WO1999012972A1 - Anticorps monoclonal contre des monocytes humains - Google Patents

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Definitions

  • Monoclonal antibodies against human mononuclear cells TECHNICAL FIELD-The present invention relates to a monoclonal antibody against human mononuclear cells, which is useful for studying and treating inflammatory responses, and which inhibits extravasation of human mononuclear cells after vascular endothelial cell culture, and a monoclonal antibody against the same. It relates to the produced hybridoma. Background art
  • the inflammatory response is the most important biological response in host defense, minimizing tissue damage due to bacterial and viral infections and promoting power and tissue repair.
  • inflammatory reactions can also cause progressive damage to the body, such as intractable diseases of unknown origin, such as autoimmune diseases. Therefore, elucidation of the mechanism and pathology of the inflammatory response is essential for the treatment of these intractable diseases.
  • migration of peripheral circulating leukocytes to extravascular tissues is the earliest phenomenon of inflammation, and its control is an important goal of therapeutic strategies for chronic inflammatory diseases.
  • T lymphocytes which play a central role in the immune response, are completely unknown. Blood after adhesion of T lymphocytes to vascular endothelial cells Regarding extravasation, not all adherent cells migrate, and the selectivity is clearly working. It is strongly presumed that such selectivity factors play an important role in the development and progression of chronic inflammation. Determining the identity and function of these factors is crucial for inflammation research and the development of inflammation treatments, and many researchers have been waiting for. To study such a factor, it is useful to obtain a monoclonal antibody against the factor, but to date it has not been obtained.
  • an object of the present invention is to provide a monoclonal antibody against a factor involved in extravasation of human leukocytes, particularly monocytes, after adhesion of vascular endothelial cells. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted various studies to solve the above-mentioned problems, and found that human mononuclear cells having adhesiveness to human vascular endothelial cells, and human vascular endothelial cells cultured in a monolayer on a collagen gel were used as gels.
  • antigen-screening is performed by determining the inhibition of T lymphocyte adhesion and migration using vascular endothelial cells cultured on collagen gel.
  • the inventors have found that a monoclonal antibody that inhibits extravasation after endothelial cell adhesion can be obtained, and completed the present invention.
  • the present invention provides a monoclonal antibody against human mononuclear cells, which has the ability to inhibit extravasation of human mononuclear cells after adhesion of vascular endothelial cells.
  • the present invention also provides a hybridoma that produces the above monoclonal antibody.
  • FIG. 1 is a graph showing the fluorescence intensity (reactivity with the monoclonal antibody of the present invention) of granulocytes, monocytes and lymphocytes of healthy subjects.
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody of the present invention is a cell fusion method using human mononuclear cells as an antigen, i.e., fusion of mammalian antibody-producing cells immunized with human mononuclear cells and mammalian myeloma cells.
  • the mammal to be immunized here is more preferably a mouse, a heron, a rat, a goat, a chick or the like, and a mosquito or a mouse.
  • the antigen may be human mononuclear cells.
  • Human mononuclear cells (a) that adhere to human vascular endothelial cells, and human monocytes that migrated into the gel from human vascular endothelial cells monolayer cultured on collagen gel. It is preferable to use in combination with the nucleus (b), and it is particularly preferable to use (a) as the sensitizing antigen and (b) as the final immunizing antigen.
  • Human mononuclear cells can be obtained from peripheral blood, synovial fluid, pleural effusion, etc., but those collected from peripheral blood are preferred.
  • the immunization method can be in accordance with a general method.
  • the antigen mononuclear cells described above are suspended in a normal buffer solution / physiological saline. The same operation may be repeated as necessary after administration to the animal by an appropriate route such as intraperitoneal or subcutaneous stimulation and temporary stimulation.
  • the dose of the mononuclear cell used as the antigen is appropriately determined according to the route of administration, the type of mammal, etc., but when administered intraperitoneally or intravenously to mice, the usual dose is 1X per dose. it is appropriate to the 1 0 7 cells / mouse about.
  • antibody-producing cells such as spleen cells, lymph nodes, and peripheral blood are collected.
  • Spleen cells are preferred as antibody-producing cells.
  • Myeloma cells include various well-known cell lines that have already been established, for example, P3 / NSl / l-Ag4-KNSl in mice), SP2 / 0-Agl4 (SP2), ⁇ 3 ⁇ 63-Ag8 (x63) , P3 / x63-Ag8.Ul CP3Ul), F0, MCP-11, x63.653, S194, etc. Agl. 2.3 (Y3) etc. can be used.
  • the fusion reaction between the antibody-producing cells and the myeloma cells is performed by a known method, for example, a polyethylene glycol method, an electrofusion method, or the like.
