WO1999018126A1 - POLYPEPTIDE, ADNc LE CODANT ET LEUR UTILISATION - Google Patents

POLYPEPTIDE, ADNc LE CODANT ET LEUR UTILISATION Download PDF

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WO1999018126A1
WO1999018126A1 PCT/JP1998/004514 JP9804514W WO9918126A1 WO 1999018126 A1 WO1999018126 A1 WO 1999018126A1 JP 9804514 W JP9804514 W JP 9804514W WO 9918126 A1 WO9918126 A1 WO 9918126A1
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polypeptide
present
seq
clone
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PCT/JP1998/004514
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French (fr)
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Daikichi Fukushima
Shiro Shibayama
Hideaki Tada
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Ono Pharmaceutical Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
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    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel polypeptide, a method for producing the same, cDNA encoding the polypeptide, a vector comprising the cDNA, a host cell transformed with the vector, an antibody of the polypeptide, and the peptide or A pharmaceutical composition comprising the antibody.
  • the present inventors have so far studied the cloning of genes for growth / differentiation factors that work in the hematopoietic and immune systems. Most of secreted proteins such as growth / differentiation factors (for example, various cytokines) and membrane proteins such as their receptors (hereinafter collectively referred to as secreted proteins, etc.) Focusing on the fact that it has a sequence called a signal peptide at the N-terminus, the present inventors have intensively studied a method for efficiently and selectively cloning a gene encoding a fern peptide. As a result, a method (signal sequence strap (SST) method) that can easily search for the presence or absence of a signal peptide using animal cells was found (see Japanese Patent Application No.
  • SST signal sequence strap
  • the present inventors have conducted intensive studies to find novel factors (polypeptides) that are useful in therapy, diagnosis, or research, particularly, secretory proteins and membrane proteins having secretory signals. .
  • cell lines and tissues that are expected to produce a wide variety of secreted and membrane proteins, such as human placenta, adult brain tissue and cell lines derived from brain tissue, cell lines derived from human bone and bone marrow, And a novel secretory protein or membrane protein produced by a human umbilical vein endothelial cell line, and a cDNA encoding the same, and the present invention was completed.
  • the cDNA sequence provided by the present invention was identified as clone ON056, ON034, ⁇ X003, and was isolated from a cDNA library prepared from human placental tissue by the yeast SST method. .
  • Clones ON056, ON034, and ⁇ X003 are complete cDNAs that code for secreted proteins (represented here as ON056, ON034, and OX003 proteins, respectively).
  • the cDNA sequence provided by the present invention was identified as clones OA052, OC004, OM017, OM101, OM126, OM160, OMA016a, OMA016b, OMB130, OMB142, ⁇ VB100. It was isolated from the cDNA library prepared from adult brain tissue and cell lines derived from brain tissue ( ⁇ 98G, IMR-32, and CCF-STTG1) by the yeast SST method. The clones OA052, OC004, OM017, OM101, OM126, OM160, OMA016a, OMA016b, OMB130, OMB142, and OVB100 are secreted proteins (here, OA052, OC004, OM0, respectively). 17, OM101, OM126, OM160, OMA016a, OMA016, OMB130, OMB142, OVB100 proteins.) The full-length chain including the complete cDNA sequence c DNA.
  • the cDNA sequences provided by the present invention are clones OAF062, OAF075, 1AG 119, isolated from the human bone and bone marrow-derived cell line (cDNA library prepared from HAS 303, LP 101) by the yeast SST method.
  • Clone OAF 062, OAF 075, OAG 119 is a full-length cDNA containing a complete cDNA sequence encoding a secreted protein (represented herein as OAF062, OAF075, and OAG119 proteins, respectively).
  • the cDNA sequence provided by the present invention was identified as clones OAH040 and OAH058, and was isolated from a cDNA library prepared from a human umbilical vein endothelial cell line (HUV-EC-C) by the yeast SST method.
  • Clone OAH040, OAH058 is a full-length cDNA chain containing the complete cDNA sequence encoding a secreted protein (herein represented as OAH040, OAH058 protein, respectively).
