WO1999013065A1 - Nouvelle amorce et son utilisation - Google Patents

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WO1999013065A1
WO1999013065A1 PCT/JP1998/004076 JP9804076W WO9913065A1 WO 1999013065 A1 WO1999013065 A1 WO 1999013065A1 JP 9804076 W JP9804076 W JP 9804076W WO 9913065 A1 WO9913065 A1 WO 9913065A1
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gene
milk
keratin
primer
ratio
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PCT/JP1998/004076
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Mio Imamura
Yasuharu Itagaki
Morimasa Tanimoto
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Snow Brand Milk Products Co Ltd
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Snow Brand Milk Products Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a primer that hybridizes with a keratin gene or an S 1 -casein gene.
  • the primers of the present invention can be used for the examination of mastitis in mammals such as sea urchin, and for measuring the level of milk protein synthesis in mammary gland cells.
  • Landscape technology
  • Mastitis refers to inflammation of the breast tissue caused by pathogenic microorganisms that have entered the breast. Big.
  • the principle of mastitis control is early detection and early treatment, and as a diagnostic method using milk, a somatic cell count method and a PL test are generally used. These methods use the phenomenon that the number of somatic cells in milk increases when mastitis is affected, and the phenomenon that the pH of milk leans toward the Alkali side. It is considered that this method is not always sufficient as an early method for detecting mastitis.
  • mastitis milk shows component fluctuations, but casein is characterized by a decrease.
  • milk yield or milk fat percentage has been widely used in the past as an index for assessing the performance of the sea bream.
  • milk protein percentages have been attracting attention due to the spread of health orientation or dairy production.
  • high casein among milk proteins Is attracting much attention as an index of milk quality evaluation.
  • the conventional method is to separate casein from milk and measure the nitrogen content of the casein fraction. The operation is complicated, requires a long time for measurement, and requires a detailed study of sensitivity. Was not enough.
  • a method for simply measuring the amount of casein in milk using infrared spectroscopy or near-infrared spectroscopy has been developed.However, there is a problem in the consistency with actual measured values by the conventional method. Is left.
  • mastitis-causing bacterium invades the breast from the ducts and attaches to the mammary epithelial cells. Possible mechanisms are inhibited. In other words, it is considered that mastitis can be detected early by measuring the change in the ability of mammary gland epithelial cells to synthesize milk by some method.
  • the present inventors have determined that the most representative protein among milk proteins synthesized by breast mammary epithelial cells is S1- force zein as an index.
  • RT-PCR reverse transcription-polymerase chain reaction
  • PCR method U.S. Pat. Nos. 4,683,195 and 4,683,202.
  • the PCR method has been used as a method for detecting the transcript amount of mRNA with high sensitivity. This method has made it possible to measure qualitatively or quantitatively the expressed protein in cells with high sensitivity.
  • RNA In order to extract RNA from milk, it is necessary to minimize the degradation of RNA by RNase, and when extracting cell-derived RNA, the number of mammary epithelial cells in the milk is similar to that of other cells. Very low compared to milk components for RNA extraction In order to remove as much of the effect as possible, it is necessary to centrifuge the milk to obtain cell pellets before extracting RNA.
  • the keratin gene is a cytoskeletal gene that is specifically expressed only in epithelial cells.There are various types, and the type of keratin gene that is expressed differs depending on the species and site.
  • the primer used as an indicator of the amount needs to hybridize with the keratin gene expressed in the mammary epithelial cells of the cyst, and the expression amount of the keratin gene needs to correlate with the number of epithelial cells. In addition, it sheds s! Casein is known to have four genetic variants, and it is necessary to use a primer that hybridizes with any sl -casein variant gene for a versatile detection method. Disclosure of the invention
  • the present inventors have intensively studied a method for preparing RNA from milk and a highly accurate method for detecting mastitis using the obtained RNA.
  • the milk is quickly cooled to ice temperature, diluted with buffer, centrifuged, and, if necessary, repeated, and RNA is extracted from the resulting cell pellet.
  • a method for preparing RNA from mammary epithelial cells was found.
  • the range of amplification of the RNA prepared by this method by PCR for basic (type 2) component 3 keratin which is expressed in correlation with the cell number in breast mammary epithelial cells, is considered in consideration of the reaction efficiency.