  • the selection of hybridomas that have acquired the antibody-producing ability and the proliferation ability is performed, for example, by culturing for several days to several weeks in a HAT medium. -- ⁇ Search for the antibody-producing strain of interest from the hybridomas obtained in this way. The search for the target antibody-producing strain is performed by measuring the migration ability of human mononuclear cells after adhesion of vascular endothelial cells. That is, a hybridoma that does not inhibit the adhesion between human mononuclear cells and vascular endothelial cells and that inhibits migration after adhesion is selected.
  • Cloning of the selected hybridoma is preferably carried out by a limiting dilution method—a force that can be carried out by the so-called overnight loan method, or by an ultra dilution method.
  • the thus obtained hybridomas can be subcultured in a normal medium, and can be easily and stably stored in liquid nitrogen for a long period of time.
  • Production of the monoclonal antibody of the present invention from the above-described hybridoma is carried out by culturing the hybridoma according to a conventional method and separating it from the culture supernatant, or administering the hybridoma to a mammal compatible therewith, It can be carried out by a usual method such as a method of growing and separating from ascites of the animal.
  • the former method is particularly suitable for obtaining high purity, and the latter method is suitable for mass production.
  • the monoclonal antibody of the present invention produced as described above can be further purified, for example, by immunoglobulin fractionation by ordinary separation means such as ammonium sulfate fractionation and gel filtration such as DEAE cellulose column chromatography.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by isolating the components.
  • Antigen is co-cultured with human umbilical vein endothelial cells before immunizing animals with human peripheral blood mononuclear cells
  • the remaining mononuclear cells (a) except the non-adherent mononuclear cells were used.
  • nuclei were added to human umbilical vein endothelial cells cultured monolayer on type 1 collagen gel, and after 5 hours, mononuclear cells migrated into the collagen gel under the monolayer endothelial cells (b ) was used as an antigen. That is, a gel culture medium with a final concentration of type 1 collagen of 0.8 mg ZTT was prepared in a 60-ml plastic petri dish, and a human umbilical vein suspended in a culture medium containing endothelial cell growth factor was placed on top of this.
  • Endothelial cells were added and cultured to form a monolayer. After a complete monolayer, mononuclear cells were added and cultured. After a certain time, the endothelial cells on the collagen gel and the mononuclear cells that did not migrate into the gel were removed with 0.4% EDTA, then the collagen gel was treated with collagenase, and the mononuclear cells migrated into the gel. (B) was isolated.
  • the mononuclear cells (a) were suspended in phosphate buffer, a 1 XI 0 7 cells per animal for mice were injected into the peritoneal cavity. This was repeated at least 4 times every 2 to 4 weeks.
  • For the final immunization about 1 ⁇ 10 7 migrating monocytes (b) isolated from the collagen gel as described above were directly administered to mice intravenously.
  • the spleen was excised from the mouse, and 1 ⁇ 10 3 spleen cell suspensions containing antibody-producing cells were prepared and subjected to fusion with a myeloma cell line. This cell line was subcultured in RPMI-164 medium containing 10% fetal calf serum (FCS), and 5 to 10 min of the number of spleen cells prepared.
  • FCS fetal calf serum
  • the cell pellet was prepared in HAT medium supplemented with inleukin 6 so that the spleen cells became 1 ⁇ 10 / m &, and 0.1 per each well was spread on a 96-well flat bottom plastic plate. The cells were cultured at 37 ° C. until the hybridomas proliferated sufficiently. -— ⁇ — ⁇
  • the culture supernatant of the selected hybridoma group was screened for a hybridoma producing the desired antibody using a system for measuring the migration of human mononuclear cells after adhesion of vascular endothelial cells. That is, the method described in (1) was applied, and human umbilical vein endothelial cells cultured monolayer on collagen gel 50 / ⁇ added to a 96-well flat bottom plastic plate were used. To the plate thus prepared, 50 ⁇ of the hybridoma supernatant and 50 ⁇ of the human mononuclear cell suspension were added and cultured.
  • Cloning of the selected hybridomas was performed by limiting dilution. By repeating the limiting dilution method three to four times, selecting a hybridoma with a high antibody titer, and selecting the hybridoma strain producing the antibody with a high migration inhibition rate and a hybridoma producing an antibody. And
  • the obtained hybridoma strain was suspended in a growth medium containing IL-16 and allowed to grow, and then injected into the peritoneal cavity of mice of the same strain to obtain ascites. Next, protein The IgG fraction was purified from the ascites fluid using an A column.
  • the monoclonal antibody 4C8 obtained above has an isotype of IgG3 and 1
  • the migration of monocytes, including lymphocytes and T lymphocytes, under the endothelial cells after endothelial cell adhesion was inhibited by approximately 80% to 90%.
  • the characteristics of the obtained ⁇ monoclonal antibody of the present invention were discussed. ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ 1 1 ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ 1 ⁇ ⁇ 1 ⁇ ⁇ 1 ⁇ ⁇ .
  • NK cells Reacts with human lymphocytes, NK cells, monocytes, granulocytes including eosinophils, and vascular endothelial cells.
