WO1999012412A1 - Method for producing virus-free red pepper plant seedlings - Google Patents

Method for producing virus-free red pepper plant seedlings Download PDF

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Mamiko Yui
Hiroshi Yuasa
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a virus-free pepper plant seedling by vegetative propagation.
  • the present invention relates to a method for producing a virus-free pepper plant seedling by vegetative propagation using a growing point culture technique.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a virus-free pepper plant seedling. It is.
  • an object of the present invention is a plant belonging to a pepper plant, which has a large fruit and a sweet taste of the fruit, and which is widely used as a "pepper” (hereinafter sometimes referred to as a "pimentan plant”). )) Is to provide a method for producing seedlings.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a seedling of a red pepper plant imparted with juvenility by growing point culture. Disclosure of the invention
  • a cut section of a slice obtained by cutting a growth point of a pepper plant to be propagated is brought into contact with a cut surface of a growing stock obtained by cutting a solanaceous plant seedling that has been separately aseptically grown.
  • the present invention provides a virus-free method for producing a pepper plant seedling, which comprises elongating the slice on a cut surface of a growing stock and growing a pepper plant seedling from the elongated shoot. .
  • the method of the present invention comprises a step of obtaining a rootstock of a solanaceous plant, a step of obtaining a section of a growing point of a pepper plant, a step of obtaining a shot obtained by extending the section of the growing point, and a step of obtaining a seedling of a pepper plant from the shoot.
  • the solanaceous plant to be the breeding rootstock is not particularly limited as long as it belongs to the Solanaceae plant, and is preferably a plant belonging to the same genus as Capsicum, Caps i cum bacca tum, Caps ic um ch inense, Caps i cum fr tescens, etc., more preferably, the same pepper plant (Caps i cum annuum L.) that is about to proliferate, and most preferably, a pepper plant.
  • the growing rootstock is obtained from aseptically grown solanaceous plants.A method for aseptically growing solanaceous plants is to seed seeds that have been disinfected with seeds on a medium used for plant tissue culture.
  • Germinate in a culture room where the solanaceous plants are grown There is no particular limitation on how large a rootstock can be obtained by growing a Solanaceae plant, but it is preferable that at least two weeks have passed after sowing, and that about 13 true leaves have developed. Uses solanaceous plants.
  • the stem of the Solanaceae plant thus grown is cut with a sharp knife to form a growing stock.
  • the position where the stem is cut is not particularly limited, but is preferably the epicotyl part on the cotyledon.
  • the cutting surface of the breeding rootstock may be horizontal, but it is preferable to incline it about 45 degrees with respect to the horizontal plane. May not be.
  • the water passing through the vessel will accumulate on the cut surface, and the slice of the growth point placed on the cut surface of the breeding stock may be washed away.
  • a step of obtaining a slice of a growth point of a pepper plant will be described.
  • the method of extracting the growth point is not particularly limited. For example, the following method is used. In other words, techniques are collected from growing pepper plants, and the leaves are removed in the laboratory to make it easier to extract the growing point. In order to aseptically remove the growing point, it may be sterilized by spraying with ethanol in advance.
  • the growth point of the pepper plant is at the base of the axillary bud, etc., and is cut and removed using a scalpel under a stereoscopic microscope.
  • the size of the section including the extracted growth point is preferably 0.3 to 0.5 mm. It is not limited to this. If the plant from which the growing point is to be removed is confirmed to be virus-free and the sole purpose of cultivating the growing point is to grow the growing point, the size of the section containing the growing point should be further increased. Is also possible.
  • the section of the growing point is placed on the cutting section of the growing stock such that the cutting section of the growing section and the cutting section of the growing stock contact each other.
  • the placement position is preferably the vascular bundle around the cut surface. If the cut surface of the growing stock is inclined, it is preferable to place it above the inclined surface.
  • the section of the growth point When the section of the growth point is placed on the breeding stock for a predetermined period of time, preferably, for 13 weeks, the section of the growth point elongates to form a shoot. If the growing point of the growing stock grows during this time, it is preferably removed aseptically.
  • the last step of obtaining a pepper plant seedling from the shoot is according to a conventional method. For example, a shot obtained by elongating a section at the growth point is cut into a plurality of pieces as necessary, and then each shoot is cut into a prepared medium for plant tissue culture, and then cut. Roots, stems and leaves can be grown and grown in pepper plant seedlings if the temperature and humidity and light conditions are suitable.
  • the obtained pepper plant seedlings are subjected to acclimatization treatment, if necessary, so that they can be cultivated in a pipe house or a field.