  • a primer that amplifies a part of the s , -casein gene designed to be amplified to 351 bp in size is synthesized according to a conventional method, and is used for reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).
  • RT-PCR reverse transcription-polymerase chain reaction
  • an object of the present invention is to provide a novel DNA which is a primer which hybridizes with the keratin gene or the sl -casein gene.
  • Another object of the present invention is to provide a method for amplifying a keratin gene and a Z or casein gene using the primer.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for examining the breast or measuring the level of milk protein synthesis of breast cells using the method for amplifying the keratin gene and the Z or casein gene. Is to do.
  • the present invention relates to a primer represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing.
  • the present invention also relates to a primer which hybridizes with a keratin gene represented by SEQ ID NO: 1 or 2 in the sequence listing.
  • the present invention also relates to a primer that hybridizes with the s, -force zein gene represented by SEQ ID NO: 3 or 4 in the sequence listing.
  • the present invention relates to a method for amplifying a keratin gene and Z or casein gene contained in milk by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) using these primers.
  • RT-PCR reverse transcription-polymerase chain reaction
  • the milk is quickly cooled to ice temperature, diluted with a buffer solution, centrifuged, and RNA is extracted from the obtained precipitate.
  • RNA is extracted from the obtained precipitate.
  • the present invention calculates the ratio of the expression level of the sl -force zein gene in milk to the keratin gene expression level using these gene amplification methods, and indicates this ratio.
  • the present invention relates to a method for examining mastitis morbidity or measuring the level of milk protein synthesis in mammary cells using as a target.
  • the present invention relates to the primer shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing. Then, this primer hybridized with the keratin gene, and CAG-TGT-CGG-GGG-CTC-TGG (SEQ ID NO: 1) or ATG-TGG-GTC-TGC-GAT-AGG-CT (SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1) 2) has the sequence represented by In addition, it hybridizes with the sl -casein gene and uses GTC-AAG-TGA-ATT-CTG-AGG (SEQ ID NO: 3) or TGG-CAC-TTA-CAG-GAG-AAG (SEQ ID NO: 4). Has the sequence represented.
  • oligonucleotides are designed with attention to high specificity, size, GC content, Tm value, etc., and can be obtained by chemical synthesis or the like according to a conventional method. In addition, purity and synthesized amount can be confirmed by electrophoresis and absorbance measurement.
  • the present invention uses these primers to diagnose mastitis, particularly mastitis.
  • Milk used as a test object in the present invention is not particularly limited as long as it is mammalian, but maggot milk is particularly preferably used.
  • RNA of cells contained in milk to be tested according to the present invention is prepared as follows. That is, collect milk in a sanitary environment as much as possible and immediately cool to ice temperature. Milk is diluted with an appropriate buffer, preferably physiological phosphate buffer (PBS (-)), and centrifuged. Separate and collect the precipitate. If necessary, repeat the dispersion and centrifugation in a buffer solution, preferably PBS (-). From the precipitate thus obtained, RNA derived from cells contained in milk is extracted by a conventional method. It is also possible to extract mRNA if necessary.
  • PBS physiological phosphate buffer
  • RNA RNA as a type II
  • a reverse transcription reaction is performed with a reverse transcriptase to synthesize complementary DNA (cDNA).
  • an oligo dT primer or a random primer particularly preferably an oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 Is used as an antisense primer.
  • the obtained cDNA is used as type III
  • the oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 1 is used as a sense primer
  • the oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 2 is used as an antisense primer, or as shown in SEQ ID NO: 3.
  • PCR is performed using a DNA polymerase. After separating this PCR reaction solution by electrophoresis, it is stained with an appropriate coloring agent, preferably ethidium bromide solution, and the stained band is measured as a staining intensity by an image analyzer or the like.
  • an appropriate coloring agent preferably ethidium bromide solution
  • Keratin gene expression level, and the staining intensity of the band in the PCR reaction solution obtained using the oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 3 as a sense primer and the oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 4 as an antisense primer S S 1 — is the expression level of the casein gene.
  • this value is 1.0 or more, it is normal, if it is 0.5 or more and less than 1.0, it is diagnosed as mild mastitis, and if it is less than 0.5, it is diagnosed as severe mastitis.