  • a 96-well flat-bottomed plastic plate was prepared by treating 3 to 30 zgZ of purified anti-4C8 antibody or control IgG3 with 100 // Zwel 1 for 18 hours at 4 ° C. .
  • Mononuclear cells are collected from the blood of a healthy person by specific gravity centrifugation, and then the fraction passed through a nylon wool column is used as lymphocytes. The cells were suspended in 1 ⁇ 1-1640 medium. Was added to each well of lymphocyte 3 X 1 0 5 pieces of prepared plates were incubated at 1-3 hours 3 7 ° C. After the culture, the cells were well sprayed with a pipette and collected, and the cells were washed once with PBS.
  • Phal loidin specifically binds to polymerized actin, that is, filament actin, so fluorescently-labeled Phal loidin is treated on 3% varaformaldehyde-fixed mononuclear cells, and the degree of binding is determined by flow cytometry. I checked in one. "Results: In the lymphocyte fraction gated by flow cytometry, the number of Phal loidin-positive cells was around 20% for control IgG3, but concentration-dependent for the plate treated with anti-4C8 antibody. In the meantime, the number of Phal loidin-positive cells increased to reach a maximum of 65%, indicating that stimulation through the 4C8 antigen induces actin polymerization in lymphocytes.
  • Anti-4C8 antibodies were used as ligands to determine whether stimulation of 4C8 antigen on lymphocyte surface induced lymphocyte migration. Ie 9 6 holes . Create the Kola one Gengeru that mixed in various concentrations of anti-4 C 8 antibody flat bottom plate is,; the Ml 9 9 lymphocytes 3 X 1 0 5 cells was suspended in serum-free medium to each well in Les Was added. After culturing for 3 hours, 0.4% EDTA was added to remove lymphocytes attached to the gel, and the number of lymphocytes per unit area migrated into the gel was counted under a phase-contrast microscope.
  • the plate treated with the anti-4C8 antibody as shown in 2) was further treated with 3% BSA for 2 hours at 37 ° C. This, 51 C r labeled human lymphocytes 3 X 1 0 5 cells were added in 1 hour, were cultured in 3 7 ° C. After the culture, non-adherent cells were removed, and the adherent cells were lysed with 1 N Na ⁇ H, and the radioactivity was measured with a gamma counter. The difference between the radioactivity of the whole cells added and the radioactivity in the control well as the denominator, and the difference between the radioactivity in the 4C8 antibody-treated well and the radioactivity in the control well as the numerator was 100 times The result was defined as% adhesion.
  • a plate treated with an anti-4C8 antibody was prepared as shown in 2), and human lymphocytes prepared in the same manner were added thereto. After culturing for 1 hour, lymphocytes are collected, stained with a fluorescent-labeled anti-CD69 monoclonal antibody, and then subjected to flow cytometry for fluorescence. The light intensity was measured.
  • the 4C8 antigen is not expressed on healthy human granulocytes, but is expressed on patients with rheumatoid arthritis. Therefore, granulocytes were collected from such patients and examined whether stimulation of the 4C8 antigen activated granulocytes. That is, peripheral blood was mixed with 1% dextran sulfate at a ratio of 1: 0.75, allowed to stand for 40 to 50 minutes, and then the upper layer was taken. This was overlaid on the Ficoll-Conray solution. After centrifugation for 30 minutes, the supernatant was aspirated, and the cell pellet was further washed with PBS three times at 4 ° C. Finally, the granulocytes were suspended in RPM I-164 medium.
  • Anti-rheumatic drug administration suppresses 4C8 expression of mononuclear cells and granulocytes in patients with rheumatoid arthritis.
  • Mononuclear 4C8 antigen is attenuated, especially in rheumatoid patients who responded successfully to anti-rheumatic drugs, compared to untreated or active patients. Was significantly attenuated. In addition, some active rheumatic patients 3 ⁇ 4 ⁇
  • the present invention has revealed that these mechanisms It has become possible to analyze the order at the cellular, protein, and molecular levels.
  • the expression of the molecule recognized by the antibody of the present invention is related to various disease states and diseases, it can be applied to clinical diagnosis and treatment.

