遺伝子が検出された（表 2) 。それに対し 2週目では力価（titer)が低く 2 nd P C Rで検出されるに過ぎなかった。本例については輸血した血液は保存されておらず、したがって、輸血血液について HNT 22遺伝子の有無の確認はできなかった。

なお、本例は HNT22のクローン #22を分離した症例である。分離においてドライバ一として使用した 2週目の血液にも本ウィルスが存在していたことが判明したが、高感度の 2段階増幅時でのみ検出できたことから、この時点でのゥィルス量は極めて少なく、そのため実質的にドライバ一として機能したと考えられる。表 2

(3) 症例 3

56歳の男性輸血後肝炎例。

本例も HB V、 H C Vおよび GB V— C/HGVのマーカーは本検討期間を通じていずれも陰性であった。肝機能マ一力一である AL Tは輸血前には正常値を示していたが輸血後 6週目前後に異常値を示した。この症例の輸血前（輸血後 0 週と表示）、輸血後 2， 4, 6 , 8、 12、 13週、 4ヶ月目および 5ヶ月目の患者血液について実施例 2記載の方法を用いて 2段階の増幅を行う P CRを行い、 HNT 22遺伝子の有無を確認した。また、検体を 10倍づっ希釈した系列を作成し同様に測定して、検出される最高希釈倍率からウィルス遺伝子の力価

(ウィルス量と考えられる）も求めた。その結、輸血後 2週目では陰性であつたが、輸血後 6週目から 4ヶ月の各点の血液から H NT 22遺伝子が検出された

(表 3) 。一方、肝機能異常は輸血後 6週目から顕となり、その後漸次軽快化したが、その変化はウィルスの消長とよく一致した。本例については輸血した血液は保存されておらず、したがって、輸血血液についての HNT 22遺伝子の有無の確認はできなかった。表 3

(4) 症例 4

70歳の女性の輸血後肝炎の例。

本例も HB V、 H C Vおよび GB V— C/HGVのマーカーは本検討期間を通じていずれも陰性であった。肝機能マ一力一である AL Tは輸血前には正常値を示していたが輸血後 6週目前後に異常値を示した。この症例の輸血後 4， 6, 8、 1 1， 12、 15、 16, 17，および 2 1週目の患者血液について実施例 2および 3の方法を用いた 2段階の増幅を行う P CRを実施し、症例 3同様に H NT 22遺伝子の有無とウィルス遺伝子の力価も求めた（実施例 2および 3の方法のいずれとも同様の結果が得られた）。その結果、輸血後 4週目では陰性であったが、輸血後 6週目から増加し、肝機能異常が最も顕著であった 1 1週に最も高い力価を示し、その後ウィルスが消失するのと平行して肝機能も正常に復帰し、ゥィルスの消長と肝機能異常の消長が良く一致した（表 4) 。本例については輸血した血液は保存されておらず、したがって、輸血血液についての HNT 22遺伝子の有無の確認はできなかった。また、 H NT抗体の有無を実施例 13に記載の方法により測定したところ、発症後は陽性であった。表 4

N T ：試験未実施実施例 7 輸血感染例の検討

実施例 6で既知肝炎マーカーが陰性で原因が不明であった輸血後肝炎例より本発明の HNT 22遺伝子が検出され、また肝機能マーカ一異常値の推移とウィルスの消長が良く一致したことから、 HNT 22が該肝炎の原因であることが強く示唆された。本例は、 HNT 22が輸血により感染することを一層明確に証することを目的に実施した。即ち、輸血歴があり、且つ幸血後の血液より HNT 22 遺伝子が検出された例で、輸血された血液パイロッ卜が全例確保されているケースについて、輸血後の血液と輸血血液パイロットのすべてについて後述する方法により遺伝子測定を行い、感染源と考えられる遺伝子陽性輸血パイロットを特定し、さらに患者血液から得られた遺伝子とパイロットの遺伝子の配列を決定、比較し、配列の相同性を調べた。

実施例 2記載の方法で輸血後 HNT 22遺伝子陽性となった症例について、輸血前と、使用された輸血血液パイロットについて、 HNT 22遺伝子が検出されるか否かを調べた。その結果、輸血前の検体からは HNT 22遺伝子は検出されなかったが、輸血後 2週目以降の検体からは全て HNT 22遺伝子が検出され輸血により感染したことが強く示唆された。

さらに、使用した血液パイロッ卜の 10本全てについて HNT 22遺伝子測定を実施したところその内の 1本から HNT 22遺伝子が検出された。 HNT 22 陽性となった検体全てから、実施例 2記載の方法に従い核酸を抽出した。ついで第 1段階の増幅は実施例 2の 1 s t P CRのセンスプライマー RD 037を配列番号 40記載の塩基配列をもつプライマー NG 001に変更し、 P CR条件を 94°C、 30秒—55° 30秒—72°(、 1分の反応サイクルに変更し 35回繰り返した。本条件で増幅すると陽性例では 415 bpの DNA断片が得られる。実施例 2で第 2段階の増幅に使用したセンスプライマ一 RD 05 1を NG 001 に変更し、〇1条件を94° 30秒_ 55°(、 30秒—72° 1分からなる反応サイクルを 25回繰り返す条件にして実施した。本条件で増幅すると陽性例では 396 bpのDNA断片が得られる。この 396 bpの増幅産物を実施例 1と同様にプラスミドベクターに挿入し、クローン化した後、それそれの増幅例について 3クローンについて塩基配列を決定、比較して相同性を検討した。

