JPH05176773A

JPH05176773A - オリゴヌクレオチド、オリゴペプタイド、ならびに抗ｃ型肝炎ウイルス抗体検出・鑑別方法

Info

Publication number: JPH05176773A
Application number: JP36148891A
Authority: JP
Inventors: Hiroaki Okamoto; 宏明岡本; Tetsuo Nakamura; 徹雄中村
Original assignee: IMUNO JAPAN KK
Current assignee: IMUNO JAPAN KK
Priority date: 1991-12-27
Filing date: 1991-12-27
Publication date: 1993-07-20
Also published as: CA2086162A1; EP0554624A1

Abstract

(57)【要約】（修正有）【構成】配列番号３または４記載のオリゴペプタイドの
１種または２種以上を抗原として使用する抗Ｃ型肝炎ウ
イルス抗体の検出・鑑別方法。オリゴペプタイドは、化
学合成によって得ることができ、配列番号１または２記
載のオリゴヌクレオチド、その他これをコードするオリ
ゴヌクレオチドを宿主細胞に組み込んで発現させて得る
こともできる。【効果】抗ＨＣＶ抗体のサブタイプを簡易、迅速、確実
かつ大量的に検出・鑑別し、ＨＣＶ肝炎の治療、予防、
感染経路の追跡、ワクチンの開発等に広く応用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、オリゴヌクレオチド、
ポリゴペプタイド、ならびにこれを抗原として使用する
抗Ｃ型肝炎ウイルス抗体（以下「抗ＨＣＶ抗体」とい
う）検出法、抗ＨＣＶ抗体サブタイプ鑑別方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】ウイルスに由来する肝炎には、既に病原
体が解明されその診断法や予防法が確立したものとして
Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎がある。これ以外は一括して、非Ａ
非Ｂ型肝炎（以下「ＮＡＮＢ型肝炎」という）と呼ばれ
てきた。日本における輸血後肝炎は、Ｂ型肝炎の検出法
が輸血血液のスクリーニングに導入された後は格段に減
少したが、なお、年間推定２８万例が、ＮＡＮＢ肝炎ウ
イルスにより発症していると考えられてきた。

【０００３】近年、ＮＡＮＢ肝炎ウイルス肝炎は、タイ
プ別にＣ型、Ｄ型、Ｅ型と命名され、その病原体につい
ての研究が進展し、撲滅に向けての努力が世界的に進め
られるようになった。輸血後肝炎に関して、１９８８年
アメリカのカイロン社がＣ型肝炎ウイルス（以下「ＨＣ
Ｖ」という）のＲＮＡウイルスゲノムのクローン化に成
功したと発表し、これを基に組換え体を用いた抗ＨＣＶ
抗体（Ｃ１００−３抗体）のＥＬＩＳＡ法測定系を開発
した。現在、Ｃ１００−３抗体測定系は、輸血血液のス
クリーニングや肝疾患患者の診断に、日本を始めとして
各国で用いられている。このＣ１００−３抗体は急性お
よび慢性ＮＡＮＢ型肝炎の多くの症例との間に関連性が
認められ、全世界人口の約１％がこれに感染していると
推定される。しかし、ＮＡＮＢ型慢性肝炎の捕捉率は約
７０％にすぎず、また急性Ｃ型肝炎における早期の診断
が困難である等重大な問題点が残されている。したがっ
て、カイロン社の前記開発によってもＮＡＮＢ型肝炎へ
の対処は依然として解決されていない。

【０００４】Ｃ１００−３抗体に関連するＮＡＮＢ型肝
炎ウイルス、すなわちＨＣＶはプラスの一本鎖ＲＮＡを
持ち、その遺伝子構造からフラビウイルスやペスティウ
イルスとの関連性が推定されている。それらウイルスの
ゲノム構造比較により、コア（核）蛋白、エンベロープ
（外殼）蛋白、非構造蛋白のそれぞれをコードすると推
定される領域がＨＣＶにも認められ、ＨＣＶ抗体ＥＬＩ
ＳＡはこのうち非構造蛋白の一部（ＮＳ３／ＮＳ４境界
領域）に対する抗体を検出していると考えられている。