  • the medium used for the plant tissue culture used in the above method of the present invention is not particularly limited.
  • it is a known MS medium, N6 medium or B5 medium, and more preferably, MS medium.
  • agar is added to the above-mentioned medium to form a solid medium, and various plant hormones can be added as needed.
  • a medium used for culturing these plant tissues a pepper plant that can be aseptically grown from a pepper seed is grown or a cut obtained by extending a section of a growing point of a pepper is used as a medium. It can be cut and grown aseptically to obtain a pepper plant seedling.
  • Browning line F 20005 line shoots growing vigorously were selected and collected from the tip of the branch at a length of about 20 cm. The length was adjusted to about 5 cm in order to remove the leaves and make it easier to extract the growth point in the laboratory. Sterilization was not performed to remove the growing point, but when spikes were found in the collected shoots, about 70% ethanol was sprayed on the entire shoot in order to prevent contamination by various bacteria. After the above treatment, a section of the growth point was excised to a size of about 0.3-0.5 mm by using a scalpel under a stereo microscope installed in a clean bench. Growth points were found at the base of many axillary buds, but those that were morphologically determined to have differentiated into flower buds were not removed.
  • a section of the growth point obtained by the method of Example 2 was placed on the cut surface of the epicotyl of the growing rootstock prepared by the method of Example 1. At this time, the cut surface of the section at the growth point and the cut surface of the growing stock were placed so as to be in contact with each other. This work was performed using a stereo microscope in a clean bench, and the section of the growth point was placed on the cut surface of the growing stock, at the periphery of the cut surface of the epicotyl of the growing stock, and After completing the work of placing the section of the growth point, which is the vascular bundle above the surface, on the cutting surface of the growing stock, immediately move the test tube to a culture room at 25 ° C for 12 hours, and Culture was continued.
  • the growth point of the growing stock starts to grow after the growth point section has taken root on the cutting surface of the growing stock but before the growth point piece has started growing, the growth of the growing point piece will be promoted. For this reason, the shoots where the growing point of the rootstock grew were removed under aseptic conditions.
  • the two growth point sections were elongated and shoots were formed.
  • the cut shoots were cut into a rooting medium.
  • the medium for rooting was prepared by adding IAA (indoleacetic acid) at a concentration of 1 mg / 1 to the medium composition for aseptic sowing used in Example 1.
  • Agripot Karlin Brewery Co., Ltd.
  • the roots of the transplanted shoots were observed from about one week later, and one month later, they grew on green pepper plants about 5 cm in height.
  • the pepper seedlings were acclimated to produce healthy pepper seedlings that can grow in a pipe house.
  • the acclimatization treatment is carried out for 2 days under light-shielded conditions, and a plastic container is placed over the cultivated Piman seedlings to prevent excessive evaporation of water. It was done.
  • Rootstock varieties include California Wonder (Sakata Seed Co., Ltd.), Wonder Bell (Yukiki Seedling Co., Ltd.), and Kyonami (Takii Seedling)
  • the scion cultivars that is, the growing points were extracted, and the cultivars in contact with the rootstock were California Wonder, Keinami and selected strains (CU02SY).
  • California Wonder As a result of placing a total of 50 growth points on the cut surface of the hypocotyl of the rootstock plant, 16 shoots could be induced. Among them, the highest rate of inducing shoots was when California Wonder was used as a rootstock, with a rate of 60%.
