WO1999009062A1 - Cell chemotactic factor (cctf) originating in mammalian tooth precement or cement, method for purifying the same, and novel connective tissue adhesion promoters containing the same as the active ingredient - Google Patents

Cell chemotactic factor (cctf) originating in mammalian tooth precement or cement, method for purifying the same, and novel connective tissue adhesion promoters containing the same as the active ingredient Download PDF

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purifying
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Masanobu Munekata
Kazuaki Nishimura
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Kanebo Ltd
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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Definitions

  • CCT cement chemotactic factor
  • the present invention relates to a cell chemotactic factor (CCTF) derived from mammalian pre-cementum and Z or cementum, a method for purifying the same, and a new method for preparing teeth, gingiva and (root and periodontal ligament) using the same as an active ingredient.
  • CCTF cell chemotactic factor
  • Periodontal disease is an inflammatory disease in which plaque (a mass of bacteria) destroys the supporting tissues of the teeth (gingiva, periodontal ligament, alveolar bone). In the dental field, it is said to be two major diseases alongside caries. ing.
  • Severe periodontal disease requires surgical reconstruction of periodontal tissue. Its purpose is not only to remove periodontal pockets but also to restore occlusal function by regeneration of periodontal tissue destroyed by periodontal disease.
  • the typical surgical procedure currently performed is gingival exfoliation, but the postoperative healing method is based on the true adhesion between the root and the periodontal ligament (neoplastic tissue) Attachment) is limited to the apical side, and others are less than ideal attachment (epithelial attachment).
  • GTR method guided tissue regeneration technique
  • the outline of this method is as follows. That is, the pocket formed by periodontal disease is surgically resected, the flap is removed, and the contaminated cementum corresponding to the pocket is completely repelled. Then, cover the root surface with the membrane and suture the gingiva on the membrane You.
  • gingival fibroblasts (hereinafter referred to as new connective tissue adherent forming cells) are induced to migrate, adhere, proliferate, and differentiate, and around the root. It is necessary to form new cementum, obtain new connective tissue attachment, and to form alveolar bone.
  • An object of the present invention is to provide a substance that induces the migration, attachment, proliferation and differentiation of new connective tissue attachment-forming cells, and promotes the formation of new connective tissue attachment between teeth and gums (root and periodontal ligament).
  • the object of the present invention is attained by a mammalian tooth precement and Z or cementum-derived cell chemotactic factor (CCTF) having a molecular weight by SDS-PAGE of 6700 ⁇ 100. .
  • CCTF cementum-derived cell chemotactic factor
  • an object of the present invention is to extract a precementum and Z or cementum from a tooth extraction of a mammal, and to stir and infiltrate into physiological saline or a collagenase-containing physiological saline to obtain a molecular weight from an eluted component.
  • the object of the present invention is achieved by a novel connective tissue adhesion promoter containing the above-mentioned precement and Z or cement-derived cell chemotactic factor (CCTF) as an active ingredient.
  • CCTF cement-derived cell chemotactic factor
  • the present inventors have studied known cell adhesion factors, cell growth factors, etc. in order to solve the above-mentioned problems. As a result, none of them was good. Or have cell chemotaxis in cementum, and It has been found that there is a substance that invades, proliferates and differentiates synapse-attachment-forming cells to attract connective tissues.
  • CCTF novel cell chemotactic factor
  • Fig. 1 shows a preparative cement and a cementitious 1% collagenase-containing pH 7 physiological saline extract, TSK G3000 and TSK.G4000 preparative columns connected in series. It is an elution pattern.
  • Figure 2 shows the elution pattern obtained by mixing and concentrating the cell chemotaxis fractions with molecular weights of 270,000 to 290,000, 580,000 and 630,000 or more obtained in Fig. 1, and then performing DEAE ion exchange chromatography. is there.
  • Fig. 3 shows the elution profile obtained by desalting and concentrating the cell chemotactic activity fraction (Fr. No. 13) obtained in Fig. 2, and then performing HP LC hydroxyapatite chromatography. It is.
  • FIG. 4 shows a pattern obtained by measuring the molecular weight of the cell chemotaxis-active fraction (Fr. No. 14) CCTF obtained in FIG. 3 by SDS-PAGE (detection by silver staining).
  • FIG. 5 shows a western blotting pattern of CCTF using an anti-BSP-II antibody.
  • FIG. 6 shows a Western blotting pattern of CCTF using an anti-BMP-2 antibody.
  • the CCTF of the present invention is derived from pre-cement and / or cement of mammalian teeth.
  • the resulting glycoprotein has a molecular weight of 67,000 ⁇ 1,000 as determined by SDS-PAGE, has cell chemotaxis, and has the effect of promoting the formation of new connective tissue-adhering cells.