  • the cDNA sequence provided by the present invention was identified as clones OM011, OM028, OMB092, OMB108, 0T007, and was obtained by the yeast SST method using adult brain tissue and a cell line derived from brain tissue. It was isolated from a cDNA library prepared from IMR-32). Clone OM0 1 1, OM 028, OMB 092, OMB 108 and OT 007 are complete cDNA sequences encoding membrane proteins (here represented as OM011, OM028, OMB092, OMB108 and OT007 proteins, respectively). Is a full-length cDNA containing
  • the cDNA sequence provided by the present invention was identified as clone ⁇ AGO51, OUB068, and was prepared from human bone and bone marrow-derived cell lines (LP101 and U-2OS) by the yeast SST method. From the isolated cDNA library.
  • Clone OAG051, OUB068 is a full-length cDNA containing the complete cDNA sequence encoding a membrane protein (herein represented as OAG051, OUB068 protein, respectively).
  • the present invention relates to a cDNA having the nucleotide sequence represented by 69, 7275, 78 or 81.
  • Figure 1 shows the acrylamide gels after electrophoresis (SDS-PAGE) of the solubilized fractions of the prepared fractions and the insoluble fractions according to Example 1 using urea using an image analyzer (FUJI BAS2000). This is a shot taken in the evening, and the arrow in the figure indicates that the ON056 protein is expressed in E. coli.
  • SDS-PAGE electrophoresis
  • the present invention provides SEQ ID NOs: 1, 4, 7, 10, 13, 16, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, in substantially pure form.
  • the present invention relates to a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76 or 79, or a homolog thereof, a fragment of the sequence thereof, and a polypeptide comprising the homolog thereof.
  • the invention further relates to cDNAs encoding those polypeptides.
  • the present invention relates to a cDNA having a fragment that selectively hybridizes to the indicated nucle
  • a polypeptide having an amino acid sequence represented by 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76 or 79 generally means at least 90%, for example, 95, 98 or 99%, of the polypeptide at the time of production.
  • SEQ ID NOs: 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70 , 73, 76 or 79 are generally homologues of a polypeptide consisting of at least 20, preferably at least 30, for example 40, 60 or 100 contiguous amino acids and at least 70 %, Preferably at least 80 or 90%, more preferably 95% or more homologous, and such homologues are hereinafter described as polypeptides of the present invention.
  • Fragments of the polypeptides, or fragments of homologs thereof refer to at least 10 amino acids, preferably at least 15 amino acids, for example, a 20, 25, 30, 40, 50 or 60 amino acid portion.
  • cDNAs that selectively hybridize to cDNA having a nucleotide sequence represented by 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, or 81 At least 70%, preferably at least 80 or 90%, more preferably 95% or more homologous, e.g., 40, 60 or 100 contiguous nucleotide regions, such cDNA Is hereinafter referred to as cDNA of the present invention.
  • a cDNA fragment having at least 10 bases, preferably at least 15 bases, e.g., a 20, 25, 30 or 40 base portion And such a fragment is also included in the cDNA of the present invention.
  • the present invention includes a replication or expression vector comprising the cDNA of the present invention.
  • the vector include a plasmid, virus, or phage vector comprising an ori region, a promoter for expression of the cDNA as necessary, a regulator of a promoter, and the like.
  • the vector may contain one or more alternative marker genes, for example, an ampicillin resistance gene.
  • Vectors can be used in vitro, for example, to produce RNA corresponding to cDNA or to transform host cells. Can be.
  • the present invention provides SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59 , 62, 65, 68, 7 1, 74, 77, 80, 3, 6, 9, 12, 15, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78 or 81, or a cDNA of the present invention including a cDNA having an open reading frame thereof is replicated.
  • a host cell transformed with the vector for expression is also included.
  • Cells include, for example, bacteria, yeast, insect cells or mammalian cells.