【０００５】ＮＡＮＢ型肝炎の経過は不良であり、水平
感染によっても持続感染化（キャリア化）し、慢性肝炎
に進展することが確認されている。また、肝硬変、肝が
んへ進展するケースも多いと予想され、一日も早くウイ
ルス本体の全貌を解明し、診断法、治療法、予防法を確
立することが望まれている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記のようにカイロン
社のＨＣＶ抗体検出キット（Ｃ１００−３抗体検出系）
では捕捉されないＮＡＮＢ型肝炎が多数存在する。この
ことから、ＨＣＶ感染の判別診断には、カイロン社の前
記検出キットのような非構造蛋白に対する抗体では不充
分であり、コア蛋白そのものに対する抗体を検出する事
が重要であるとの考え方があり、コア領域の遺伝子、お
よびこれにコードされる蛋白質の研究が盛んに行われて
いる。

【０００７】ところが、種々のＨＣＶ−ＲＮＡを単離
し、その塩基配列を比較すると、保存性の高いコア領域
においても１０％以上異なるＨＣＶ株が見いだされた。

【０００８】また、ワクチン開発に重要なエンベロープ
領域においてはさらに変異が著しく、塩基の相同性が６
０％以下を示す株も少なからず存在する事が明らかにな
った。これら株間の変異の原因はＨＣＶがＲＮＡウイル
スであるためと考えられる。

【０００９】したがって、ＨＣＶをいくつかのタイプ
（サブタイプ）に分類することができるならば、診断、
治療、予防のうえで極めて有益である。すなわち、ＨＣ
Ｖをサブタイプに分類することにより、垂直感染（母児間感染）、水平惑染における感染経路
を解明できる、サブタイプ別に肝炎の進行状況、症状の特色等を追跡
することができ、予後を予測したり、治療の指針とする
ことができる、サブタイプ間の塩基配列、アミノ酸配列の異同を解明
し、核酸検出系または抗体検出系によるＨＣＶの検出率
を高める、変異の著しいエンベロープ領域中に、サブタイプに特
異的な共通配列を見いだすことにより、サブタイプに特
異的な免疫グロブリン（ｌｇＧ）やワクチンを製造する
ことができる。投与対象のサブタイプを判別することにより、これに
投与すべきｌｇＧやワクチンを選択でき、効果的な予防
手段を直ちに講ずることができる、等の応用を行うことができるので、その医学的、社会的
意義はきわめて大きい。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＮＡＮＢ
型肝炎の検出方法、治療、予防、感染経路判定ならびに
疫学調査に有用なＨＣＶのサブタイプ鑑別方法、ならび
にこれに用いるオリゴヌクレオチド、これを産生させる
オリゴヌヌクレオチドを見いだすために、ヒト及びチン
パンジーキャリアの血清より種々のＨＣＶのＲＮＡを単
離し、非コード領域およびコア蛋白質、エンベロープ蛋
白質をコードする領域を含む遺伝子のｃＤＮＡをクロー
ン化してその塩基配列を決定した（特願平３−１９６１
７５号、および特願平３−２８７４０２号）。その結
果、ＨＣＶゲノムは、比較的保存性の高いと考えられて
きたコア領域においてすらグループに特徴的な塩基配列
の変異が認められ、さらにエンベロープ領域では変異が
著しいことが明らかとなった。

【００１１】本発明者らは、数多くのＨＣＶゲノムにつ
いて研究を進めることにより、コア領域における塩基配
列を基準として分類することにより、ＨＣＶをいくつか
のグループに分別しうるとの見解に達した。