  • CCTF is not a cell adhesion factor, fibronectin (molecular weight: 450 Kd) or vitronectin (molecular weight: 76 Kd)
  • CCTF did not inhibit cell chemotactic activity with an antibody against each.
  • BSP obtained from cementum involved in gingival cell adhesion (molecular weight 33.6 Kd, about 60 Kd for sugar chain containing), BMP-2 involved in alveolar bone regeneration (30 K molecular weight) d) was proved to be different by Western blotting. It is known that bone regeneration involves TGF-3, PDGF (platelet-derived growth factor), etc. in addition to BSP-II and BMP-2. (3) The CCTF cell chemotactic activity was not inhibited by the antibody and the anti-PDGF antibody, indicating that CCTF was not TGF-; 3 or PDGF. It became clear that there was no such material.
  • a tooth extracted from a mammal is used.
  • mammals in particular, large numbers of animals are bred for edible purposes, etc., the population is large, the availability of teeth is easy, and the amount of CCTF obtained from a single tooth is large. It can be suitably used.
  • the purification method is performed, for example, as follows.
  • the precement and Z or cementum are replated with a sharp scaler, etc., and pH7 containing 0-5% collagenase is added. 0 ⁇ 0.5 Disperse in physiological saline (collagenase is not contained if only precement is used) and elute protein components by stirring. The insolubles are removed from the eluate by centrifugation, followed by filtration through a membrane filter. The filtrate is subjected to a molecular weight fractionation method such as gel filtration or ultrafiltration to obtain a fraction having a molecular weight of 270,000 or more.
  • a molecular weight fractionation method such as gel filtration or ultrafiltration to obtain a fraction having a molecular weight of 270,000 or more.
  • the membrane was washed with 50 ⁇ 5 mM Trisethanolamine hydrochloride buffer, and 0.2 to 0.3 M Collect the fractions eluted with 50 ⁇ 5 mM Trisethanolamine buffer containing sodium chloride, desalinate and concentrate.
  • the concentrated solution is adsorbed to hydroxyapatite equilibrated with 10 ⁇ ImM phosphate buffer at pH 6.6 ⁇ 0.3, washed with 10 ⁇ ImM phosphate buffer at ⁇ 6.6 ⁇ 0.3, and Collect fractions eluted with 11 OmM phosphoric acid.
  • the material thus obtained shows a single band of 67 SKd on SDS-PAGE.
  • the amino acid composition is Asp: 10.6 ⁇ 0.5%, Thr: 3.7, 0.3%, Ser: 13.3, 0.7%, G 1 u: 13.8 ⁇ 0. 7%, G 1 y: 23.3 ⁇ 1.2%, A la: 10.1 ⁇ 0.5%, Cys / 2: 3.6 ⁇ 0.3%, V a 1: 6.7 ⁇ 0.3%, I 1 e: 3.8 ⁇ 0.3%, Leu: 7.3 ⁇ 0.4%, Lys: 3.8 ⁇ 0.3%, sugars containing sugar chains It is a protein.
  • the isoelectric point is 6.5 ⁇ 0.5.
  • the glycoprotein obtained as described above is a substance having cell chemotaxis, and further has an action of promoting adhesion of new connective tissue.
  • a new connective tissue adhesion promoter for example, a collagen membrane, a gelatin membrane, or a shape impregnated in another biodegradable membrane, or Injection, application, subcutaneous injection, etc., are administered to the affected area.
  • the collagen film is placed between the gingival surface and the gingiva where contaminants are lubricated.
  • a method for promoting adhesion of new connective tissue after surgery by inserting a cell in which the cell chemotactic factor of the present invention is impregnated into a gelatin membrane or other biodegradable membrane. . By using in this way, it is possible to restore healthy periodontal tissue.
  • periodontal ligament fibers were removed as much as possible using a scaler to remove 40 teeth from the slaughtered cattle.
  • the cement containing the precement was dispersed in 20 ml of pH 7 physiological saline containing 1% collagenase using a sharp scaler. Portex After stirring with an (Automatic Mixer S-100, manufactured by Taitec) for 10 minutes, the protein component was eluted. Next, the insoluble matter was removed by centrifugation at 300 rpm for 5 minutes to obtain a supernatant. Filtration was performed using a 0.22 membrane filter (Durapore, Nippon Millipore), and the filtrate was concentrated to 4 ml (1 lmg of protein by Bradford method).
  • fractions A and B did not show TGF-3, BSP- ⁇ activity and were not inactivated by treatment at 60 ° C for 30 minutes.
  • Preliminary experiments showed that fractions A and B had the same molecular weight band on SDS-PAGE when purified by DEAE ion-exchange chromatography and droxapatite chromatography.
