JPH05509318A

JPH05509318A - インターロイキン―４とインターロイキン―１βが共働してＶＣＡＭ―１を誘導する

Info

Publication number: JPH05509318A
Application number: JP3513758A
Authority: JP
Inventors: マシノブスキー，ボリス; ガラテイン，ウイリアム　マイケル; シモンズ，ポール　ジェイ．
Original assignee: フレッドハッチンソンキャンサーリサーチセンター
Priority date: 1990-08-02
Filing date: 1991-08-01
Publication date: 1993-12-22
Also published as: AU662106B2; CA2088579A1; EP0745611A1; AU8417891A; WO1992002253A1; US5206345A; EP0541701A4; CA2088579C; EP0541701A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】インターロイキン−４とインターロイキン−１βが共働してＶＣＡＭ−１を誘導する本発明は公衆衛生局認可第ＣＡ　４０２７２号、Ｐ２ＯＣＡ　１５７０４号及びＲＲ００１６６に基づき政府補助の下になされた。本発明に基づく権利の一部は政府が所有することになる。

技術分野本発明は組換えＤＮＡ技術を伴なう遺伝子工学に係わるものであり、特に患者の炎症治療を含む免疫応答変調（ｍｏｄｕｌａ＋ｅ）用の治療方法及び治療試薬に係わる。

発明の背景この明細書では下記の略語を使用する：　ＣＡ　Ｍ、細胞接着分子；ＥＢＭ、内皮基底媒質、ＥＣ，内皮細胞、ＥＤＴＡ。

エチレンジアミンテトラ酢酸、ＥＧＦ、表皮成長因子；ＥＬＡＭ−１，内皮性白血球接着分子−１；ＦＢＳ、ウシ胎児血清、ＨＥＶ、高内皮細静脈、ＨＵＶＥＣ，ヒト請静脈内皮細胞、Ｉ　ＣＡＭ−１，細胞間接着分子−１，ＩＬ−１，インターロイキン−１；ｒＬ−１β、インターロイキン−１−β；ＩＬ−４，インターロイキン−４，ＩＮＦ−γ、インターフェロンーγ、ＬＤＬ、低密度リポ蛋白、ＬＦＡ−１，リンパ−１はＬＥＣ−ＣＡＭ　（レクチン、ＥＧＦ、補体−細胞接着分子）類の１つである内皮白血球接着分子−１（ＥＬＡＭ−１）を誘発し、このＥＬＡＭ−１は選択的に多形核白血球に対して接着性を示し、単球に対しては接着性が弱い（１９゜２６）。同様に、白血球インテグリンＬＦＡ−１（リンパ球機能関連抗原−１）に対するリガンドである細胞間接着分子−１、（ＩＣＡＭ−１）のシトキン誘発も内皮細胞との関連で報告されている（２７）。最近、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）がＶＬＡ４を介してリンパ球をヒト謄静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に接着させるＴＮＦ−及びＩＬＬ−誘発リガントであることが識別された（２８−３０）。機能的にリンパ球移行と直接的な関係はないが、生体内のトラフィック内皮と関連する他の細胞面マーカがＩＦＮ−γによって誘発されることか実証されている（１５）。組織分布が比較的狭い付加された接着リガンド、即ち、血管アトレシン（ａｄｄｒｅｓ＋１ｎｓ）　Ｍ　Ｅ　ＣＡ　−７９及びＭＥＣＡ−３６７もリンパ節及び粘膜リンパ組織中からそれぞれ識別されている（３１゜３２）。特定のシトキンによってこれらのリガンドを試験管内で誘発できるかどうかは現時点では明らかでないがトランスジェニック・マウスによる実験は生体内発現にＩＦＮ−γが寄与している可能性を示唆している（３３）。

微小血管系内皮細胞へのリンパ球接着を促進するシトキンの能力がげっ歯頚及びヒツジで分析された（１５．　２４．　２５）。ＥＣ−ＣＡＭが分子レベルでほぼ解明されているヒトについては、もっばら謄静脈を内皮細胞供給源として使用してシトキンによる誘発が研究されている（１６−１９）。最近１ｓｓｅｋｕｔｘ　（２４）が指摘したように、これらの系において得られた結果にはある程度の食違いがある。

上記の所見に基づき、かつ発明者らの予備所見として大血管系の内皮細胞と微小血管系の内皮細胞とでは接着という事象に対するシトキン応答において差のあることが判明したから、免疫学的に活性のシトキンが霊長類（赤毛サル：　ｍａｃａｑｕｅ）の微小血管系内皮細胞へのリンパ球接着にどのように作用するかを検討した。さらにまた、炎症部位だけでなくリンパ節の高内皮においても内皮細胞のトラフィック表現型にシトキンが重要な役割を果しているらしい（３４）ことから、微小血管系内皮細胞の供給源の１つとして腸間膜リンパ節を使用した。

発明の摘要発明者らの実験結果に照らして、ＩＬ−１β及びＩＦＮ−γによって誘発される微小血管系内皮細胞はＨＵＶＥＣと同様に挙動する。これと対照的にＩ　Ｌ−４は単独でもＩ　Ｌ−１βとの組合わせにおいても微小血管系内皮細胞へのリンパ球接着に際して潜在的なエフェクタとして作用したが謄静脈内皮細胞に対する作用は極めて微弱であった。接着が促進される原因の大部分はＶＣＡＭ−１または血清学的に関連のある分子の発現が促進されることであった。

従って、本発明はリンパ器官の微小血管系内皮細胞への末梢血リンパ球接着を促進して患者の免疫応答を変調させるのに充分な量のＩＬ−４を患者に投与することにより患者の免疫応答を変調させる治療方法を提供する。患者にはＩＬ−１β と一緒にＩ　Ｌ−４を投与するのが好ましい。代表的な実施態様としては、患者の炎症部位においてリンパ球が血液から後毛細管細静脈外へ遊出するのを促進するため、炎症の治療を必要とする患者にＩ　Ｌ−４を投与する。

本発明はまた、細胞接着分子と結合する結合パートナ−を生成させるため細胞系をスクリーニングする改良された方法を提供する。この方法は細胞接着分子を含む細胞と結合パートナ−を接触させるステップと、結合パートナ−と細胞との間の結合応答を検出するステップを含む。改良点として、結合パートナ−をＩＬ４ −活性化及び非活性化微小血管内皮細胞と接触させ、ＩＬ４−活性化微小血管内皮細胞とは結合するか非活性化微小血管内皮細胞とは結合しない結合パートナ− を生産する細胞系を選択することを含む。スクリーニングのもう１つのステップとして、選択された細胞系の結合パートナ−を、リンパ球がシトキン活性化内皮細胞と結合するのを阻止する能力についてその後テストするステップをも加えることができる。従って、本発明はＩ　Ｌ−４で活性化された微小血管内皮細胞とは特効的に結合するが非活性化微小血管内皮細胞とは結合しない免疫学的ペプチド結合パートナ−を提供する。結合パートナ−はリンパ球がシトキン活性化内皮細胞と結合するのを阻止する能力をも特徴とすることが好ましく、さらに好ましくはヒトＶＣＡＭ−１及びＩ　Ｌ−４またはＴＮＦ−αで活性化された骨髄間質細胞と結合することを特徴とする。この好ましい結合パートナ−の代表的な実施例がハイブリドーマ　ＡＴＴＣＮｏ、ＨＢ　１０５１９によって生産されるｍＡｂ６Ｇ１０である。

本発明はさらに、Ｉ　Ｌ−４によって活性化された微小血管内皮細胞と選択的に結合する作用剤を、患者の血液中から後毛細管細静脈を横切って細胞外液中へ特にＶＣＡＭ−１と結合するリンパ球や腫瘍細胞などへ移行するのを阻止するのに充分な量だけ患者に投与することにより患者の免疫応答を変調する治療方法をも提供する。

図１は例１で述べるような、血清含有培地（パネルＡ）及び血清なし培地（パネルＢ）で培養された代表的な微小血管内皮細胞の顕微鏡写真を示す。

図２は例１で述べるような、培養微小血管内皮細胞及びその他の内皮細胞による代表的な内皮細胞マーカの取込みを示す。

図３は例２で述べるような、シトキンによる活性化後における培養微小血管内皮細胞へのリンパ球接着の顕微鏡写真を示す。

図４は例２で述べるような、培養微小血管内皮細胞へのシトキン活性化リンパ球接着を経時的に示す代表的なグラフである。

図５は例３で述べるような、内皮細胞へのＩＬ４／ＩＬＬ誘発リンパ球誘発９女８図６は例４で述べるような、ＩＬ４／ＩＬＬ活性化内皮細胞へのリンパ球接着か二価カチオン依存性であることを示す。

図７は例４で述べるような、培養微小血管内皮細胞のｍＡｂ６Ｇ１０によるラベリングを示す。

図８は例４で述べるような、ＩＬ４／ＩＬＬによって誘発された赤毛サルの微小血管内皮へのリンパ球接着に対するモノクローン抗体６Ｇ１０の阻止効果を示す。

図９は例４で述べるような、ｍＡｂ’５６Ｇ１０及び４Ｂ９でＣＨＯ　）ランスフエクトされた細胞のラベリングを示す。

図１０は例４で述べるように、ｍＡｂ６Ｇ１０がシトキン活性化内皮細胞に約１１０ｋＤの分子を認識することを示す。

図１１は例５で述べるように、骨髄間質細胞におけるｍＡｂ６Ｇ１０によって認識される抗原の発現がＩＬ４／ＴＮＦαによって促進されることを示す。

図１２は例５で述べるように、ＶＣＡＭ−１に対するＶＬＡ−４レセプタがＤＣ３４抗原を含む骨髄細胞に高レベルで発現することを示す。

好ましい実施例の詳細な説明内皮細胞（Ｅ　Ｃ）へのリンパ球接着は血中から毛細管線静脈を横切る多段移動プロセスにおいて必要な第１要素である。

細織に炎症がある時、（例えばリンパ節のような）リンパ器官の微小血管内皮細胞が選択的に細胞接着分子（ＣＡＭ）を発現させその結果、１つの部位にむかってこの移動トラフィックに変調が起こる。内皮細胞によるＣＡＭ合成は局所投与されるシトキンによって制御される。主としてヒト屓静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を使用して行われた研究では内皮細胞への白血球接着を促進するシトキンとしてＩＬ−１，ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを使用した。以下に述べる実施例では、赤毛サルのリンパ節から得られた培養微小血管内皮細胞のＩ　Ｌ−１β，ＩＬ− ２及びＩ　Ｌ−４に対する応答を検討した。