【００１２】本発明者らは、上記の見解にもとづいてＨ
ＣＶのサブタイプに関して更なる研究を進めた結果、Ｈ
ＣＶが塩基配列の相同性から４種のサブタイプに分類し
うることを解明し、各サブタイプに特異的な配列を、特
異プライマーを用いたＰＣＲ法で遺伝子を増幅すること
により、サブタイプを簡便かつ確実に鑑別する方法を確
立した（特願平３−３０７２９６号）。以下、ＰＣＲ法
により鑑別されたサブタイプをジェノタイプ（ｇｅｎｏ
ｔｙｐｅ）という。

【００１３】本発明者らの前記鑑別方法を適用すること
により、ＨＣＶゲノムは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｉ
Ｖ型の４種に重複なく分類されることが解明された。

【００１４】前記鑑別法により本発明者らが解明したＨ
ＣＶゲノム、およびカイロン社ＨＣＶゲノム（ＨＣＶ−
１）のアミノ酸配列を解析した結果、Ｉ型とＩＩ型は、
コア領域で９８％、エンベロープ領域で７９％の相同性
を有し、またＩＩＩ型とＩＶ型は、コア領域で９５％、
エンベロープ領域で７１％の相同性を有していた。これ
に反し、Ｉ型とＩＶ型、ＩＩ型とＩＩＩ型の相同性を調
べたところ、コア領域ではいずれも９１％、エンベロー
プ領域にいたっては５４％、５３％といずれも低いこと
が判明した。その結果、４種のサブタイプは大きく２群
に分類され、Ｉ型とＩＩ型、ＩＩＩ型とＩＶ型が各々近
縁であることが解明された。

【００１５】本発明者は、ＮＡＮＢ型肝炎患者およびＨ
ＣＶキャリアの保有するＨＣＶのサブタイプを一層簡便
に鑑別、かつ大量的にするため、血清学的な方法によっ
てサブタイプ特異的な抗体を検出する方法を確立し、本
発明を完成した。

【００１６】本発明は、次のようにして完成された。本
発明者らは、まずヒトおよびチンパンジーより得た血
清、血漿検体よりＨＣＶ−ＲＮＡを単離し、そのｃＤＮ
Ａのコア領域の塩基配列を決定し、それによってコード
されるアミノ酸配列を明らかにした。つぎに、特願平３
−３０７２９６号に記載したＰＣＲ法によるサブタイプ
鑑別方法により、各ＨＣＶゲノムを４種のサブタイプに
分類し、コア領域の中でＩ、ＩＩ型の群とＩＩＩ、ＩＶ
型の群の間でアミノ酸配列の異なる部分を特定し、これ
を抗原として利用することによって、ＨＣＶ抗体を検
出、鑑別する本発明の方法を確立した。

【００１７】すなわち、Ｉ、ＩＩ型の群と、ＩＩＩ、Ｉ
Ｖ型の群とでは、コア領域の６５番目にあたるイソロイ
シンから８１番目にあたるチロシンまでの１７アミノ酸
中で７アミノ酸が異っている。この事実にもとづき、配
列番号３記載のオリゴペプタイドＣＰ−ＴＹＰＥ−１Ｉ
ｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ
−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒおよび、配列番号４
記載のオリゴペプタイドＣＰ−ＴＹＰＥ−２Ｉｌｅ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｔｈ
ｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒを各々合成した。（なお、下線部分はＣＰ−ＴＹＰＥ
１、２間で異なるアミノ酸部分である。）

【００１８】本発明者らは、上記ＣＰ−ＴＹＰＥ−１お
よび２を各々抗原とする２種類の抗体検出ＥＬＩＳＡ法
（ＴＹＰＥ−１、ＴＹＰＥ−２）を作製した。

【００１９】上記の血清、血漿を２種類のＥＬＩＳＡ法
にて抗体の測定を行ったところ、抗体価が十分に高く
（吸光度０．３以上）、かつＴＹＰＥ−１とＴＹＰＥ−
２の吸光度の比率が４以上を示した１９例では、全例で
ＰＣＲ法による鑑別結果と一致した。これにより、本鑑
別方法により高い確率で抗体のサブタイプを鑑別し得る
ことが明らかとなった。