  • the present invention also includes a method for producing the polypeptide of the present invention, which comprises culturing the host cell of the present invention under conditions for expressing the polypeptide of the present invention.
  • the cultivation is preferably carried out under conditions under which the polypeptide of the present invention is expressed and produced from host cells.
  • An antisense RNA can also be produced by inserting the cDNA of the present invention into an antisense region of a vector as described above. Such antisense RNA can also be used to control the level of the polypeptide of the present invention in cells.
  • the present invention also includes a monoclonal or polyclonal antibody of the polypeptide of the present invention. Furthermore, the present invention also includes a method for producing a monoclonal or polyclonal antibody of the polypeptide of the present invention. Monoclonal antibodies can be produced by the usual hybridoma technology using the peptide of the present invention or a fragment thereof as an antigen. The polyclonal antibody can be produced by an ordinary method in which a host animal (for example, rat or egret) is inoculated with the polypeptide of the present invention and immune serum is collected.
  • a host animal for example, rat or egret
  • the present invention also includes a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the polypeptide of the present invention, its antibody, a pharmaceutically acceptable excipient, and a carrier.
  • polypeptide of the present invention (1), SEQ ID NOs: 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76 or 79
  • amino acid sequence having the specified amino acid sequence the amino acid sequence is partially deleted (for example, a polypeptide comprising only a portion essential for the expression of a biological activity in SEQ ID NO: 1), and a part thereof is replaced with another amino acid.
  • substitutions for example, substitutions with amino acids having similar properties
  • substitutions of other amino acids with a part thereof are also included.
  • nucleotide sequence of cDNA can be changed without changing the amino acid sequence of the polypeptide.
  • the cDNA of the present invention identified in (2) includes, in (1), SEQ ID NOs: 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, All the nucleotide sequences encoding the polypeptides represented by 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76 or 79 are included. Changing the nucleotide sequence may improve the productivity of the polypeptide.
  • the cDNA specified in (3) is an embodiment of the cDNA shown in (2) and represents a natural sequence.
  • the cDNA shown in (4) shows a sequence obtained by adding the natural untranslated portion to the cDNA specified in (3).
  • Production of cDNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 is performed according to the following method.
  • yeasts such as Saccharomyces cerevisiae to use sucrose or raffinose as an energy or carbon source, they must secrete invertase into the culture medium. It is an enzyme that breaks down finose into sucrose and melibiose, and sucrose into fructoose and glucose. ). It is also known that many known mammalian signal peptides can secrete yeast ymbelase. Based on these findings, this method was developed as a method for screening a novel signal peptide that enables secretion of yeast invertase from a mammalian cDNA library based on the growth of yeast on raffinose medium. .
  • the vector pSUC2 for yeast SST was prepared.
  • a yeast SST cDNA library was prepared by incorporating a mammalian cDNA upstream of the SUC2 gene.
  • This library was transformed into a yeast deficient for secretory inbellase. If the integrated mammalian cDNA encodes a signal peptide, it is more likely to have a secretory effect on yeast-expressed ymbeltase, resulting in growth on a roughinos medium. Is possible. Thus, yeast was cultured from the colonies that emerged, a plasmid was prepared, and the nucleotide sequence of the insert cDNA was determined. This facilitated the search for new signal peptides quickly and easily.
  • yeast SST cDNA library -(1) Isolate mRNA from target cells and synthesize double-stranded cDNA using random primers linked to specific restriction enzyme (enzyme I) sites And
  • step (1) After stimulating with a suitable stimulant from a target mammalian organ or cell line as necessary, a known method (hereinafter, known methods are not particularly described. For example, Molecular Cloning (Sambrook, J., Fritzsch, EF and Maniat is, T., published in 1989 from the Cold Spring Harbor Laboratory Press) or Current Protocol in Molecular Biology (FM Ausubel et al., ⁇ Ohn Wiley & Sons, Inc. The publication is carried out according to the method described in (1).