  • the solution is concentrated by ultrafiltration to 2 ml, adsorbed on a DEAE ion exchange resin (TSK • DEAE-3 SW, manufactured by Tosoh) at pH 7.5, and then adsorbed on a DEAE ion exchange chromatography (DEAE-3).
  • the amino acid composition of the obtained CCTF was Asp: 10.6%, Thr: 3.7%, Ser: 13.3%, G1u: 13.8%, G1y: 23.3%, A la: 10.1%, Cys / 2: 3.6%, Val: 6.7%, I 1 e: 3.8%, Leu: 7.3%, Lys : 3.8%, indicating a glycoprotein containing sugar chains.
  • the isoelectric point was 6.5 ⁇ 0.5.
  • periodontal ligament fibers were removed as much as possible using a scaler from the 40 teeth removed from the slaughtered cattle.
  • sharpen the pre-cement and cement with a sharp scaler It was dispersed in 20 ml of a pH 7 physiological saline containing 1% collagenase.
  • the protein component was eluted.
  • the insoluble matter was removed by centrifugation at 3000 rpm for 5 minutes to obtain a supernatant, which was then filtered through a 0.45 pore size membrane filter (Durapore, Nippon Milli pore). The filtrate was concentrated with a 200,000 ultrafiltration membrane having a molecular weight cut off to 4 ml.
  • the concentrated fraction was subjected to hydroxyapatite chromatography (1 Omm x 10 cm in length, manufactured by Koken Co., Ltd.) equilibrated with 1 OmM phosphate buffer at pH 6.6 to obtain 0 to 20 OmM phosphate phosphate.
  • the fractions eluted with 80 to 11 OmM phosphoric acid were collected and desalted and concentrated to obtain 730 ng of CCTF.
  • the material thus obtained showed a single 67 klk band on SDS-PAGE.
  • a 5% collagen solution (type I_A) was prepared, and 600 ng of the above-mentioned CCTF was added thereto, mixed, poured into a thickness of 2 mm, and freeze-dried to prepare a CCTF-containing collagen membrane. This was UV sterilized for 2 hours immediately before use.
  • the monkey's upper left and right incisors and the gingival flap on the labial side of the incisor are turned around and the alveolar bone is removed about 4 mm in the apical direction, the roots are exposed, and the cementum on the surface is removed.
