JPH0242022A - 結合を誘導する組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、無機化組織（ｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ　ｔｉ
ｓｓｕｅ　）部分の少くとも一部分場合によっては更に
他部分にも、無機化組織を新たに形成することにより無
機化組織部分間に結合を誘導するための組成物に関する
。更に本発明は、例えば歯周炎治療のための、かかる結
合の誘導方法に関する。

本発明は、無機化組織、例えば歯および骨、の部分間に
結合を誘導するのに有用な新しい生物学に基いた技術に
関する。本発明は、かかる結合の提供に一般的に適用可
能であるが、本明細傷においては、主として歯の弛緩、
いわゆる歯周炎の治療に関連させて説明する。しかしな
がら、本発明についてのこの主たる説明を制限的に解す
べきではない。本発明の技術をより詳細に説明する前に
、本発明の理解を容易にするために、歯および関連の疾
病に関連した生物学的条件について簡潔に背景を述べる
ことが適切である。正常な歯の状ｍＶｃあっては、歯の
顎骨の特別な空洞、いわゆる歯槽内に係止されている。

歯根と顎骨との間にはいわゆる歯周膜が位置している。

歯根は主に、象牙質と呼ばれる物質により構成されてい
る。この象牙質の周囲は厚さ約０．０１〜１１Ｉｓのセ
メント質薄層により被覆されている。このセメント質内
では、特に、コラーゲン線維がセメント質から歯周膜を
通して延び、そして顎骨内に係止されていることが認め
られている。従ってセメント質は、顎骨に対する歯の結
合にとって極めて重要である。歯周膜は約０．２１１１
１の厚さを有し、また前述のコラーゲン線維より成り、
また該線維とこれらの組織に属する細胞との間には血管
や神経が走っている。

顎骨は歯冠にまでＫは延びておらず、また顎骨によって
被われていない歯根部において歯根セメント質からの線
維は囲りの歯肉（０１７１Ｎ）内に延びている。これら
の線維は、歯の係止を助け、そして更に歯肉を安定化す
る。歯肉および口腔全体は薄い上皮層により被われてい
る。この上皮は、歯の囲りに稠密なコラ−またはスリー
ブを形成する。歯に隣接して、歯と上皮の間に浅溝が形
成される。

歯を顎骨に結合している組織の炎症性疾患は極めて頻度
が高くそして程度の差はあれ、世界人口の大部分を悩ま
している。これまでに用いられている治療方法は、主と
して、進行中の疾病の進みを遅延させそして歯の弛緩を
できるだけ防ぐことを狙いとしている。現在のところ、
歯が顎骨に再び給金可能となるような治ゆが得られる臨
床的に有用な方法は存在しない。

この分骨の炎症性疾患におけるもう一つの問題は、先天
的欠陥を有する歯の結合についてである。このような欠
陥を有する患者は、若令にて歯周炎、いわゆる若年性歯
周炎が発症する。

その治療はしばしば抜歯およびブリッジ構造による代替
をすることからなり相当な費用がかかるＯ 歯牙表面の細菌は歯牙周囲の歯肉に慢性的炎症をおこす
。炎症細胞はそれら細菌を殺すための酵素を分泌するが
、それはこの場合、歯を歯肉および顎骨に結合している
コラーゲン線維をも侵襲してしまう。このため、歯肉ま
たはセメント質上の細胞は分解を受けやすくなり、口腔
粘膜からの上皮は歯に沿って下方に生長しそしていわゆ
る歯肉溝を生じる。この溝内において、新たな細菌が好
ましい増殖条件に遭遇し、そして新たな炎症細胞がこの
場所を侵襲して歯周膜の組織の分解を進行させる。セメ
ント質細胞は死滅しそして歯槽部分の骨は破壊される。

その過程は一般的にきわめて遅いが、時折、極めて速く
進行する。しばらくすると、侵襲を受けている歯は顎骨
への結合を完全に失ってしまうことになる。

今日の治療は、主として、歯牙表面上の細菌沈着を除去
することに向けられている。細菌を除去すれば、歯肉お
よび歯周膜の炎症は止まり、そして分解の進行も止まる
。この治療は更に、新たな１ＩＪｉ菌沈看が歯牙表面に
形成されないようＫすることを狙いとしている。従って
その結果顎骨に対する歯の結合の破壊も止まるが、その
治ゆ過程において新たな歯周膜または新たなセメント質
が形成されることはない。