Ｉ　Ｌ−１βまたはＩＦＮ−γ中で微小血管内皮細胞の予備培養後におけるリンパ球接着の増大は対照の２乃至４倍に達し、ＨＵＶＥＣに関して報告されたレベルに匹敵し，た。ＩＬ−２の効果はゼロであった。最も驚くべき発見はＩ　Ｌ− ４による刺激の直後に得られた。即ち、このシトキンは大血管培養内皮細胞に対して微弱な作用しか示さなかったが、微小血管内皮細胞への接着を著しく促進した。ＩＬ−４によって誘発された接着は誘発から４時間後には早くも顕著になり、２４時間で安定レベルに達し、７２時間にわたる培養中室定状態を維持したが、培養物からＩ　Ｌ−４を取除いてから７２時間以内に最低レベルまで崩壊した。Ｉ　Ｌ−２またはＩＦＮ−γには見られない作用であるか、ＩＬ−１βは培養微小血管内皮細胞に対してＩ　Ｌ，−４と共働して相乗的にその作用を強めることによりリンパ球結合を促進する。このようにトリガーされる接着はあらたな蛋白合成を必要とした。ただし、Ｉ　Ｌ　−４によって活性化された微小血管内皮細胞のリンパ球に対する親和性，動力学的分析，陽イオン及び温度依存性，及び／またはＥＬＡＭ−１，ＩＣＡＭ−１，及びＭＥＣＡ−７９に対するｚＡＪ’ｓによる遮断の欠如から判断して、これらのＣ　ＡＡＭは現象の中心要因ではないことが判明した。関連ＣＡＭの識別を助けるため、Ｉ　Ｌ−４によって誘発された微小血管内皮細胞に対して特異性を示すｍＡｂ ’ｓを生産した。その１つとして、６Ｇ１０はＩＬ−４によって誘発された微小血管内皮細胞へのリンパ球接着の９０％までを阻止し、β１インテグリンＶＬＡ −４の内皮リガンドであるヒトＶＣＡＭ−１でトランスフェクトされたＣＨ○細胞と特異な反応を示した。

発明者らの実験結果はＩＬ−４が生体内でのリンパ球再循環に影響を及ぼす可能性を示唆すると共に内皮細胞並類型が特定のシトキンに応答してそれぞれ異なる態様でＶ　Ｃ　Ａ　Ｍ−１を制御するらしいことを示唆している。

多くの研究は急性、慢性の別なく炎症部位への白血球漸増か内皮及び白血球における細胞接着分子（ＣＡ．Ｍ）の発現及び作用が増大によってトリガーされることを示唆している（３，１０．１４）。このようなＣＡＭ機能の促進はＩＬ−１、ＩＦＮ−γのような前炎症シトキンの投与によっである程度達成でき、最近の文献ではＴＮＦ−αもその１例として挙げられている（１１，１３，２３．２８）。複雑な遊出プロセスのその他の要素、例えば内皮面における横移動や血管外漏出か他のシトキン、例えばＩ　Ｌ−８によって促進または抑制されることは明白である（５１）。また、試験管内において一部の白血球ポピユレーションに対し、他の内皮ＣＡＭ誹りも強い接着性を示す内皮ＣＡＭがある（１７，１９゜５２）。個々のＣＡ　Ｍ発現の速度特性も種類に応じて異なり、個々のシトキンによる誘発も選択的である。従って、これらの可溶性分子を局部的に分泌させることによって、リンノ々細胞、単球細胞及び顆粒球細胞をある程度独立に制御できる手段が得られる。

以下に述べる種々の研究は、シトキンによって刺激された内皮への白血球接着に関する試験管内データとシトキン注射部位への漸増集中に関する生体内所見との間に、場合によって食違いがあることを念頭に置いてなされたものである。例えば、ＩＦＮ−γは局所注射後皮フへのリンノく球遊走を著しく促進する（２３，５３．５４）のに対して、培養ヒト内皮・＼のリンパ球接着については顕著であるもののめざましし）作用は及ぼさないことが報告されている（２０．２７）。

逆に、試験管内では充分に接着を促進するＩＬ−１がう・ソトの注射部位における皮フへの漸増集中を促進しなかった（２３゜５４）。試験管内実験では多くの場合細胞性接着ベースとしてヒト謄静脈内皮細胞を使用するのに生体内実験ではげつし類またはヒツジをモデルとして利用することが多い（２４゜２５）から、原理的には上記観察結果の食違いを種特異性（こよって説明することができる。

微小血管から得た内皮細胞と大血管から得た内皮細胞との差に原因があるとも考えられる。

例えば、ｌ＋ｓｅｋ＋＋＋＋　（２４）及びＨａｇｈｅｉ等（５５）はラットの微小血管内皮細胞をＩＦＮ−γ処理するとリンパ球接着を著しく促進することを発見した。生体内データと試験管内データの食違いを裏づける０ｐｐｅｎｆ＋ｅｉｍｅ＋−Ｍａ「ｋｓ及び１ｉｆｔの実験（５６）によれば、ＩＦＮ−γは接着だけでなくこれに続く内皮を横切る遊走をも促進するのに対して、ＩＬ−１は初期リンパ球結合を促進するだけである。これらの問題のいくつかを解決するため、発明者等は培養リンパ節微小血管内皮へのリンパ球接着を検討するためのシステムを開発した。後述するように赤毛サルのリンパ節から比較的純度の高い培養内皮細胞を増殖させた。この培養細胞は培養内皮細胞に固有のドーム形の丸石形態を有し、内皮に固有のマーカーの特性、例えばアセチル化ＬＤＬの取込みを発現させた。実験結果を表１に要約する。

培養微小血管内皮に対するシトキンの作用全Ｃ３−１，５５なし　２５０±５３．７　６５６±６７．７　２９１±５７．１１　４５２±３６９内皮細胞をＩＬ −１β（ｌｎｇ／ｍｌ）　、Ｉ　Ｌ−２（１００ｕ／ｍｌ）　、Ｉ　Ｌ−４（ＩＱｎｇ／ｍｌ）　、Ｉ　ＦＮ−ｙ　（ｔｏｏ　μ／ｍｌ）、またはこれらの組合わせで処理するか、または刺激を加えない状態で２４時間放置した。シトキンを除去したのち、各ウニル（４ｅ　ｌ　ｌ）にＢＢＬを添加し、（＋４℃で３０分間絶えず撹拌し、なから）接着を分析評価し、内皮細胞に結合したリンパ球をカウントした。それぞれの値は接着リンパ球の平均個数／′）２±ＳＥＭを表わす。

ＩＬ−１β、ＩＦＮ−γ及びＩ　Ｌ−２に関する実験結果はＨＵＶＥＣに関する結果とほぼ同様であった。ＩＬ−１βもＩＦＮ−γもリンパ球の接着を促進し、その場合Ｉ　Ｌ−１βの方が強力かつ一様に作用したのに対して、Ｉ　Ｌ−２は目立つほどの作用を示さなかった。驚くべき所見として、内皮細胞をＩ　Ｌ−４で処理した結果リンパ球接着が著しく強められた。このことは処理してから僅か４時間後に明瞭になり、約１２−２４時間でピークに達し、少なくとも７２時間にわたってこのピーク状態か維持された。このような効果を得るためには常にあらたな蛋白合成が必要であり、シトキンの存在を持続しなければならなかった。

興味深いことに、Ｉ　Ｌ−４のように強力な作用はＨＵＶＥＣでは認められず、赤毛サルの大動脈から得た内皮細胞においても観察されなかった。即ち、ＩＬ− ４はリンパ球接着を全く促進しないか、促進しても極めて微弱であった（Ｌ　［Ｉａ＋ｌａｎ、　Ｌ　Ｐｏｂｅ＋の個人的な通信文。

Ｍａｔ　１ｎｏｖＳｋｙ及びＧａ１ｌａ＋ｉｎの未発表データ）。リンパ球接着の最大促進率はＩＬ４で処理されたＨＵＶＥＣについてＴｈｕ！１ｂｉｌ１等（５２）が最近報告したのと同じ程度（約２倍）であった。２つの異なるタイプの内皮細胞かこのように異なる応答を示すメカニズムは不明である。ただし、ＨＵＶＥＣにＩ　Ｌ−４レセプタそのものが存在しないということではこのことを説明できないであろう。少なくとも赤毛サルにおいては大血管内皮細胞でも微小血管内皮細胞でもＩ　Ｌ−４レセプタの発現はほぼ等しい（Ｍａ＋１ｎｏｖ＋に７及びＢｅｃｋｍａｎｎの未発表データ）。

この現象の少なくとも必須部分としてＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１を介した接着を挙げるのは次の理由から除外されるであろう。即ち、ＩＬ４で誘発された接着はａ）低温に感応せず、ｂ）主としてカルシウム依存性であり、Ｃ）これらのＣＡＭにｍＡｂを添加することによって阻止されなかったという理由である。同様の抗体抑制テストの結果、ＭＥＣＡ−７９、ＣＤ４４．及び第■類ＭＨＣがプロセスに関与するという条件が除外された。直接除外されたわけではないが、接着成分としてＥＬＡＭ〜１か利用されるとは考えられない。

誘発と接着との動力学的関係については観察結果に差異かあり、Ｅ　Ｌ　Ａ　Ｍ　−１はリンパ細胞よりも好中球及び単球に対してすぐれた接着性を示す。特異的にＩＬ４−誘発微小血管内皮細胞と応答するｍＡｂの１っである６Ｇ１０はリンパ球接着を阻止し、ヒトＶＣＡＭ−１４ランスフエクトと選択的に応答したが、このことはＶＣＡＭ−１または血清学的にこれと密接な関係にある分子（ｔｏｏ　−１１０ｋＤ、後述）かこのシステムにおいてリンパ球結合を仲介することを示唆するものである。微小血管内皮細胞においてＩＬ−４はその他の細胞表面分子をも誘発したから、上記ＶＣＡＭ−１だけが関連の構造とは断定できない（Ｍａｓ　１ｎｏｖｓｋ７及びＧａ１ｌａｊｉｎ、未発表データ）。ただし、上記その他の成分を細胞接着分子と確定するには至っていない。

別名Ｉ　Ｎ　ＣＡＭ　１１０でも知られるＶ　ＣＡ　Ｍ　−１がＩＦＮ−α及びＩＬＬによって誘発されたＨＵＶＥＣにおいて最近識別された（２８．２９）。

分子分析の結果、Ｖ　ＣＡ　Ｍ　−１は免疫グロブリン超遺伝子の１つであり、１つのリガンドとしてβ１−インテグリンであるＶＬＡ−４を有することが明らかになっている（２９．３０）。炎症に際して果す生理的役割を性格に定義できる段階にはないが、関節炎のような慢性炎症部位にむかってリンパ球を漸増集中させることが１つの可能性として考えられる。ＶＬＡ−４のα−鎖がバイエル板の高内皮へのリンパ球結合に関与するから、粘膜リンパ組織を通過する正常なトラフィックにＶＣＡＭ−４またはこれと関連する分子が関与することも考えられる（２）。ＶＬＡ−４は末梢リンパ球のすべてに均等に発現しないから、■ＣＡＭ−１を介して起こる接着は特定のリンパ球部分集団だけを選択的に漸増させると考えられる。事実、シトキンによって活性化された内皮に対してリンパ球の特定部分集団だけが接着することがＤａｍｌｅ及びＤ　ｏｙｌｅによって最近実証された（５７）。両人の研究ではＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１によって仲介される接着か関与するかどうかはテストされなかったが、これは大いにありそうなことであり、これによって両人の実験データをある程度裏づけることかできる。リンパ球のトラフィックに関与するだけでなく、ＶＣＡＭ−１は腫瘍転移における重要な要因となることも考えられる（２８）。残念ながらＶＣＡＭ−１が利用できるその他のｍＡｂ’＋はヒト以外の霊長類内皮細胞とは応答し難い（Ｍａ＋１ｎｏｖ＋ｋｙ及びＧａ１ｌａｔｉｎ、未発表データ；　Ｍ、　Ｂｅｖｉ　１ａｃｑｕａ、　１．　Ｈａｒｌａｎ、　１．　Ｉ’ｏｂｅ＋、個人的通信文）。ｍＡｂ６Ｇ１０はヒトの内皮細胞とも赤毛サルの内皮細胞とも応答したから、Ｉ　Ｌ− ４の組織分布、生体内機能及びＶＣＡＭ−１誘発における役割を解明する有用な手段となるであろう。例えば、Ｉ　Ｌ−４の全身的投与でＶＣＡＭ−１誘発を招くかどうかを判断するテストにより、このシトキンを利用する臨床治療中に観察される血管漏出やリンパ球減少のメカニズムの解明に役立ってあろう。