  • the exposed root surface on the left side was covered with a collagen membrane containing CCTF, and on the right side, the gingival flap was put back and sutured with the exposed root surface unchanged. Plaque control was performed daily for 3 weeks after surgery until healing was observed. After 3 weeks of sacrifice, fixation by port flow, tissue block was collected, paraffin sections were prepared, HE staining was performed, and histological observation was performed. The formation of connective tissue attachment was observed. Alveolar bone formation was also observed. On the other hand, none were found on the right. Industrial applicability
  • the invention according to claim 1 provides a CCTF that is applicable to a periodontal tissue defect by promoting the formation of new connective tissue attachment and restoring healthy periodontal tissue. Things.
  • the CCTF of the present invention can be efficiently extracted and purified by the purifying method of the present invention according to claim 4.
  • invention according to claim 7 can provide an agent that promotes formation of new connective tissue attachment between teeth and gums (root and periodontal ligament).

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Description

明細書 哺乳類の歯のプレセメント質及び Z又はセメント質由来細胞走化性因子 （C C T F ) 、 その精製法及びそれを有効成分とする新結合組織付着促進剤 技術分野
本発明は、 哺乳類の歯のプレセメント質及び Z又はセメント質由来の細胞走化 性因子 （C C T F ) 、 その精製法及びそれを有効成分とする歯と歯肉と （歯根と 歯根膜と） の新結合組織付着の形成を促進する薬剤に関する。 背景技術
歯周病とは、 歯垢 （細菌の塊） が歯の支持組織 （歯肉、 歯根膜、 歯槽骨） を破 壊する炎症性疾患であり、 歯科領域において、 虫歯と並んで 2大疾患といわれて いる。
歯周病のうち重度のものは、外科的手法による歯周組織の再構築が必要となる。 その目的は、 歯周ポケットの除去のみならず、 歯周病により破壊された歯周組織 の再生による咬合機能の回復にある。 現在行われて ^る代表的な手術法は歯肉剥 離搔爬術であるが、 術後の治癒様式は、 セメント質の新生を伴った、 歯根と歯根 膜との真の付着 （新結合組織付着） はごく根尖側に限局しており、 他は理想的な 付着とは言えない （上皮性の付着） 。
このような背景から、 近年、 新結合組織付着を積極的に獲得するため種々の方 法が試みられている。 中でも、 歯周組織再生誘導法（Guided tissue regeneration technique： G T R法） が注目を集めている。 この G T R法は、 治癒しつつある歯 周組織の欠損部に歯肉上皮や歯肉真皮の細胞が入り込まないようにすることによ つて、 そこに新しい結合組織付着と歯槽骨を作れる細胞を増殖させて歯周組織を 再生させようとする方法のことである。
この方法を概説すると、 次のようになる。 すなわち、 歯周病によって形成され たポケットを外科的に切除、 歯肉弁を剥離し、 ポケットに対応する汚染セメント 質を完全に搔爬する。 その後、 歯根面を膜で覆い、 歯肉を膜の上において縫合す る。
上記方法において、健全な歯周組織を再生させるためには、歯肉線維芽細胞（以 下、 新結合組織付着形成細胞と記す） の移動、 付着、 増殖及び分化を誘導し、 歯 根の周りに新生セメント質を形成させ、 新結合組織付着を得ること、 更には、 歯 槽骨の形成させることが必要である。
しかし、 現在一般的に行われている歯周病の治療法では、 新結合組織付着及び 歯槽骨の形成が不完全である。
本発明の目的は、 新結合組織付着形成細胞の移動、 付着、 増殖及び分化を誘導 し、 歯と歯肉と （歯根と歯根膜と） の新結合組織付着の形成を促進する物質を提 供すること、 また、 これを単離精製する方法を提供すること、 更には、 これを有 効成分とする、 歯周病に羅患した歯の健全な歯周組織を回復させるために用いら れる、 新結合組織付着の形成を促進する薬剤を提供することにある。 発明の開示
本発明の目的は、 S D S— P A G Eによる分子量が 6 7 0 0 0 ± 1 0 0 0であ る哺乳類の歯のプレセメント質及び Z又はセメント質由来細胞走化性因子 （C C T F ) により達成される。