  • Rootstock Species Scion varieties Number of grafts No. of cuts Efficiency (%) 7 wanders in caliphs-California wanders-2 1 50. 0 Kyoba 13 10 76.2 Selected strains 5 1 20.0 (subtotal) 20 12 60. 0 Kyonami California Wander 3 0 0

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Description

明糸田 ¾ ウィルスフリ一のトウガラシ植物苗生産方法
発明の属する技術分野
本発明は、 栄養増殖によるウィルスフリ一のトウガラシ植物苗生産方法に関す る。 特に、 成長点培養技術を利用した栄養増殖によるウィルスフリーのトウガラ シ植物苗生産方法に関する。 従来の技術
成長点培養技術をはじめとする培養増殖技術及び接ぎ木、 揷し芽等の植物苗増 殖技術の進歩により、 従来、 種子で生産されてきた野菜、 花卉類でも栄養増殖に より植物苗を生産することが可能になりつつある。 栄養増殖を行うにあたって、 これらの技術はいずれも重要なものであるが、 特に成長点培養技術は、 ウィルス フリ一化及び植物体の若返りを図る技術として、 栄養増殖を行う際に非常に重要 な技術である。 ウィルスの感染が、 最終生産物の品質及び収量に大きな影響をも たらす作物にとっては、 必須の技術である。
トマトでは、 成長点培養の技術がすでに確立され、 栄養増殖により植物苗を生 産することが可能となっているカ^ 同じナス科に属する トウガラシ植物では、 成 長点培養及び成熟個体の試験管内増殖が困難で、 それらに関する報告例はなく、 従って栄養増殖によるウィルスフリ一の植物苗生産も不可能であった。 発明が解決しょうとする課題
前述の通り、 従来、 トウガラン植物 （Caps i cum annuum L. ) においては、 成長 点培養が不可能であった。 この課題について、 発明者らは、 鋭意研究の結果、 卜 ゥガラシ植物においてはじめて成長点培養を可能とし、 本発明ウィルスフリ一の 卜ゥガラシ植物苗生産方法を完成した。
本発明の目的は、 ウィルスフリ一のトウガラシ植物苗生産方法を提供すること である。 特に、 本発明の目的は、 トウガラシ植物に属する、 果実が大きく、 その 果実の味が甘味である、 「ピーマン」 として普及している植物 （以下、 「ピ一マ ン植物」 と呼ぶことがある。 ） の苗生産方法を提供することである。 本発明の他 の目的は、 成長点培養によって、 幼若性を付与したトウガラン植物苗の生産方法 を提供することである。 発明の開示
本発明は、 増殖しょうとする トウガラシ植物の成長点を切断して得た切片の切 断面を、 別に無菌的に生育させたナス科植物苗を切断して得た育成台木の切断面 に接触させることによって、 該切片を育成台木の切断面上において伸長させ、 伸 長したシュートからトウガラシ植物苗を育成することを特徴とするウィルスフリ 一のトウガラシ植物苗生産方法を要旨とするものである。
本発明方法は、 ナス科植物の育成台木を得る工程、 トウガラン植物の成長点の 切片を得る工程、 成長点の切片を伸長させたシユートを得る工程及びシユートか らトウガラン植物苗を得る工程からなる。
まず、 ナス科植物の育成台木を得る工程について説明する。
育成台木となるナス科植物は、 ナス科に属する植物であれば特に限定されない 力く、 好ましくは、 トウガラシと同じ属に属する植物 Caps i cum bacca tum 、 Caps i c um ch i nense 、 Caps i cum f ru tescens などであり、 さらに好ましくは、 増殖しよ うとする同じトウガラシ植物 （Caps i cum annuum L. ) であり、 最も好ましくは、 ピーマン植物である。 育成台木は、 無菌的に生育されたナス科植物から得られる ナス科植物を無菌的に育成する方法としては、 種子消毒した種子を植物組織培養 に使われる培地の上に播種し、 組織培養を行う培養室内にいれて発芽させ、 ナス 科植物を生育させる。 ナス科植物を生育させて、 どのく らいの大きさの育成台木 を得るかについては、 特に限定されないが、 好ましくは、 播種後 2週間以上経過 した、 本葉が 1 一 3枚程度展開したナス科植物を用いる。 このように育成された ナス科植物の茎を鋭利な刃物で切断し、 育成台木とする。 茎を切断する位置は、 特に限定されないが、 好ましくは、 子葉の上の上胚軸の部分である。 育成台木の 切断面は、 水平としてもよいが、 水平面に対して 45度程度傾斜させた方が好まし い場合がある。 水平とした場合には、 道管を通る水分が切断面にたまり、 育成台 木の切断面上に置いた成長点の切片が流されてしまう場合があるからである。 次に、 トウガラシ植物の成長点の切片を得る工程について説明する。