Ｉ　Ｌ−４かリンパ球のトラフィックを制御するらしいということはあとから考えれば驚くに当らない。当初はＢ細胞刺激因子（５８）の名称で記述されたＩ　Ｌ−４は、非造血細胞（４１−４４）を含む多様なタイプの細胞にレセプタを有し、多くの異なる応答をトリガーする。Ｉ　Ｌ−４は部分的には第■類ＭＨＣ分子を制御することによってＢ細胞とＴ細胞の間の接着を促進する（５９）。Ｉ　Ｌ−４がＩ　Ｌ−１βと共働することによって微小血管内皮細胞を活性化するということは新しい発見であるが全く前例がないわけではない。Ｉ　Ｌ−４はＩＬ −２及びＩ　Ｌ−５と共働することによって種々の免疫グロブリン重複標本の分泌を制御しく６０）　、ＧＣ３Ｆと共働して顆粒球形成を促進しく４６）、Ｉ　Ｌ−３と共働してマスト細胞の分化を制御する（６１）。同様に炎症に際してＰＭ　Ｎ　ｓの遊走を誘発するＩ　Ｌ−１とＴＮＦの共働も報告されている（６２）。Ｂ細胞活性化の際にＩＬ−４とＩＦＮ−γとの間に拮抗作用か見られることが報告されているが（６３゜６４）、発明者等は培養内皮細胞においてこのような作用を観察しなかった（表１）。このシステムにおけるＩ　Ｌ−１とＩ　Ｌ− ４の共働を裏づけるメカニズムは今のところ不明である。完全に否定することはできないが、いずれか一方のシトキンが他方のシトキンの誘発を介してのみ作用するとは考え難い。広範囲の濃度にわたって一方のシトキンたけをテストしたところ、いずれのシトキンも双方を併用した場合のような強い接着を誘発しなかった。しかし、双方ともＶ　Ｃ、Ａ　Ｍ　−１のすぐれた誘発因子であるＩＬ−４，ＴＮＦ−αのいずれか一方が内皮細胞に直接作用するのか第２の可溶メディエ −夕の誘発を介して間接的に作用するかを確めるのは興味深い微小血管内皮細胞の増殖この作業を開始するに当って、リンパ節から内皮細胞の均質な培養物を得る方法を採用した。材料及び方法の項で後述するように、赤毛サル腸間膜のリンパ節から得た培養物中に内皮の形態を具えた小コロニーか一次平板培養の２−３日後に認められた。細胞は多角形を呈し、相互間にほとんど接触が見られなかった。７ −５日目には増殖して合流し、この増殖は限られたトリプシン効果によって線維芽細胞及びその他の非内皮細胞か先ず選択的に除去されるコロニー周縁に集中して起こった。この方法を実証するに際して適当な培地と組合わせると、樹状突起または単球細胞の特徴である線維芽細胞形態またはマーカを有する細胞による汚染がほとんどない培養物が得られた。内皮細胞は使用した３種類の培地のすべてにおいて増殖に成功したが、培地は典型的な内皮マーカ及びシトキン応答（後述）を維持しなから内皮細胞を選択的に増殖させる相対的な能力において各培地間に差異があった。

例えば、異なる培地で増殖させた微小血管内皮細胞間には形態差があり、血清を含有する培地からは内皮細胞に特有の丸石状形態を有する細胞が生成する頻度が高かった（図］、パネルＡ）。これに対して、血清を含有しないＣＳ−１，５５培地では非内皮ｍ胞よりも内皮細胞の方が迅速がっ選択的に増殖した（パネルＢ）。

赤毛サル腸間膜リンパ節の生きた培養微小血管内皮細胞の詳細に示す図１の２つの顕微鏡写真は２％ＦＢＳを含有する全ＥＢＭ中で密集状態に増殖したドーム形の細胞（パネルＡ）と、血清を含有しない内皮細胞培地である全Ｃ８−１，５５中で増殖した比較的細長い細胞（パネルＢ）とを比較して示している（目盛バーはＩＮμｍ）。

図２から明らかなように、ＣＳ　ｉ、　５５中で培養された内皮細胞による、内皮と関連するマーカであるアセチル化ＬＤＬ取込みは大動脈から得た内皮細胞の場合と同様であった。具体的には、図２は下記の部位から得られた培養サル内皮細胞によにるアセチル化ＬＤＬ取込みのフローサイトメトリー分析である：大動脈（太い実線）；腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）の微小血管内皮細胞（破線）；２４時間にわたってＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−１β（ｌｎｇ／ｍｌ）で活性化されたＭＬＮ微小血管内皮細胞（点線）；及び負対照ヒト培養包皮（ｔｏ＋ｅｓｋｉｎ）線維芽細胞（ＨＦＦ）（、細い実線）。６時間にわたって細胞にアセチル化ＬＤＬ（１０μｇ／ｍｌ）を作用させてから、これをトリプシン−ＥＤＴＡで除去し、Ｃｏｕｌｔｅ＋ＥＰ　Ｉ　ＣＳ　７２０−２フローサイトメータで分析した；材料及び方法の項を参照されたい。

血清を含有しない培地で培養された内皮細胞は６回以上の継代を繰返えしてもその形態はほとんど変化しなかった。これに反して血清を含有する培地で培養された微小血管内皮細胞は通常３回の継代後には扁平になり、多くの場合基質との接触が消えた。従って、血清を含有する培地の場合、最初の２回の継代から得られる細胞だけを接着評価に使用した。

例　２シトキンによって誘発された培養微小血管内皮細胞へのリンパ球接着内皮を刺激してリンパ球接着を促進するＩＬ−１β、ＩＬ−２，ＩＬ〜４及びＩＦＮ−γの能力を下記のように検討した。要約すると、赤毛サル腸間膜リンパ節から得た微小血管内皮細胞の培養物を異なる時間にわたって上記シトキンの存在において培養し、洗浄し、後述するようにそのリンパ球接着を評価した（材料及び方法の項を参照）。評価に先立ってリンパ球懸濁液から単球を除去した。その結果を表１と図３及び図４に示す。

図３はサルの１種Ｍａｃａｃａ　ｎｅｍｅｓ＋ｒｉｎａの腸間膜リンパ節から培養した内皮細胞へのＰＢＬ接着を示す顕微鏡写真である。

内皮細胞を密集状態になるまで増殖させ、２４時間にわたってシトキンにより活性化した。接着評価後、細胞をグルタルアルデヒド１兇ＰＢＳ溶液で固定した。

パネル（ａ−ｄ）は（ａ）ＩＬ−１β　（ｌｎｇ／ｍｌ）　；　（ｂ）　■　Ｌ　−４（ＩＯｎｇ／ｍｌ）；（ｃ）ＩＬ−１β（ｌｎｇ／ｍｌ）及びＩ　Ｌ　− ４（１０ｎｇ／ｍｌ）による内皮細胞活性と；　（ｄ）インターロイキンを添加しなかった対照を示す。矢印は接着リンパ球；矢じりは内皮細胞；目盛バーはｌ１ｌｆｌμのである。

図４はシトキン濃度及び培養時間を変えながら測定したシトキンで活性化した培養微小血管内皮細胞へのＰＢＬ接着を示すグラフである。接着評価する前にグラフに示しである時間にわたって内皮細胞をシトキン（ベタ円はＩＬ−４，中抜き円はＩＬ−１β：三角形は１　ｎｇ／ｍ１（７）　Ｉ　Ｌ　−１βと併存するＩＬ−４）で処理し、培養してがら接着を評価した。これらの内皮細胞へのリンパ球結合を、接着しているリンパ球を視覚的にカウントすることによって測定した。それぞれの点は接着ＰＢＬの平均個数子ＳＥＭを表わす。

先に述べた研究内容（１６，１８，２０）から予測されるように、２４時間にわたる誘発後、ＩＬ−１β処理もＩＦＮ−γ処理も接着リンパ球の数を同様に増大させた。ｌｐｇ／ｍｌ乃至１０ｎｇ／＋ｎｌのシトキン濃度にわたり、対照に対して２乃至４の刺激指数が典型的であった（図３及び表１）。どのテスト濃度においてＩ　Ｌ−２はリンパ球結合に全く作用しなかった（表１、及び図示しないデータ）。

他のシトキンで観察された微弱な作用とは対照的にＩＬ−４処理は常にリンパ球接着を極めて顕著に増大させた（図３及び図４、表１）。Ｉ　Ｌ−４誘発内皮細胞へのＰＢＬ接着のレベルは（シトキンを添加されない）対照のそれを４５倍も上回った（図４．２４時間）。内皮細胞へのリンパ球接着を最大限に促進するＩＬ−４の最適濃度は１１００ｐ／ｍｌ乃至１０ｎｇ／山１であった：この最適値は内皮細胞にこのシトキンを作用させるすべての時間長（４，２４，７２時間）に共通であった（図３１図４）。この濃度ではＩ　Ｌ−４を作用させた内皮細胞に結合するリンパ球の絶対数は常に２００−１３００リンパ球／ｍｍ２てあったのに対して対照の内皮細胞では僅かに５−４０リンパ球／ｍｍ２であった。刺激指数（２乃至４５）は微小血管内皮の供給源として使用された動物の種類に応じて異なり、血清を含有しない培地で増殖させた内皮細胞では基本の接着レベルが比較的高いことが主な原因となり刺激指数は比較的低かった（第１表）。

分析評価の過程で培養物に抗ＩＬ−４抗体を添加しても、分析評価の３０分前にリンパ球懸濁液にＩＬ−４を添加しても、培養内皮細胞へのリンパ球結合に影響はなかったから、Ｉ　Ｌ−４はリンパ球よりはむしろ微小血管内皮細胞に作用することによって接着を促進した。ＩＬ４で誘発した接着はシトキン処理後早くも４時間で検出され、１２−２４時間後には高平部に達し、Ｉ　Ｌ−４が存在し続ける少なくとも７２時間にわたってこの接着が認められた（図４）。Ｉ　Ｌ−４に対する機能レセプタを有する線維芽細胞（４１−４４）のような他の接着性細胞にシトキンを添加しても発明者等のシステムにおいてリンパ球接着を促進しなかった（図示しないデータ）から、Ｉ　Ｌ−４の作用は比較的培養微小血管内皮細胞に対して特異であると判断された。テストされた最高濃度のＩＬ−４（５［１−１００ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−１β（５−］Ｏｎｇ／ｍｌ）では培養微小血管内皮細胞はその形態に変化が起こり、丸石形からもっと扁平な形となり、細胞間の接触が少なくなるだけでなく、細胞が寒天層（培地）から分離した。このような変化はシトキン添加から２４時間後に現われ、培養ウェルの単位面積当りのリンパ球接着が減少した。