  • Target cells include T98G (human glioblastoma cell line: ATCC No. CRL-1690), IMR-32 (human neuroblastoma cell line: ATCC No. CCL-127), U-2 OS ( Human osteosarcoma strain: ATCC No. HTB-96), CCF-STTG 1 (human astrocyte tumor strain: ATCC No. CRL-1718), HAS 303 (human bone marrow stromal cell line: Tokyo Medical University Daiichi Internal Medicine) Courtesy of Keisuke Toyama and Shinsuke Aizawa, described in J. Cell. Physiol. H8, 245-251, 1991 and Experimental Hematol.
  • Tissues also include human placenta and human adult brain.
  • the synthesis of double-stranded cDNA using a random primer is performed by a known method.
  • the restriction enzyme (enzyme I) site to be connected to the adapter and the restriction enzyme (enzyme II) site used in the next step (2) may be any as long as they are different from each other.
  • Xho I is used as enzyme I
  • Ec0R I is used as enzyme II.
  • Step (3) is a step of transforming Escherichia coli by incorporating the cDNA fragment obtained in (2) upstream of the gene of the invertase which has deleted the signal peptide linked to the yeast expression plasmid vector. It is.
  • various plasmid vectors for yeast expression are known. For example, YEp24 that functions in Escherichia coli is used, and the above-described plasmid pSUC2 is preferably used.
  • E. coli strains for transformation are already known, and are preferably DH10B competent cells.
  • the transformation may be performed by any known method, but is preferably performed by electroporation.
  • the transformant is cultured by a conventional method to obtain a cDNA library for yeast SST.
  • the cDNA library 1 is a yeast Saccharomyces cerevisiae (for example, YT455 strain) that does not have the inbellase gene or a strain in which the inbellase gene is artificially deleted (can be prepared according to a known method). be able to.
  • the yeast is transformed by a known method, for example, the lithium acetate method. After the transformants are grown on a selective medium, they are transferred to a medium using roughinos as a carbon source, viable colonies are selected, and the plasmid is recovered. The fact that the yeast grew using the raffinose as a carbon source indicates that some of the secretory protein signal peptides had been incorporated into the library.
  • nucleotide sequence of the isolated positive clone was determined, and for cDNA that was found to encode an unknown protein, a full-length clone was isolated using it as a probe, and the full-length nucleotide sequence was determined. Can be determined. These operations are performed by methods known to those skilled in the art.
  • oligonucleotide having an appropriate nucleotide sequence By synthesizing an oligonucleotide having an appropriate nucleotide sequence and using it to hybridize from a cDNA library or mRNA derived from a mammal by PCR or using a fragment of the appropriate nucleotide sequence as a probe, From one mammalian cDNA library or its genomic library, cDNA encoding another mammalian type of the protein of the present invention can be obtained.
  • the cDNA thus obtained contains the base sequence of the cDNA fragment obtained by SST (or a homologous sequence thereof), it means that the signal peptide is coded. It is clear that the cDNA is full-length or nearly full-length (sidinal peptides are encoded at the 5 'end of the open reading frame of the cDNA, since they are at the N-terminus of the protein without exception).
  • the full length may be confirmed by Northern analysis using the cDNA as a probe.
  • the size of the mRNA obtained from the hybridized band is compared with the size of the cDNA, and if they are almost the same, the cDNA is considered to be almost full length.
  • the cDNA of the present invention can be obtained thereafter by chemical synthesis or by chemically synthesizing fragments of these base sequences and hybridizing them with a probe. Furthermore, a required amount of the desired cDNA can be obtained by introducing the vector cDNA containing the present cDNA into an appropriate host and growing it.
  • an initiation codon is added to the 5 'end of the cDNA encoding the mature protein portion, and the resulting cDNA is ligated to a suitable promoter (eg, trp promoter, lac promoter,
  • a suitable promoter eg, trp promoter, lac promoter
  • the expression vector is prepared by connecting downstream of the ⁇ PL promoter, T7 promoter, etc.) and inserting it into a vector (eg, pBR322, pUC18, pUC19, etc.) that functions in E. coli.