パイプハウス又は畑で生育している トウガラン植物のなかから、 栄養増殖しよ うとする対象のトウガラシ植物を選んで、 成長点を取り出す。 成長点を取り出す 方法については、 特に限定されないが、 例えば、 次のような方法で行う。 すなわ ち、 生育中のトウガラシ植物から、 技先を採取して、 実験室内で葉を取り除き、 成長点を取り出しやすくする。 成長点を無菌的に取り出すために、 あらかじめェ タノールを噴霧して、 消毒してもよい。 トウガラシ植物の成長点は、 腋芽の基部 などに有り、 実体顕微鏡下でメスを用いて切断し、 取り出す。 取り出した成長点 を含む切片の大きさは、 好ましくは、 0. 3 - 0. 5 mmである。 これに限るものでは ない。 成長点を取り出す対象の植物が、 ウィルスフリーであることが確認されて いて、 単に幼若化のみが成長点培養の目的である場合には、 成長点を含む切片の 大きさをさらに大きくすることも可能である。
次に、 成長点の切片を伸長させたシユ ートを得る工程について説明する。
成長点の切片は、 前述した育成台木の切断面上に、 成長点の切片の切断面と育 成台木の切断面が互いに接触するようにして、 置かれる。 置く位置は、 好ましく は、 切断面の周辺にある維管束部であり、 育成台木の切断面が傾斜している場合 には、 傾斜面の上方に置くのが好ましい。
このように成長点の切片を育成台木の上に載せて所定期間、 好ましくは、 1 一 3週間経過させると、 成長点の切片が伸長して、 シュートを形成する。 この間に、 育成台木の自身の成長点が伸長した場合は、 好ましくは、 無菌的に除去する。 最後の、 シュートからトウガラシ植物苗を得る工程は、 常法による。 例えば、 成 長点の切片を伸長させて得られたシュ一トを、 必要に応じて複数本に切断した後 に、 あらかじめ準備した植物組織培養のための培地に各シュートを挿し木し、 生 成に適する温湿度及び光条件におけば、 根、 茎及び葉が生育しトウガラシ植物苗 に生育させることができる。 さらに、 得られたトウガラシ植物苗は、 必要に応じ て、 パイプハウス又は畑で栽培できるようにするために、 順化処理が施される。 以上の本発明方法に用いられる植物組織培養に使われる培地は、 特に限定され ないが、 好ましくは、 公知の M S培地、 N 6培地又は B 5培地であり、 さらに好 ましくは、 M S培地である。 また、 上記培地には、 好ましくは、 寒天を加えて固 形培地とし、 必要に応じて、 各種植物ホルモンを適宜加えることもできる。 これらの植物組織培養に使われる培地を用いて、 トウガラシ種子からの無菌的 に育成台木となる トウガラシ植物を生育させ、 或いは卜ゥガラシの成長点の切片 を伸長させて得られたシユートを培地に挿し木して、 無菌的に生育させてトウガ ラシ植物苗を得ることができる。 実施例
〔実施例 1〕 ナス科植物の育成台木を得る工程
トウガラシ植物 （Caps i cum annuum L. ) に属するピーマン植物の品種 "土佐ひ かり D " ( (有） 南国育種研究農場） 及び " K E L V I N " (DeRu i ter Seeds) の種子を有効塩素濃度 1 %の次亜鉛素酸ソーダ水溶液で、 10分間処理し表面殺菌 を行った。 次に滅菌済みの水で種子を 2回洗浄し、 余分の水分を濾紙により吸水 させた後、 あらかじめ用意しておいた各種栄養成分を含み、 オートクレープで滅 菌処理をした培地に 1試験管あたり 1粒を置床した。 培地には M S培地を用い、 しょ糖を 2 %濃度で加え、 pHを 5. 8に調整後、 0. 8 %濃度で寒天を加えたものを 用いた。 置床作業後、 種子は 25°C、 12時間日長の培養室で生育させた。 培養開始 後、 約 3週間で育成台木として利用可能な生育ステージに達した。 次の実施例 2 で述べる成長点の切片を摘出する直前に、 育成台木とするために、 生育した上胚 軸を鋭利な刃物で切断した。 切断面は胚軸に対して約 45度の傾斜角度になるよう に切断した。
〔実施例 2〕 トウガラシ植物の成長点の切片を得る工程
成長点の切片を摘出するために、 パイプハウスで育成中のピーマン植物母株
(育成系統 F 20005系統） から、 旺盛に育成しているシュートを選び、 枝先から 20cm程度の長さで採取した。 実験室内で葉う取り除き成長点を摘出しやすくする 目的で 5 cm程度の長さに調整した。 成長点の摘出にあたって滅菌処理は行わなか つたが、 採取したシュートにハダ二が認められたときは、 雑菌の混入を防ぐ目的 で 70 %程度のェタノ一ルをシユー卜全体に噴霧した。 上記の処理後、 クリーンベンチ内に設置した実体顕微鏡下でメスを用いること により、 0. 3 - 0. 5 議程度の大きさで成長点の切片を摘出した。 成長点は多数の 腋芽の基部に見いだされたが、 花芽に分化していると形態的に判断されたものは 摘出しなかった。