例　３培養微小血管内皮細胞へのリンパ球接着を促進するＩ　Ｌ−４とＩＬ−１の相乗作用して全く影響を受けなかった。いったん誘発させると、内皮細胞の接着機能は比較的安定に持続］７た。ただし、関連の細胞接着分子が作用状態に維持されるためには絶えずシトキンが存在することが必要であった。内皮細胞をＩＬ−１β及びＩ　Ｌ−４で２４時間培養してからインターロイキンを除去すると、最初の８時間はリンパ球接着維持能力はほとんど変らず、２４時間後に５０％だけ低下し、７２時間後にはほぼ基本レベルにまで戻った（図５）。

例　４微小血管内皮細胞へのＩ　Ｌ−４誘発リンパ球接着に関与する１つのＣＡＭの識別公知の接着分子を誘発することによってこのシステムにおけるＩ　Ｌ−４の効果か現われること、あるいはこの効果が新規ＣＡ　Ｍ　ｓの発現を伴なうことは先験的に推測できる。この可能性を実証するために次に述べるアプローチを試みた。先ずリンパ球結合の温度依存性と陽イオン依存性を測定した。

温度依存性は小さく、４°Ｃにおいても３７℃においても強固な接着が観測された（図３及び図４、表１．及び図示しないデータ）。また、リンパ球結合は二価陽イオン依存性であり、マグネシウムイオンよりはむしろカルシウムイオンを必要とした（図６）。これらの事実はいずれもＬＦＡ−１（ＣＤ１１　／’　ＣＤ　１８　）　／　Ｉ　ＣＡ　Ｍ−１によって仲介される相互作用を考慮から除外する根拠となり得るものである。なぜなら、これらの相互作用は低温に感応し、好ましい陽イオンとしてマグネシウムを利用するからである（４７）。

図６に詳細を示すように、内皮細胞を２４時間にわたってＩＬ−１β（ｌｎｇ／ｍｌ）及びＩ　Ｌ−４（ＩＯｎｇ／ｍｌ）で活性化した。次いて内皮細胞をパラホルムアルデヒド１％のＰＢＳ溶液中に固定し、洗浄し、Ｃａ”またはＭｇ″゛を添加した１％ＢＳＡ及び１％グルコース含有ＰＢＳベースの培地中で接着を分析評価した。グラフ中の各バーは４回の測定で得た接着リンパ球数の平均値±ＳＥＭを表わす。黒いバー：　ＩＬＩ／　Ｉ　Ｌ　４によって活性化された内皮細胞；白いバー：シトキンを添加しなかった対照。

次いで、ＣＡＭｓ　、ＣＤ４４．ＭＥＣＡ−７９によって仲介される細胞間の相互作用を妨げるものと知られるｍＡｂによる阻止効果及びＬＦＡ−１とＩＣＡＭ −１と間の相互作用による阻止効果に対するＩ　Ｌ−４誘発接着の感度を、分析評価の前に関連細胞（即ち、リンパ球または内皮細胞）を個々のｍＡｂで予備処理することによってテストした（材料及び方法の項参照）。これらの試薬はいずれも培養物中または組織切片中の赤毛サル内皮細胞及び／またはリンパ球とよく反応したか、この条件下でリンパ球結合を著しく妨げるものは皆無であった。ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αで誘発後、内皮における第■類ＭＨＣ分子が活性化されることが報告されているから（５０−５２）、抗第■類（ａｎｔｉ−ｃｌａｓｓ　Ｕ　）　Ｍ）（ＣｍＡｂであるＨｂｌＯａをもテストしたところ、これもリンパ球接着に作用しなかった（図示しないデータ）。ＥＬＡＭ−１に対して利用可能な抗体は赤毛サル内皮細胞と反応しないからこのＥＬＡＭ−１について同様の分析評価を行うことはできなかった。ただし、ＥＬＡＭ−］によって仲介される接着とＩ　Ｌ−４刺激後に観察される接着との間のその他の相違点は特定のＣＡ　Ｍが重要な役割を果すとする想定とは相客れなかった（上述の説明を参照）。

ヒトＶＣＡ、ＩＶｌ−１（別名ＩＮＣＡ、Ｍ−１０１（２８−３０））に対する２つの異なる抗体（４Ｂ９及びＥｌ／６）で行われた並行実験において、免疫蛍光共焦点鏡検によってシトキン誘発微小血管内皮細胞との反応性が極めて微弱であることか検出された（図示しないデータ）。ただし、４つの実験の１つにおいて、ＩＬ４／ＩＬ−１誘発微小血管内皮細胞へのリンパ球結合の抑制（４０％）が検出された。断定はてきないが、このような結果は特にｍＡｂ’５４Ｂ９及びＥ１／６か比較的種特異性であるだけに、接着プロセスにＶＣＡＭ−１か寄与する可能性を示唆１゜た。これらのｍＡｂ’ｓは赤毛サル組織の免疫細胞化学テストにおいて微弱な反応しか示さなかった。

問題を解決するため、Ｉ　Ｌ−４によって誘発された赤毛サル内皮細胞に特異なｍＡｂ’ｓを調製した（材料及び方法の項参照）。要約すると、シトキン刺激した内皮細胞で免疫処理したマウスからの牌臓細胞を利用した融合から得たハイブリドーマを、ＩＬ４／ＩＬＬ活性化内皮との選択的反応性について先ずＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。次いて種々のシトキン処理条件下で内皮細胞へのリンパ球結合を阻止する能力について陽性クローンをテストした。このように誘発された１つのｍＡｂである６Ｇ１０は培養内皮細胞上に、各シトキン（即ち、ＩＬＩβ＋Ｉ　Ｌ４＞　Ｉ　Ｌ４＞　Ｉ　Ｌ−１β、図７）によって誘発されるリンパ球接着量と並行して発現する細胞表面抗原を検出した。さらに重要な所見として、６Ｇ１０は内皮細胞をＩＬ−１β／ＩＬ−４で処理し７たのちに生ずるリンパ球接着を８０％まで阻止した（図８）。ｍＡｂ　６Ｇ　］、　Ｏによって認識される構造を明確に識別するため、ヒトのＥＬＡＭ−１，ＩＣＡＭ−１，ＶＣＡＭ−１，または対照としてのＣＤ４を符号化するｃ　Ｄ　Ｍ　Ａ　ｓでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞との反応性についてこの試薬を間接免疫蛍光によってテストした。発明者等はｍＡｂ４Ｂ９と同様のｍＡｂ６Ｇ１０がＶＣＡＭ −１遺伝子の産物を発現させるトランスフエクタントと特異的に結合するという所見を得た（図９）。他のトランスフエクタントに対しては反応性が観察されなかった。このシステムにおいてＩ　Ｌ−４により刺激された内皮細胞と結合するリンパ球はおそらく赤毛サルのヒトＶＣＡＭ−１相同体またはこれと血清学的に関連する分子を主要な接着成分として利用すると考えられる。

詳しくは図７に示すように、内皮細胞を２４時間にわたって下記因子で活性化した・パネルＡ、シトキン添加なし；ノ々ネルＢ、ＩＬ−１β（ｌｎｇ／ｍｌ）　；パネルＣ，ＩＬ−４（１０ｎ　ｇ　／　ｍ　ｌ　）　；パネルＤ、Ｉ　Ｌ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−１β（ｌｎｇ／ｍｌ）。刺激後、室温で２時間にわたり未固定の細胞にｍＡｂ６Ｇ１０を作用させ、・次いでビオチニル化（ｂｉｏｔｉｎ７１ａ！ｅｄ）　２次抗体を作用させ、アヴイジン（ａｖｉｄｉｎ）　 −Ｆ　ＩＴＣ標識処理し、バイオラド・レーザ走査共焦点顕微鏡で分析した。図から明らかなように、内皮細胞のＩ　Ｌ　−４及びＩＬ−１β＋Ｉ　Ｌ−４活性化と共に免疫蛍光が強まる。目盛ノく−は５０μｍである。

図８に示すように、内皮細胞をＩ　Ｌ　−４（ｌｏｎｇ／ｍｌ）だけまたはＩＬ −１β（ｌｎｇ／ｍｌ）と組合わせて２４時間にわたり活性化した。シトキンを除去したのち、細胞にｍＡｂ４Ｂ９または６Ｃ１０を３０分間にわたって作用させ、接着評価を行なった。それぞれのバーは４回の測定による接着リンパ球の平均個数±ＳＥＭを表わす。

図９は各トランスフエクタントの免疫蛍光を示す：パネルＡ、６Ｇ１０で標識処理されたヒトＶＣＡＭ−１トランスフェクタント；パネルＢ、（Ａ）と同じだが４Ｂ９で標識処理されたヒトＶＣＡＭ−１トランスフエクタント；パネルＣ９６Ｇ１０で標識処理されたヒトＩＣＡＭ−１）ランスフェクタント；パネルＤ、６Ｇ１０で標識処理されたヒトＥＬＡＭ−１トランスフエクタント。目盛バーは１００μｍである。

図１０はｍＡｂ６Ｇ１０による微小血管内皮の細胞表面分子の放射標識免疫沈降反応を示す。内皮細胞を全ＥＢＭ中で密集状態となるまで増殖させ、Ｉ　Ｌ−４（ＩＯｎｇ／ｍｌ）　、ＴＮＦ　−ａ　（ＩＯｎｇ／ｍｌ）　、またはＩ　Ｌ　 −４（ＩＯｎｇ／ｍｌ）及びＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）で活性化させるか、あるいはシトキンが添加されていない対照として使用した。内皮細胞を１２５■ で標識処理し、溶解させ、ｍＡｂ６Ｇ１０で免疫沈降させ、還元条件下で１０％ＳＤＳゲル上て電気泳動させた。対照レーンには存在しないレーン２−４のｌｌ０ｋＤに、はっきりした帯が現われていることに注目されたい。

例　５骨髄基質細胞においてｍＡｂ６Ｇ１０によって認識される発現をＩ　Ｌ−４及びＴＮＦが誘発する１３年前、Ｄ＋、Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｄｅｘｌｅ＋とその協力者達（６５）は試験管内での長期間にわたる原始骨髄幹細胞の生存及び増殖を維持する方法を確立した。本来、ネズミ細胞を培養するために最適化されたものであるが、このいわゆる長期骨髄培養（ＬＴＢＭＣ）システムをヒト骨髄の成長を助けるように改良した（６６）。この両システムの重要な特徴は骨髄の基質細胞ポピユレーションから得られる間葉細胞の接着性層か発生することにある。この培養物の基質要素による誘発作用は、培養物中の幹細胞の成長、自己更新及びより特定化された子孫細胞（例えば骨髄性先駆細胞）への分化を生体内と同様に誘発するのに不可欠である。このプロセスでは基質細胞から放出されるシトキンも基質細胞と造血先駆物質との間の接着性相互作用もともに重要である（６７．６８）。なお、この試験管内システム及びこれに対応する生体内システムにおいて利用される具体的な接着メカニズムは疾病に応して異なる。