その結果、 HNT 22陽性輸血血液パイロットより得たクローンの配列は、同パイロットから輸血された患者より得られた H N T 22遺伝子配列と完全に一致した（図 7) 。このことから、 HNT 22ウィルスが輸血により感染し、その後持続化することが示された。なお、この遺伝子配列をクローン # 22の配列と比ベると、両端のプライマー由来配列以外の 356塩基中 3塩基が異なっていた。実施例 8 本発明ウィルスが DNAウィルスであることの証明

肝炎ウィルスには HBVのように DN Aウィルスであるものと、 HC Vのように RN Aウィルスであるものが存在する。本発明のウィルスがいずれの種類のゥィルスであるかを以下の作業より確かめた。

( 1) 逆転写反応の工程を省略した PCR

実施例 1に示す様に本ウィルス遺伝子を分離した試料は核酸抽出後に逆転写反応の工程を経ている。従って、逆転写反応後の試料中にはもともと存在していた DNAと、反応前は RN Aとして存在していたが、逆転写反応により DN Aとなつたものとが混在している。したがって、もしも、本発明のウィルスが RNAゥィルスであるならば、逆転写反応を省略することによりウィルスの遺伝子の検出が不可能または極めて困難になる。このことから、本発明者らは、逆転写反応を省略した実施例 2に基づく PCR を実施し、上記の可能性について検討した。その結果、逆転写反応を省略しても HNT 22遺伝子を同等のレベルで検出可能であることが確認された。

このことから、 HNT 22は DN Aウィルスであると判定された。

(2) DNA分解酵素処理による証明

本発明者らは上記（ 1) の検討に加えて、実施例 2の方法で HNT 22遺伝子の存在が確認されている試料より抽出した核酸分画を DN A分解酵素で処理し、これに逆転写反応を行い、得られた DNAをサンプルとして HNT 22遺伝子測定を実施例 2の方法で実施した。

具体的には実施例 2と同じ市販のキット（EX MD,住友金属製）を用いて抽出した核酸分画を DNa s e I (宝酒造社製）で 37 °C、 30分間処理した後、 D Na s e Iの活性を阻害した。そのサンプルを用いて実施例 1記載の条件と同一条件で逆転写反応以降の操作を行い、 HNT 22遗伝子の検出を試みた。その結果、 DNa s e Iで処理すると HNT 22遺伝子が検出されなくなることが判明した。

上記（ 1 ) および（2) の結果より、本発 HJ]の HNT 22ウィルスは DNAゥィルスであることが示された。実施例 9 1本鎖 D N Aウィルスであることの証明

( 1) 制限酵素を用いた証明

DNAウィルスには、遺伝子構造の異なる、即ち DN A鎖が 1本鎖のものと 2 本鎖のものの 2種類が存在することが知られている。本発明者らは HNT 22ゥィルスの実体を知るうえで該特徴を明らかにすることが重要と考え、以下の実験を行った。

即ち、 HNT 22ウィルス遺伝子が自然界には 2本鎖で存在すると仮定すると、その配列中には幾箇所かに制限酵素特異的な構造が認められる。しかし、もし該ウィルス遺伝子が 1本鎖であれば、この制限酵素特異的配列は存在しないことになる。逆に、抽出された遺伝子が上記配列に特異性を持つ制限酵素に感受性である（切断される）ならば、本ウィルスの遺伝子は 2本鎖構造を取っていると考えられる。

本発明者らは上記の考えに立ち、 HNT 22遺伝子を 2本鎖と仮定したときに配列内に特異配列が認められる制限酵素 E c 0 R Iと、対照として特異配列が認められない制限酵素 B g 1 IIについて切断の有無を調べた。

すでに実施例 2および 3記載の方法で HNT 22ウィルス陽性であることが確認されている患者より得た血漿 800〃1より、実施例 1記載の方法を用いて D NAを得た（90 1) 。その内より各 15〃1をとり、それそれについて E c oR I (宝酒造社製）または Bglll (宝酒造社製）を 2〃1加え 37°Cで 2. 5時間処理した。また、同時に制限酵素のかわりにリン酸緩衝液を加え同様の反応も行った。制限酵素処理の後、各サンプルより 3〃1を取り、 10倍、 100 倍の希釈サンプルを作成し、それそれについて E c oR I制限酵素特異配列がその内側に存在するプライマ一 NG 001と RD 038を用いて、 E c o R I制限酵素特異配列を含む HNT 22遺伝子領域を増幅した。その結果、いずれのサンプルでも制限酵素による切断は認められなかった。

(2) ムング ' ビーン ·ヌクレア一ゼ（Mung Bean Nuclease)処理による証明ムング · ビーン ·ヌクレア一ゼは 1本鎖の DN Aを特異的に切断することが知られている。従って、 HNT 22が 1本鎖で存在しているのであれば、ムング ' ビーン ·ヌクレアーゼに感受性であると考えられる。

本発明者らは上記の考えに立ち、前記の制限酵素処理実験に用いたのと同一の患者より同様に DNAを得てムング ' ビーン ·ヌクレアーゼで処理した。また対照として実施例 2の方法で増幅される HNT 22の一部領域を M 13ファージに組み込み、 2本鎖の状態のものと 1本鎖の状態のものを作成し、それぞれについてムング . ビーン ·ヌクレア一ゼ処理を行った後に実施例 2の方法に従い HNT 22遺伝子の増幅を行った。その結果、 HNT 22陽性患者より得た DNAと 1 本鎖のファージ由来 DNAでは増幅がかからず、ムング ' ビーン ·ヌクレア一ゼに対し感受性であった。