  • Escherichia coli eg, E. Coli DH1, E. Coli JM109, E. Coli HB101, etc.
  • Escherichia coli transformed with the expression vector is cultured in an appropriate medium, and the desired polypeptide is isolated from the cells. Can be obtained.
  • a signal peptide of a patella for example, a signal peptide of pe1B
  • a target polypeptide can be secreted during periplasm.
  • it can produce fusion proteins with other polypeptides.
  • SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12, 15, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78 or 81 can be ligated with a cDNA encoding an appropriate vector (for example, a retrovirus vector, a papilloma virus vector).
  • an appropriate vector for example, a retrovirus vector, a papilloma virus vector.
  • a vaccinia virus vector, an SV40-based vector, etc. into an appropriate promoter (eg, an SV40 promoter, an LTR promoter, a metamouth thionein promoter, etc.) to prepare an expression vector.
  • appropriate mammalian cells eg, monkey COS — 7 cells, Chinese hamster CHO cells, mouse L cells, etc.
  • the transformant is cultured in an appropriate medium.
  • the protein of the present invention is a secretory protein or a membrane protein, it is expressed as follows.
  • the desired polypeptide is expressed in the cell supernatant.
  • fusion with other polypeptides for example, a cDNA fragment encoding the constant region (Fc portion) of an antibody, can produce fusion protein.
  • the protein of the present invention is a membrane protein
  • the desired polypeptide is expressed on the cell membrane.
  • a deletion lacking the transmembrane region of the cDNA encoding the nucleotide sequence represented by 72, 75, 78 or 81 is inserted into the vector and used to transform an appropriate mammalian cell. As a result, the desired soluble polypeptide is secreted into the culture solution.
  • fusion is achieved by linking the cDNA fragment encoding the deletion member lacking the transmembrane region and another polypeptide, for example, a cDNA fragment encoding the constant region (Fc portion) of the antibody.
  • a cDNA fragment encoding the constant region (Fc portion) of the antibody.
  • 'It can also produce protein (fusion protein).
  • polypeptide obtained as described above can be isolated and purified by a general biochemical method. Industrial applicability
  • the polypeptide of the present invention and the cDNA encoding the same may exhibit one or more effects or biological activities (including those related to Atsushi listed below).
  • the effects or biological activities described with respect to the proteins of the present invention may be dependent upon the administration or use of the protein, or the administration or use of cDNA encoding the protein (eg, a vector suitable for gene therapy or cDNA transfer). , Provided.
  • the protein of the present invention may exhibit site force-in activity and cell proliferation (induction or inhibition) and Z differentiation activity (induction or inhibition), or may induce or suppress the production of other cytokines in a certain cell population.
  • the activity of the proteins of the present invention can be demonstrated by any of a number of conventional factor-dependent cell line cell proliferation assays.
  • the protein of the present invention is considered to exhibit immunostimulatory activity and immunosuppressive activity. Certain proteins may also regulate (stimulate or suppress) the growth and proliferation of, for example, T and / or B lymphocytes, as well as affect the cytotoxic activity of NK cells and other populations. Giving it would be effective in treating a variety of immunodeficiencies and diseases, including severe combined immunodeficiency (SCID). These immunodeficiencies can be hereditary or can be caused by, for example, a virus such as HIV, as well as bacterial or fungal infections. Alternatively, it may come from an autoimmune disease.
  • SCID severe combined immunodeficiency
  • HIV hepatitis viruses
  • herpes viruses mycobacteria
  • leishmania a virus that causes of infectious diseases caused by viruses, bacteria, fungi or other infections, including various fungal infections such as Candida
  • the protein of the present invention is effective in places where it is generally suggested that the immune system is increased, that is, in the treatment of cancer.
  • the proteins of the present invention are also believed to be effective in treating allergic reactions and conditions such as asthma and other respiratory diseases. It is contemplated that other conditions where immunosuppression is desired, including, for example, asthma and related respiratory diseases, can also be treated using the proteins of the present invention.