また、 本発明の目的は、 哺乳類の抜歯からプレセメント質及び Z又はセメント 質を採取し、 生理食塩水中又はコラゲナ一ゼ含有生理食塩水中に撹拌浸析するこ とにより得られる溶出成分から、 分子量分画、 イオン交換吸着クロマトグラフィ —、ハイドロキシァパタイト吸着クロマトグラフィーにより S D S—P A G E に よる分子量 6 7 0 0 0土 1 0 0 0のプレセメント質及び Z又はセメント質由来 細胞走化性因子 （C C T F ) を精製する方法によって達成される。
また、 本発明の目的は、 上記のプレセメント質及び Z又はセメント質由来細胞 走化性因子 （C C T F ) を有効成分として含有する新結合組織付着促進剤によつ て達成される。
本発明者らは、 上記課題を解決すべく、 既知の細胞接着因子、 細胞成長因子等 について検討したところ、 良好なものはなく、 更に研究を進めた結果、 哺乳類の 歯のプレセメント質及び Z又はセメント質中に、 細胞走化性を有し、 また、 新結 合組織付着形成細胞を侵入、 増殖及び分化させて結合組織に誘引する物質が存在 することを見出した。
また、 哺乳類の抜歯から採取したプレセメント質及び Z又はセメント質を生理 食塩水中又はコラゲナーゼ含有生理食塩水中に撹拌浸折し、 得られた溶出成分か ら、 分子量分画、 イオン交換吸着クロマトグラフィー、 ハイドロキシアパタイト 吸着クロマトグラフィーを行うことにより、 新規な細胞走化性因子 （以下、 CC TFと記す） を精製することが可能であることを見出し、 本発明に到達した。 また、 上記 CCTFを有効成分とする、 歯周病に羅患した歯の健全な歯周組織 を回復させるために有用な、 新結合組織付着の形成を促進する薬剤を見出した。 図面の簡単な説明
第 1図は、 プレセメント質及びセメント質の 1 %コラゲナーゼ含有 pH 7生理 食塩水抽出物の TSK · G3000と TSK. G4000分取用カラムを直列に つなぎ HP L Cゲル濾過ク口マトグラフィーを行った溶出パターンである。 第 2図は、 第 1図で得られた分子量 27〜 29万、 58万及び 63万以上の細 胞走化活性分画を混合濃縮後、 D E A Eイオン交換クロマ卜グラフィ一を行った 溶出パターンである。
第 3図は、 第 2図で得られた細胞走化活性分画 （ F r . No. 13) を脱塩濃 縮後、 HP LCハイドロキシァパタイトク口マトグラフィーを行った溶出パ夕一 ンである。
第 4図は、 第 3図で得られた細胞走化活性分画 （F r. No. 14) CCTF を SDS— PAGEで分子量を測定したパターンである （検出は銀染色） 。
第 5図は、 抗 BS P— Π抗体を用いた CCTFのウェスタンプロッティングの パターンである。
第 6図は、 抗 BMP— 2抗体を用いた CCTFのウエスタンプロッティングの パターンである。 発明を実施するための最良の形態
本発明の CCTFは、 哺乳類の歯のプレセメント質及び/又はセメント質から 得られる、 SDS— PAGE による分子量が 67000 ± 1000の糖蛋白質 であり、細胞走化性を有し、新結合組織付着細胞の形成を促進する作用を有する。 この CCTF力 細胞接着因子であるフイブロネクチン（分子量 450Kd)、 ビトロネクチン (分子量 76Kd)でないことは、 CCTFがそれぞれに対する抗 体で細胞走化活性が阻害されなかつたことから証明された。
更に、 歯肉細胞の接着に関与するセメント質より得られた BSP— Π(分子量 33. 6 Kd、糖鎖含有では約 60 Kd)、歯槽骨の再生に関与する BMP— 2 (分 子量 30 K d ) とはウエスタンブロッテイングにより異なることが証明された。 また、 骨の再生には、 BSP— Π、 BMP— 2以外に、 TGF— 3、 PDGF (血小板由来成長因子） 等が関与していることが知られているが、 これらの抗体 すなわち抗 T G F - 3抗体および抗 P D G F抗体によって、 CCTFの細胞走化 活性が阻害されないことから、 CCTFは TGF— ;3や PDGFではないことが 判明し、 現在までに報告されている細胞接着因子、 細胞成長因子に該当する物資 がないことが明らかになった。
本発明の CCTFを得るためには、 哺乳類から抜去した歯を使用する。 哺乳類 の中でも特に、 食用目的等で大量に飼育されており個体数が多いこと、 歯の入手 が容易であること及び 1本の歯から得られる CCTFの量が多いことから、 ゥシ の歯が好適に使用できる。
その精製法は、 例えば、 以下のようにして行う。
即ち、 抜去した歯からスケ一ラ一等で歯根膜繊維を除去した後、 鋭利なスケー ラ一等でプレセメント質及び Z又はセメント質を搔爬、 0〜 5%コラゲナ一ゼ含 有の pH7. 0±0. 5生理食塩水中に分散 （プレセメント質のみの場合はコラ ゲナーゼ不含有） し、 撹拌等により蛋白質成分を溶出する。 溶出液から不溶物を 遠心分離除去し、 更に、 メンブランフィルター濾過を行い、 その濾過液をゲル濾 過、 限界濾過等の分子量分画法により分子量 27万以上の分画を得る。