  • the aforementioned O Ri resulting keratin gene expression and non-in method s, - the Kazin gene expression level by obtaining the ratio of keratin gene expression of Yore a sl Ichiriki Zin gene expression, in a subject breast non s i of mammary epithelial cells - Ru can be obtained casein gene expression level. By comparing this value under different conditions or different feed conditions, it can be used as a standard for evaluating maggot milk quality, such as casein synthesis ability, or for evaluating feed.
  • the above measurement method is shown in the flow chart as follows.
  • Primer Primer Any one type and reverse transcriptase Any one type and reverse transcriptase reaction using reverse transcriptase Reverse transcriptase reaction using reverse transcriptase SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 3
  • FIG. 1 is an electropherogram of RNA extracted from milk of Example 1.
  • the lanes 1 to 10 show the pesticide specimen numbers, and 18 s and 28 s show the ribosome RNA.
  • FIG. 2 S 1 of the sample in Example 2 - in c illustrations that are electropherogram of casein and keratin, the lane 1-10 is ⁇ shea sample number, M the molecular weight, also 274bp and 351bp purposes Shows the respective bands.
  • the milk of the 10 birds shown in Table 1 was collected in sterilized containers, 50 ml each, immediately cooled on ice, and then transported to the laboratory under cooling conditions.
  • the milk was diluted 2-fold with PBS (-), centrifuged at 1,5006 for 5 minutes, and the precipitate was collected.
  • the obtained precipitate was dispersed in 50 ml of PBS (-), and centrifuged under the same conditions to collect the precipitate.
  • RNA was extracted using RNAzol (Tel'Test) to obtain a sample.
  • the obtained sample was subjected to SDS-polyacrylamide electrophoresis, and the ratio of absorbance at wavelengths of 260 nm and 280 nm was measured.
  • the electrophoretogram is shown in Fig. 1, and the absorbance ratio is shown in Table 1.
  • the amount of RNA is measured by the absorbance at 260 nm, impurities (proteins, etc.) are measured by the absorbance at 280 nm, and the purity is measured by this ratio, that is, (absorbance at 260 nm) Z (absorbance at 280 nm). If the RNA is pure, the absorbance ratio will be 2.0. When the absorbance ratio is 1.9 to 2.1, it can be judged that the purity is extremely high, and the sample can be used for RT-PCR.
  • RNA obtained in Example 1 to each of the cells in two micro-tubes so that the total RNA becomes 1 g each, and use the primer shown in SEQ ID NO: 2 in one tube.
  • the primary strand cDNA was synthesized using reverse transcriptase (Gibco) using the primer shown in SEQ ID NO: 4. Transfer the reaction mixture to separate microtubes, 1 ⁇ 1 each, and confirm the correctness of AmpliTaqDNA polymerase (perkin
  • the conditions were denaturation 96 ° C, 1 minute, annealing 56 ° C, flame 1 minute, chain extension reaction 72 ° C, 1 minute.
  • visualization is performed by ethidium-bubble-mide staining, and it is taken into Combi-Yuichi (Apple Inc.) with a scanner (Heureett Packard) and image analysis software (the staining intensity of purpose bands of purpose band and sl _ Kazin gene shed in a sample of 351bp in the sample keratin gene of 274bp was quantified by NIHImage).
  • the band staining state is shown in FIG.
  • the present invention keratin contained in the milk by the novel primer primary, shed S 1 Ichiriki Zin gene High Priestess soybeans to novel primer primary, and RT-PCR using these plies Ma one keratin gene Haiburidizu A method for amplifying a gene and / or a casein gene is provided. Further, a method for examining mastitis and a method for measuring the level of milk protein synthesis in mammary gland cells using the method are provided.
  • the present invention provides a simple, rapid, and highly accurate method for examining mastitis without removing mammary tissue, particularly as a method for examining mastitis, or as a method for measuring the level of milk protein synthesis in breast cells. Useful.