発明者等はｍＡｂ　６　Ｇ　ｉ　Ｏによって認識される抗原が特にＩＬ−４及び／′またはＴ　Ｎ　Ｆによる誘発後、試験管内のヒト骨髄基質細胞に発現することを発見した。図１１は確立された方法に従い２週間にわたる長期骨髄培養で成長したヒト骨髄基質細胞を示す。この代表的な実験では、ｍＡｂ６Ｇ１０（２０ μｇ／ｍ１）（パネルＡ）、またはアイソタイプ適合対照抗体（パネルＢ）及びヒツジのアンチマウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｓ５ｏｃ、　）で放射性標識処理する前に、組換えヒトＴＮＦ− ａ及びＩ　Ｌ　−４（１０ｎｇ／ｍｌ）て２５時間にわたって培養物を処理した。走査レーザ共焦点顕微鏡を利用して免疫蛍光像を記録した。６　Ｇ　ｉ　Ｏによって認識される基質細胞における抗原発現がＩＬ−４／ＴＮＦ−αによって促進されることはパネルＡて明白である。この新しい所見はＶＣＡＭ−１の組織分布に関する従来の情報からは予測できなかったであろう。興味深いことに、ヒト内皮においてＶＣＡＭ−１を認識することでは６Ｇ１０と同様であるｍＡｂ　４　Ｂ　９　（Ｊｏｈｎ　Ｈａ＋ｌａｎ提供）はこのように培養されたヒト骨髄基質とは顕著に結合しなかった。従って、ｍＡｂ６ＧＩＯによって結合される抗原決定基はｍＡｂ４Ｂ９によって結合される抗原とは異なると考えられる。ｍＡｂ６Ｇ１０によってＴＮＦα／Ｉ　Ｌ４活性化培養ヒト骨髄基質から免疫沈降させた細胞表面分子は、活性化された網（ｏｍｅｎｌｕｍ　）内皮細胞で観察された細胞表面分子とは異なる。６Ｇ１０によって認識される分子はそのサイズが比較的大きく、分子量か＋１５−１３０ｋＤのものと、２００ｋＤ以上のものがあり、いずれも公知のＶＣＡＭ−１の１００ｋＤよりも大きかった。

発明者等はまた、（インテグリンα４／β１（６９）とも呼称される）ＶＬＡ− ４，ＶＣＡＭ−１に対する主要レセプタがＣＤ３４抗原を含む骨髄細胞に高レベルで発現することを発見した。図１２は負対照ｍＡｂ　（細い線）及び抗ＶＬＡ −４ｍＡｂ　１６３Ｈ（太い線）で着色したヒトＣＤ３４＋骨髄細胞のＦＡＣプロットを示す。ＣＤ３４の発現が原始幹細胞及び先駆細胞の中で増量される骨髄細胞の部分集合（１−４％）を弁別し易くするから、この共発現の発見は有意義である（７０）。従って、発明者等は造血幹細胞及び／または先駆細胞と基質要素との間に起こる骨髄内での接着相互作用は、ＶＬＡ−４と６６１０によって認識される抗原との結合によって仲介されるものと推測する。骨髄移植の前または途中に２つの既知接着分子ＣＤ４４及びＬＦＡ−１にそれぞれ対抗する抗体（７１，７２，７３）を投与すれば、移植骨髄と受容体が完全に遺伝子適合でない場合に移植プロセスを容易にすることが大型動物系（イヌ）及びヒトにおいて実証されている。

従って、ｍＡｂ６Ｇ１０及びその抗原結合誘導体のほか、ｍＡｂ６Ｇ１０、ＶＣＡＭ−１及びその誘導体のような抗原結合特異性を有するハイブリドーマから発生するまたは組換え操作された結合パートナ−１特にｍＡｂ６Ｇ１０、ＶＬＡ− ４及びその誘導体によって認識される結合パートナ−は、骨髄幹細胞または骨髄基質の成長または分化を肯定的または否定的に変化させるため試験管内または生体内で使用することができる。例えば、ここに開示したシトキン及び試薬は移植片の成長を促進することによって（例えばＩ　Ｌ−４またはＴＮＦ−α投与によって）、または移植片に対する拒絶症状を防止することによって（例えばｍＡｂ６Ｇ１０によって認識される可溶性ＶＣＡＭ−ルセプタによる予備処理、またはｍＡｂ６Ｇ１０によって認識される抗原によって認識されるＶＬＡ−４に向けられる抗体によって）骨髄移植の成功を容易にする上で有用である。

ここに開示する試薬に原始造血幹細胞、先駆細胞または骨髄基質要素を（例えば、ＦＡＣ３細胞選別、磁気ビーズ選択、または否定的には補体溶解によって）免疫選択するのにも有用である。

上記応用は、腫瘍や貧血の治療法として骨髄移植を促進するために生体内または試験管内でここに開示するシトキンを投与する場合に特に有用である。

ここに開示する試薬は、放射性核種やその他の薬剤と容易に接合することにより、腫瘍性疾病、貧血、または造血源の良性肥厚を放射性造影またはそれ等を治療する目的で放射性核種または薬剤を骨髄に極めて特異的に局限化するターゲット手段を提供する。

Ｉ　Ｌ−４及びＴＮＦ−αは骨髄基質における６Ｇ１０抗原の発現を誘発するから、上記抗体を注射して生体内にシトキンを、またはレセプタ接合体を適当に使用することによって骨髄に対する抗体またはレセプタ結合体の特異的な局限化を高めることができる。

ワシントン州シアトル、ワシントン大学Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｐ＋ｉｍａｔｅＲｅｓｅａＩｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　（地域霊長類研究センター）のＴｉ５ｓｕｅ　Ｄｉｓｔ＋ｉｏｕ目ｏｎ　Ｐ「ｏｇＩａｍ　（組織分布プログラム）を介して０５乃至７年のＭａｃａｃａ　ｎｅｍｅｓｌ＋ｉｎａの腸間膜リンパ節を得た。このリンパ節は２５　ｍＭ　ＨＥＰＥＳで緩衝され、ｐＨ７，０であり、チロシン及びゲンタミシンを含有するＲＰＭＩ−１６４０から成る水冷洗浄液（Ｓｉｇｍａ　）に浸して運搬された。小血管及び内皮細胞を分離するため、Ｗｉｌｌｉａｍｓが報告している方法（３５）を改良した方法を利用した。要約すると、リンパ節を細かに裁断し、それを１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（Ｆ　Ｂ　Ｓ、Ｈｙ　Ｃ１ｏｎｅ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）を含有するｐＨ７，２の全ウェイマウス培地（ＷＭ）中に０．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＴ７ｐ　Ｉ　Ｖ　（Ｓｉｇｍａ　）　。

０、５ｍｇ　／ｍｌのジスパーゼ（Ｂｏｅｈ＋ｉｎｇｅ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）及び０．０５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ＋ｅ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）を添加した消化溶液へ移した。組織を３７°Ｃで保温し、１５−２０分ごとに渦流させることによって撹拌した。懸濁状態にある単独細胞及び小さい細胞集団を０５−１時間ごとに採取した。小さい細胞凝集塊や、毛細血管及び大血管の断片を短時間２００ＸＧで遠心処理によって大部分のリンパ球及び個別の基質細胞から分離した。ペレットを洗浄液中で洗浄し、全ＷＭ、または２％ＦＢＳを含む全内皮基礎培地（ＥＢＭ、　Ｃ１ｏｎｅｔｉｃｓ　）、または内皮細胞成長因子（ＥＣＧＳ、　ＩＯμｇ　／ｍｌ、　ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍ＋　）及びヘパリン（５０μｇ　／ｍｌ、　Ｃｅ１ｌ　Ｓ７ｓＳ７５ｔｅを含む血清なしの内皮細胞培地ＣＳ−１，５５（Ｃｅｌｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）中に再び懸濁させた。燐酸塩緩衝食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）中に１％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ　）を含むｐＨ７，０の液であらかじめコーティングされた２５ｃｎｆフラス−７（Ｆａｌｃｏｎ）を使用し、５％ＣＯ２で細胞を３７０℃で培養した。約１８時間後、新鮮な培地を加えて非接着状態の細胞を吸出した。５−１０日目間スクレーパによって機械的に、または１×トリプシン／ＥＤＴＡを使用する９０秒間の消化によって、増殖中の線維芽細胞を除いた。

この手法は３〜７日毎に繰返えされた。内皮細胞が密集状態にまで増殖したら、１×トリプシン／ＥＤＴＡによる処理で細胞を固定状態から離脱させ、１：３の割合で新しいフラスコへ継代させた。細胞の少なくとも９５％が内皮細胞に固有の形態及びマーカ（例えばアセチル化低密度リボプロティンの取込み、シトケラチン発現の欠如）を有する培養物だけを以後の実験に使用した。このような条件下では、培養物中には単球または樹状突起細胞に固有の形態学的及び免疫組織学的マーカを持つ細胞はほとんど認められなかった。

接着評価に際しては、最初から２つの継代から得た細胞を、ゼラチン・コーティングされた２４個のウェル平板（Ｃｏｓｔａｒ）またはコーティングされてない２４個のウェルＰ＋ｉｍａ＋ｉａ　（商品名）平板（Ｆａｌｃｏｎ）上で、５Ｘ１０’個／ウェルの割合で平板培養し、密集状態に増殖するまで、通常は１週間にわたって保温した。使用済み培地を除いてから、混合物のない、またはヒト組換えＩＬ−１β、ＩＬ−２，ＩＬ−４（１ｍｍｕｎｅｘ　）　、またはＩＦＮ− ７（人１ｐｈａ　Ｔｈｅ【ａｐｅｕｔｉｃ　）、またはこれらの組合わせから成るシトキンを混入した１ｍ（／ウェルの新鮮な培地を加え、さらに４−７２時間にわたって細胞を増殖させた。ヒト組換えＩ　Ｌ−４及びＩＬ−１βの他の供給源としてミネソタ州ミネアポリス、　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　＆　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ＳＨｌｅｍｓ　も含まれる。蛋白合成依存性をテストする実験では、接着評価の前にエメチン（Ｓ　ｉ　ｇｍａ　）を最終濃度が５０μＭになるまでは添加した。

低密度リボプロティン（Ｌ　Ｄ　Ｌ）取込み過塩素酸ジオクタデシルテトラメチルインドカルボシアニン（Ｄ　ｉ　Ｉ　−Ａｃ　−ＬＤＬ、　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　）で標識処理されたアセチル化低密度リボプロティン１０μｇ／ｍｌを使用して細胞を４時間にわたり３７℃に保温した。

ＰＢＳで２回洗浄してから、細胞をトリプシンＥＤＴＡで離脱させ、２％パラホルムアルデヒドＰＢＳ溶液で固定し、Ｃｏｕ目ｅｒ　ＥＰ　ＩＣ３７５０−２フローサイトメータで５５５ｎｍ励起を利用して分析した。合計２Ｘ１０’の事象（ｅｖｅｎｔｓ）をリスト形式のファイルとして採取し、前進角光散乱を利用するＲｅｐ＋ｏｍａｎ　（商品名）ソフトウェア（Ｔ＋ｕｅＦ　Ａ　ＣＳ）によって再処理することで死細胞を排除した。全Ｃ３−１，５５中で培養された赤毛サル大動脈からの内皮細胞及びヒト包皮（Ｔ、Ｂｒｏｗｎ、　Ｆ　ＨＣＲＣから寄贈）をそれぞれ正及び負の対照として利用した。