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Description

明 細 書 ヒト単核球に対するモノクローナル抗体
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技術分野 - ： 本発明はヒト単核球に対するモノクローナル抗体であって、 炎症反応の研究、 治療に有用なヒト単核球の血管内皮細胞培養後の血管外遊走を阻止するモノクロ ーナル抗体及びこれを産生するハイプリ ドーマに関する。 背景技術
炎症反応は生体防御の上で最も重要な生体反応であり、 細菌やウィルス感染に よる組織障害を最小限に抑え、 力、つ組織修復を促進する。 しかしまた炎症反応は 自己免疫性疾患などの原因不明の難治性疾患のように生体にとつて進行性の障害 を引き起こすこともある。 従って、 炎症反応の機序や病態の解明はこれらの難治 性疾患の治療に不可欠である。 炎症反応の機序を考えるにあたって、 末梢循環白 血球の血管外組織への遊走は炎症の最も早期に見られる現象で、 その制御は慢性 炎症性疾患の治療戦略の重要な目標となっている。
モノクローナル抗体の使用や分子生物学的手法によって、 白血球の血管外遊走 の機序は精力的に研究され 1 9 9 0年代に入り大きな進歩があった。 すなわち、 白血球が血管外へ遊走する第一段階は白血球，内皮細胞間のセレクチンを介する 緩い接着 （ローリング） で始まり、 次に白血球を介するインテグリ ンの活性化に よつて内皮細胞への強し、接着が誘導されることが明らかになつた。 しかしながら、 白血球の血管外遊走が完結するために必要な血管内皮細胞への接着後の白血球の 遊走の機序については、 C D 3 1抗原が NK細胞、 好中球、 単球においてその因 子であるという説があるものの、 特に免疫反応において中心的な役割を果たす T リンパ球については全く不明である。 Tリンパ球の血管内皮細胞への接着後の血 管外遊走については、 接着した細胞がすべて遊走するわけではなく、 明らかに選 択性が働レ、ている。 このような選択性を決める因子は慢性炎症発症や進展に重要 な役割を担っていることが強く推定される。 その因子の実体や機能を明らかにす ることは、 炎症研究や炎症治療の開発には極めて重要で、 多くの研究者が待ち望 んでいるものである。 このような因子を研究するにはその因子に ¾ "するモクク ーナル抗体を得ることが有用であるが、 今日まで未だ得られていない。
従って、 本発明の目的はヒト白血球、 特に単核球の血管内皮細胞接着後の血管 外遊走に関与する因子に対するモノクローナル抗体を提供することにある。 発明の開示
そこで、 本発明者は上記課題を解決すべく種々検討した結果、 ヒト血管内皮細 胞と接着性を有するヒト単核球、 及びコラーゲンゲル上で単層培養されたヒト血 管内皮細胞からゲル内へ遊走したヒト単核球を組み合せて抗原として用い、 また 抗体のスクリーニングではコラーゲンゲル上に培養した血管内皮細胞で Tリンパ 球の接着，遊走の阻止を判定することにより、 ヒト単核球の血管内皮細胞接着後 の血管外遊走を阻止するモノクローナル抗体が得られることを見出し、 本発明を 完成するに至った。
すなわち、 本発明は、 ヒト単核球に対するモノクローナル抗体であって、 ヒト 単核球の血管内皮細胞接着後の血管外遊走を阻止する能力を有するモノクローナ ル抗体を提供するものである。
また、 本発明は上記のモノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマを提供す るものである。 図面の簡単な説明
図 1は、 健常人の顆粒球、 単球及びリンパ球の蛍光強度 （本発明モノクロ一ナ ル抗体との反応性） を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマは、 ヒト単核球を抗原 _として用いる細胞融合法、 すなわちヒト単核球で免疫された哺乳動物の抗体産生 細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞とを融合させることにより得られる。 … · .— ' ここで免疫される哺乳動物としては、 マウス、 ゥサギ、 ラッ ト、 ャギ、 ニヮト リ等が挙げられるカ、 マウスがより好ましい。
抗原としてはヒト単核球であればよいが、 ヒト血管内皮細胞と接着するヒト単 核球 （a ) と、 コラーゲンゲル上で単層培養されたヒト血管内皮細胞からゲル内 へ遊走したヒト単核球 （b ) とを組み合せて使用するのが好ましく、 （a ) を感 作用抗原とし、 （b ) を最終免疫用抗原として用いるのが特に好ましい。 ヒト単 核球は、 末梢血、 関節液、 胸水等から得ることができるが、 末梢血から採取した ものが好ましい。