本発明をもたらした研究に関連して、セメント質の形成
は歯根の発生において全歯根表面に沿って形成されるエ
ナメル質の前駆物質の薄層によって開始されるという知
見を利用した。エナメル質の前駆物質がセメント質の形
成を誘導できるということは公に知られていないことは
銘記すべきである。しかしながら、この知見は同時係属
出願、例えば欧州特許出願用８７８５０２６４．０号な
どに記載されている。セメ、ント質形成の機構につき更
に研究と実験を続けた結果、驚くべきことに、歯牙エナ
メル質（ｄｅｎｔａｌ　ｅｎａｍｅｌ　）の前駆物質、
いわゆるエナメルマトリクスは活性成分として該エナメ
ルマトリクスの有機部分から得られるタンパク質画分を
含有していることが明らかとなった。前記タンパク質画
分を構成するタンパク質の生物学的機能は歯牙エナメル
質を形成および特に無機化にあると考えられることから
（Ｆｉｓｃｈｅｒ、　Ｌ、　＆　Ｔｅｒｍｉｎｇ、　Ｄ
、　Ｃ１１ｎｉｏａｌＯｒｔｈｏｐａｅｄｉａｓ　　２
００　、　１９８５．５６２−５５ｇ照）この発見はな
おさらに驚くべきものである。エナメルマトリクスのタ
ンノぐり質は高分子上部分と低分子量部分とで構成され
ており、またそれらの活性成分はそれの低分子量部分か
ら構成されるが、その活性決定質（ａｏｔｉｖｅ　ｄｅ
ｔｅｒｍｉｎａｎｔ）から構成されていてもよいことを
見出した。エナメルマトリクスタンパク質の前記低分子
量部分は、約４０，０００までの、主に、約５０００〜
約２５０００の範囲の分子量を有する、−役にアメロゲ
ニン（ａｍｅｌｏｇｅｎｉｎ　）と称する酢酸で抽出可
能なタンパク質で構成されている。

本明細書に用いた「エナメル質の前駆ｖＩＪ質」および
「エナメルマトリクス」という表現の意味するところを
十分明確にしている二つの文献が参考となる。すなわち
、 Ａ、　Ｒ，Ｔｅｎ　Ｃａｔｅ、　０ｒａｌ　Ｈｌｓｔｏ
ｌｏｇｙ、　Ｄｅｖｅｌｏｐ−ｍｅｎｔ、５ｔｒｕｏｔ
ｕｒｅ、ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｔｈｅ　Ｃ，Ｖ、
Ｍｏ５ｂｙＣｏ、、　ｓ：ｔ　　Ｌｏｕｉｓ、　ＵＳＡ
（１９８０）ｐｐｌ　８２−８５゜１、　Ａ、　ＭＪｏ
ｒ、　Ｏ，Ｆｅｊ　ｅｒｓｋｏｖ、　Ｈｕｍａｎ　０ｒ
ａｌ　Ｅｍｂｒｙｏ−１ｏｇｙ　＆　Ｈｌｓｔｏｌｏｇ
ｙ、Ｍｕｎｋａｇａａｒｄ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（１
９８６）ｐｐ４４−４５゜ これらの文献に十分開示しであることは本明細書の記載
の一部として引用する。

本発明に関連して、例えば歯根表面を削って空洞とする
などして象牙質を歯周膜の細胞に曝すと陣営歯牙に付着
し組織を囲むように結合する線維のない骨様組織の形で
治ゆが生じることを見出した。しかしながらその人工的
に作った空洞表面を歯牙エナメルの前駆物質（その歯牙
エナメに）ｍｔｌｌ物質を以下エナメルマトリクスと呼
ぶ）より得られる活性タンパク買画分で彼うと、正常な
セメント質係止組＃　（ｎｏｒｍａｌ　ａｅｍｅｎ−ｔ
ｕｍ　ａｎｏｈｏｒｉｎｇ　ｔｉｓｓｕｅ　）が生じる
ことが見出された。

エナメルマトリクスタンパク質は好ましくは、哺乳動物
、例えばウシまたはブタといった生物種から得られる。

前記実験中に、サルおよびヒトにおけるセメント質の形
成は、歯根表面を削った空洞を他の生物種、例えばブタ
といった生物種からのエナメルマトリクスから得られる
タンパク質画分で肢うことにより誘導できることを見出
した。

従って以下に記載する発明は、生体（ｌｉｖｉｎｇ　）
無機化組織部分の少くとも一部に無機化組織を新たに形
成することにより生体無機化組織部分間に結合を誘導す
るための新しい技術を提供する。これらの技術の特徴は
、歯牙エナメルの前駆物質、いわゆるエナメルマトリク
スから得られるエナメルマトリクスタンパク質を応用し
て結合を誘導させることにある。従って本発明は更に、
活性成分としてかかるエナメルマトリクスタンパク質ま
たは活性決定質を含有する、かかる用途のための組成物
を提供する。

前駆の如く、本発明は、歯科治療との関係において、例
えば、歯周炎、すなわち歯牙弛緩の治療に、歯牙移植に
１あるいは事故によりはずれた歯牙の再導入ＫＳ４？に
応用可能である。しかしながら、本発明は更に、人工イ
ンプラント、例えば歯牙インプラントや人工ヒップジヨ
イントなどの結合を容易にするのにも用いることができ
る。本発明は更に、新しい廊アタッチメントを提供した
い場合に、人工インプラント上の無機化組織形成を誘導
するのに用いることもできる。

本発明による技術の適用にあたり用いられるタンパク質
画分は、適切には、その歯が発育中である哺乳動物のエ
ナメルマトリクスから得ろれる。エナメルマトリクスの
適切な給源は屠殺動物、例えばブタまたは修生であり、
そしてそれらの屠殺はしばしば、歯がまだ発育中の間に
、ブタの場合は約α５才のときに、行われる。従って好
ましい、哺乳動物はウシまたはブタといった生物種から
選択されるが、その他の生物種、例えば生長し続ける歯
をもつ羊および纂歯傾などを用いることもできる。この
タンパク質画分のもう一つの給源として、組換えＤＮＡ
技術により変性した培養細胞または細菌を用いることも
できる（例えば米国特許第４，６７２，０３２号参照）
。