接着評価Ｍａｃａｃａ　ｎｅｍｅｓｌｒｉｎａの末梢血リンパ球を上記不連続フィコール勾配遠心法（３９）によって他の血液要素から分離した。

マクロファージ及びその他の高接着性白血球を除去するため、標準的な組織培養ペトリディッシュ（ＦａｌｃＯｎ）を使用し、完全なＷＭの中で３×１０６細胞／ｍｌの配分で１−２時間にわたり３７℃で細胞を保温した。接着も評価するため、２４ウエル平板上の内皮細胞を水冷接着緩衝液（１％ＦＢＳ及び１゜％グルコースを含むｐＨか６８の１１　Ｅ　Ｐ　Ｅ　Ｓ緩衝ＲＰ　Ｍ　Ｉ　−１６４０）で２回洗浄し；０．４ｍｌの接着緩衝液をウェルごとに等分し１４℃の温度で５０ｒｐｍ回転の回転シェーカ（Ｎｅｗ　Ｂ＋ｕｎ’　５ｔｉｃｋ　）上に配置した。ペトリディッシュからリンパ球を採取し、カウントし、２．５Ｘｉ０６細胞／ｍｌの割合で水冷接着緩衝液中に再懸濁させ、内皮細胞単層に添加した（０．２ｍｌ／ウェル）。３０分後、ゲルタールアルデヒド２％のＰＢＳ溶液を各ウェルに少しずつ添加することによって細胞を固定した。

ＰＢＳで２回洗浄してから、次のような方法て光鏡検によってリンパ球接着を量定した。計算のため、各ウェルを４分円に分割した。各４分円内で内皮細胞に接着しているリンパ球の個数をウェルの０．２４ｍｍ２に相当する顕微鏡視界で測定した。

測定結果は平均埴土標準偏差として表現される。二二価陽イオン依存性をテストする実験では、分析評価の前に内皮細胞をパラホルムアルデヒド固定し、ＰＢＳで洗浄し１１％ウシ血清アルブミン及び１％グルコースを含むと共に、Ｃａ”（１ｍＭ）またはＭｇ”　（１ｍＭ）を添加した、または添加しないＰＢＳ中で接着評価した。

シトキンで誘発される内皮細胞に対するｍＡｂの生産Ｂａ１ｂ／ｅマウス（Ｉａｃｋｓｏｎ　ＬａｂｏＩａｔｏｒｉｅｓ）を免疫処理するため、培養された微小血管内皮細胞を２４時間にわたってＩＬ　−４（ｌｏｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−１ β（］、ｎｇ／ｍｌ）で活性化し、ＰＢＳで洗浄し、スクレーパで剥離させた。

２０ＯＸＧで遠心分離処理後、補助薬ペプチド及びムラミル・ジペプチド（５０ μｇ／マウス、　Ｓｉｇｍａ　）を含有するＰ　Ｂ　Ｓ　（０，５ｍｌ／マウス）に再懸濁させ、細胞（１−５Ｘ］、０６／マウス）をマウスに皮下（頚部）及び腹腔内注射した。以後８力月に４回追加を行なった。最後の追加から４日後、肺臓を摘出し、Ｋｃｎｎｅ口（４０）が報告しているようにポリエチレングリコール（ＭＷ−１５００，＾ｌｄ＋ｉｃｈ　）を使用してリンパ球をＮ５−１骨髄腫細胞と融合させた。ハイブリドーマの選択はアミノプテリン（Ｓｉｇｍａ　）によって行なった。ＩＬ−４／ＩＬｉで活性化された微小血管内皮細胞と活性化されていない微小血管内皮細胞において上澄みをＥＬＩＳＡスクリーニングしたのち、接着評価において陽性クローンをテストし、シトキン活性化内皮細胞へのリンパ球結合を阻止する陽性クローンの能力をテストした。選択されたハイブリドーマを少なくとも３回サブクローニングした。純粋なモノクロナール抗体（ｍＡｂ’ｓ）を生産するため、血清を含まない培地（Ｎｕｔ＋ｉｄｏｍａ−Ｎ　Ｓ　。

Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）中でハイブリドーマを増殖させ、硫酸アンモニウムで免疫グロブリンを沈降させた。

ｍＡｂ６Ｇ１０を生産するハイブリドーマは１９９０年８月２日に受入れ番号筒ＨＢ　１０５１９号で米国メリーランド州ロックビル、１２３０１パークローン・ドライブに所在するアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（ＡＴＣＣ）に供託さ内皮細胞へのリンパ球接着を阻止するため、最終濃度が１０−５０ μｇ／ｍ　ｌまたは接着緩衝液の上澄が５０％となるように内皮細胞またはリンパ球にすべてのｍＡｂ’ｓを添加し、３０分間にわたって３７℃に保温した。２回洗浄したのち、上述のように細胞を接着評価に利用した。免疫蛍光テストのため、ヒトＶＣＡＭ−１，ＩＣＡＭ−１，ＥＬＡＭ−１まタハＣＤ４を符号化するｃＤＮＡｓ　（Ｒ，Ｌｏｂｂ及び１．Ｈａ＋ｌａｎからの寄贈）でトランスフェクトされた内皮細胞またはＣＨＯ細胞を組織培養８−チェンバー・スライド（ＶＷＲ）で増殖させた。生または水冷アセトンまたはパラホルムアルデヒド固定された（ＰＢＳ中２％）細胞をヒツジ血清の３％ＰＢＳ溶液で予備ブロックし、ｍＡｂまたはポリクロナール抗体と共に２時間室温で培養した。洗浄後、細胞をＦ　ＩＴＣ標識ヒツジ抗マウスＩｇ抗体と共に３０分間室温で培養し、洗浄し、バイオラド・レーザー走査共焦点顕微鏡及び画像分析ソフトウェアを使用する免疫蛍光鏡検によって分析した。使用した抗体は次の通り：抗Ｉ　ＣＡＭ　（ＲＲＩ　／　１　、　Ｒ，Ｒｏｊｂｌｅｉｎから寄贈）、抗体Ｌ　Ｆ　Ａ　−１（６０，３，Ｐ、　Ｂｅａｔｔ７から寄贈）、抗ＣＤ４４（Ｈａｔｃｈ−１）　、抗リンパ節アドレッシン（ＭＥＣＡ−７９゜Ｐ、　Ｓｆ＋ｅｅｔｅ＋及びＥ、　Ｂｕｔｃｈｅ「から寄贈）、抗第■類ＭＨＣ（ＨＢ　１０ａ　、　Ｅ、Ｃ１ａ＋ｋから寄贈）、抗因子■（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）　。

抗１　ｔ、−４（１ｍｍｕｎｅｘ　）　、及び抗ヒトＶＣＡＭ−１（４Ｂ９゜Ｊ、Ｈａ＋ｌｘｎから寄贈；及びＥ　１　／　６．　Ｍ、　Ｂｅｖｉｌａｑｕａから寄贈）。

赤毛サル大動脈からの培養内皮細胞とは異なり、微小血管内皮細胞は因子■に対するポリクロナール抗体によって検出可能な標識を全く示さず、このことはラット末梢節からの培養微小血管内皮細胞の因子■抗体による負標識処理に関する報告と完全に一致した（３６−３８）。

引例文献１、　Ｗ、Ｍ、Ｇａ１ｌａｊｉｎ等、　′リンパ球の器官特異性ホーミングに関与する細胞表面分子”、ＮａｔｕＩｅ　３４０　：　３０．１９８３゜２、Ｂ、Ｈｏｌｚｍａｎｎ等、　′ネズミのバイエル板に特異なリンパ球ホーミング・Ｉノセプタを、ヒトＶＬＡ４と相同のα鎖を有するインテグリン分子と識別”、Ｃｅ１ｌ　５６　：３７．　１９８９゜３、　Ａ、Ｄｕｉｊｖｅｓｔｉｊｎ及びＡ、　）Ｉａｍａｎｎ、″リンパ球遊走のメカニズム及び制御”　、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｔｏｄａｙ　１０　：　２３．１９８８゜４、　Ｗ、Ｍ、Ｇａ１ｌａｌｉｎ等、　“リンパ球ホーミング・レセプタ”。

Ｃｅ１ｌ　４４　：　６７３．１９８６゜５、Ｔ、＾、Ｙｅｄｎｏｃｋ及びＳ、Ｄ、Ｒｏｕｎ、　”リンパ球ホーミング。

Ａｄｙ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、４４　：　３１３．１９８９゜６、　Ｊ、Ｊ、Ｗｏｏｄｒｕｌ＋及びり、　Ｍ、　Ｃ１ａ「ｋｅ、“再循環リンパ球の遊走経路を確定する特異な細胞接着メカニズム、”＾ｎｎ、Ｒｅｖ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、５　：　２０１．１８９７゜７、　Ａ、Ｈａｍａｎｎ等、　“ ホーミング中のリンパ球／高内皮細胞相互作用におけるＬＦＡ−１の補助的役割の実証”、Ｊ、Ｉｍａ＋ｕｎｏ１．１４０　：　６９３．１９８８゜８、　Ｒ，Ｒｏｌｈｌｅｉｎ等、”ＬＦＡ−１とは全く異なるヒト細胞間接着分子（ＩＣＡＭ−１）　”　、　Ｊ、１．ｍｍｕｎｏｌ、１３７　：１２７０゜１９８６゜９、　Ｓ、Ｄ、Ｍａ＋ｌｉｎ及びＴ、Ａ、Ｓｐ＋ｉｎｇｅ＋、”精製された細胞間接着分子−１−（Ｉ　ＣＡ　Ｍ　］、　）はリンパ球機能を伴った抗原−１（ＬＦＡ−４）のリガンドである”　、Ｃｅ１ｌ　５１：　８１３゜１９８７゜１０、Ｒ８Ｓ、　Ｃｏｔｒａｎ、“炎症及び免疫における内皮の新しい役割”　、Ａｍ、　Ｊ、　Ｐａｔｈｏｌ、１２９　：　４０７、ｌ９８７゜１１、　Ｓ、　Ｉａ、１ｋａｎｅｎ等、　“炎症のある滑液へのリンパ球のトラフィックを制御する明確な内皮細胞認識システム“、　５ｃｉｅｎｃｅ２３３　：　５５６．１９８６゜１２、１．Ａ、Ｍａｄ＋ｉ等、　“基質の作用下に起こる細胞サイズが大動脈内皮細胞の増殖及びシート移動を変調する”、　Ａｍ。

Ｊ、　Ｐａｆｂｏｌ、１３２　：　１８．１９８８゜１３、Ｓ、Ｔ、Ｐａ１ｓ等、　“ヒトのリンパ球遊走のメカニズム及び疾病の病原論に係わるその役割”、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｒｅｖ、１０８　：ＩＩｌ、　１９８９゜１４、　Ｊ、Ａ、Ｐｏｂｅ＋　、“シトキンによる静脈内皮の活性化。