次に、 DEAEイオン交換クロマトグラフィーにて （pH7. 5〜土 0. 5に て樹脂に吸着後）、 50± 5mMトリスエタノールァミン塩酸緩衝液にて洗浄し、 0. 2〜0. 3 M塩化ナトリウム含有の 50± 5mM卜リスエタノールアミン塩 酸緩衝液で溶出してくる分画を集め、 脱塩濃縮する。 濃縮液を pH6. 6±0. 3の 10 ± ImMリン酸緩衝液で平衡化したハイド ロキシアパタイトに吸着させ、 ρΗ6· 6±0· 3の 10 ± ImMリン酸緩衝液 で洗浄後、 80〜1 1 OmMのリン酸で溶出してくる分画を集める。
こうして得られた物質は、 SDS— PAGEで単一な 67土 lKdのバンドを 呈する。 また、 アミノ酸組成は A s p ： 10. 6±0. 5%, Th r : 3. 7士 0. 3 %, S e r ： 13. 3土 0. 7%, G 1 u： 13. 8±0. 7%, G 1 y ： 23. 3± 1. 2%, A l a : 10. 1 ±0. 5%, Cy s/2 ： 3. 6±0. 3 %, V a 1 : 6. 7±0. 3%, I 1 e ： 3. 8±0. 3%， L e u ： 7. 3 ±0. 4%， Ly s ： 3. 8±0. 3%であり、 糖鎖を含む糖蛋白質である。 等 電点は 6. 5±0. 5である。
上記のようにして得られる糖蛋白質は、細胞走化性を有する物質であり、更に、 新結合組織付着促進の作用を有するものである。
次に、 上記のようにして得られた本発明の CCTFを、 新結合組織付着促進剤 として使用するには、 例えば、 コラーゲン膜、 ゼラチン膜又は他の生分解性膜に 染み込ませた形状、 或いは、 塗布剤、 皮下注射等により行い、 これらを患部に投 与する。
具体的な使用方法としては、 例えば、 歯周病の治療法である歯肉剥離搔爬手術 に適用する場合に、 汚染物質を搔爬滑沢化した歯根面と歯肉との間に、 コラーゲ ン膜、 ゼラチン膜又は他の生分解性膜に、 本発明の細胞走化性因子を浸み込ませ た形態のものを挿入することによって、 手術後、 新結合組織付着を促進させる方 法が挙げられる。 このようにして使用することにより、 健全な歯周組織を回復す ることが可能である。 実施例
以下、 実施例を示し、 本発明を具体的に説明する。
実施例 1
屠殺牛から抜去したゥシ歯 40本をまずスケーラ一で歯根膜繊維を可及的に除 去した。次に、鋭利なスケ一ラーで プレセメント質を含むセメント質を搔爬、 1 % コラゲナ一ゼ含有 pH 7生理食塩水 2 0 m 1 に分散した。 ポルテックス (Automatic Mixer S- 100,タイテック製） で 1 0分撹拌後、 蛋白質成分を溶出さ せた。 次に不溶物を 3 0 0 0 r pm、 5分間の遠心分離で除去し、 上清液を得た 後、更に、 ？し径 0. 22 のメンブランフィル夕一（Durapore,NipponMillipore 社製） にて濾過を行い、 その濾過液を濃縮し 4m l (ブラッドフォード法による 蛋白量として 1 lmgとし、 TSK ' G30 0 0 (内径 2. 1 5 cmX長さ 6 0 cm、 東ソー製） と TSK . G400 0 (内径 2. 1 5 cmX長さ 3 0 c m、 東 ソ一製） 分取用カラムを直列につなぎ、 HP L Cゲル濾過クロマトグラフィーに より分子量分画を行った。
4. 2m lづっ分取し、 ヒト歯肉線維芽細胞を用いた c h emo t ax i s a s s a y (細胞走化性検出法） [KW.Falkら、 Immununol.Methods, Vol.33, 239-247(1980)] に従って活性分画を調べた。
すなわ b、具体的 (こ ii、 96well microchemotaxis chamber ( euro Probe, Cabin John, MD,USA)を使用し、 チヤンバーの下部 wellに各分子量分画を 1 0 %含ん だ D— ΜΕλ4(無血清）培地を 2 5 1 /we 1 1分注した。なお、 positive control として D— λΙΕΜ (1 0 FB S) 培地を、 negative control として D-MEM (無血清） 培地を用いた。 下部チャンバ一の上に孔経 8 のフィルター、 ラバ ―、上部チャンバ一の順に置き固定した。上部チャンバ一の we 1 1に 5 X 1 05 sells/ml のヒト歯肉線維芽細胞を含む D— MEM培地を 5 0 1 /we 1 1分注 した。 3 7°C、 5 %C〇2— 9 5%a i rの条件下で、 3時間培養した。 培養後、 D i f f -Qu i c h染色液 （International Reagents &Co.,Japan)に固定、 染 色して、 水洗後風乾した。 メンブランフィル夕一の下面にまで遊走した細胞数を 計測した。 計測法としては、 接眼レンズ （X 1 0) 内に方眼ミクロメ一夕を挿入 した光学顕微鏡（対物レンズ X 2 0)にて観察し、各 we 1 1における high power field内の細胞数を計測した。
その結果、 分子量約 58万以上のフラクション 40〜4 1 (以下、 A分画と記 す） 及び分子量約 2 7〜2 9万のフラクション 47〜49 (以下、 B分画と記す） で細胞走化活性が認められた。 その結果を第 1図に示す。