本発明による治療に用いられる組成物は、かかるタンパ
ク質画分のみ、またはその活性決定質のみより成ってい
てもよい（水と混合状態にあるのが適している）が、前
記組成物は、タンパク質画分を担体、希釈剤または接着
剤、例えばこの目的に許容し得る変性セルロース、寒天
、アルギネートまたはゼラチンなどとの組合せで含有し
てもよい。歯科用に用いるには、担体または希釈剤が歯
科的に許容し得るものであることが適切である。現在の
ところ、水溶性ポリマーより成る担体を用いるのが好ま
しい。かかるポリマーとしては例えば（以下のものに限
定されるものではない）ナトリウムカルボキシセルロー
ス、微結晶性セルロース、ヒドロキシエチルセルロース
、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、
高分子量ポリアクリル酸、アルギン酸ナトリウム、プロ
ピレングリコールアルギネート、キサンタンガム、グア
ーガム、ロカストビーンガム、変性スターチ、ゼラチン
、スフチンまたはこれらの組合せである。活性タンパク
質画分を取り込んだ後、これらの水溶性ポリマーは、所
望により、ゲルまたはフィルムに変えることができ、そ
の結果、有利な物性の故に応用が容易な組成物が得られ
る。前記組成物は、所望により、貯蔵安定性を高めるた
めに安定化剤または保存剤を含有してもよい。

本発明は、更に、歯根、セメント質と顎骨の形成および
これらの間の生理学的コラーゲン線維結合を誘導するこ
とにより歯の結合を回復させることより成る歯周炎の治
療方法をも提供する。この方法の特徴は、上皮が存在す
る場合それを歯根から除去し、次いでその歯根にエナメ
ルマトリクスから得られた関連のタンパク質画分の層を
施すことＫある。

歯周炎の治療に本発明を好適に適用するには、侵襲を受
けている歯牙部に隣接したフラーゲン組織（歯肉）を切
開して歯根光面をむき出しにする。上皮が存在するとき
はそれを除去し、次いで歯根の清浄な表面を前記タンパ
ク質画分の、または活性成分としてかかるタンパク質画
分を含有する組成物の層で妓鷹し、次いでコラーゲン組
織（歯肉）を再度位置決めし、そして所望により縫合し
て治ゆが生じるようＫする。

前述のとおり、本発明は、歯周炎の治療に加えて、歯牙
の再植込み、または移植に用いることができる。１０代
前半の年少者が事故の結果、−本または数本の歯、主と
して＠歯が抜けて（ｄｉｓｌｏｃａｔｉｏｎ　）　シま
うことは比較的よくあることである。抜けた歯牙を速か
にもとに戻すことによって良好な治ゆが得られ、顎骨に
正常に結合する。多くの場合、抜けた歯牙のこのような
復位はすぐには行い得す、その歯牙はある時間の間、口
の外の適切でない媒質、例えば空気中に置かれたままと
ならざるを得ない。これでは歯根表面の歯周膜の細胞は
破壊されてしまうことになる。その歯牙を日中の所定位
置に戻しても、それは生理学的結合を回復することなく
結局は弛緩してしまうことになる。今日に到るも、結合
組織再生により恒久的歯牙結合を得ることのできる方法
は案出されていない。

しかしながら、本発明の技術によれば抜けた歯牙上の死
んだ歯１Ｍ膜を適切な方法で、機械的または化学的手段
により除去することができ、そしてその後に前記タンノ
ぐり質画分を含有する、またはそれだけから成る組成物
を歯根のむき出しの表面に適用すればよい。次にその歯
牙をその歯槽に戻し数週間軽く固定する。歯根表面に適
用されたタンパク質画分またはその組成物の故に、新し
いセメント質層が生じ、ここに歯牙は新しい結合を獲得
する。

歯の移植、すなわち、ある人から他の人への歯の移し替
え、に関し、移植された歯牙組織は受は取り側の免疫防
制による攻ポを受け、そして極めて短期間で分解してし
まうことが判っている。免疫学的にコンパチブルな個人
間で移植を行う試みがなされている。しかしながら、こ
れらの試みの結果も思わしくない。−本または数本の移
植歯牙を維持するために免疫抑制剤で長期治療すること
は、それに伴うリスクと見合わず、従って今日、好まし
い長期予後を伴う歯牙移植のための臨床的に有用な方法
は存在していない。

しかしながら、本発明による技術を用いることにより、
このような方法を案出することができ、そしてその課題
は、移植される歯牙を供与者から取り出し、歯髄を除去
し、その歯髄空間に清浄化しそしてその歯髄空間に歯根
充填剤を適用することにより解決される。歯周膜は機械
的または化学的に除去され、そして歯根を活性タンパク
質画分含有組成物で被覆する。次にその歯牙を受は取り
側の口内の新たな位置に置（。その歯牙をある時間にわ
たって固定位ｔｉｆＫ保つと、そのタンパク質画分によ
って、移ｆｌ［１１牙を披涜しそれを固定する内生無機
化組織の再形成が誘導されることＫなる。