【００２０】本発明の方法では、前記抗体価が十分に高
く、かつＴＹＰＥ−１の吸光度の比率が４以上のサブタ
イプをセロタイプ１とし、抗体価が十分に高く、かつＴ
ＹＰＥ−２の吸光度の比率が４以上のサブタイプをセロ
タイプ２という。セロタイプ１にはジェノタイプＩ型お
よびＩＩ型が含まれ、セロタイプ２にはジェノタイプＩ
ＩＩ型およびＩＶ型が含まれる。

【００２１】かくして、本発明は、配列番号１記載の塩
基配列を有するオリゴヌクレオチドＣＮ−ＴＹＰＥ−
１、配列番号２記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドＣＮ−ＴＹＰＥ−２、配列番号３記載のアミノ酸配
列を有するオリゴペプタイドＣＰ−ＴＹＰＥ−１、配列
番号４記載のアミノ酸配列を有するオリゴペプタイドＣ
Ｐ−ＴＹＰＥ−２、化学合成により得られる請求項第３
項または第４項記載のオリゴペプタイド、配列番号３ま
たは４記載のオリゴペプタイドのアミノ酸配列をコード
するオリゴヌクレオチドを宿主細胞に組み込んで発現さ
せて得るオリゴペプタイド、請求項第３項ないし第６項
記載のオリゴペプタイドの１種または２種以上を抗原と
して使用する抗Ｃ型肝炎ウイルス抗体の検出方法、請求
項第３項ないし第６項記載のオリゴペプタイドの１種ま
たは２種以上を抗原として使用する抗Ｃ型肝炎ウイルス
抗体のサブタイプ鑑別方法、の発明である。

【００２２】請求項第１項記載のオリゴヌクレオチド
は、ジェノタイプＩ型、ＩＩ型がコア領域に共通に有す
るが、ＩＩＩ型、ＩＶ型が有しない塩基配列のオリゴヌ
クレオチドであり、請求項第２項記載のオリゴヌクレオ
チドは、ジェノタイプＩＩＩ型、ＩＶ型がコア領域に共
通に有するが、Ｉ型、ＩＩ型が有しない塩基配列のオリ
ゴヌクレオチドである。

【００２３】請求項第６項記載のオリゴヌクレオチド
は、もとより請求項第１項、第２項記載のオリゴヌクレ
オチドを大腸菌その他の宿主細胞に組み込んで発現させ
て得ることができるがその他配列番号３または４記載の
オリゴペプタイドのアミノ酸配列をコードするオリゴヌ
クレオチドを宿主細胞に組み込んで得ることができる。

【００２４】日本のＨＣＶゲノムをサブタイプに分類す
ると、無症候性キャリア（健常人）群ではＩＩ型が８２
％と圧倒的に高く、次いでＩＩＩ型が１０％、Ｉ型とＩ
Ｖ型がいずれも４％である。これに反し、肝疾患患者群
では、健常人群とサブタイプの分布が有意に異なり、Ｉ
Ｉ型が６０％、ＩＩＩ型が２３％という結果であった
（特願平３−３０７２９６号）。このように肝炎発症の
危険性がＨＣＶサブタイプにより有意に異なることか
ら、本発明の鑑別方法は肝炎の治療、予防、予後の予測
のうえでも有用であることが示された。

【００２５】本発明の鑑別方法が肝炎の治療、予防、予
後の予測に有用であることは、前記したとおりである
が、さらにＨＣＶ重複感染の確認や感染経路の追跡を行
うことができる。