上記（1) および（2) の結果より HNT22遺伝子は 1本鎖 DN Aとして存在しており、 HNT 22ウィルスは 1本鎖 DNAウィルスであることが判明した。実施例 10 HNT 22遺伝子にコードされるアミノ酸配列

実施例 4にて解明された HNT 22遺伝子配列に基づいて HNT 22遺伝子にコードされるアミノ酸配列を解析した。得られた塩基配列中に開始コドン配列と終止コドン配列を探し、どの組み合わせの場合に通常考えられる大きさのオーブンリーディングフレーム（ORF) が得られるかを判断基準として HNT 22遺伝子の OR Fを検索した。その結果、 2つの ORF (OR F 1 ： nt589-nt2898 ( 770ァミノ酸残基）と、 0 R F 2 ： ntl07-nt712 ( 202ァミノ酸残基））が存在することが判明した（図 6および図 8) 。このことから HNT 22遺伝子は配列番号 9および 10記載のァミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしていることが推定される。

このアミノ酸配列に基づき、コードされるポリべプチドの疎水性ノ親水性特性を公知の方法で調べた（図 9) 。実施例 11 ウィルス粒子の分離

実施例 2の方法で H N T 22遺伝子が陽性であることが判明している血液をショ糖密度勾配遠心分離法を用いて分画し、 HNT22遺伝子の密度分布を分析し、それからウィルス粒子としての可否を検討した。

(1) HNT22遺伝子陽性の血液 250 /1と、対照となる H B V陽性の血漿 5 1を混合し、微量冷却遠心分離装置を用いて 15000回転/分で 5分間遠心分離し、不純物を沈殿させ、取り除いた。

(2) 上記（1) の操作で得た上清 0. 2mlを、ベックマン SW60ロー夕一用の遠心管内に底から 60% (0. 7ml)、 50%、 40%、 30%、 20% および 10% (いずれも 0. 2ml) の順番で各重量濃度のショ糖液を重層して作成した密度勾配担体の上に添加し、さらにその上に 2. 3 mlの TEN緩衝液

( 1 OmM Tr i s— HC1、 pH 8. 0、 1 mM EDTA、 0. 5 M N aC 1) を重層した。

(3) 40000回転/分、 10°Cで 45時間遠心分離した後、チューブの底から 300〃1づっ回収し、それぞれについて屈折計を用いて密度測定を行った。

(4) 各密度分画より 100〃1を取り、プロテネース K (ベーリンガーマィム社製）とドデシル硫酸ナトリウム（SDS、和光純薬社製）を含む抽出試薬 300〃1 (Okamoto H. et al.， J. Virol. 64: 1298-1303, 1990) と混合し、 70°Cで 3時間反応させた。その後フエノールを加え核酸分画を抽出し、さらにフエノール/クロロフオルムによる抽出を行った。最後にエタノールを加えて核酸を沈殿させ回収した後、 TE緩衝液（10mM T r i s-HC 1, H 8. 0、 1. OmM EDTA) にて適当濃度になるよう溶解した。

(5)得られた DNAをサンプルとして HNT 22遺伝子を実施例 2の方法で増幅し、 HBV遺伝子は以下の方法で増幅し検出した。

DNAサンプル 5〃 1を、 HBVの表面抗原遺伝子領域内の配列から選択した配列番号 41記載の塩基配列をもつプライマー S 2一 1と配列番号 42記載の塩基配列をもつプライマー S 1—2を 0. 5〃1 ( 10OD/ml) ずっと、 2. 5mMdNTP4 zl、 10倍濃度の耐熱性 D N Aポリメラ一ゼ用緩衝液（Am pl iTaq DNA Po lymerase付属： Perkin E lmer 社製） 5〃1、耐熱性 DNA po lymeras e (Amp 1 i T a q DN A Po lymerase ： Perkin E lme r社製) 0. 2 5 ju l 留水 34. 75 1を含む増幅反応液の入った PC R用チューブに加えた後、 5 0 1のミネラルオイルを重層し、攪拌、さらに 5000 r pmで 30秒遠心分離してからサーマルサイクラ一に装着し P CRを実施した。 P CR反応条件は 9 4°C、 30秒—55°(、 30秒—72° 75秒で、このサイクルを 35回実施した。この方法では HBV遺伝子は電気泳動のゲル内では 250 bpの長さのバンドとして検出できる。更に高感度の検出が必要な場合には、上記増幅産物の一部を用いて次の条件で第 2段階の P CRを行った。即ち、増幅産物 5 1を、使用するプライマ一を配列番号 43記載の塩基配列をもつプライマー $ 088と配列番号 44記載の塩基配列をもつプライマー S 2-2に変更した以外は上記と同一の条件の反応溶液に加え、同様の操作をおこなった後に PCRを実施した。 P 〇11反応条件は94°(、 30秒— 55° (：、 30秒—72° 60秒で、このサイクルを 25回繰り返した。第 2段階目の PCRにより得られる増幅産物は 228 b pのバンドとして電気泳動ゲル内に検出される。