本発明の更なる好ましい一面によれば、活性タンパク質
画分含有組成物にフイプリノケ゛ン、用層因子（血漿由
来凝固因子）およびトロンビンに基づく組織接着剤を補
給してもよい。このように補給された組成物は、エナメ
ルマトリクスおよびフイブリノゲンおよび第雇因子のプ
レミックスで構成されていてもよく、そしてトロンビン
は手術部位にその組成物を適用する直前に適用される。

そのプレミックスは所望により、分解速度を抑えるため
にアプロチニンを含有していてもよい。

このように補給された組成物に用いるのに有用な市販品
は、ＩＭＭＵＮＯＡＧ、　（オーストリア、ウィーン）
により製造・販売されている二成分フィブリン・シーラ
ントのＴｉ５ｓｅｅｌである。かかる組織接着剤を使用
するに際しては、タンパク質画分、フイブリノケ゛ン、
第雇因子および所望によりアプロチニンのプレミックス
をトロンビン溶液と混合し、そして得られた組成物を次
に速かに手術部位に適用する。歯周炎の治療において、
この技術により手術は極めて容易なものとなる。すなわ
ち、歯根への組成物接着が高まり、出血は止まり、また
粘膜性骨膜フラップの位置決めは極めて簡易になる一方
縫合糸を使用することもない。

現在のところ、本発明により補給された組成物に用いる
のに好ましい物は、セルロース誘導体およびアルギネー
ト、例えばカルボキシメチルセルロース類およびナトリ
ウムまたはプロピレングリコールアルギネートなどであ
る。

本発明を以下特定実施例と共に更に説明する。

例示は、サルおよびヒトに対して行った歯科実験に関連
させてなされている。この例示において、ＳＤＳ−Ｐａ
ｇｅ　（ポリアクリルアミドゲル、電気泳動）分離を示
す添付図面も参照される。分子量に基づいてエナメルマ
トリクスから得られるタンパク質画分の２つの主要部分
はアプロチニン（低分子量）およびエナメリン（高分子
債）と称される。

実施例　１ 動物試験用抽出物の調製 動物モデルでエナメルマトリクス中のどの成分が活性か
を確認するために、以下の供試物質を調製した。すべて
の物質はブタのエナメルマトリクスからのものである。

Ｅｌｏ、３ｇのマトリクス（タンパク質含量２７％＋４
チ）を３１Ｒｔの０．９　’ｌｒ　ＮａＣ１中でスラリ
ー化しそして氷冷しながら、Ｐｏ１ｙｔｈｒｏｎｅを用
いて１分間にわたり１０秒間隔でホモジナイズした。

ホモジネートを次に凍結乾燥する。収Ｓｔ：１９９岬、
Ｌｏｗｒｙによるタンノ（り贋金ｆｆ１４７％”２チ。

ｇ２０．３ｇのマトリクスをスラリー化しそしてＭ記の
如くホモジナイズし、次いで水浴上で４分間加熱した。

凍結乾燥により１９９１１Ｉｇの収量が得られた。可溶
性タンパク贋金ｌｆ３％”３チ。

Ｅ３０．３９の物質を３１Ｒｔの０．５Ｍ酢酸（ｐ、ａ
−）中でスラリー化し、前述の如くホモジナイズ、次い
でタンパク質抽出のために、４℃で攪拌下に２４時間放
置した。次いで冷却下に遠心分離を１０．００　Ｏｒｐ
ｍで１０分間行った。沈殿を回収し、凍結し、そして上
清を凍結乾燥した。凍結乾燥物の収遣：６８１ＮＩ０タ
ンパク質含量２９％＋３チ。

Ｅ４０．３ｇのマトリクスを０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ　ｄ
ｉ衝液（ｐＨ７，４）中の３−の１０チＥＤＴＡ中でス
ラリー化し、そして前述の如く冷却しながらホモジナイ
ズした。抽出は冷却下に２４時間攪拌することにより行
い、次にそのホモジネートを冷却遠心分Ｒ器で遠心分離
した。その上清を蒸留水に対して透析しそして凍結乾燥
した。収ｉｔ　：　１ｆ　Ｗｌｉ。

タンパク質含量３３％＋２１゜ Ｅ５　遠心分離後の沈殿（Ｅ４）を冷却下にゆっくり攪
拌しながら約１０容の０．５　Ｍ酢酸で２４時間抽出し
た。次に、新たに遠心分離を行い、モして上清を凍結乾
燥した。収ｆｆｉ：１０９〜。タンノぐり含量１５％＋
３％。

Ｅ６　　Ｅ５に記載の遠心分離で得られた沈殿を凍結乾
燥した。収量：３７ｙｖ０タンパク質含量１８％＋４−
〇 Ｅ７０．３７のマトリクスを、０．４ｍＭプロテイナー
で阻害剤ＰＭＳＦ　（フェニルメチルスルホニルクロラ
イド）を含むα０３ＭＴｒｉｓ緩＃ｉＫ　（ｐＨ７，４
）中の３−の１０　Ｓ　ＥＤＴＡ中でスラリー化し、そ
してサンプルＥ４と同様にしてホモジナイズし抽出した
。遠心分離し、そしてその上清を透析後、凍結乾燥を行
った。収量：１１η。タンパク質含量４１％＋２％。