免疫方法は一般的手法に従うことができ、 例えば上記の抗原単核球を通常の緩 衝液ゃ生理食塩水に懸濁させたもの、 あるレ、はこれとフロインドのアジュバンド との混合液を哺乳動物に腹腔内、 皮下等の適当な経路で投与して一時刺激後、 必 要に応じて同様の操作を繰返せばよい。 本発明においては、 前記 （a ) の単核球 を腹腔内投与で 4回以上、 前記 （b ) の単核球を最終免疫として静脈内投与す ¾ のが好ましい。 抗原とする単核球の投与量は、 投与経路、 哺乳動物の種類等に応 じて適宜決定されるが、 マウスに腹腔内又は静脈内投与する場合は、 通常投与量 が 1回あたり 1 X 1 0 7個/マウス程度とするのが適当である。
最終免疫から 2〜4日後に抗体産生細胞、 例えば脾臓細胞、 リンパ節、 末梢血 等を採取する。 抗体産生細胞としては脾臓細胞が好ましい。
骨髄腫細胞 （ミエローマ細胞） としては、 既に確立されている公知の各種 細胞株、 例えばマウスにおける P3/NSl/l-Ag4-KNSl)、 SP2/0- Agl4(SP2)、 Ρ3Λ63 - Ag8(x63)、 P3/x63-Ag8. Ul CP3Ul), F0、 MCP- 11、 x63. 653、 S194等、 またラッ ト における 210. RCY3. Agl. 2. 3(Y3)等が使用できる。
上記抗体産生細胞と骨髄腫細胞との融合反応は、 公知の方法、 例えばポリェチ レングリコール法、 電気融合法等により行なわれる。
. 融合後、 抗体産生能と増殖能を獲得したハイプリ ドーマの選択は、 例えば HA T培地で数日〜数週間培養することにより行なわれる。 - - · 一 かく して得られるハイプリ ドーマから、 目的とする抗体の産生株の検索を行な う。 該目的抗体産生株の検索は、 ヒト単核球の血管内皮細胞接着後の遊走能を測 定することにより行なわれる。 すなわち、 ヒト単核球と血管内皮細胞との接着は 阻止せず、 かつ接着後の遊走を阻止するハイプリ ドーマを選択する。
選択したハイプリ ドーマのクロ一ニングは、 限界希釈法ゃソ一夕一ローン法等 により行なうことができる力、 限外希釈法によるのが好ましい。
かくして得られるハイプリ ドーマは、 通常の培地で継代培養でき、 また液体窒 素中で容易に長期間安定に保存することができる。
上記ハイプリ ドーマからの本発明モノクローナル抗体の製造は、 常法に従い該 ハイプリ ドーマを培養し、 培養上清から分離する方法、 あるいは上記ハイプリ ド 一マをこれと適合性のある哺乳動物に投与し、 増殖させ、 該動物の腹水より分離 する方法等の通常の方法により実施できる。 前者の方法は特に高純度のものを得 るのに適しており、 後者の方法は大量生産に適している。 '' 上記で製造された本発明のモノクローナル抗体は、 さらに精製することもでき、 例えば硫安分画法、 D E A Eセルロースカラ厶クロマトグラフィー等のゲル濾過 法などの通常の分離手段によりィ厶ノグロブリン画分を単離することにより本発 明のモノクローナル抗体を収得できる。 実施例
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明はこれら実施例 に何ら限定されるものではない。 実施例 1
( 1 ) 抗原の調製
抗原はヒト末梢血単核球を動物に免疫する前にヒト臍帯静脈内皮細胞と共培養
-し、 非接着性単核球を除いた残りの単核球 （a) を使用した。 ただし最終免疫に おいては、 タイプ 1 コラーゲンゲル上に単層培養したヒト臍帯静脈内皮細胞に 核球を添加し、 5時間後に単層内皮細胞下のコラーゲンゲル内へ遊走した単核球 (b) を単離し、 これを抗原として用いた。 すなわち、 タイプ 1 コラーゲンの最 終濃度を 0. 8 mgZTT にしたゲル状培養液を 6 0■のプラスチックペトリデイツ シュに 作り、 この上に内皮細胞増殖因子を含む培養液に浮遊させたヒト臍帯 静脈内皮細胞を加え単層になるように培養した。 完全に単層になったのち、 単核 球を添加培養した。 一定時間後、 コラーゲンゲル上の内皮細胞とゲル内へ遊走し なかった単核球を 0. 4 %EDTAで除去したのち、 コラーゲンゲルをコラーゲ ナ一ゼ処理し、 ゲル内へ遊走した単核球 （b) を単離した。
(2) 免疫
上記単核球 （a) をリン酸緩衝液に浮遊させ、 マウスの場合 1匹あたり 1 X I 07個を腹腔内へ注入した。 これを 2〜4週ごとに 4回以上繰返した。 最終 免疫は、 上述したようにコラーゲンゲル内から単離した約 1 X 1 07個の遊走単 核球 （b) をマウス静脈内へ直接投与した。 最終免疫 2〜4日後にマウスから脾 臓を摘出して抗体産生細胞を含む 1 X 1 03個の脾臓細胞浮遊液を調製し、 ミエ ローマ細胞株との融合に供した。 この細胞株は 1 0%ゥシ胎仔血清 （FCS) を 含む RPM I - 1 6 4 0培地で継代培養し、 調製した脾臓細胞数の 5〜1 0分の