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Description

明 細 書
新規プライマー及びその利用 技術分野
本発明は、 ケラチン遺伝子あるいは S 1 - カゼイン遺伝子とハイブリダィズす るプライマーに関する。 本発明のプライマーは、 ゥシ等の哺乳動物の乳房炎の検 査ゃ乳腺細胞における乳夕ンパク質合成レベルの測定に用いることができる。 景技術
乳房炎は、 乳房内に侵入してきた病原性微生物により発症する乳房組織の炎症 を指し、 乳量の減少や罹患牛の淘汰など酪農、 乳業にとって乳房炎によってもた らされる経済的損失は非常に大きい。 乳房炎対策は早期発見、 早期治療が原則で あり、 乳による診断法としては体細胞数の計測法、 P Lテストなどが一般的に用 いられている。 これらは乳房炎に罹患すると乳中の体細胞数が増加する現象や、 乳の p Hがァルカリ側に傾く現象を利用した測定法であるが、 これらの因子は、 いずれも個体間ゃ泌乳期による変動が大きく、 乳房炎の早期発見法としては必ず しも十分でないものと考えられる。 一般に、 乳房炎乳には成分の変動が見られる が、 特にカゼインについては減少が特徴的である。 このことを利用し、 乳成分の カゼィン窒素量 Z総窒素量の値を利用して乳房炎乳を判定する試み等も行なわれ たこともあるが、 測定値のバラツキが大きく、 正確な判定を行なうことは困難で めつた o
一方、 ゥシの能力の評価の指標として、 従来乳量あるいは乳脂肪率が広く用い られていた。 し力、し、 最近、 健康指向の広がりあるいは乳製品製造上の観点から、 乳タンパク質率が注目されてきている。 特に、 乳タンパク質の中でも高カゼイン であることが乳質評価の指標として大いに注目されている。 しかし、 従来の方法 は乳からカゼィンを分離してカゼィン画分の窒素量を測定するという方法であり、 操作が煩雑であり、 かつ測定に長時間必要であり、 感度的にも詳細な検討のため には不十分なものであった。 また近年、 赤外分光分析法あるいは近赤外分光分析 法を用いて、 簡便に乳中のカゼイン量を測定する方法も開発されているが、 従来 法による実測値との整合性の面で課題が残されている。
乳成分の変動は、 様々な要因により発生するが、 その一つとして乳房炎原因菌 が乳管より乳房内に侵入して乳腺上皮細胞に付着することにより、 乳腺上皮細胞 における乳成分の合成が阻害される機構が考えられる。 つまり、 何らかの方法に よつて乳腺上皮細胞の乳成分合成能力の変化を測定することにより、 乳房炎の早 期発見が可能と考えられる。
本発明者らは、 ゥシ乳腺上皮細胞が合成する乳タンパク質の中で最も代表的な 夕ンパク質であるひ S 1—力ゼィンを指標とすることとした。
一方、 近年、 ポリメレ—ス連鎖反応（PCR法：米国特許第 4, 683, 195号明細書及 び第 4， 683， 202号明細書） を利用した逆転写一ポリメレ一ス連鎖反応 (RT-PCR)法 が、 mRNAの転写量を高感度に検出する方法として用いられるようになってきてい る。 そして、 この方法により細胞における発現タンパク質を高感度に定性的ある いは定量的に測定することが可能となってきている。 しかし、 乳房炎の診断のた めに乳腺組織を切除して R N Aを抽出することは産業動物である乳牛においては 実質上不可能であり、 生体を傷つけること無く乳腺上皮細胞の R N Aを抽出する 方法はいままでに報告がなされていない。
乳から R N Aを抽出するためには、 R N A分解酵素による R N Aの分解を最小 限度に抑える必要があり、 さらに細胞由来の R N Aを抽出する場合は、 乳中の乳 腺上皮細胞数は他の細胞と比較して非常に少なく、 また乳成分が R N A抽出に与 える影響を極力除くために、 乳を遠心分離して細胞の沈殿を得た上で R N A抽出 を行なう必要がある。 又、 ケラチン遺伝子は上皮系の細胞でのみ特異的に発現す る細胞骨格遺伝子であるが、 様々な種類があり、 種及び部位により発現するケラ チン遺伝子の種類が異なるため、 ゥシ乳腺上皮細胞量の指標として用いるプライ マーはゥシ乳腺上皮細胞で発現するケラチン遺伝子とハイブリダィズする必要が あり、 又、 ケラチン遺伝子の発現量は上皮細胞数と相関する必要がある。 又、 ひ s！ _カゼインは 4つの遺伝的変異体の存在が知られており、 汎用性のある検出法 のためには、 何れのひ s l—カゼィン変異体遺伝子ともハイプリダイズするプライ マ一を用いる必要がある。 発明の開示