上記分析の結果、 HNT 22遺伝子はショ糖密度 54. 5%、密度 1. 26 g /cm³にビークをもって存在し、他方コントロールとしての HBVは従来の報告と同様、密度 1. 26〜 1. 20 g/cm³にピークをもって存在することが判明した（表 5) 。この密度分析は HNT 22遺伝子がウィルス粒子分画に存在していることを示しており、密度勾配遠心法にて上記密度分画に分離回収できることが示された。表 5 HNT 22遺伝子のショ糖密度勾配遠心分画の分布ショ糖密度密度 HNT 22 -DN A HB V - DNA

(%) g/m 1 IstPCR 2ndPCR IstPCR 2ndPCR

60. 7 1. 29 + + +

54. 5 1. 26 + + + +

45. 2 1. 20 + + +

30. 9 1. 13 土 + + + +

19. 5 1. 08 + + +

12. 0 1. 05 + +

一：陰性土：弱陽性 + ：陽性 + + ：中陽性 + + + ：強陽性実施例 1 2 HNT 22遺伝子型配列

実施例 3で記載の如く、 H N T 22には遺伝了^が存在することが示唆されたことから、本発明者らは実施例 3記載の遺伝子検出法により陽性となった H N T 22陽性例について、その増幅遺伝子を解析し、その遺伝子配列に基づいて分子系統樹を作成し、 HNT 22の遺伝子型を検索した。

発明者は、日本人、米国人、フランス人を対象として実施例 3記載の方法により HNT 22遺伝子の有無を調べ、その結果合計で 1 99例（日本人 187例、米国人 8例、フランス人 4例）の陽性例を得た。これら陽性例について、増幅した遺伝子を実施例 1記載の方法に従いクロ一二ングし、それそれ少なくとも 3クローンについて塩基配列を決定し、市販ソフトを用いて分子系統樹を作成した

(図 10。各配列は図 1 1〜12に示す）。その結果、 HNT 22遺伝子は配列番号 45から 54記載の配列（配列番号 1の ntl939- 2160に相当）を有する 10 の型に分類された。本発明者らはそれぞれ遺伝子型 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9および 10と名付けた。実施例 13 分離 HNT22ウィルス粒子を利用した免疫沈降法による抗 HNT 22抗体検出法

実施例 1 1記載の方法により HNT22粒子が分離回収できることがしめされた。本発明者はこれを利用した免疫沈降法による抗体の検出について検討した。まず、血液中に H NT 22遺伝子が存在していることが判明している 5名の H NT感染患者より便を採取し、これを適当な液に懸濁して試料調製した後、実施例 3記載の方法に従い便中の HNT 22遺伝子の有無を調べた。その結果、便中にも HNT 22遺伝子が存在すること、その浮上密度が 1. 35 g/cm³であること、そしてその遺伝子配列が同一患者の血液より得た HNT 22の遺伝子配列に同一であることが判明した。これより、 HNT 22粒子は便より回収することとした。

患者より得た便に蒸留水を加え 15% (重量濃度）の懸濁液を作成した。この懸濁液を冷却遠心分離器（日立製）を用いて 3000 rpm、 30分間遠心分離し、上清を得た。微量冷却遠心分離器（High Apeed Micro Refrigerated Centri fuge：トミ一精ェ製）を用いてこの上清を更に 10000 r pm、 5分間遠心分離した。その上清を集めて HNT 22粒子液とした。粒子液の DN A力価は 10 ⁵/m 1であった。

血清ないし血漿 50〃1に上記11^^丁22粒子液 10 1を加え、 37°Cで 2 4時間反応させた。反応後、二次抗体としてャギ抗ヒト I gG (# 46340, Capp e 1社製）を原液のまま 50〃 1加え 37 °Cで 1時間反応させた。反応終了後、微量冷却遠心分離器 (High Apeed Micro Refrigerated Centrifuge：トミー精ェ製）を用いて 10000 r pm、 5分間の遠心分離を行い、上清と沈殿に分離した。上清を別のエツペンドルフチューブに移し、市販の核酸抽出キット (EX R&D、住友金属社製）を利用して DNAを抽出した。一方、沈殿に 1 10〃 1の生理食塩水を静かに加え、 10000 r pmで 5分間遠心分離を行い、上清を捨て、さらに生理食塩水 110〃1を滴下して懸濁した。この懸濁液から同様にして DN Aを抽出した。得られた DN A分画を 20〃 1の蒸留水に溶解し、 95°Cで 5分間処理し、その半量を HNT 22遺伝子検出試料として用いた。 H NT 22遺伝子の検出は実施例 3と同様にして実施した。同一血清ないし血漿に HNT 22粒子液を添加せず同一作業を行ったもの、および HNT 22陰性の血清ないし血漿を用いて同一作業を行ったものを対照とした。

その結果、粒子液を加えた HNT 22遺伝子陽性血清ないし血漿では、沈殿分画に HNT 22遺伝子が認められたが、粒子液を加えない場合および HNT陰性血清ないし血漿を用いた場合には沈殿分画に HNT 22遺伝子を認めなかった。このことから、 HNT 22抗体が存在するときのみ、 HNT 22粒子がこの抗体と抗ヒト I gG抗体を介して集合し沈殿分画を形成すると考えられ、逆に上記作業により沈殿分画に H N T遺伝子が認められる例では抗 H N T抗体が存在すると考えられる。実施例 14 HNT粒子液を用いた抗 HNT 22抗体検出法による輸血後肝炎例と劇症肝炎例における抗 HNT 22抗体の測定