Ｅ８　　Ｅ７に記載の遠心分離により得られる沈殿を低
温で０５Ｍ酢酸を用いて４８時間抽出し、遠心分離し、
そしてその上清を凍結乾燥した。

収ｌ：１０１η。タンパク質含量１７％”１チ。

Ｅ９　　ｇ８に記載の遠心分離により得られる沈殿を凍
結乾燥した。収量：４０岬、タン１５り贋金量３０　％
”　３チ。

前記Ｅ１〜９で得られた物質をタンパク質含量、タンパ
ク質分子量分布（Ｐｈａｓｔを用いたＳＤＳ　−Ｐａｇ
ｅ）、タンパク質の等電点および炭水化物含量に関して
特徴付けた。ブタのエナメルマトリクスからの抽出物の
見かけ分子量組成を添付図面に示す。５ＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気原動（８０８８〜２５％、Ｐｈａｓ
　ｔ、　Ｐｈａｒｍａｏｉａ社）後に、タンパク質のバ
ンドをレーザースキャナー（ＩＪＢＵｌｔｒｏｓｏａｎ
　ＸＬ　）によるピークに変換しである。

分子量は、タンパク質（１４〜９０　ｋＤａ　）および
ポリはプチド（２〜１４　ｋＤａ　）標帛（Ｐｈａｒｍ
ａｏｉａ社）を用いてキャリブレーションを行うことに
より評価する。ダイアダラムは抽出物Ｅ４およびＥ５に
ついて与えられており、そしてこれらの、およびその他
のアブストラクトを次にまとめる。

Ｅｌｘ　　　　　　ｘｘｘＸｘ　　　　　　　ＸＥ３Ｘ
　　　　　ｘ　　　　ｘ　　　　　　　Ｘ（ｘ）Ｅ４　
　　　　　　　　　ｘ　　　　　　　　　　ｘ　　　　
　　　　　　　　　ＸＢ５ｘ　　　　　　　　　　ｘ　
　　　　　　Ｘ（ｘ）Ｅ７　　　　　　　　　　　ｘ　
　　　　　　　　　ｘ　　　　　　　　　　　　　　Ｘ
Ｅ８］Ｃｘ　　　　　　　Ｘ（Ｘ） 米ポリＲプチドキャリプレーションキットを用いるとき
は低分子量が得られ、またタンパク質キャリブレーショ
ンを用いるときは高分子量が得られる。

Ｘ＝多１、　Ｉ＝小量、（Ｘ）＝僅少量この実施例の目
的は、歯牙エナメルの前駆組織（エナメルマトリクス）
から段階的抽出により得られた物質Ｅ１〜Ｅ９が実験的
に作られた辺縁性崗周傷（ｍａｒｇｉｎａｌ　ｐｅｒｉ
ｏｄｏｎｔａｌ　ｗｏｕｎｄｓ　）の治ゆに及ぼす影響
をみることにある。マウス歯牙の辺縁歯周の欠陥は歯牙
セメント質、歯周膜および辺縁歯槽骨を、歯パーを用い
て約５ｍの歯頚−尖端距＠　（ｏｅｒｖｉｏｏ　−ａｐ
ｉｃａｌ　ｄｉｓｔａｎｏｅ　）にわたり除去すること
により作り出した。次に、前記物質を実験的に作られた
欠陥に適用してその傷を放置的ゆさせた。コントロール
用の欠陥も作ったが、これにはいかなる物質も用いるこ
となく放置的ゆさせた。８週間の治ゆ期間の後、結果を
組織形態測定により評価した。

治ゆ過程の結果は、セメント質および骨被櫨（ｄｏｎｅ
　ｏｏｖｅｒ　）のもとのレベルのチとして表わしであ
る（第１表）。その治ゆ過程は、新たなセメント質、歯
周膜および歯槽骨の付着層の形成（新たな結合（ｎｅｗ
　ａｔｔａａｈｍｅｎｔ　）　）　ｏより成る。

治ゆ（チ）　　　５　　９３　　３７９　　４４９　　
２　　０４８　　５このように、物質Ｅ１、Ｅ３、Ｅ５
およびＥ８の適用後に結合が生じた。コントロールおよ
び物質Ｅ２、Ｅ４、Ｅ６、Ｅ７およびＥ９で治療した歯
の場合にはこのような結果は得られず、歯牙は口上皮で
被覆されていただけなのに欠陥は存続した。これらの結
果は、エナメルマトリクスのタンパク質部分の低分子量
画分の適用が歯周炎の治療の際組織結合を促進させるこ
とを示しているＯ 実施例　２ エナメルマトリクスからの脱塩・酸抽出物の調製 前の例（Ｅ３）のそれと同様の凍結乾燥調製物を０．１
Ｍ酢酸に溶解し、そして０．１　Ｍ酢酸中の超微細（５
ｕｐｅｒ　ｆｉｎｅ　）　５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−２
５を詰めた１５Ｘ５４０鰭カラムに移した（１４４〜／
１２ｍ）。