これらの状況に鑑み、 本発明者らは乳から R N Aを調製する方法、 及び得られ た R N Aを用いて精度の高い乳房炎の検出法を鋭意研究した。 その結果、 乳を速 やかに氷温まで冷却し、 緩衝液にて希釈し遠心分離を行ない、 必要に応じこれを 繰り返し、 得られた細胞ペレッ トから R N Aを抽出することにより、 乳中から乳 腺上皮細胞由来の R N Aを調製する方法を見出した。 そしてさらに、 この方法に より調製された R N Aを、 ゥシ乳腺上皮細胞において細胞数と相関して発現する 塩基性 （タイプ 2 ) コンポーネント 3のケラチンにおいて、 P C Rによって増幅 する範囲を反応効率を考慮して 274bp の大きさに増幅されるようにデザィンされ たケラチン遺伝子の一部を増幅するブライマ一、 及びひ s l —カゼィン遺伝子の遺 伝的変異体においても保存されている配列において、 反応効率を考慮して 351bp の大きさに増幅されるようにデザインされたひ s ,—カゼィン遺伝子の一部を増幅 するプライマ一を常法に従って合成し、 これを用いて逆転写—ポリメレース連鎖 反応 (RT-PCR ； Wang et al.， Pro Nat l. Acad. Sci . USA, 86, pp9717 - 9721 (1989 ：) )法を行なうことにより、 乳から簡便、 迅速、 且つ高精度に乳房炎の検出を行な う方法を見出した。
従って、 本発明の課題は、 ケラチン遺伝子あるいはひ s l—カゼイン遺伝子とハ イブリダィズするプライマ一となる新規な D N Aを提供することにある。
また、 本発明の他の課題はこのプライマ一を用いてケラチン遺伝子及び Z又は カゼィン遺伝子を増幅させる方法を提供することにある。
さらに本発明の他の課題は、 このケラチン遺伝子及び Z又はカゼィン遺伝子を 増幅させる方法を用いて乳房 を検査したりあるいは乳腺細胞の乳夕ンパク質合 成レべルを測定したりする方法を提供することにある。
すなわち、 本発明は、 配列表配列番号 1〜 4のいずれかで表されるプライマ一 に関する。
また、 本発明は、 配列表配列番号 1又は 2で表される、 ケラチン遺伝子とハイ プリダイズするプライマーに関する。
また、 本発明は配列表配列番号 3又は 4で表されるひ s , —力ゼィン遺伝子とハ イブリダイズするプライマーに関する。
さらに、 本発明は、 これらのプライマ一を用いて逆転写ーポリメレース連鎖反 応 (RT-PCR)法により、 乳中に含まれるケラチン遺伝子及び Z又はカゼィン遺伝子 を増幅する方法に関する。
本発明の前記増幅は、 乳を速やかに氷温まで冷却し、 緩衝液を用いて希釈し、 遠心分離し、 得られる沈殿物から R NAを抽出し、 この R NAを铸型とし、 前記 プライマーを用いてケラチン遺伝子及び Z又はカゼィン遺伝子を増幅することに よって行なわれる。
さらに、 本発明は、 これらの遺伝子増幅法を用いて乳中におけるひ s l—力ゼィ ン遺伝子の発現量のケラチン遺伝子発現量に対する比率を算出し、 この比率を指 標として用いて乳房炎の罹病を検査したりあるいは乳腺細胞の乳タンパク質合成 レベルを測定したりする方法に関する。
前記のように本発明は、 配列表配列番号 1〜4のいずれかに示されるプライマ —である。 そして、 このプライマーは、 ケラチン遺伝子とハイブリダィズし、 CA G - TGT- CGG- GGG- CTC-TGG (配列表配列番号 1 ) 又は ATG- TGG-GTC- TGC- GAT-AGG- CT ( 配列表配列番号 2 ) で表される配列を有する。 又、 ひ s l —カゼイン遺伝子とハイ ブリダィズし、 GTC-AAG-TGA- ATT- CTG-AGG (配列表配列番号 3 ) 又は TGG- CAC- TTA - CAG-GAG- AAG (配列表配列番号 4 ) で表される配列を有する。