生理学及び病理学”　、Ａｍ、　Ｊ、　Ｐａｔｈｏｌ、１３３　：　４２６．１９８８゜１５、Ａ、　Ｍ、　Ｄｕｉｊｖｅｓｔｉｊｎ等、　“リンパ球トラフィックに関与する内皮細胞に特異な抗原をインターフェロン−γが制御する”　、Ｐ＋ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３　：　９１１４．１９８６゜］、　５　、　Ｔ、　Ｈ，Ｐｏｈｌｍａｎ及びＪ、　Ｍ、　Ｈａ＋ｌａｎ、“リポポリサッカライド、インターロイキン−１及び腫瘍壊死因子に対するヒト内皮細胞の応答は蛋白合成によって制御される”、　Ｃｅ１１．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１１９　：　４１．１９８９゜１７、　Ｍ、　Ｐ、　Ｂｅｖｉｌａｑｕａ等、　“インターロイキン１は培養ヒト静脈内皮に作用して多形核白血球、単球、及び関連の白血球細胞系の接着を促進する”、１．　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、７６　：　２００３゜１９８５゜１８、Ｄ、Ｅ、Ｃａｖｅｎｄｅ＋等、　“インターロイキン１は内皮細胞単層へのヒｈＢ及び１９２８球の結合を促進する”、１．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３６　：　２０３．１９８６゜１９、１１１．ｌ’、Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ等、　“誘発可能な内皮−白血球接着分子の確定”　、　Ｐｒｏｃ、ＮａＮ＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４　：　９２３８．１９８７　。

２Ｑ、Ｃ，Ｌ、Ｙｕ等、　“ヒトのγインターフェロンは内皮細胞へのＴリンパ球結合を促進する”　、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｘｐ、　Ｉｍｍｏｎｏｌ、６２　：５５４、　＋９８５２１、Ｃ，Ｌ、Ｙｌｌ等、　“内皮細胞単層へのリンパ球結合に対する細菌性リポポリサッカライドの作用”、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３６５６９、　＋９８６゜２２、　Ｄ、　Ｅ、　Ｃａｖａｎｄｅ＋等、　“腫瘍壊死因子による内皮細胞へのリンパ球接着刺激”　、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３９　：　１８５５．１９８７゜２３、　Ｔ、　Ｂ、　ｌ５ｓｅｋｕ＋２及びＬＭ、５ｔｏｌｌｚ、”エンドトキシン。

腫瘍壊死因子及びインターフェロンによるリンパ球遊走刺激”　、　Ｃｅ１１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２０　：　１６５．１９８９゜２４、７Ｂ、ｌ５ｓｅｋｕｌ＋　“微小血管内皮へのリンパ球接着及びラットにおける生体内リンパ球遊走に対する６種の異なるシトキンの作用”　、　１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１．４４　：　２目０．１９９０゜２５　、　Ａ、　Ｎ、Ｋａｌａａｊｉ等、　“腫瘍壊死因子αによるヒツジ皮フ部位へのリンパ球集中化促進”、Ｉｍｍｏｎｏｌ、ＬｅＮｅ＋ｓ　２３　：１４３−１４８．１９８９゜２６、　Ｌ、Ｍ、Ｓｊｏｏｌｍａｎ、”リンパ球遊走を制御する接着分子”　、Ｃｅ１ｌ　５６　：９０７，１９８９゜２７　、　Ｍ、　Ｌ、　Ｄｕｓｔｉｎ及びＴ、Ｓ、Ｓｐ＋ｉｎｇｅ＋、“細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−４）とリンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）との相互作用は、培養内皮細胞へのリンパ球接着を裏づける少なくとも３つのメカニズムの１つである”、　Ｉ、Ｃｅ１ｌＢｉｏ１．　１．０７　：　３２１．１９８８゜２８、　Ｇ、Ｅ、Ｐ＋ｉｃｅ及びＭ、Ｐ、Ｂｅｖｉｌａｑｕａ、　”誘発可能な内皮細胞表面グリコプロティンが黒色腫接着を仲介する”、　５ｃｉｅｎｃｅ２４６・１３０３．　＋９８９゜２９　、　Ｌ、　０ｓｂｏ＋ｎ等、　“静脈細胞接着分子１．リンパ球と結合するシトキン誘発内皮プロティンの直接クローニング。

Ｃｅ１ｌ　５９　：　１２（１３，１９８９゜３０、　Ｍ、　］、　Ｈｉｃｅｓ等、　“活性化内皮のＶＣＡＭ−１がＶＬＡ−４／フィブロネクチン結合部位とは異なる部位において白血球インシュリンＶＬＡ−４と相互作用する”、Ｃｅ１１６０　：　５７７、　＋９９１１゜３１、　Ｐ、Ｒ，５Ｉｒｅｅｌｅｒ等、　“末梢リンパ節へのリンパ球ホーミングに関与する静脈アドレッシンの免疫組織学的及び機能的特徴”、］、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１０７　：１８５３．］９８８゜３２、　Ｐ、　Ｒ，５（ｒｅｅｌｅｔ等、　“リンパ球ホーミングに関与する組織特異性の内皮細胞分子”、　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄ、）３３１　：　４１゜１９８８゜３３、　Ｎ、　Ｓａ＋ｖｅｌｎｉｃｋ等、　”第■類ＭＨＣ及びインターフェロン−γの異所性発現によりトランスジェニック・マウスにおいて誘発されるインシュリン依存性糖尿病”、Ｃｅ１１５２ニア７３、　＋９８８゜３４、　Ｈ，Ｒ，Ｈｅｎｄｒｉｋｓ等、　″輸入リンパ管を除去されたリンパ節の高内皮細静脈へのリンパ球接着の急激な減少”、　Ｅｕｒ。

Ｊ、　Ｉｍｍｏｎｏｌ、１７　：　１６９１．１９８７゜３５、　Ｓ、に、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、“微小血管及び大血管内皮細胞の分離及び培養；健康及び疾病状態における大血管の潅流と輸送に関するそれ等の移送と臨床研究への応用”、　ＭｃＤｏｎａｇｈ、ｅｄ、　；Ｋａｔｇｅｔ、　Ｂａ５ｅ１．　ｐ、　２０４．１９８７゜３６　、　Ｓ、　Ｋｕｍａ＋等、　“大小の血管から得られる内皮細胞における異質性”、　Ｄｉｆｌｅｒｅｎｔｉａｌｉｏｎ　３６　：　５７．１９８７゜３７、Ａ、＾ｇｅｔ、“ラットのリンパ節から得た高内皮細胞の分離と培養”、　Ｉ、Ｃｅ１ｌ　Ｓｃｉ、８７　：　１３３，１９８７゜　Ａ３８、Ｙ、Ｉｓｅ等、　“リンパ再循環の分子的メカニズム、１試験管内で培養された高内皮細胞の機能的、表現型的及び形態学的特徴”　、Ｅｕｒ、　ｌ、　Ｉｍｍｏｎｏｌ、’Ｊ−８：　１２３５．１９８８゜３９、　Ｗ、Ｍ、Ｇａ１ｌａ！ｉｎ等、”ＣＤ４＋リンパ球部分集合体におけるサルの免疫欠損ウィルスの選択的再現”、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６　：　３３０１．１９８９゜４０、　Ｒ，Ｈ，Ｋｅｎｅｌｔ、“融合プロトコル。ポリエチレングリコールに懸濁させた細胞の遠心分離処理によるモノクロナール抗体への融合。ハイブリドーマ；生物学的分析における新しい要素”、Ｒ，Ｈ，にｅｎｅＮ等、　ｅｄｓ；Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

ｐ、　３６５．１９８０４１　、　］、　Ｇ、　Ｍｏｎ＋ｏｅ等、　“炎症プロセスのリンパ値制御：インターロイキンー４が線維芽細胞増殖を刺激する”、　ＣｌｉｎＩｍＣ１１ｎＩ、　１ｍｍｕｎｏｐａｊｈｏ１．　４９　：　２９２．１９８８゜４２、　Ｌ、Ｐａ＋に等、　“ヒトのＢ細胞刺激因子ルセプタの特徴”、］、　ＥＩＬ　Ｍｅｄ、１６６　：　４７６、１９８７゜４３、　Ｌ、　Ｓ、　Ｐａｒｋ等、　“ネズミのＢ細胞刺激因子１に対応する高親和性細胞の表面レセプタの特徴”、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ８４　：　１６６９．１９８７゜４４、　Ｊ、Ｗ、Ｌｏｗｅｎｊｈａｌ等、　“造血及び非造血細胞におけるネズミのインターロイキン４　（ＢＳＦ−４）に対応する高親和カレセプタの発現”　、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４０　：　４５６．１９８ｇ。

４５．　Ｊ、Ａ、Ｅｌｉａｓ等、　“Ｉ　Ｌ−６及びＩＬ−１の相乗的相互作用が組換えＩＬ−１で刺激される線維芽細胞による胸腺細胞刺激作用を仲介する” 、Ｊ、　Ｉｍ＋ｎｕｎｏ１．　１４２　：　５０９．１９８９゜４６、　Ｈ，Ｅ、　Ｂｒａｘｍｅｌｅｒ等、　“試験管内における造血先駆細胞によるコロニー形成に対する精製されたヒト及びネズミＢ細胞成長因子の相乗効果”、１．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４１　：　３ｇ５２゜１９８８゜４７、　Ｍ、Ｗｌｌｌａｋｇｏｂａ等、　“細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）がＴ細胞で仲介される細胞傷害におけるＬＦＡ−１依存性接着のリガンドであることを示す機能的証拠”、　Ｅｕｒ、Ｉ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８　：　６３７．１９８８゜４８、１．Ｓ、Ｐｏｂｅｒ等、　“静脈内皮によるＩａ発現は活性化Ｔ細胞及びヒトγ−インターフェロンによって誘発される”。

Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６７　：　１３３９．１９８３゜４９、　Ｔ、Ｃｏ１１ｉｎｓ等、　“組換えヒト腫瘍壊死因子が試験管内で静脈内皮細胞及び皮フ線維芽細胞におけるＨＬＡ−Ａ。

Ｂ抗原のｍＲＮＡレベル及び表面発現を増大させる”、　Ｐ＋ｏｃ。

Ｎａｊｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ｌｌ５Ａ　８３　：　４４６．１９８６゜５０、Ｌ、＾、Ｌａｐｉｅ＋ｅ等、　“３種類の調節性シトキンが内皮細胞ＭＨＣ抗原の発現を制御する”、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６７　ニア９４、１９８８゜５１、Ｍ、＾Ｇｉｍｂｒｏｎｅ　Ｊｒ、等、内皮インターロイキン−８；白血球 −内皮相互作用に対する新しい抑制因子”、　５ｃｉｅｎ：ｅ２４６　：　１６０１．　ｌ９８９゜５２、　Ｍ、Ｈ，Ｔｈｏｒｎｈｉｌｌ等、　“ＩＬ−４がヒト細胞接着性をＴ細胞に対しては増大させるが好中球に対しては増大させない”　、Ｊ、　Ｉｍ＋ｎｏｎｏ１．　１４４　：　３０６０．１９９０゜５３、　Ｔ、　Ｂ、　１ｓｓｅｋｕｔｚ等、　“皮フへのリンパ球集中におけるインターフェロンの役割”　、　Ｃｏ１１．　ｌｎｍｏｎｏｌ、９９　：　３２２．１９８６゜５４、　Ｔ、　Ｂ、　ｌ５ｓｅｋｕｔｘ等、　“遅延型過敏症におけるリンパ球集中。γ−インターフェロンの役割”、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、ｌ　４　Ｑ　：２９ｇ９．１９８８　。