1を使用した。
( 3 ) 細胞融合
イスコフ培地に懸濁した P3/NS1/1- Ag4- KNS- 1)を 2 X 1 07個と上記脾臓細胞 1 X 1 08とを混合、 遠心し、 上清を吸引したのち、 3 7°Cに保温したポリェチ レングリコール 4 0 0 0、 1 を緩徐に滴下した。 次に、 イスコフ培地をさらに 計 1 0 になるまで同様に添加し、 これを遠沈しブこのぢ、 -―ポリ—ヹチレングリコ一 ルを含む上清を吸引した。 細胞ペレツ トをイン夕一ロイキン 6を添加した HA T 培地で脾臓細胞が 1 X 1 0 / m&に るように調製し、 これを 1穴あたり 0 . 1 を 9 6穴平底プラスチゾクプレートに撒き、 ハイプリ ドーマが十分増殖するま で 3 7 °Cにて培養した。 - — ノ —一
( 4 ) スクリーニング
選択されたハイプリ ドーマ群の培養上清を、 ヒト単核球の血管内皮細胞接着後 の遊走を測定する系を用いて、 目的とする抗体を産生するハイプリ ドーマをスク リーニングした。 すなわち、 （ 1 ) で記述した方法を応用し、 9 6穴平底プラス チックプレートに添加したコラーゲンゲル 5 0 / ^の上に単層培養したヒト臍帯 静脈内皮細胞を用いた。 このように用意したプレートにハイプリ ドーマ上清 を 5 0 ^とヒト単核球浮遊液 5 0 ^を加え培養した。 一定時間後、 非接着細 胞を除去し、 位相差顕微鏡で内皮細胞への単核球接着状態をハイプリ ドーマ培養 上清未添加のコントロールと比較し、 差のないものを選択した。 次に、 選択した 穴の内皮細胞を 0 . 4 % E D T A溶液にてコラーゲンゲルより除去後、 ゲル内へ 遊走した単核球数を位相差顕微鏡下で測定した。 コントロールに比べ、 5 0 %以 上遊走を抑制したハイブリ ドーマを目的の抗体を産生しているものとして選択し た。 ヽ
( 5 ) 抗体産生ハイプリ ドーマのクローニング
選択したハイプリ ドーマのクローニングには限界希釈法を利用した。 遊走抑制 率の高レ、抗体を産生するハイブリ ドーマにっレ、て限界希釈法を 3〜 4回繰返し、 安定して抗体価の高いハイプリ ドーマを選択し、 これを該抗体産生ハイプリ ドー マ株とした。
( 6 ) 抗体の精製
得られたハイプリ ドーマ株を I L一 6を含む増殖培地に浮遊させて増殖させた のち、 これを同系統のマウスの腹腔内へ注入して腹水を得た。 次に、 プロテイン Aカラムを使って腹水から I gG画分を精製した。
上記で得られたモノク口一ナル抗体 4 C 8は、 そのィソタイプが I g G 3で、 1
Figure imgf000009_0001
リンパ球及び Tリンパ球を含む単核球の内皮細胞接着後の 内皮細胞下への遊走をおよそ 80 %〜 90 %阻止した。 . 一 得られた本発明 ωモノクローナル抗体の性質を挨討した ό そめ糸 果、 本発明モ ノクローナル抗体は、 （ 1 ) ヒトリンパ球、 ΝΚ細胞、 単球、 好酸球を含む顆粒 球、 及び血管内皮細胞など接着性細胞に反応する ； （2) ァクチン重合など細胞 骨格蛋白質に変化を与える ； （3) ヒトリンパ球にケモカイン様又は化学走化性 物質様の遊走刺激を与える ； （4) ヒトリンパ球の基質への接着を惹起させる ； (5) CD 6 9抗原など細胞活性化関連分子の発現を誘導する ； （ 6 ) 好酸球を 含む顆粒球に反応し、 細胞活性化を刺激する ； （7) 抗リウマチ薬投与による慢 性関節リゥマチ患者単核球、 顆粒球の 4 C 8発現を抑制する ； （ 8 ) 悪性腫瘍細 胞に反応する等の作用を有することが判明した。 次に、 各項目についてその方法 と結果を記載する。
1 ) ヒトリンパ球、 NK細胞、 単球、 好酸球を含む顆粒球、 及び血管内皮細胞 と反応する。
方法：モノクローナル抗体 4 C 8を蛍光標識キッ トで蛍光標識したのち、 抗凝 固剤を添加した採血管に採取した末梢血 0. 1;^にこれを適当量を加え、 氷上で 30分静置した。 これを氷冷した 0. 1 %ゥシ血清アルブミン （BSA) 添加リ ン酸緩衝液 （PBS) で 3回洗浄後、 溶血剤にて溶血させ、 さらにパラホルムァ ルデヒドで固定した。 血管内皮細胞は 0. 4 % E D Τ Α処理でプラスチックプレ —トより剝離させ、 3 x 1 05個を白血球と同様に染色した。 これら染色した細 胞はフローサイ トメトリーにて、 顆粒球、 単球、 リンパ球各画分にゲーティング を行ない、 それぞれの蛍光強度を測定した。