これらのオリゴヌクレオチドは、 特異性の高さ、 サイズ、 GC含量、 Tm値などに 留意して設計してあり、 常法に従って化学合成などにより得ることができる。 ま た、 電気泳動と吸光度測定によって純度、 合成量の確認ができる。
本発明は、 これらのプライマ一を用い乳房炎、 特にゥシ乳房炎の診断を行なう ものである。 本発明での検査対象として用いる乳は、 哺乳動物のものであれば特 に限定されないが、 特に好ましくはウジの乳を用いる。
本発明の検査対象となる乳中に含まれる細胞の R N Aは、 以下のように調製す る。 即ち、 可能な限り衛生的な環境下で乳を採集し、 速やかに氷温まで冷却する 乳を適当な緩衝液、 好ましくは生理的リン酸緩衝液（PBS (-））にて希釈し、 遠心分 離を行ない、 沈殿物を回収する。 必要に応じ、 緩衝液、 好ましくは PBS (-)への分 散と遠心分離を繰り返す。 このようにして得られた沈殿物から、 常法にて乳中に 含まれる細胞由来の R N Aを抽出する。 又、 必要に応じ m R N Aの抽出も可能で める。
得られた R N Aを鐯型として、 逆転写酵素により逆転写反応を行なつて相補的 DNA(cDNA)を合成する。 この際、 オリゴ d Tプライマーあるいはランダムプライ マ一、 特に好ましくは配列番号 2、 もしくは配列番号 4に示されるオリゴヌクレ ォチドをアンチセンスプライマーに用いる。 次に、 得られた c D N Aを铸型に、 配列番号 1に示されるオリゴヌクレオチドをセンスプライマ一に、 配列番号 2で 示されるオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーに用い、 もしくは配列番 号 3に示されるオリゴヌクレオチドをセンスプライマーに、 配列番号 4で示され るオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマ一に用い、 D N Aポリメレ一スに より P C Rを行なう。 この P C R反応液を電気泳動にて分離したのち、 適当な染 色剤、 好ましくはェチジゥムブロマイ ド液により染色し、 染色されたバンドを画 像解析装置などにより染色強度として測定する。 配列番号 1に示されるオリゴヌ クレオチドをセンスプライマーに、 配列番号 2に示されるオリゴヌクレオチドを アンチセンスプライマ一に用いて得られた P C R反応液におけるバンドの染色強 度は塩基性 （タイプ 2 ) コンポーネント 3型のケラチン遺伝子の発現量であり、 配列番号 3に示されるオリゴヌクレオチドをセンスプライマーに、 配列番号 4に 示されるオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーに用いて得られた P C R 反応液におけるバンドの染色強度はひ S 1—カゼィン遺伝子の発現量である。 S 1 一力ゼィン遺伝子発現量のケラチン遺伝子発現量に対する比を得ることにより、 対象の乳房における乳腺上皮細胞のひ S 1—力ゼィン遺伝子発現量を知ることがで きる。 この値が 1. 0 以上を示すときは正常、 0. 5 以上、 1. 0 未満を示すときは軽 度の乳房炎、 0. 5 未満のときは重度の乳房炎と診断される。 又、 前述の方法によ り得られたケラチン遺伝子発現量及びひ s ,—カゼィン遺伝子発現量を用レ a s l 一力ゼィン遺伝子発現量のケラチン遺伝子発現量に対する比を得ることにより、 対象乳房における乳腺上皮細胞のひ s i -カゼイン遺伝子発現量を得ることができ る。 この値を異なるゥシ、 あるいは異なる飼料条件などで比較することにより、 カゼィン合成能力などウジの乳質評価、 あるいは飼料評価の基準とすることがで きる。 上記測定法をフローチャートで示すと次のとおりである,
Figure imgf000009_0001
rォリゴ dTプライマー ォリゴ dTプライマー