  • the protein of the present invention is, for example, associated with infections such as septic shock or systemic inflammatory response syndrome (SIRS), inflammatory bowel disease, Crohn's disease, or has been proved effective by IL_11. It may also suppress chronic or acute inflammation resulting from overproduction of cytokines such as TNF and IL-11.
  • infections such as septic shock or systemic inflammatory response syndrome (SIRS), inflammatory bowel disease, Crohn's disease, or has been proved effective by IL_11. It may also suppress chronic or acute inflammation resulting from overproduction of cytokines such as TNF and IL-11.
  • the protein of the present invention is expected to be effective in controlling hematopoietic cells and, correspondingly, in treating myeloid or lymphoid cells deficiency. Even weak bioactivity with the aid of colony-forming cells or factor-dependent cell lines suggests that they may be involved in the control of hematopoietic cells.
  • the biological activity relates to all or any of the following.
  • erythroid progenitors alone, or in combination with other cytokines, and suggests efficacy, such as in the treatment of various anemias, or in the production of erythroid progenitors and / or erythrocytes Use in combination with irritating radiation therapy / chemotherapy; supports the growth and proliferation of myeloid cells such as granulocytes and monocytes Z macrophage (ie, classic CSF activity), bone marrow associated with chemotherapy Combination with chemotherapy to prevent suppression; support for megakaryocyte growth and proliferation and subsequent platelet growth and proliferation, thereby protecting and treating various platelet disorders such as thrombocytopenia General use complementary to or complementary to platelet transfusions; support for the growth and proliferation of hematopoietic stem cells that can mature into some or all of the hematopoietic cells; and thus, various stem cell disorders (including but not limited to , Such as those commonly treated with transplantation, including aplastic anemia and paroxysmal nocturnal hemoglobinuria), as well
  • the protein of the present invention can be measured by the following method, among other methods.
  • the proteins of the present invention are believed to be used for either bone, cartilage, tendon, ligament, and nerve tissue growth or regeneration, as well as wound healing and tissue repair, and treatment of burns, incisions, and ulcers. Can be
  • Proteins of the invention that induce cartilage and bone or any growth in an environment that does not form bone normally are applied to the healing of fractures and cartilage damage or defects in humans and other animals.
  • the preparation using the protein of the present invention is considered to be effective for reduction of closed fracture as well as open fracture, improvement of fixation of artificial joint, and preventive use.
  • New bone formation induced by osteogenic agents contributes to the restoration of craniofacial defects induced by congenital, traumatic, carcinomactomy. It is also effective in the field of cosmetic plastic surgery.
  • the proteins of the present invention are also believed to be used in the treatment of periodontosis and other dental restorations. Such drugs would provide an environment that attracts osteogenic cells, stimulates their proliferation, and induces their progenitor cells to differentiate.
  • the proteins of the present invention may be stimulated by repairing bone and / or cartilage or any of them, or by inhibiting the process of inflammation or tissue destruction mediated by the inflammatory process (collagenase activity or osteoclast activity). It is considered to be effective in treating osteoporosis and osteoarthritis.
  • Another category of tissue regeneration activity that may be attributed to the proteins of the present invention is tendon ligament formation.
  • the protein of the present invention induces such tissue formation in an environment where tendon / ligament-like tissue or other tissue is not normally formed, but it is known that tendon / ligament lacerations, malformations, and Applicable to healing of other tendon ligament disorders.
  • Formulations that use proteins that induce tendon or ligament-like tissue can be used to improve tendon / ligament fixation to bone or other tissues and to repair tendon or ligament damage, as well as to repair tendon Z ligament tissue defects. Preventive use for defense is also conceivable.
  • Neotendon tendon ligament-like tissue formation induced by the compositions of the present invention contributes to the repair of congenital, traumatic, or tendon or ligament defects of other origin. It is also effective in cosmetic plastic surgery, in which a tendon or ligament is attached or repaired.
  • compositions of the present invention provide an environment that attracts tendon ligament forming cells, stimulates their proliferation, and induces their progenitor cells to differentiate.