発明者らは実施例 13の方法を用いて、輸血後に一過性に HNT 22に感染し肝機能異常を示した実施例 6の症例 4と、既知の肝炎ウィルス感染が否定された非 A— G型散発性劇症肝炎例の回復期について抗 H NT 22抗体の消長を調べた

(表 4と 6) 。

その結果、両例について抗 HNT 22抗体がウィルスの消失後に出現することが示され、ウィルス感染に於ける中和抗体の消長に類似した消長パターンを示すことが示された。

表 6 非 A— G型散発性劇症肝炎の回復期における HNT 22遺伝子と抗 HNT

22抗体の消長

N T：試験未実施

入院後 ALT HCV GBV-C/HGV

採血日（IU/1) 抗体 RNA 実施例 15 HNT 22遺伝子の亜種の検出および配列決定

HNT 22ウィルスには複数の遺伝子型が存在することが示されたこと（実施例 12) 、 B型肝炎や C型肝炎などの他のウィルスでは地域的に遺伝子型の偏りがあること、から米国での主要な HNT 22遺伝子型が日本での主要な型と異なる可能性があるため、米国人より得た HNT22陽性検体について検討を行った。実施例 3に記載の検出方法により HNT 22ウィルス陽性であることが確認されている米国人由来血清（それそれ UM3— 17、 UM3_34、 UM3_56、 UM3- 73と称する）のそれぞれ 100〃 1から、市販の拡散抽出キット（ベ —リンガー ' マンハイム社製、 High Pure Viral Nucleic Acid Kit) を用い、使用説明書に従い核酸を抽出しサンプルとした。

これまでに判明している HNT 22ウィルスの配列に基づいて選択した配列番号 55記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（NG 055 ) および配列番号 8記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（NG 063 ) をプライマーとして用い、上記サンプルを鍊型として、下記の条件にて PCRを行った。用いたプライマーの位置関係を図 13に示す。 PCR条件

( 1 ) 反応液組成

鍊型核酸溶液 1 0 z l

1 0 xEx. Taq緩衝液 5 1

2.5 mM dNTP 4 z 1

プライマ一（NG055: 10 OD/ml) 1 ju 1 (280nmにおける 0D、以下同じ）プライマ一（NG063: 10 OD/ml) 1 υ.1

蒸留水 2 9. 5 / 1

Ex. Taq DNAポリメラ一ゼ 1 JUL 1

A口き口 + τ 50 / 1

( 2 ) 反応条件

9 5 °C 2分

9 5 °C 45秒

5 5°C 30秒 35サイクル

72 °C 90秒

72°C 7分その結果、全てのサンプルで遺伝子増幅が認められた。各サンプルについて複数の増幅断片を実施例 1と同様にして Tベクターにクローニングし、遺伝子配列を決定した。その結果、 UM3— 1 7と UM3 _ 73からは、これまでに判明している塩基配列に相同性の高レ、配列を有するクローンに加え、この塩基配列とは相同性の低い配列を有するクローンが得られた（以下、それそれ、 U 1 7— 2および U73— 2と称する）。いずれも、これまでに判明している塩基配列の相当する領域の塩基配列との相同性は 30%であった。 UM3— 5 6と UM3— 34 からは、これまでに判明している塩基配列と高い相同性を有するクロ一ンしか得られなかった。

上記により得た U 1 7一 2クローンと、これまでに判明している HNT 22ゥィルスとの間で塩基配列を比較し、保存性の高い領域を選び、上記クローンのさらに 5 ' 側の塩基配列を増幅するためのプライマ一として、配列番号 5 6記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（NT 0 1 ) を作成した。このオリゴヌクレオチド NT 0 1と、これまでに判明している HNT 22ウィルスの配列に基づいて作製した配列番号 57記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（NG0 54) とをプライマーとして、 UM3— 1 7由来の核酸を錶型として用いて下記の条件で P CRを行い、得られた増幅断片について上記同様の方法で配列決定を行った。プライマーの位置関係は図 1 3に示す。

P CR条件 2 o 75 o

分秒秒秒分

( 1 ) 反応液組成

銪型核酸溶液 l Oju l

10 xEx. Taq緩衝液

2.5 mM dNTP pi l

プライマ一（NT01: 10 OD/ml) 1 μ.1

プライマー（NG054: 10 OD/ml ) 1 1

蒸留水 2 9. 5 j l

Ex. Taq DNAポリメラーゼ 1 JLL 1 合計 50 i 1

( 2 ) 反応条件

95°C h 35サイクル

72°C 一方、同様にして U 1 7— 2の 3 ' 側の塩基配列と、これまでに判明している HNT 2 2ウィルスの塩基配列に基づいて、上記クローンのさらに 3，側の配列を増幅するためのプライマーとして、配列番号 5 8および 5 9記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（それそれ、プライマー NT 03および NT 04) を作製し、また、これまでに判明している HNT 2 2ウィルスの塩基配列の 3' 側末端部付近の塩基配列に基づいて、増幅のためのプライマーとして、配列番号 6 0および 6 1記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（それそれ、プライマ -NG 06 5および N GO 2 1) を作製した。まず、 NT 03と NG06 5を用いて 3' 側の遺伝子を増幅し、さらに得られた増幅断片の一部を NT 04と NG 06 5または N GO 2 1を用いて増幅した。プライマ一の位置関係は図 1 3に示す。増幅は、鎵型として、 UM3— 17由来の核酸を用いて下記の条件で行った。増幅断片は、前記と同様の方法でその塩基配列を決定した。 P CR条件