また、 この A分画及び B分画は、 TGF— 3, B S P— Π活性を示さず、 また 60°C、 3 0分の処理で失活しなかった。 既に、 A分画及び及び B分画は DEAEイオン交換クロマトグラフィー、 ドロキシァパタイトクロマトグラフィーで精製すると、 SDS— PAGEで同一 の分子量バンドを示すことが準備実験で判明していたので、 一緒にして限外濾過 で濃縮して 2m lとし、 pH7. 5にて DEAEイオン交換樹脂 （TSK · DE AE— 3 SW、 東ソー製） に吸着させた後、 DEAEイオン交換クロマトグラフ ィ一 （DEAE— 3 SW：内径 7. 5mmX長さ 7. 5 cm, 東ソー製） にて、 5 OmMトリスエタノールァミン塩酸緩衝液で洗浄し、 0〜0. 5 M塩化ナ卜リ ゥムの 5 OmMトリスエタノールァミン塩酸緩衝液でグラジェント溶出し、 lm 1づっ分取し、 上記細胞走化性検出法にて活性分画を調べたところ、 0. 2〜0. 3 M塩化ナ卜リゥム含有の 5 OmMトリスエタノールァミン塩酸緩衝液で溶出 してくる分画に活性を認めた。 その結果を第 2図に示す。
次に、 それぞれの活性分画を脱塩濃縮し、 この濃縮分画を p H 6. 8の 1 0 m Mリン酸緩衝液で平衡化したハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー （内径 1 011111 長さ 10じ11、 高研製） にて pH6. 8の 1 0 mMリン酸緩衝液で洗 浄し、 0〜20 OmMのリン酸グラジェント溶出を行い、 1. 5m lづっ分画し た。細胞走化性検出法にて活性分画を調べたところ、 80〜1 10 mMのリン酸 で溶出してくる分画に細胞走化性活性が認められた。 その結果を第 3図に示す。 この分画を脱塩濃縮して、 CCTFを 700 n g得た。 こうして得られた CC TFは、 SDS— PAGEで単一な 67 ± 1 Kdのバンドを呈した。 その結果を 第 4図に示す。
また、 このバンドは抗 BSP— Π抗体、 抗 BMP— 2抗体を用いたウエスタン ブロッテイングで染色されなかったので CCTFは B S P— Π、 BMP- 2 と は異なる物質であることが判明した。 （第 5図、 第 6図） 。
また、 得られた CCTFのアミノ酸組成は A s p ： 1 0. 6 %, Th r ： 3. 7 %, S e r ： 1 3. 3 %, G 1 u： 1 3. 8 %, G 1 y： 23. 3%, A l a : 10. 1 %, Cy s/2 : 3. 6%, Va l : 6. 7%, I 1 e : 3. 8%, L e u : 7. 3 %, Ly s : 3. 8 %であり、 糖鎖を含む糖蛋白質であった。 また、 等電点は 6. 5±0. 5であった。
次に、 5%コラーゲン溶液 （タイプ I— A) 4m lを作成、 これに上記 CCT F 200 ngを添加した。 これを、 24 穴プレート （ 1穴；底面積 1 · 77 c m2， 高さ 2 cm) に 1穴当たり 0. 4ml 分注し、 開放系で重合させた。 30分 後に、 そのコラーゲンゲル上に 5 X 104個のヒト歯肉線維芽細胞を播種、 3日 間 37°C、 5%炭酸ガス存在下で培養し、 電顕試料を作製、 エボン包埋し、 トル ィジンブルー染色を施した。 播種したヒト歯肉線維芽細胞の、 CCTF含有コラ 一ゲン内への侵入距離、 細胞数を光学顕微鏡にて鏡検測定した。
また、 無添加、 フイブ口ネックチン添加、 TGF— 3添加、 PDGF添加及び CCTFと抗ビトロネクチン抗体添加についても同様に実施した。 その結果を表 1に示す。 表 1
Figure imgf000010_0001
*) No. 2、 6 実施例
* *) No. 1、 3〜 5 比較例 表 1に示すように、 CCTFを添加した場合、 無添加、 フイブロネクチン添加、 TGF添加、 PDGF添加に比べて、 コラ一ゲンゲル内への侵入細胞数、 侵入距 離共に有意に高い値を示した。 また、 CCTFのこれらの作用は、 抗ビトロネク チン抗体で活性が阻害されることはなかつた。
(実施例 2 )
屠殺牛から抜去したゥシ歯 40本を、 まず、 スケ一ラーで歯根膜繊維を可及的 に除去した。 次に鋭利なスケ一ラーでプレセメント質及びセメント質を搔爬し、 1%コラゲナ一ゼ含有 pH 7生理食塩水中 20m 1に分散した。 ボルテックス (Automatic Mixer S-100,タイテック製） で 1 0分間撹拌後、 蛋白質成分を溶出 させた。 次に、 不溶物を 3000 r pm、 5分間の遠心分離で除去し、 上清液を 得た後、 更に、 孔径 0. 45 のメンブランフィル夕一 （Durapore, Nippon Milli pore社製） にて濾過を行い、 その濾過液を、 分画分子量 20万限外濾過膜で濃縮 し 4 mlとした。
次に、 pH7. 5にて DE A Eイオン交換カラム樹脂に吸着させた後、 DEA Eイオン交換クロマトグラフィー （DEAE— 3 SW:内径 7. 5mmX長さ 7. 5 cm、 東ソ一製） にて、 0〜0. 5 M塩化ナトリウムの 5 OmMトリスェタノ —ルァミン塩酸緩衝液でグラジェント溶出し、 0. 2〜0. 3 M塩化ナトリウム 含有の 5 OmMトリスエタノールァミン塩酸緩衝液で溶出してくる分画を集め、 脱塩濃縮した。