【００２６】さらに、本発明の方法が、ＰＣＲ法による
ジェノタイプ鑑別方法より優れている点は、技術的に
より簡便である、検出時間が早く多数検体を処理する
のに適する、ＨＣＶ感染の既往のある例、すなわちＨ
ＣＶキャリアでなく、ゲノムが既に存在しない例でも、
血液中に産生されているコア抗体からサブタイプを特定
できる、等が挙げられ、応用範囲が広い。

【００２７】

【作用】本発明の検出・鑑別方法は、抗ＨＣＶ抗体のサ
ブタイプを簡便かつ迅速、確実に検出することができ、
また、本発明のポリペプタイドは抗ＨＣＶ抗体のサブタ
イプ鑑別方法に供することができる。本発明の方法がＨ
ＣＶサブタイプ特異的な抗体を確実に検出することがで
きることから、抗体検出系の感度を向上させ得る。また
サブタイプ特異性の高いＩｇＧ、ワクチンの開発、およ
びその投与方法の確立等、応用範囲がきわめて広い。

【００２８】本発明の請求項第３項ないし第５項記載の
オリゴペプタイドは、いずれも本発明の検出方法、鑑別
方法において抗原として使用することができる。

【００２９】本発明の請求項第１項、第２項記載のオリ
ゴヌクレオチドは、これを大腸菌その他の宿主細胞に組
み込んで、本発明のオリゴペプタイドを得ることができ
る。

【００３０】

【実施例】以下、本発明の実施例について述べるが、も
とより本発明の範囲がこれら実施例に限定されるもので
はない。

【００３１】実験例ＰＣＲ法によるサブタイプ決定方法（１）ＲＮＡ抽出オーソＨＣＶＡｂＥＬＩＳＡキット（オーソ・ダイアグ
ノスティック・システムズ社）によりＨＣＶ抗体陽性と
判定されたヒト血清および血漿検体から次のようにして
ＲＮＡを抽出した。血清または血漿にトリス塩酸緩衝液
（１０ｍＭ、ｐＨ８．０）を加え、６８×１０^３ｒｐｍ
で１時間遠心した。得られたペレットに２００ｍＭＮ
ａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ２％（ｗ／ｖ）ドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および１ｍｇ／ｍｌのプロテ
ナーゼＫを含むトリス塩酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．
０）を加え、６０℃で１時間加温し、フェノール／クロ
ロホルムで抽出した後、エタノール沈澱を行い、ＲＮＡ
を得た。

【００３１】（２）ポリメラーゼチェインリアクション
（ＰＣＲ）法による増幅上記（１）で得られたＲＮＡを７０℃で１分間加熱変性
させ、これを鋳型として合成プライマー＃１８６（５′
−ＧＣＣＧＡＣＣＴＣＡＴＧＧＧＧＴＡＣＡＴ−３′、
ｎｔ３９１−４１０：アンチセンス）と逆転写酵素Ｓｕ
ｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（ＢＲＬ社；アメリカ）とを用いて
ｃＤＮＡを合成しサブタイプ鑑別ＰＣＲに供した。ＰＣ
Ｒの反応サイクルは、変性（９４℃ １分間）、プライ
マーのアニール（６０℃ １分間）およびプライマーの
伸長（７２℃ １分３０秒）の工程で行い、第１段階、
第２段階とも３０サイクル繰り返した。反応生成物は
１．５％ＮｕＳｉｅｖｅと１．５％ＳｅａＫｅｍ（いず
れもＦＭＣ社）の混合アガロースゲルで電気泳動し、臭
化エチジウム染色の後、紫外線照射したバンドを確認し
た。第１段階ＰＣＲはサブタイプ共通プライマーの＃２
５６（５′−ＣＧＣＧＣＧＡＣＴＡＧＧＡＡＧＡＣＴＴ
Ｃ−３′、ｎｔ１３９〜１５８、センス）と＃１８６で
ｎｔ１３９−４１０の２７２塩基を増幅し、得られた反
応生成物の５０分の１量を第２段階ＰＣＲにかけた。第
２段階はセンスプライマーとして共通プライマーの＃１
０４（５′−ＡＧＧＡＡＧＡＣＴＴＣＣＧＡＧＣＧＧＴ
Ｃ−３′、ｎｔ１４８−１６７：センス）を、アンチセ
ンスプライマーとしてサブタイプ特異的プライマーの＃
１３２（５′−ＧＴＣＡＧＣＣＴＡＴＣＣＣＣＡＡＧＧ
ＣＡ−３′、ｎｔ１８５−２０４：アンチセンス）、＃
１３３（５′−ＴＧＧＧＧＴＧＧＧＣＡＧＧＡＴＧＧＣ
ＴＣ−３′、ｎｔ２７２−２９１：アンチセンス）、＃
１３４（５′−ＧＡＧＧＴＴＣＣＣＧＴＣＣＣＴＣＴＴ
ＧＧ−３′、ｎｔ３０２−３２１：アンチセンス）、＃
１３５（５′−ＣＴＣＴＧＴＡＣＧＧＡＡＡＣＧＡＧＧ
ＧＴ−３′、ｎｔ２５１−２７０：アンチセンス）を等
量混合して加え、得られた反応生成物について電気泳動
でバンドを確認し、＃１３２〜１３５のいずれのプライ
マーによって増幅されたものであるかを判定した。サブ
タイプは、使用したアンチセンスプイラマー＃１３２、
＃１３３、＃１３４、＃１３５によって増幅されるサブ
タイプをそれぞれＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型とし
た。