  • tendon / ligament cells or progenitor cells are induced ex vivo, in preparation for return to in vivo for tissue repair.
  • the compositions of the present invention are also effective in treating tendinitis, carpal tunnel syndrome, and other tendon or ligament defects.
  • the compositions of the present invention include suitable matrixes and carriers as well as sequencing agents well known to those skilled in the art.
  • the protein of the present invention can be used for the growth of nerve cells and regeneration of nerve and brain tissues, that is, the central and peripheral nervous systems as well as mechanical and traumatic disorders including degeneration, death, or trauma of nerve cells or nerve tissues. It may also be effective in treating diseases and neurological disorders. More specifically, certain proteins are associated with diseases of the peripheral nervous system, such as peripheral neuropathy, peripheral neuropathy, and focal neuropathy, and Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, amyotrophic lateral disease ( It is thought to be effective in treating central nervous system diseases such as amyo trophic l ateral) and Shy-Drager syndrome.
  • diseases of the peripheral nervous system such as peripheral neuropathy, peripheral neuropathy, and focal neuropathy, and Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, amyotrophic lateral disease ( It is thought to be effective in treating central nervous system diseases such as amyo trophic l ateral) and Shy-Drager syndrome.
  • Further conditions that can be treated in accordance with the present invention include mechanical and traumatic disorders such as cerebrovascular disease such as spinal cord injury, head trauma, and stroke. Chemotherapy or other treatment Peripheral neurosis due to force can also be treated using the proteins of the present invention.
  • the protein of the present invention may be, for example, an activity to produce other tissues such as visceral organs including liver, intestine, kidney, skin, endothelium, smooth, skeletal or cardiac muscle, and vascular endothelium, Alternatively, it is also expected to exhibit an activity of promoting the proliferation of cells constituting such a tissue. Some of the desired effects may also be mediated by the inhibition of fibrous scarring, which regenerates normal tissue.
  • the protein of the present invention is also considered to be effective in protecting or regenerating the digestive tract, and in treating fibrosis of the lung or liver, reperfusion injury of various tissues, and conditions caused by systemic site force-in disorder. .
  • the protein of the present invention is considered to exhibit activity related to activin / inhibin.
  • Activin is characterized by its activity of stimulating the release of follicle-stimulating hormone (FSH)
  • inhibin is characterized by its activity of inhibiting the release of follicle-stimulating hormone (FSH). Therefore, the protein of the present invention is a contraceptive regulator based on the activity of inhibin, alone or as a heterodimer with a member of inhibin a family, which reduces fertilization rate in female mammals and reduces spermatogenesis in males. It is considered to be effective. Administration of sufficient amounts of other inhibins can induce infertility in mammals.
  • the protein of the present invention is a homodimer or heterodimer with other protein subunits of the inhibin b group, and is a therapeutic drug based on the activity of an activin molecule that stimulates the release of FSH from cells of the pituitary gland. It is considered to be effective as a fertility inducer (see US Pat. No. 4,798,885).
  • the protein of the present invention is believed to be effective in hastening the onset of pregnancy in sexually immature mammals in order to extend the lifespan of livestock such as cattle, sheep and pigs. .
  • the protein of the present invention is, for example, monocytes, neutrophils, T cells, mast cells, eosinophils, and endothelial cells, or any of them, against mammalian cells, For example, it is thought to have chemotactic z chemokinetic activity to act as a chemokine.
  • Chemotaxis Z chemokinetic proteins can be used to immobilize or attract a desired cell population to the desired site of the reaction.
  • Chemotactic Z chemomotility proteins offer special advantages in treating wounds and other trauma, as well as local infections. For example, attracting lymphocytes, monocytes, or neutrophils to a tumor or site of infection may result in an improved immune response to the tumor or site of infection.
  • a protein or peptide retains chemotactic activity on a particular cell population if it can directly or indirectly stimulate the indicated direction or movement of that cell population. Desirably, the protein or peptide retains the activity of directly stimulating the directed movement of the cell. Whether a particular protein retains chemotactic activity for a population of cells is easily determined using such a protein or peptide in any known cell chemotaxis assay. it can.