〔実施例 3〕 成長点の切片を伸長させたシユ ー卜を得る工程
実施例 2の方法により得られた成長点の切片を、 実施例 1の方法により調製さ れた育成台木の上胚軸の切断面上に置いた。 この際、 成長点の切片の切断面と育 成台木の切断面とを、 互いに接触するように置いた。 この作業は、 クリーンベン チ内で実体顕微鏡を用いて行い、 育成台木の切断面に成長点の切片を置く場所は、 育成台木の上胚軸の切断面の周辺部であって、 傾斜面の上方部の維管束部とした 成長点の切片を育成台木の切断面上に置く作業が終了した後、 速やかに 25°C、 12 時間日長の培養室に試験管を移動し、 培養を継続した。 成長点の切片が育成台木 の切断面に活着した後、 成長点の切片の伸長が開始する以前に、 育成台木の成長 点の伸長が開始した場合は、 成長点の切片の成長を促すために、 育成台木の成長 点が伸長したシュ一トを無菌条件下で除去した。
上記の方法により、 30個の成長点の切片を育成台木に置いた結果、 2個の成長 点の切片が伸長して、 シュートが形成された。
〔実施例 4〕 シュートからトウガラシ植物苗を得る工程
育成台木の切断面上に置いた成長点の切片が伸長して得られたシユ ー卜が、 2 ~ 3 cmに伸長した時点で、 育成台木と接触させた位置の上部のシユ ートをメスに より切断した。
切断されたシュートは、 発根用の培地に挿し木した。 発根用の培地には実施例 1で用いた無菌播種用の培地組成に I A A (イ ンドール酢酸） を 1 mg/ 1の濃度 で添加し、 調製したものを用いた。 培養容器には、 ァグリポッ ト （キリ ンビール (株） ) を用い、 各容器に 50mlの培地を分注した。 移植されたシュートは、 約 1 週間後から発根が認められ、 1力月後、 高さ 5 cm程度のピーマン植物苗に生育し た。 このピーマン植物苗を順化処理して、 パイプハウスで生育可能な健全なピー マン植物苗とした。 順化処理は、 遮光条件下で 2日間行い、 培養して得られたピ 一マン植物苗にプラスチック性の容器を被せ、 水分の過度の蒸発を防ぐことによ つて行われた。
〔実施例 5〕 台木品種の選定
実施例 1 ~ 3に記載した手法により、 実施例 1記載以外の品種を台木として用 い、 その胚軸の切断面上に摘出した成長点を置床し、 シュートの伸長を誘導する のに適した台木を選定した。 台木品種としては、 カリフォルニアワンダー （ （ 株） サカタのタネ） 、 ワンダーベル （夕キイ種苗 （株） ） 、 京波 （タキイ種苗
(株） ） を用いた。 接ぎ穂品種すなわち成長点を摘出し、 台木に接ぐ品種には、 カリフォルニアワンダー、 京波及び選抜株 （CU02SY) を用いた。 合計で 50個の成 長点を台木となる植物体の胚軸の切断面上に置床した結果、 16本のシユ ートを誘 導することができた。 その中で最も高率で、 シュートを誘導することができたの は、 カリフォルニアワンダーを台木として用いた場合で、 その率は 60%であった
(表 1 ) 。
表 1 . 台木品種とシュート誘導本数の関係
台木 種 接ぎ穂品種 接ぎ木数 ン 一卜本数 効率 （％) カリフ に 7ワンダ- カリフォルニアワンダ- 2 1 50. 0 京波 13 10 76. 2 選抜株 5 1 20. 0 (小計） 20 12 60. 0 京波 カリフォルニアワンダ- ァ 3 0 0
京波 11 0 0 選抜株 5 0 0
(小計） 19 0 0 ヮンターべノレ 京波 9 3 33. 3 選抜株 2 1 50. 0 (小計） 11 4 36. 4 発明の効果
以上述べた本発明方法により、 はじめてトウガラシ植物、 特にピーマン植物、 の成長点培養が可能となった。 本発明方法によって、 栄養増殖によるウィルスフ リーのトウガラシ植物苗生産が可能になつた。

Claims

請求の範囲
1 . 増殖しょうとする トウガラシ植物の成長点を切断して得た切片の切断面を、 別に無菌的に生育させたナス科植物苗を切断して得た育成台木の切断面に接触さ せることによって、 該切片を育成台木の切断面上において伸長させ、 伸長したシ ユ ー卜からトウガラシ植物苗を育成することを特徴とするウィルスフリーのトウ ガラシ植物苗生産方法。
2 . 育成台木がトウガラン植物苗であることを特徴とする請求項 1に記載のゥ ィルスフリーのトウガラシ植物苗生産方法。
3 . 伸長したシュートを複数本に切断してから、 複数本のトウガラシ植物苗を 育成することを特徴とする請求項 1ないし 2に記載のウィルスフリーのトウガラ シ植物苗生産方法。
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