ランダムプライマ一 ランダムプライマー
L配列番号 2 に示される L配列番号 4 に示される
プライマー プライマ一
Figure imgf000009_0002
どれか一種類と、 逆転写酵素 どれか一種類と、 逆転写酵素 を用いて逆転写酵素反応 を用いて逆転写酵素反応 配列番号 1に示される 配列番号 3に示される
プライマ' プライマ' 配列番号 2に示される 配列番号 4に示される
プライマ · プライマ
Figure imgf000009_0003
両方用いて PCR 反応 両方用いて PCR 反応
274bpの産物 351bpの産物
比を算出し、 乳房炎の診断を行なう 図面の簡単な説明 第 1図は、 実施例 1の乳から抽出した R N Aの電気泳動図である。 図中、 レ一 ン 1 〜10は、 ゥシ検体番号を、 また 18 s及び 28 sはリボソーム R N Aをそれぞれ 示す。
第 2図は、 実施例 2の試料中の S 1 —カゼインとケラチンの電気泳動図である c 図中、 レーン 1 〜10はゥシ検体番号を、 Mは分子量を、 また 274bp 及び 351bp は 目的のバンドをそれぞれ示す。
発明を実施するための最良の形態
次に実施例を示して本発明を詳細に説明する。 しかし、 これらは単なる例示で あって、 これらによって本発明は何ら限定されるものではない。 実施例 1
乳から RNAを調製する方法
第 1表に示す 1 0頭のゥシの乳を滅菌した容器に 50mlずつ採取し、 氷上にて速 やかに冷却したのち、 冷却条件下で実験室へと搬送した。 乳を PBS (-)にて 2倍に 希釈し、 4でにぉぃて1，5006で5分間遠心し、 沈殿を集めた。 得られた沈殿を 50 mlの PBS (-) へ分散させ、 同条件で遠心分離を行ない、 沈殿を回収した。 この沈 殿を試料とし、 RNAzol (テル 'テスト社） を用い、 RN Aを抽出して試料とした。 得られた試料の SDS—ポリアクリルアミ ド電気泳動、 並びに波長 260nm及び 280 nmにおける吸光度の比を測定した。 電気泳動図を第 1図に、 吸光度の比を第 1表 にそれぞれ示した。 なお、 260nm における吸光度によって RNAの量を測定し、 280nm における吸光度によって不純物 （蛋白質など） を測定し、 この比、 すなわ ち、 （260nmにおける吸光度） Z(280nmにおける吸光度） により純度を測定する。 RN Aが純品の場合は、 吸光度の比は 2.0となる。 吸光度の比が 1.9〜2.1 の場 合、 非常に純度が高いと判断でき、 RT- PCR法に供することができる。
この結果より、 この試料は RT-PCR法に使用可能な純度であることが確認された。
第 1表
吸光度
検 体 比
260nm 280nm
1 0.746 0.363 2.055
2 0.890 0.441 2.018
3 0.733 0.385 1.904
4 0.534 0.280 1.907
5 0.894 0.447 2.000
6 0.384 0.196 1.959
7 0.681 0.358 1.902
8 0.856 0.441 1.941
9 0.894 0.466 1.918
10 0.851 0.438 1.943 実施例 2
プライマーを用いたゥシ乳房炎の診断方法及び結果
実施例 1で得られた R N Aを各ゥシについて、 2本ずつの微量試験管に総 R N Aが各 1 gずつになるように取り、 一方の試験管では配列番号 2に示されるプ ライマーを用い、 他の一方の試験管では配列番号 4に示されるプライマーを用い て、 逆転写酵素 （ギブコ社） を用いて一次ストラン ド c D N Aを合成した。 反応 液を別々の微量試験管に 1〃1 ずつ取正慢正正り、 Ampl iTaqDNA ポリメレース （パーキン 性
エルマ一ジャパン社） を用い、 常法によ常常常乳り P C R反応を行なった。 P C Rの反応 房