第１のタンパク質−リッチ（ｒｉｏｈ　）な画分を集め
、そして凍結乾燥する。出発物質中のタンパク質の８℃
１Ｍに相当する約７２チタンバク質を含む物質を３４岬
得た。残留タンパク質は塩画分中に認められた（約７％
のタンパク質含量を有する６３〜の凍結乾燥物質）。

このようにして調製された凍結乾燥タンパク質を１０１
Ｒｔバイアルに充填しく各々２０■）、そして放射線照
射滅菌（３ｓｋｏｙ）してから動物試験に用いた。

前の例に記載された如くに調製物を分析した。

結果を下記第２表に示す。

第２宍 ｉ！二ンゆ（％ン　　　　　　　４　　　　　　　７２
実施例　３ 精製タンノξり質画分の調製 ２００１りの凍結乾燥、１！製物Ｅ３（実施例２で用い
たものと同一のもの）を２０−の０．１Ｍ酢酸に溶解し
、そして４℃で０．１Ｍ酢酸中の５ｅｐｈａｄｅｘＧ−
７５を詰めた２５Ｘ７８０１１ｆｆｉカラムにかけた。

そのカラムを５５ＴＲｔ／時の速度で溶出しそしてサン
プルを４ｒｎｔずつ果めた。その溶出液を２８０酩でモ
ニターＬ　（Ｕｖｉｏｏｒｄ　）　、そして大部分の溶
出物質を含むサンプルを合一して得られた５つの画分を
電気泳動（８ＤＳ−Ｐａｇｅ　）により分析し、以下に
示す分子量分布を得た。溶出クロマトグラムから５つの
ピーク（０−ＩＡ）。

両分サンプル （１）　　５０−６０：高分子量タンパク質「エナメリ
ン」（分子量４０，０００） （２）　　６２−８０：高分子量アメロゲニン（分子遣
約２５キロダルトン） （３）　　９０−１００：中間分子遣アメロゲニン（分
子量約１４キログルトン） （４）　　１１０−１２５：低分子量アメロゲニン（分
子量約５〜１０キロダルトン） （５）　　１３０−１６０：塩 ピーク（２）、（３）および（４）を凍結乾燥後に、そ
れぞれ１０ｒｒ４．７ηおよび１２■の高分子量、中間
分子量および低分子量アメロゲニンタンパク質が得られ
た（タンパク質含量〉９０俤）。

この実験の目的はエナメル質前駆組ｉａ、（エナメルマ
トリクス）から抽出された高、中間および低分子量のア
メロゲニン物質が実験的な辺縁性虜周傷の治ゆに及ぼす
影響をみることにあった。サル歯牙の実験的な辺縁性ｍ
　１ｒｉＪ　ｇｈは歯パーを用いて歯牙セメント質、歯
周膜および辺縁歯槽骨を約５鴎の歯頚−尖端距離にわた
り除去することにより作り出した。次に前記ｇｈ質を実
験的に作られた欠陥に適用しそしてその傷全治ゆさせた
。コントロール用の欠陥も作ったが、これにはいかなる
物質も適用することなく治ゆさせた。８週間の治ゆ期間
の麦、結果を組織形態測定により評価した（第６表）。

第３表 このように、高分子量アメロゲニンの適用後に、そして
また程度は劣るが中間分子置アメロゲニンおよび低分子
値アメロゲニンの適用後に新たな結合が得られた。これ
らの結果はエナメルマトリクスから得られたアメロゲニ
ンの高分子量画分の適用が歯周炎の治療において鏝も効
率的に組織結合を促進させることを示している。

実施例　４ エナメルマトリクスの酸抽出物の調製 屠殺ブタ（約６月令、屠殺重遣約８１９）の下顎を軟組
織から切断しそして屠殺場で凍結した。適当な歯胚を凍
結類半体から部分的融解後に切採し、そしてエナメルマ
トリクスを単離した。

６８りのエナメルマトリクスを７８０−の０．５Ｍ酢酸
（ｐＨ４，１）中でスラリー化し、そして水冷下にホモ
ジナイズした（　Ｈｏｍｏｇｅｎｉｓａｔｏｒ　Ｐｏ１
ｙｔｒｏｎＰＴＩＯ−３０）。そのホモジネート冷却下
に２２詩間攪拌してｐＨ約４で可溶なタンパク質を抽出
した。不溶性物質は遠心分離により除去しそしてその酢
酸溶液を凍結乾燥した。

約５０チのタンパク買収率に相当する約２０％のタンパ
ク賃金はを有する８、５ノの凍結乾燥物が得られた。

凍結乾燥抽出物を水分含量、アセテート含量、タンパク
賃金ｊｉ　（Ｌｏｗｒｙ　）、炭水化抱含ｉ、１ｉ　（
Ａｎｔｒｏｎ試薬）、アミノ酸組成物、元素分析、タン
パク質分子量分布（ＳＤＳ−Ｐａｇｅ　）およびタンパ
ク質の等電点について分析した。