結果：図 1に示すように、 健常者のリンパ球 '単球は、 人により異なる力^ 90 %以上の細胞が 4 C 8抗原を発現し、 リンパ球が最も強い蛍光強度を示し、 単球がそれに続いた。 リンパ球画分には約 1 0 %の NK細胞を含むので N K細胞 もこの分子を発現しているのは明らかである。 一方、 顆粒球ではほとんど発現し ていなかつた。 しかし、 慢性関節リゥマチやその他の慢性炎症性疾患の一部の患 者では顆粒球の 4 C 8抗原の明らかな発現がみられた。 また、 アトピー性疾患で は好酸球に同様の発現がみられた。 また、 接着性細胞、 例えば血 内皮細胞で 、 増殖が止まった状態では発現がみられなかったが、 増殖中の細胞では明らかな発 現細胞集団がみられた。
2 ) ァクチン重合など細胞骨格蛋白質に変化を与える。
方法： 3〜 3 0 z g Z の精製抗 4 C 8抗体又はコントロール I g G 3を 1 0 0 // Zwel 1で 1 8時間、 4 °Cで処理した 9 6穴平底ブラスチックプレート を用意した。 健常人末稍血から比重遠沈法にて単核球を採取し、 次にこれのナイ ロンウールカラム素通り分画をリ ンパ球とし、 1 0 % じ 3を含む ？1^ 1 - 1 6 4 0培地に懸濁した。 リンパ球 3 X 1 0 5個を用意したプレートの各穴に 添加し、 1〜3時間 3 7 °Cで培養した。 培養後、 ピペッ トで細胞をよく吹き付け て採取し、 これを P B Sで 1回洗净した。 Phal loidinは重合したァクチン、 すな わちフイラメントァクチンに特異的に結合するので、 蛍光標識した Phal loidinを 3 %バラフオル厶アルデヒドで固定した単核球に処理し、 その結合程度をフロー サイトメ トリ一で調べた。 " 結果： フローサイ トメ ト リーでゲーティ ングしたリ ンパ球画分では、 Phal loidin陽性細胞数はコントロール I g G 3で 2 0 %前後であつたが、 抗 4 C 8抗体処理プレートでは濃度依存性に Phal loidin陽性細胞は増加し、 最 大 6 5 %に達した。 これより、 4 C 8抗原を介する刺激はリンパ球にァクチンの 重合を誘導することが明らかになつた。
3 ) ヒトリンパ球にケモカイン様の遊走刺激を与える。
方法： リンパ球表面上の 4 C 8抗原の刺激によってリンパ球の遊走が誘導され るかを調べるため、 抗 4 C 8抗体をリガンドとして使用した。 すなわち、 9 6穴 平底プレートに抗 4 C 8抗体を種々の濃度で混ぜたコラ一ゲンゲルを作.り、 ；れ に血清を含まない Ml 9 9培地に浮遊させたリンパ球 3 X 1 05個を各穴に添加 した。 3時間の培養後、 0. 4 %EDTAを加え、 ゲル上に付着したリンパ球を 除去し、 位相差顕微鏡下でゲル内に遊走した単位面積当たりのリンパ球数を数え た。 ' 一 —- 結果：抗 4 C 8抗体 1 g Ζτ^の濃度で遊走刺激がみられ、 1 0 g Ζτηβで最 大ではコントロールの 8倍に達した。 しかし、 1 0 0〃 gZmの高濃度では再び コントロールレベルに戻り、 ケモカインや化学走化性因子のように 1峰性の濃度 依存性を示した。 以上より、 4 C 8抗原を介する刺激はリンパ球に遊走を誘導す ることが明らかになった。
4) ヒトリンパ球の基質への接着を惹起させる。
方法： 2) に示したごとく抗 4 C 8抗体を処理したプレートをさらに 3 % BSAを 2時間、 3 7°Cで処理した。 これに、 51C rで標識したヒトリンパ球を 3 X 1 05個添加し、 1時間、 3 7 °Cで培養した。 培養後、 非接着細胞を除去し、 接着細胞を 1 Nの N a〇 Hで溶解させたのちガンマカウンタ一にてその放射活性 を測定した。 添加した細胞全体の放射活性とコントロール穴での放射活性の差を 分母とし、 また 4 C 8抗体処理穴の放射活性とコントロール穴での放射活性の差 を分子として割り出した値を 1 0 0倍したものを％接着率とした。 ' 結果：抗 4 C 8抗体 1〜 1 0 0 g/ の濃度で、 濃度依存性に細胞接着は増 加し、 1 0 Q j g/r で約 S 0%の細胞がプレートへの接着を示した。 一方、 コ ントロール I g G 3では全濃度で細胞接着は 5 %以下であつた。 4 C 8抗原を介 する刺激はリンパ球に基質への接着を著しく高めることが明らかになった。
5) CD 6 9抗原など細胞活性化関連分子の発現を誘導する。
方法： 2) に示したごとく抗 4 C 8抗体を処理したプレートを用意し、 これに 同様に調製したヒトリ ンパ球を添加した。 1時間培養後、 リ ンパ球を採取し蛍光 標識抗 CD 6 9モノクロ一ナル抗体で染色したのち、 フローサイ トメ トリーで蛍 光強度を測定した。