次に、 この濃縮分画を pH6. 6の 1 OmMリン酸緩衝液で平衡化したハイド ロキシアパタイトクロマトグラフィー （内径 1 OmmX長さ 1 0 cm、 高研製） にかけ、 0〜20 OmMのりン酸グラジェント溶出を行い、 80〜 1 1 OmM の リン酸で溶出してくる分画を集め、 脱塩濃縮して、 CCTFを 730 n g得た。 こうして得られた物質は、 SDS— PAGEで単一な 67士 lKdのバンドを呈 した。
また、 このバンドは抗 B S P— Π抗体、 抗 BMP— 2抗体を用いたウエスタン プロッティングで染色されなかったので B S P— Π、 BMP- 2とは異なること が判った。
次に、 5 %コラーゲン溶液 （タイプ I _A) 10m lを作成、 これに上記 CC TFを 600 n gを添加混合し、 2 mm厚に流し込み、凍結乾燥することにより、 C C T F含有コラーゲン膜を作製した。これを使用直前に 2時間紫外線殺菌した。 サルの上顎の左右の切歯と測切歯の唇側の歯肉弁剥離翻転し歯槽骨を根尖側方 向へ約 4mmの削除し、 歯根を露出させ、 表面のセメント質を搔爬し、 なめらか にした後、 左側の露出歯根面を CCTF含有コラーゲン膜で覆い、 右側は露出歯 根面はそのままの状態で、 歯肉弁を元に戻し縫合した。 手術後、 治癒が認められ るまでの 3週間は毎日プラークコントロールを施した。 3週間後に屠殺、 港流固定後、 組織ブロックを採取し、 パラフィン切片を作製、 H— E染色を施し、 組織学的観察を行った結果、 左側の CCTF含有コラーゲン 膜を施した方には新結合組織付着の形成が認められた。 また、 歯槽骨の形成も認 められた。 一方、 右側にはそのいずれも認められなかった。 産業上の利用可能性
請求の範囲第 1項に係る発明は、 歯周組織の欠損部に適用することによって、 新結合組織付着の形成が促進され、 健全歯周組織を回復させるために、 適用可能 な CCTFを提供するものである。
また、 請求の範囲第 4項に係る発明の精製法により、 本発明の CCTFを効率 良く、 抽出、 精製することができる。
また、 請求の範囲第 7項に係る発明により、 歯と歯肉と （歯根と歯根膜と） の 新結合組織付着の形成を促進する薬剤を提供することができる。

Claims

請求の範囲
1. SDS— PAGEによる分子量が 67000 ± 1 000である哺乳類の歯の プレセメント質及び Z又はセメント質由来細胞走化性因子 （CCTF) 。
2. アミノ酸組成が As p ： 10. 6±0. 5%， Th r ： 3. 7±0. 3%， S e r ： 13. 3土 0. 7%， G l u : 1 3. 8±0. 7%， G 1 y ： 23. 3 ± 1. 2%, A l a : 10. 1 ±0. 5%， Cy s/2 ： 3. 6±0. 3%, V a 1 ： 6. 7±0. 3%， I 1 e ： 3. 8土 0. 3%， L e u ： 7. 3±0. 4%, L y s ： 3. 8 ±0. 3 %の糖鎖を含む糖タンパクで、 等電点が 6. 5土 0. 5であることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の細胞走化性因子 （CC TF) 。
3. 哺乳類がゥシであることを特徴とする請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の 細胞走化性因子 （CCTF) 。
4.哺乳類の歯のプレセメント質及び Z又はセメント質から蛋白質成分を溶出し、 分子量分画、 イオン交換吸着クロマトグラフィー、 ハイドロキシアパタイト吸着 クロマトグラフィーにより、 哺乳類のプレセメント質及び Z又はセメント質由来 細胞走化性因子 （CCTF) を精製する方法。
5. (a) 哺乳類の抜歯からプレセメント質及び/又はセメント質を採取し、 生 理食塩水中又はコラゲナ一ゼ含有生理食塩水中に撹拌浸析することにより、 蛋白 質成分を溶出し、
(b) 工程 （a) の溶出液から不溶物を遠心分離及び濾過により除去し、 その濾 過液からゲル瀘過、 限外濾過等の方法により分子量 27万以上の分画を得、
(c) 工程 （b) で得た分画を DEAEイオン交換樹脂に吸着させ、 0. 2〜0. 3 mM塩化ナトリゥム含有トリスエタノールアミン塩酸緩衝液で溶出してくる分 画を集め、 脱塩濃縮し、
(d) 工程 （c) で得た濃縮液をリン酸緩衝液で平衡化したハイドロキシァパ夕 ィ卜に吸着させ、 80〜1 1 OmMのリン酸で溶出してくる分画を集めることを 特徴とする請求の範囲第 4項に記載の細胞走化性因子 （CCTF) を精製する方 法。
6. 哺乳類がゥシであることを特徴とする請求の範囲第 4項又は第 5項に記載の 細胞走化性因子 （CCTF) を精製する方法。
7. 請求の範囲第 1項乃至第 3項記載の哺乳類の歯のプレセメント質及び 又は セメント質由来細胞走化性因子 （CCTF) を有効成分として含有する新結合組 織付着促進剤。
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