条件は変性 96°C、 1分、 アニーリ ング 56°C、 炎 1分、 鎖長延長反応 72°C、 1分とし た。 P C R増幅産物を 2 %ァガロースゲル電気泳動にて分離後、 ェチジゥムブ口 マイ ド染色により可視化し、 スキャナー （ヒユーレツトパッカ一ド社） でコンビ ユー夕一 （アップル社） へ取り込み、 画像解析ソフ ト（NIHImage)により 274bp の 試料中ケラチン遺伝子の目的バンド及び 351bp の試料中ひ s l _カゼィン遺伝子の 目的バンドの染色強度を数値化した。 バン ドの染色状態を第 2図に、 それぞれの 染色強度及びケラチン遺伝子バンド染色強度に対するひ s t _カゼィン遺伝子バン ド染色強度の比を第 3表に示す。 この結果、 第 3表で示される、 各ゥシにおける ケラチンバンド染色強度に対するひ s l—カゼィンバンド染色強度の比の値から判 断した乳房炎の診断結果と、 第 2表に示される目視、 及び体細胞数によって判断 した乳房炎の診断結果が一致した。 よって、 本法は乳房炎の検査方法として有効 であることが確認された。
第 2表 検 体 乳房炎の診断結果
1
2
3
4 5
6
7
8
9
10 第 3表 バンド強度 （ピクセル平均）
検 体 比 診断
ひ S 1—カゼイン慢慢顕慢顕顕 ケラチン
在在在性性
1 62.54 性孚乳性性 ¾ 54.56 1.15 正常
2 42.38 乳房房房乳乳 41.99 1.01 正常
3 47.42 27炎炎房房炎房.45 1.73
炎炎炎 正常
4 13.43 15.70 0.86 軽度
5 9.20 10.44 0.88 軽度
6 10.60 10.67 0.99 軽度
7 21.13 30.51 0.69 軽度
8 14.56 30.84 0.47 重度
9 6.63 31.00 0.21
10 4.37 30.57 0.14
産業上の利用可能性
本発明により、 ケラチン遺伝子とハイブリダィズする新規なプライマ一、 ひ S 1 一力ゼィン遺伝子とハイプリダイズする新規なプライマ一、 及びこれらのプライ マ一を用いて RT-PCR法によって乳中に含まれるケラチン遺伝子及び/又はカゼィ ン遺伝子を増幅する方法が提供される。 さらにこの方法を用いた乳房炎の検査方 法及び乳腺細胞における乳タンパク質合成レベルの測定方法が提供される。
本発明は、 乳腺組織を切除することなく、 簡便、 迅速、 且つ高精度な乳房炎の 検査方法、 特にゥシ乳房炎の検査方法として、 あるいは乳腺細胞における乳タン パク質合成レベルの測定方法として有用である。

Claims

請 求 の 範 囲 . 配列表配列番号 1〜 4のレ、ずれかによって表されるプライマー。
. 配列表配列番号 1又は 2によって表される、 ケラチン遺伝子とハイブリダィ ズするプライマー。
. 配列表配列番号 3又は 4によって表される、 ひ s l—カゼイン遺伝子とハイブ リダイズするプライマー。
. 請求項 1に記載されるプライマ一を用いて逆転写一ポリメレ一ス連鎖反応 （ RT - PCR法） によって乳中に含まれるケラチン遺伝子及び Z又はカゼィン遺伝子 を増幅する方法。
. 乳を速やかに氷温まで冷却し、 緩衝液で希釈し、 遠心分離を行なって沈殿物 を生成させ、 得られた沈殿物から R N Aを抽出し、 この R N A遺伝子を铸型と して用いて RT- PCR 法を行なう請求の範囲 3に記載の方法。
. 請求の範囲 4又は 5に記載の方法を用いて乳中に含まれるケラチン遺伝子及 びひ s！—カゼィン遺伝子を増幅させてひ s！—力ゼィン遺伝子発現量のケラチン 遺伝子発現量に対する比率を算出し、 この比率を指標として乳房炎の発症の状 態を評価することよりなる乳房炎の検査方法。
. 請求の範囲 4又は 5に記載の方法を用いて、 乳中に含まれるケラチン遺伝子 及びひ s l—力ゼィン遺伝子を増幅させて s l -カゼィン遺伝子の発現量及びケ ラチン遺伝子の発現量を測定し、 s —力ゼィン遺伝子発現量のケラ千ン遺伝 子発現量に対する比率を算出し、 この比率を指標として乳腺細胞の乳夕ンパク 質合成レベルを評価することよりなる乳腺細胞の乳夕ンパク質合成レベルの測 定方法。
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