第 1段階 P CR

( 1 ) 反応液組成

錶型核酸溶液 1 21

1 0 Ex. Taq緩衝液 5j l

プライマー（NT03: 10 OD/ml) 1 μ.1

プライマー（NG065: 10 OD/ml) 1 μ.1

蒸留水 29. 5 ^ 1

Ex. Taq DNAポリメラ一ゼ合計 50 1

( 2 ) 反応条件

9 5°C 2分

9 5°C 45秒

5 5°C 30秒 35サイクル

72°C 90秒

72°C 7分第二段階 P C R

( 1 ) 反応液組成

錡型核酸溶液 5 ^ 1

1 0 Ex. Taq緩衝液 5〃 1

2.5 mM dNTP A fi l

プライマー（Nt04: 10 OD/ml) 0. 5〃 1

プライマー（NG065: 10 OD/ml)または

プライマ一（NG021: 10 OD/ml) 0. 5〃 1

蒸留水 34. 5 1

Ex. Taq DNAポリメラ一ゼ 0. 5 1 合計 50 ^ 1

( 2 ) 反応条件

95 °C 2分

9 5 °C 45秒

5 5°C 30秒 h 2

72°C 90秒

72°C 7分

上記のようにして、 U 1 7— 2の 5 ' 側配列クローンとして 1— 1、 1— 9および 1— 10を得、さらに 3，側配列クローンとして 2 A—3 (第二段階 PCR のプライマ一が NT04/NG065の組み合わせ）、ならびに、 2B— 1および 2 B— 3 (第二段階 P CRのプライマーが NT04/NG021の組み合わせ）を得た。これらのクローンについて上記と同様に塩基配列を決定して、これらを連結することにより米国人由来血清から検出されたウィルス遺伝子の塩基配列を得た（配列番号 62) < 本配列を HNT 22遺伝子の塩基配列と比較すると、 5' 側と 3' 側の領域で極めて高い相同性を認めるものの、それ以外の領域の配列についての相同性は 3 0 %程度と低く、また実施例 2および 3の検出方法ではこの配列を検出できないことが判明した。この遺伝子を有するウィルスは、 TUS 0 1と名付けた。

US 01遺伝子の塩基配列について、実施例 10と同様にして OR Fを検索した。その結果、二つの OR F (ORF 1 ： nt590-nt2872 ( 76 1アミノ酸残基）と、 ORF 2 ： nt258-nt725 ( 156アミノ酸残基））が存在することが判明した（図 15) 。これらは、 HNT 22遺伝子の塩基配列における ORF 1および OR F 2に相当する位置に存在した。

表 7に各領域の相同性をまとめてしめす。表 7 HNT 22遺伝子と TUS 0 1遺伝子の相同性

HNT 22²⁾ TUS 0 1 配列相同性全長 3739 n t 3722 n t 63. 7%

5，非翻訳領域 262 n t 257 n t 90. 3% 翻訳領域 2636 n t 26 15 n t 54. 7%

ORF 1 23 10 n t 2283 n t 54. 8%

(アミノ酸配列） 770 a a 76 1 a a 37. 0%

ORF 2 ⁿ 450 n t 468 n t 55. 5%

(アミノ酸配列） 150 a a 156 a a 38. 8%

3' 非翻訳領域 84 1 n t 850 n t 84. 2%

1) ORF 2については、 TU S 0 1に合わせて比較するため、 HNT 22については第 2番目の AT Gコドンからのフレームを採用した。

2) HNT 22として用いた配列は T A 278のものである。相同性の高い 5' 非翻訳領域（5' 端領域）および 3' 非翻訳領域（3，端領域）の塩基配列を比較した結果を図 15および 1 6に示す。

TUS 0 1遺伝子の塩基配列について既知配列との相同性を F A S Tおよび B LASTを利用して実施例 4と同様に検索したところ、高い相同性を示したものは全て HNT 22遺伝子の塩基配列であった。

以上の性質からみて、 TUS 0 1ウィルスは、 HNT 22ウィルスの亜種と推定される。実施例 16 HNT 22遺伝子および TUS 0 1の同時検出

実施例 2および 3の検出方法では、検出し得ない TUS 0 1遺伝子も同時に検出できる方法を検討した。

両方の配列を比較し、共通する配列を有し、 P CRのプライマ一として適切と思われるオリゴヌクレオチドとして NG054と NG065を選択した。血清 1 00 z 1から実施例 2に記載の方法に従い核酸を抽出した。抽出した核酸を蒸留水 10 1に溶解した。 NG054および NG 065 (共に 10 OD/ml) の溶液 1 〃1、 10倍濃度の Ex. Taq緩衝液（TaKaRa社製） 5〃 1、 2. 5mMdNTP 4〃1、蒸留水 29. 5〃 1の入った P CRW用チューブに溶解した核酸 10 / 1を加え、すぐに耐熱性 DN Aポリメラーゼ（Ex. Taq Polymerase: TaKaRa) を加え、 95 °C 2分の処置をした後、 95°C45秒、 55°C30秒、 72 °C 120 秒のサイクルを 35回繰り返し、最後に 72 °C 7分の反応を加えて、増幅した。増幅産物をァガロース電気泳動を用いて分離し、塩基配列より予測される長さのバンドの存在を確認した。バンドが確認できた増幅産物について、その配列を決定した。その結果、本法により、 HNT 22遺伝子および TUS 0 1遺伝子を同時に検出できることが判明した。産業上の利用可能性