【００３２】実施例１ペプタイドの製造Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相法に基づき、ペプタイドの
Ｃ末端のアミノ酸をまず架橋ポリスチレンに縮合させ、
ついでＮ末端の方向へ向かってｔ−プトキシカルボニル
アミノ酸を１個づつ順次縮合させてゆき、アミノ酸配列
がＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−
Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ＣＰ−ＴＹＰ
Ｅ−１、配列番号３）およびＧｌｎ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−
Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｔ
ｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙ
ｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ＣＰ−ＴＹＰＥ−２、配
列番号４）を合成した。合成後、６Ｎ−ＨＣｌ、１１０
℃、２４時間減圧下で加水分解し、アミノ酸組成を確認
した。

【００３３】実施例２抗ＨＣＶ抗体測定系測定系は、ポリビニルマイクロタイタープレートを用
い、サンドイッチ法ＥＩＡにて作製した。プレートの固
相は、実施例１で作製した合成ペプタイドＣＰ−ＴＹＰ
Ｅ−１、およびＣＰ−ＴＹＰＥ−２を用いた。１０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に各ペプタイドを５μｇ／
ｍｌの濃度で溶解させた溶液５０μｌを、ＥＬＩＳＡ用
マルチプレート（９６穴、ＧＲＥＩＮＥＲ社）の各ウェ
ルに注入し、室温にて１晩静置した。０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０を含む生理食塩水で洗浄した後、４０％（ｖ／
ｖ）牛血清１００μｌを入れ、室温３０分静置後、残り
を捨てた。

【００３４】検体の測定は、一次反応として、各ウェル
につき４０％牛血清、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む
生理食塩水５０μｌを入れた後、検体１０μｌを加え、
室温で１時間振盪した。反応終了後、上記と同じ手順で
洗浄を５回行った。二次反応は、標識抗体としてＨｏｒ
ｓｅｒａｄｉｓｈ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識マウス抗
ヒトＩｇＧモノクローナル抗体１ｎｇを牛血清５０μｌ
に溶解した液を加え、室温１時間振盪し反応させた。洗
浄は上記と同じ手順で５回洗浄し、その後、基質として
過ホウ酸ナトリウム、発色剤としてｏ−フェニレンジア
ミン溶解液５０μｌを室温３０分反応させた後、４Ｎ硫
酸５０μｌを加えて反応を停止させ、４９２ｎｍにおけ
る吸光度を測定した。