結果： コントロールでは約 2 %の陽性率に対し、 抗 4 C 8抗体では約 2 0 %の 細胞が、 とくに C D 2 6陽性 Tリンパ球において、 C D 6 9陽性となつた。 この 陽性率は培養時間の延長によって増加した。 4 C 8抗原の刺激はリンパ球の活性 化を惹起することが明らかになつた。 - '
6 ) 好酸球を含めた顆粒球に反応し、 細胞活性化を刺激する。
方法： 4 C 8抗原は健常人顆粒球では発現しないが、 慢性関節リウマチ患者な どでは発現する。 そこでこのような患者から顆粒球を採取し、 4 C 8抗原の刺激 が顆粒球を活性化させるか調べた。 すなわち、 末梢血を 1 %デキストラン硫酸に 1 : 0 . 7 5の割合で混合し、 4 0〜 5 0分静置したのち上層をとり、 これ を Fi col l- Conray液へ重層した。 3 0分遠沈後、 上清を吸引して細胞ペレツトを P B Sでさらに 4 °C下で 3回洗浄した。 最後に顆粒球を R P M I — 1 6 4 0培地 に浮遊させた。 これを、 2 ) に示したごとく抗 4 C 8抗体を処理したプレートに 添加した。 3 0分後、 これらの細胞を採取し、 細胞活性化により発現が増強する C D 1 1 b抗原を蛍光標識抗 C D 1 1 b抗体を用いフローサイトメトリーで調べ た。
結果：抗 4 C 8抗体の濃度が高くなるにした力 、、 顆粒球表面の C D 1 1 b抗 原の平均蛍光強度が有意に増強された。 すなわち、 4 C 8抗原を介する刺激は 粒球を活性化することが明らかになつた。
7 ) 抗リゥマチ薬投与による慢性関節リゥマチ患者単核球 ·顆粒球の 4 C 8発 現抑制効果。
方法： リゥマチ患者末梢血単核球及び顆粒球を蛍光標識抗 4 C 8抗体で染色後、 フローサイトメトリーにてリンパ球.単球 ·顆粒球の各分画の 4 C 8発現の平均 蛍光強度を測定した。
結果：抗リゥマチ薬が奏功したリゥマチ患者では、 未治療または活動期の患者 に比べ、 単核球の 4 C 8抗原は減弱し、 とくに単球 4 C 8抗原の発現は約 1 / 4 に著しく減弱していた。 また一部の活動期リウマチ患 ¾^の頼粒球に ¾現—し
4 C 8抗原は治療により消失した。 すなわち、 抗リウマチ薬の薬理作用の解明の ほか、 リゥマチ患者の単球などの 4 C 8の発現を調べることにより抗リゥマチ薬 の効果判定や予測など臨床的な応用が可能である。
8 ) 悪性腫瘍細胞株に反応する。 - ^ 方法：悪性リンパ腫由来の細胞株 S 3と Jurkatを蛍光標識抗 4 C 8抗体で処理 し、 その 4 C 8抗原の発現をフローサイトメ トリーで調べた。
結果： Jurkatには 4 C 8抗原は発現しなかったが、 SKW3では 8 5 %の細胞 に 4 C 8抗原が陽性であった。 ある種の腫瘍細胞には 4 C 8抗原が存在すること が明らかになった。 産業上の利用可能性
これまで、 炎症を代表とする白血球の血管内皮細胞接着後の血管外遊走や悪性 腫瘍の転移の機序にっレ、ては多くは未だ不明のままであるが、 本発明によって、 これらの機序が細胞、 蛋白質、 及び分子レベルで解析することが可能となった。 また、 本発明抗体によって認識される分子の発現がさまざまな病態や疾患と関連 していることから、 臨床診断 ·治療への応用が可能である。

Claims

請 求 の 範 囲 ―
1 . ヒト単核球に対するモノクローナル抗体であって、 ヒト単核球の血管内皮細 胞接着後の血管外遊走を阻止する能力を有するモノクローナル抗体。
2 . ヒト血管内皮細胞と接着するヒト単核球を感作用抗原と-し、 コラーゲンゲル 上で単層培養されたヒト血管内皮細胞からゲル内へ遊走したヒト単核球を最終免 疫用抗原として免疫された哺乳動物の抗体産生細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞との 融合細胞により産生されるものである請求項 1記載のモノクローナル抗体。
3 . 請求項 1記載のモノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマ。
4 . ヒト血管内皮細胞と接着するヒト単核球を感作用抗原とし、 コラーゲンゲル 上で単層培養されたヒト血管内皮細胞からゲル内へ遊走したヒト単核球を最終免 疫用抗原として免疫された哺乳動物の抗体産生細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞とを 融合させることにより得られるものである請求項 3記載のハイプリ ドーマ。
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