臨床試験に用いる前洗、そのタンパク質含有酢酸溶液を
滅菌濾過して滅菌１０−バイアルに流し込み、そして滅
菌条件下に凍結した。

この実施例の目的は、ヒトの辺縁性歯周炎治療時の治ゆ
に及ぼす物質Ｅ３の影響をみることである。スエーデン
当局（ｔｈｅ　Ｓ−ｗｅｄｉｓｈ　ＭｅｄｉｃａｌＢｏ
ａｒｄおよびＴｈｅ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｅｔｈｉｏｓ
　Ｃｏｍｍ１ｔｔｅｅ）から許可を得た後、前記組成物
を辺縁性ｄ周炎患者の通常の外７叫治療に対する補助と
して用いた。患者に施術して歯石および肉芽ｇｉ織を除
去した。露出歯根表面に物質Ｅ６を”塗布（ｐａｉｎ−
ｔｅｄ　）″し、そして粘膜性骨膜フラップで披Ｊした
。治ゆ結果は、周期的−未検査、ポケット深度、結合レ
ベルおよび１肉指標の記録、および口腔内ラジオグラフ
の検査によって評価した。

それらの結果を通常の歯周手術を用いた従来の定量研究
、および同じ患者の類似コントロール部において得られ
た結果と比較した。

それらの結果は、物質Ｅ３が辺縁歯槽骨の品さ（範囲４
〜３　ｍ　）および結合レベル（範囲５〜９　ｔａｇ　
）の顕著な増大を促進させることを示した。これは従来
の歯周手術ではみもれなかった治ゆ結果である。従来の
歯周手術に関するこれまでの研究に比べ、臨床的外見お
よび辺縁ポケット深度低下のいずれに関しても治ゆは一
般により速かに進行することが明らかにされた。これら
の結果はエナメルマトリクスからの低分子量タンパク質
画分がヒトにおいて新たな１！１同組織結合を促進する
能力を有することを示しているが、これは従来の治療に
はみられなかったものである。

第４表 エナメルマ ２７．５ α３５ ０．６ ３．５ ０．４ １．３ ＜０．１ α１ 〈０．１ ＜０．１ Ｄ Ｏｌｌ ４．３ Ｄ Ｌｏｗｒｙ分析　　２５　　　　２０　　　７２アミノ
酸　　　＜２３　　　　＜２６　　　＜９０〈４ Ｄ Ａｎｔｒｏｎ試薬 Ｄ ０．４ １．３ Ｄ １１．３ １．７ ３．９ ４．４ ４．５ ５０．４ ６．８ １５．５ Ｄ Ｄ ０．７ ＧＣ−法 Ｄ Ｄ 分析 エナメルマ トリクスホ モジネート （Ｅｌ） 酸抽出物 （Ｅ６） アミノ顛分析 〔全残基に対する残基率 （−Ｗ／Ｗ）：］ Ｐｒ。

ｌｕ ｅｕ ｉｓ ｅｒ ｙｒ ｈｒ ａ１ ｅｔ １ｅ ｓｐ ｈｅ ｌａ ｙｓ ｒｇ ｒｐ ｙｓ 脱塩抽出物 （Ｅｌ　０） 塩両分 （実施例２） 骨治ゆの向上 「エナメルマトリクスのタンパク質画分の低分子量部分
」の骨治ゆ効果を成体ラットの下顎骨および大腿骨に作
った実験的空洞を用いて試験した。皮膚および咀噌筋を
外科的に垂直切開することＫより下顎骨の角部を露出さ
せた。生理学的食塩水を定常的に流しながら、下顎骨に
小孔（血縁２　ｔｓ　）を穿設した。同様にして、大腿
骨の速位部の緻密骨に下顎骨の場合と同じ大きさの小孔
を作った。右下顎骨と右大腿骨Ｋｒ！−ナメルマトリク
スのタンパク質画分の低分子量部分」を適用し、一方、
左下顎骨と左大腿骨の小孔はコントロール用空洞として
用いた。

「エナメルマトリクスのタンパク質画分の低分子量部分
」は凍結乾燥スポンジ様物質としであるいは小ゼラチン
円柱体として空洞内に適用した。これらのラットの左側
の下顎骨および大ｉ骨のコントロール用小孔には「エナ
メルマトリクスのタンパク質画分の低分子上ｕ部分」を
含まないゼラチン円柱体を充填した。乾燥、凍結乾燥し
た「エナメルマトリクスのタンパク質画分の低分子量部
分を与えたラットの左側の下顎骨および大腿骨のコント
ロール用小孔には何も適用しなかった。物質を適用後５
１Ｍ後にラットを屠殺した。実験区とコントロール区を
取り出しそして光学顕微鏡検査用に調製した〇穿設孔に
エナメルマトリクスのタンパク質画分の低分子量部分を
適用してから早くも１週後には、それは骨で完全に充填
されており、そして更に顕著な骨の骨膜付着が生じた。