【００３５】抗ＨＣＶ抗体サブタイプの判定基準は、Ｃ
Ｐ−ＴＹＰＥ−１の吸光度（以下「吸光度」とする）
とＣＰ−ＴＹＰＥ−２の吸光度（以下「吸光度」とす
る）の何れかが０．３以上で、かつ吸光度／吸光度
の比率が４以上の場合をセロタイプ１と判定し、吸光度
との何れかが０．３以上で、かつ吸光度／吸光度
の比率が０．２５以下の場合をセロタイプ２と判定し
た。なお、この判定基準は、実施例において採用したも
のであって、この判定基準そのものは本発明を構成する
必須要件となるもののではない。

【００３６】実施例３本発明のＨＣＶサブタイプ鑑別方法が疫学的な調査に有
用であることを確認するため、肝炎発症率の高い地域に
おける住民の血清検体を用いてセロタイプの鑑別を行っ
た。肝炎の発症率の高い地域（Ａ〜Ｔ）の住民の血清検
体について、実施例２の方法を用いてＨＣＶサブタイプ
を鑑別した。その結果、表１に示す如く、９４検体のサ
ブタイプを鑑別することができ、セロタイプ１：５６検
体（６０％）、セロタイプ２：３８検体（４０％）であ
ることが判明した。

【００３７】

【表１】

【００３８】また、これらの検体から、ランダムに１７
検体選び、実験例の方法に従ってＲＮＡを抽出し、ＨＣ
Ｖゲノムのジェノタイプ鑑別を行った。その結果、表２
に示す如く、セロタイプの鑑別結果と全く一致した。こ
のように、本発明のＨＣＶサブタイプ鑑別方法が、ＰＣ
Ｒ法によるジェノタイプ判定法の結果とよく一致するう
え、大量の検体について簡便に鑑別できる方法であり、
非常に有用であることが明らかとなった。

【００３９】

【表２】

【００４０】

【発明の効果】本発明の検出・鑑別方法によれば、抗Ｈ
ＣＶ抗体のサブタイプを簡易、迅速、確実、かつ大量的
に検出することができ、これらの点でＰＣＲ法によるジ
ェノタイプ鑑別方法より優れる。本発明の方法は、ＨＣ
Ｖの治療、予防、予後の予測や重複感染の確認、感染経
路の追跡に有用であり、さらにサブタイプ特異性の高い
ＩｇＧ、ワクチンの開発、投与方法の確立等の広い応用
範囲を有する。本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴペ
プタイドは、本発明の検出・鑑別方法に直接、間接に用
いられる。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｋ 7/08 ＺＮＡ 8318−4ＨＧ０１Ｎ 33/576 Ｚ 9015−2Ｊ // Ｃ０７Ｋ 99:00

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１記載の塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドＣＮ−ＴＹＰＥ−１。
【請求項２】配列番号２記載の塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドＣＮ−ＴＹＰＥ−２。
【請求項３】配列番号３記載のアミノ酸配列を有するオ
リゴペプタイドＣＰ−ＴＹＰＥ−１。
【請求項４】配列番号４記載のアミノ酸配列を有するオ
リゴペプタイドＣＰ−ＴＹＰＥ−２。
【請求項５】化学合成により得られる請求項第３項また
は第４項記載のオリゴペプタイド。
【請求項６】配列番号３または４記載のオリゴペプタイ
ドのアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドを宿
主細胞に組み込んで発現させて得るオリゴペプタイド。
【請求項７】請求項第３項ないし第６項記載のオリゴペ
プタイドの１種または２種以上を抗原として使用する抗
Ｃ型肝炎ウイルス抗体の検出方法。
【請求項８】請求項第３項ないし第６項記載のオリゴペ
プタイドの１種または２種以上を抗原として使用する抗
Ｃ型肝炎ウイルス抗体のサブタイプ鑑別方法。