５５　、　Ｃ，Ｃ，Ｗ、　Ｈｕｇｈｅｓ等、　“大脳微小血管細胞へのリンパ球接着：インターフェロン−γ、腫瘍壊死因子及びインターロイキン−１の効果” 、Ｉｍｍａｌｏｇｙ　６４　：　６７７、１９８６゜５６　、　Ｎ、　Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ−Ｍａｒｋｓ及びＭ、２ｉ１１．　“内皮細胞単層を透過するリンパ球の遊走：インターフェロン−γによる増大”　、　Ｃｅ１ｌ、　１ｍ＋ｎｕｎｏ１．　１４４　：　３０７．１９８８゜５７、ＮにＤａｍｌｅ及びり、Ｖ、Ｄｏｙｌｅ、”静脈内皮細胞に接着するヒトＴリンパ球の能力と高められた内皮の高分子透過性は、後胸腺成熟の状態に関連づけられる。”、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｌ　４４　：　１２３３．１９９０　。

５８　、　Ｗ、　Ｅ、　Ｐａｕｌ及び１．Ｏｈａ＋ａ　、“Ｂ細胞刺激因子１／インターロイキン４”、　人ｎｎ、　Ｒａｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、５　：　４２９．１９８７゜５９、　Ｒ，Ｎｏｅｌ！ｅ等、　“休止Ｂ細胞において増大するＩａ抗原の発現二Ｂ細胞成長因子に対する補足的な役割”、　Ｐ＋ｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　９１　：　６１４９．１９８４゜６０、　Ｍ、Ｇ、ＭｃＨｅｙｘｕ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ、“インターロイキン２．４及び５の組合わせがネズミ免疫グロブリン・アイソタイプの分泌を制御する” 、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９　：　２０２５．１９８９゜５１、　Ｋ、Ｔｓｕｊｉ等、　“「結合組織型」肥満細胞増殖を誘発するホルボール・エステルとＩ　Ｌ−３の相乗作用”、Ｊ、１ｍ１ＩＩｕｎｏ１．　１４４　：　６７８．１９９０゜６２、２．Ｗａｎｋｏｖｉｃｚ等、　“炎症に於いて多形核白血球の遊走を誘発する際の腫瘍壊死因子αとインターロイキン−１との相乗作用 ”　、４．Ｌｑｕｋｏｒ、Ｂｉｏｌ、４３　：３４９．ｌ９８８゜６３、　Ｅ、Ｍ、Ｒａｂｉｎ等、　′インターフェロンーγが休止Ｂ細胞に対するＢ細胞刺激因子（ＢＳＦ）−１の作用を抑制する”、Ｉ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３７　：　１５７３．１９８６゜６４、　Ｄ、Ｖｅ＋ｃｅｌｌｉ等、　“Ｉ　Ｌ−４かヒト混合リンパ球の培養においてＩＦＮ−γの合成を抑制し、ＩｇＥの合成を誘発する”　、１．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４４　：５７０，１９９０゜６５、　Ｔ、Ｍ、Ｄｅｘｔｅｒ等、Ｊ、Ｃｅ１１．Ｐｈｙｓｉｏｌ、９１　：　３３５−３４４゜１９７７゜６６、　Ｓ、Ｍ、Ｇａｒｔｎｅｒ及びＨ，Ｓ、　Ｋａｐｌａｎ、　Ｐ＋ｏｃ、　Ｎａ１１．Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　７７　：　４７５６−４７６１．１９８００６７、　Ｒ，Ａ、Ｒｏｂｅ＋ｌｓ等、Ｎａｔｕｒｅ　３２６　：　４０３−４（１５，１９８７゜６８、　Ｓ、　Ａ、　Ｂｅｎｔｌｙ、　ＥＸｌｌ、　）Ｉｅｍａｊｏｌ、９　＋　３０３ −３１２．１９８１゜５９、　Ｍ、Ｊ、Ｅｌｉｃｅｓ等、Ｃｅ１ｌ　６０　：５７７．１９９Ｑ。

７０、Ｃ，１，Ｃ１ｖｉｎ等、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３３　：　１５７−１６２．１９８４゜７１、　Ｆ、　Ｓｃｌ＋ｕｅｎｉｎｇ等、　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　４４　：　６Ｇ７．１９８７゜７２　、Ｂ、　Ｍ、　Ｓａｎｄｍａｉｅ＋　、Ｒ，Ｓｆｏ＋ｂ、　Ｆ、　Ｒ，Ａｐｐｒｌｂａｕｍ及びＷ、　Ｍ。

Ｇａ１ｌａｆｉｎ　（１９９０）　Ｂｌｏｏｄ、　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ０７３、＾、　Ｆｉｓｃｈｅｒ等、　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　３　：　２０４．１９８８゜本発明をその好ましい実施例に基づいて以上に説明したが、当業者にとって、本願明細書に基づいて多様な変更等価物の代替や置換を試みることは容易であろう。従って、本願明細書に対して特許が与えられるならその保護範囲は記述する請求の範囲及び等価のものによってのみ制限される。

Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ４に３μ２− 接着性リンパ球数／ｍｍ２ αにｔ？−σ− トキＡｄｈｅｒｅｎｔ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　（ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２）接着性リンパ球（細胞数／ｍｍ２）６つ− °１≦ 要　約　書リンパ器官の微小血管内皮細胞との末梢血リンパ球接着を促進するのに有効な量のＩ　Ｌ−４を患者に投与することによって免疫応答を変調する治療方法。ＩＬ −４はＩＬ−１βと一緒に投与するのが好ましい。細胞接着分子と結合する結合パートナ−を生産する細胞系をスクリーニングする改良型の方法として、結合パートナ−をＩ　Ｌ−４で活性化された微小血管内皮細胞及び活性化されていない微小血管内皮細胞と接触させ、Ｉ　Ｌ−４で活性化された微小血管内皮細胞とは結合するが活性化されていない微小血管内皮細胞とは結合しない結合パートナ− を選択する。次いてこの選択された結合−トナーを、シトキンで活性化された内皮細胞とのリンパ球結合を阻止する能力についてテストする。結合パートナ−はヒトＶＣＡＭ−１と、及びＩ　Ｌ−４またはＴＮＦ−ａで活性化された骨髄基質細胞と結合することをも特徴とすることが好ましい。代表的な実施例はハイブリドーマＡＴＴＣＮｏ、ＨＢ１０５１９によって生産されるｍＡｂ６Ｇ１０である。Ｖ　ＣＡ　Ｍ−１と特異的に結合するリンパ球が後毛細管細静脈を透過して血液から遊出するのを阻止するのに有効な量の、Ｉ　Ｌ−４で活性化された微小血管内皮細胞と特異的に結合する作用剤を患者に投与することによって患者の免疫応答を変調する治療方法。

国際調査報告ｈｔｔｐ１Ｍｍ＋＃ｌ＾−ｅＭ＋＋ｎ＋Ｎａｐｒ７１１〒（ｏ、、、、、、−Ｉｎｔｏｒｎａｔ４ｏｎｍｌ　＾ｐｐＬｉ：ａｔｉｏｎ　Ｎｏ。

ＰＣ丁／ＬＩＳ９１／９５４７７＾ｔｔｍｃｈ＋ｅｅｎｔ　ｔｏ　ＰＣＴ／工Ｓ＾／２１のＶｌ、　０ｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ　ｗｈｅｒｅ　ｕｎｉｔｙ　ｏｆ　１ｎｖｅｎｔｉｏｎ　ｉｓ　ｌａｃｋｉｎｇＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ＠ｌ　＾ｐｐｉｉｃａｔｉ口ｎ　Ｈａ。

ＰＣ〒／υＳ９１／の５４７７

Claims

【特許請求の範囲】

１．患者の免疫応答を変調する治療方法において、リンパ器官の微小血管内皮細胞への末梢血リンパ球接着を促進するのに有効な量のＩＬ−４を患者に投与し、それによって免疫応答を変調させることを特徴とする治療方法。
２．請求項１記載の治療方法において、患者にＩＬ−１βを投与することを特徴とする治療方法。
３．炎症の治療方法において、炎症治療を必要とする患者の炎症部位での後毛細管細静脈を透過して血液中からリンパ球が遊出するのを促進するのに有効な量のＩＬ−４を患者に投与することを特徴とする治療方法。
４．請求項３記載の方法において、患者にＩＬ−１βを投与することを特徴とする方法。
５．細胞接着細胞と結合する結合パートナーを細胞接着分子を有する細胞と接触させ、結合パートナーと細胞との結合反応を検出するステップを含み、細胞接着分子と結合する結合パートナーを生産する細胞系をスクリーニングする方法において、結合パートナーをＩＬ−４で活性化された微小血管内皮細胞及び活性化されていない微小血管内皮細胞と接触させ、ＩＬ−４で活性化された微小血管内皮細胞とは結合するが活性化されていない微小血管内皮細胞とは結合しない結合パートナーを生産する細胞系を選択することを特徴とする改良方法。
６．請求項５記載の改良方法において、選択された細胞系の免疫学的な結合パートナーを、シトキンで活性化された内皮細胞とのリンパ球結合を阻止する能力についてテストするステップをも含むことを特徴とする改良方法。
７．請求項５記載の方法によって選択された細胞系。
８．請求項７記載の細胞系によって生産される結合パートナー。
９．請求項６記載の方法によって選択された細胞系。
１０．請求項９記載の細胞系によって生産される結合パートナー。
１１．ＩＬ−４で活性化された微小血管内皮細胞とは特異的に結合するが活性化されていない微小血管内皮細胞とは結合しない免疫学的結合パートナー。
１２．請求項１１記載の免疫学的結合パートナーにおいて、シトキンで活性化された内皮細胞とのリンパ球結合を阻止する能力をもさらに特徴とする免疫学的結合パートナー。
１３．請求項１１記載の免疫学的結合パートナーにおいて、ヒトＶＣＡＭ−１と結合することをもさらに特徴とする免疫学的結合パートナー。
１４．請求項１１記載の免疫学的結合パートナーにおいて、ＩＬ−４で活性化された骨髄基質細胞と結合することをもさらに特徴とする免疫学的結合パートナー。
１５．請求項１３記載の免疫学的結合パートナーにおいて、ＩＬ−４で活性化された骨髄基質細胞と結合することをもさらに特徴とする免疫学的結合パートナー。
１６．請求項１１記載の免疫学的結合パートナーにおいて、ハイブリドーマＡＴＣＣＮ　Ｎｏ．ＨＢ　１０５１９によって生産されるｍＡｂ６Ｇ１０の結合特性を有することを特徴とする免疫学的結合パートナー。
１７．患者の免疫応答を変調する治療方法において、ＩＬ−４で活性化された微小血管内皮細胞と特異的に結合する作用剤を、血液中のＶＣＡＭ−１と特異的に結合する細胞が患者の後毛細管細静脈から細胞外液へ透過して遊出するのを阻止するのに有効な量だけ患者に投与することを特徴とする治療方法。
１８．請求項１７記載の方法において、リンパ球が患者の後毛細管細静脈を透過して遊出するのを阻止するのに有効な量の作用剤を投与することを特徴とする方法。