本発明により治療されなかったコントロールにおいても
新しい骨形成はあったもののその程度は著しく低く、ま
た穿設孔は治ゆしなかった。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ図はエナメルマトリクスのＳＤＢ−Ｐａｇｅ分離
を示すものであり、第１Ｂ図はブタのエナメルマトリク
スからの抽出物の見かけ分子渣組成を示すものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）活性成分として歯牙エナメル質の前駆体、いわゆる
   エナメルマトリクスから得ることの出来るタンパク質画
   分を含有することを特徴とする、生体の無機化組織部分
   の少くとも一部分に無機化組織を再生させることにより
   該組織部分間に結合を誘導するための組成物。 ２）歯周炎治療のための請求項１記載の組成物。 ３）ヒトに用いるための請求項２記載の組成物。 ４）エナメルマトリクスが哺乳動物からのものである請
   求項１〜３項のいずれかに記載の組成物。 ５）エナメルマトリクスがウシまたはブタの生物種から
   のものである請求項４記載の組成物。 ６）前記タンパク質画分から成る請求項１〜５項のいず
   れかに記載の組成物。 ７）活性成分がタンパク質画分の低分子量部分またはそ
   の活性決定質により構成されている請求項１〜６項のい
   ずれかに記載の組成物。 ８）活性成分が一般にアメロゲニン類と称される酢酸で
   抽出可能なタンパク質により構成されている請求項７記
   載の組成物。 ９）活性成分が約４０，０００までの分子量を有する請
   求項７記載の組成物。 １０）活性成分が約５０００〜約２５０００の分子量を
   有する請求項９記載の組成物。 １１）活性成分がエナメルマトリクスのアメロゲニン部
   分の高分子量画分により構成されている請求項８記載の
   組成物。 １２）タンパク質画分を目的に対し許容し得る担体、希
   釈剤または接着剤と共に含有する、請求項１〜５のいず
   れか、および請求項１〜５に従属した請求項７〜１１に
   記載の組成物。 １３）担体、希釈剤または接着剤が歯科的または生物学
   的に許容し得る請求項１２記載の組成物。 １４）担体、希釈剤または接着剤が水溶性ポリマーより
   成る請求項１３記載の組成物。 １５）前記水溶性ポリマーがセルロース誘導体またはア
   ルギネートにより構成される請求項１４記載の組成物。 １６）歯牙エナメル質の前駆体、いわゆるエナメルマト
   リクスから得ることの出来る治療用タンパク画分。 １７）歯牙エナメル質の前駆体、いわゆるエナメルマト
   リクスから得ることが出来る、無機化組織の再生を要す
   る疾病または状態を治療するための医薬の製造のための
   タンパク質画分。 １８）歯牙エナメル質の前躯体、いわゆるエナメルマト
   リクスから得ることが出来る歯周炎を治療するための医
   薬の製造のためのタンパク質画分。 １９）活性成分として、歯牙エナメル質の前駆体、いわ
   ゆるエナメルマトリクスから得ることが出来るタンパク
   質画分を含んで成る歯周炎を治療するための薬学的組成
   物。 ２０）活性成分として、歯牙エナメル質の前駆体、いわ
   ゆるエナメルマトリクスから得ることの出来るタンパク
   質画分を含んで成る、無機化組織の再生を要する疾病ま
   たは状態の治療のための薬学的組成物。 ２１）生体の無機化組織部分の少くとも一部の連接部位
   （ｊｏｉｎｔ　ｓｉｔｅ）から軟組織がある場合にはそ
   れを除去し、該部分の少くとも一部分に、活性成分とし
   て歯牙エナメル質の前駆体、いわゆるエナメルマトリク
   スから得ることの出来るタンパク質画分を含有する組成
   物の層を適用し、次いで該部分を隣接させて無機化組織
   の再生を伴う結合を可能ならしめることを特徴とする、
   生体の無機化組織部分の少くとも一部分に無機化組織を
   再生することにより該組織部分間に結合を誘導する方法
   。 ２２）形成され得る上皮を除去しつつ歯根表面を露出さ
   せ、清浄化された歯根表面を前記組成物で被覆し、そし
   て被覆軟組織を再度位置決めしそして所望によりそれを
   縫合することにより侵襲を受けている歯部を治療して治
   ゆを図ることを特徴とする歯周炎治療のための請求項２
   １記載の方法。 ２３）エナメルマトリクスを哺乳動物を給源として単離
   する請求項２１記載の方法。 ２４）前記エナメルマトリクスがウシまたはブタを給源
   として単離される請求項２３記載の方法。 ２５）タンパク質画分またはその活性決定質が組換えＤ
   ＮＡ技術または二倍体細胞の培養により得られる請求項
   ２１記載の方法。 ２６）哺乳動物の顎から歯胚を単離し、エナメル器から
   歯胚を遊離させ、その遊離させた歯胚からエナメルマト
   リクスを回収し、エナメルマトリクスをホモジナイズし
   、そのホモジナイズされたエナメルマトリクスからタン
   パク質画分を分離し、そして所望によりそれをその目的
   に許容し得る担体、希釈剤または接着剤と混合すること
   を特徴とする、生体の無機化組織部分の少くとも一部分
   に無機化組織を再生することにより該組織部分間に結合
   を誘導するための組成物の製造方法。 ２７）単離がウシまたはブタを給源として行われる請求
   項２６記載の類似方法。 ２８）前記担体、希釈剤または接着剤が歯科的または生
   物学的に許容し得る請求項２６または２７記載の類似方
   法。