本発明は、従来原因が不明であった血液伝播性肝炎について、未知の原因ウイルスを特定した。これによつて、遺伝子測定、抗原測定、抗体測定法を確立し、該肝炎検査のためのキット、予防のためのワクチンを提供できる。

Claims

請求の範囲

1 . 配列番号 5 7に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号 6 0に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる P C R、または配列番号 5 7に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドぉよび配列番号 6 1に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる P C Rによって、およそ 3 5 0 0塩基からおよそ 4 0 0 0塩基の長さの配列が増幅可能な塩基配列を有する非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子。

2 . 前記 P C Rによって、およそ 3 6 0 0塩基からおよび 3 9 0 0塩基の長さの配列が増幅可能な塩基配列を有する請求項 1記載のウィルス遺伝子。

3 . 前記 P C Rによって増幅される断片の 5 ' 端および 3 ' 端の塩基配列が、配列番号 1記載の塩基配列の塩基番号 3〜 3 0 0および塩基番号 2 4 0 2〜 3 7 3 9の塩基配列に対し、それそれ、 7 0 %以上の相同性を有する請求項 1または 2記載のウィルス遺伝子。

4 . 前記相同性が 8 0 %以上である請求項 3記載のウィルス遺伝子。

5 . 配列番号 6に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号 8に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマ一として用いる P C Rによって、およそ 2 0 0塩基からおよそ 3 5 0塩基の長さの配列が増幅可能な塩基配列を有する非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子。

6 . 配列番号 Ίに記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号 8に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマ一として用いる P C Rによって、およそ 2 0 0塩基からおよそ 3 5 0塩基の長さの配列が増幅可能な塩基配列を有する非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子。

7 . 配列番号 1に記載の塩基配列を有する非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子またはその同種変異体遺伝子。

8 . 配列番号 4 5に記載の塩基配列、配列番号 4 6に記載の塩基配列、配列番号 4 7に記載の塩基配列、配列番号 4 8に記載の塩基配列、配列番号 4 9に記載の塩基配列、配列番号 5 0に記載の塩基配列、配列番号 5 1に記載の塩基配列、配列番号 5 2に記載の塩基配列、配列番号 5 3に記載の塩基配列、および、配列番号 5 4に記載の塩基配列からなる群から選ばれる塩基配列を有する請求項 5〜 7のいずれか 1項に記載のウィルス遺伝子。

9 . 配列番号 1に記載の塩基配列を有する非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子。

1 0 . 請求項 1〜 9のいずれか 1項に記載の遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド。

1 1 . 請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の遺伝子の塩基配列内に認められる、前記遺伝子に特異的な塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。

1 2 . 配列番号 2記載の塩基配列、配列番号 3記載の塩基配列、配列番号 4 記載の塩基配列、配列番号 5記載の塩基配列、配列番号 6記載の塩基配列、配列番号 7記載の塩基配列および配列番号 8記載の塩基配列から選ばれる塩基配列を有する請求項 1 1に記載のオリゴヌクレオチド。

1 3 . 請求項 1 1記載のオリゴヌクレオチドをプライマ一として用いて P C Rを行うことを特徴とする非 B非 C非 G型肝炎ゥィルス遺伝子検出法。

1 4 . 配列番号 2に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号 3に記載の塩基配列を有するオリゴヌクオチド、または、配列番号 4に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号 5に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマ一として用いて P C Rを行うことを特徴とする非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子検出法。

1 5 . 配列番号 6に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号 8に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、または、配列番号 7に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号 8に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて P C Rを行うことを特徴とする非 B非 C非 G型肝炎ゥィルス遺伝子検出法。

1 6 . 1の検体に関し請求項 1 4および 1 5に記載の遺伝子検出法の両方を実施し、両遺伝子検出法により得られた結果を比較することを特徴とする非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子型判別法。

1 7 . 請求項 8に記載の遺伝子にある各遺伝子型特異的配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてハイプリダイゼ一シヨンを行うことを特徴とする非 B非 C 非 G型肝炎ウィルス遺伝子型判別法。

1 8 . 請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の遺伝子の塩基配列に認められるオープンリーディングフレーム内にコードされるアミノ酸配列を有するポリぺプチド。

1 9 . 配列番号 1記載の塩基配列に認められるオープンリーディングフレーム内にコードされるアミノ酸配列を有する請求項 1 8記載のポリぺプチド。

2 0 . 配列番号 9記載のアミノ酸配列を有する請求項 1 8記載のポリべプチ F o

2 1 . 配列番号 1 0記載のアミノ酸配列を有する請求項 1 8記載のポリぺプチド。

2 2 . 配列番号 9または 1 0記載のアミノ酸配列内に認められる非 B非 C非 G型肝炎ウィルス特異的なアミノ酸配列からなるポリべプチド。

2 3 . 非 B非 C非 G型肝炎ウィルス特異的ェビトープを含む、請求項 1 8に記載のポリべプチド。

2 4 . 非 B非 C非 G型肝炎ウィルス粒子が有する密度に基づいて、前記粒子を分離することを特徴とする非 B非 C非 G型肝炎ウィルス粒子の分離法。

2 5 . 請求項 2 4記載の方法により分離されたウィルス粒子。

2 6 . 請求項 2 5記載のウィルス粒子より得られる非 B非 C非 G型肝炎ウイルスポリべプチド。

2 7 . 配列番号 9または 1 0記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列の全部または一部の配列を組み込んだ組換え遺伝子発現ベクター。

2 8 . 配列番号 9または 1 0記載のァミノ酸配列をコードする塩基配列の全部または一部の配列を保持する形質転換細胞。

2 9 . 請求項 2 8記載の形質転換細胞により発現される非 B非 C非 G型肝炎ウィルス抗原べプチドまたはその断片。

3 0 . 請求項 2 8記載の形質転換細胞を、非 B非 C非 G型肝炎ウィルス抗原ぺプチドが発現する条件で培養し、発現させた前記べプチドを採取することを特徴とする非 B非 C非 G型肝炎ウィルス抗原べプチドの生産方法。

3 1 . 請求項 1 8〜 2 3および 2 6のいずれか 1項に記載のポリべプチドまたは請求項 2 5記載のウィルス粒子を抗原として用いる非 B非 C非 G型肝炎ウイルス抗体の免疫学的検出方法。

3 2 . 請求項 1 8〜2 3および 2 6のいずれか 1項に記載のポリペプチドまたは請求項 2 5記載のウィルス粒子を免疫原として、動物を免疫することを特徴とする非 B非 C非 G型肝炎ウィルス抗体の作成方法。

3 3 . 請求項 3 2に記載の作成方法によって得られる抗体。

3 4 . 請求項 3 3記載の抗体を用いる非 B非 C非 G型肝炎ウィルス抗原の免疫学的検出方法。

3 5 . 配列番号 1記載の塩基配列にあるオープンリーディングフレームにコ ―ドされるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列を有し、非 B非 C非 G型肝炎ゥィルス中和抗体のェピトープ配列を含むポリぺプチドを含むワクチン。

3 6 . 請求項 2 5記載のウィルス粒子を含むワクチン。

3 7 . 配列番号 6 2に記載に記載の塩基配列を有する非 B非 C非 G型肝炎ゥィルス遺伝子またはその同種変異体遺伝子。

3 8 . 配列番号 6 2に記載の塩基配列を有する非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子。

3 9 . 請求項 3 7または 3 8に記載の遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド。

4 0 . 請求項 3 7または 3 8に記載の遺伝子の塩基配列内に認められる、前記遺伝子に特異的な塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなるォリゴヌクレオチド。

4 1 . 配列番号 5 7記載の塩基配列、配列番号 6 0記載の塩基配列および配列番号 6 1記載の塩基配列から選ばれる塩基配列を有する請求項 4 0に記載のォリゴヌクレオチド。

4 2 . 請求項 4 1記載のオリゴヌクレオチドをプライマ一として用いて P C Rを行うことを特徴とする非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子検出法。

4 3 . 配列番号 5 7に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号 6 0に記載の塩基配列を有するオリゴヌクオチド、または、配列番号 5 7 に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号 6 1に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマ一として用いて P C Rを行うことを特徴とする非 B非 C非 G型肝炎ウィルス遺伝子検出法。

4 4 . 請求項 3 7または 3 8に記載の遺伝子の塩基配列に認められるォ一プンリーディングフレーム内にコードされるァミノ酸配列を有するポリぺプチド。

4 5 . 配列番号 6 2記載の塩基配列に認められるオープンリーディングフレ —ム内にコードされるアミノ酸配列を有する請求項 4 4記載のポリべプチド。

4 6 . 配列番号 6 3記載のアミノ酸配列を有する請求項 4 4記載のポリぺプチド。

4 7 . 配列番号 6 4記載のアミノ酸配列を有する請求項 4 4記載のポリぺプチド。

4 8 . 配列番号 6 3または 6 4記載のアミノ酸配列内に認められる非 B非 C 非 G型肝炎ウィルス特異的なアミノ酸配列からなるポリべプチド。

4 9 . 非 B非 C非 G型肝炎ウィルス特異的ェピトープを含む、請求項 4 4に記載のポリべプチド。

5 0 . 配列番号 6 3または 6 4記載のァミノ酸配列をコードする塩基配列の全部または一部の配列を組み込んだ組換え遺伝子発現べクタ一。

5 1 . 配列番号 6 3または 6 4記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列の全部または一部の配列を保持する形質転換細胞。

5 2 . 請求項 5 1記載の形質転換細胞により発現される非 B非 C非 G型肝炎ウィルス抗原べプチドまたはその断片。

5 3 . 請求項 5 1記載の形質転換細胞を、非 B非 C非 G型肝炎ウィルス抗原ぺプチドが発現する条件で培養し、発現させた前記べプチドを採取することを特徴とする非 B非 C非 G型肝炎ウィルス抗原べプチドの生産方法。

5 4 . 請求項 4 4〜4 9のいずれか 1項に記載のポリべプチドを抗原として用いる非 B非 C非 G型肝炎ウィルス抗体の免疫学的検出方法。

5 5 . 請求項 4 4〜4 9のいずれか 1項に記載のポリペプチドを免疫原として、動物を免疫することを特徴とする非 B非 C非 G型肝炎ウィルス抗体の作成方法。

5 6 . 請求項 5 5に記載の作成方法によって得られる抗体。

5 7 . 請求項 5 6記載の抗体を用いる非 B非 C非 G型肝炎ウィルス抗原の免疫学的検出方法。

5 8 . 配列番号 6 2記載の塩基配列にあるオープンリ一ディングフレームにコ一ドされるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列を有し、非 B非 C非 G型肝炎ウィルス中和抗体のェピト一プ配列を含むポリべプチドを含むワクチン。