  • proteins of the present invention also exhibit clotting or thrombotic activity. As a result, such proteins are expected to be effective in treating a variety of coagulation disorders, including hereditary disorders such as hemophilia. Alternatively, it is expected to promote clotting and other clotting events in the treatment of wounds caused by trauma, surgery or other causes.
  • the protein of the present invention is also considered to be effective in dissolving or inhibiting the formation of a thrombus (thrombus or stroke, etc.), and in treating and preventing a condition resulting therefrom.
  • the protein of the present invention may exhibit the activity of a receptor, a receptor ligand or a receptor ligand as an inhibitor or an agonist.
  • receptors and ligands include cytokine receptors and their ligands, receptor kinases and their ligands, receptor phosphatases and their ligands, and receptors associated with cell-cell interactions (Selection). , Integur in, And its ligands, including cell adhesion molecules such as receptor kinases. ) And its ligands, and combinations of receptor Z ligands involved in antigen presentation, antigen recognition, and development of cellular and humoral immune responses, but are not limited to.
  • Receptors and ligands are also useful for the screening of potential peptides or small molecules for their interaction.
  • the proteins of the present invention are believed to be effective as inhibitors of the interaction of receptor ligands (including but not limited to receptor and ligand fragments) themselves.
  • the proteins of the present invention may exhibit one or more of the following additional activities or effects: kills infectious agents, including bacteria, viruses, molds, and other parasites; Has the effect of suppressing or promoting physical characteristics such as weight, hair color, eye color, skin or other tissue pigmentation, or organ size (eg, breast gain or weight loss); Affects protein or carbohydrate breakdown; Affects behavioral characteristics including appetite, libido, stress, cognition (cognitive impairment), depression, violent behavior; Pain relief or other pain-reducing effects Has effects; promotes differentiation and proliferation of embryonic stem cells to other lineages other than the hematopoietic lineage; and, in the case of enzymes, supplements the deficiency of the enzymes and treats related disorders.
  • Proteins having the above activity include, for example, proliferation or cell death of B cells, T cells, mast cells, class-specific induction of immunoglobulins by promoting class switches, differentiation of B cells into antibody-producing cells, granulocyte precursors Cell proliferation or differentiation, cell death, monocyte / macrophage progenitor cell proliferation or differentiation, cell death, neutrophils, monocytes, macrophages, eosinophils, basophils proliferation or hyperactivity, cell death, megakaryocytes Proliferative cell proliferation or cell death, neutrophil progenitor cell proliferation or differentiation, cell death, B or T progenitor cell proliferation or differentiation, cell death, promotion of erythrocyte production, erythrocyte, neutrophil, eosinophil, Basophils, monocytes, macrophages, mast cells, megakaryocyte progenitor cells, neutrophils, monocytes, macrophages, B cell or T cell migration Stimulation, Thymocyte proliferation or cell death, Adipocyte differentiation inhibition, Natural killer cell proliferation
  • the peptide of the present invention since the peptide of the present invention is also expected to act on the nervous system, it differentiates into various neurotransmitter-operated neurons and maintains their survival or cell death, promotes proliferation or death of glial cells, neurites Growth, maintenance or death of ganglion cells, proliferation or differentiation promotion of astrocytes or cell death, proliferation or maintenance of peripheral nerves, cell death, proliferation or cell death of Schwann cells, proliferation of motor nerves or It is thought that it also has the effect of maintaining survival and cell death.
  • polypeptide of the present invention may be used in the developmental process of the early embryo during the development of the early embryo, such as formation of the epidermis, brain, spine, and nerve by the action of inducing ectoderm, the dorsal cord connective tissue (bone, muscle, tendon) and blood cells by the action of inducing mesoderm.
  • the polypeptide of the present invention itself may be a disease relating to a decrease or increase in the function of the immune system or nervous system or bone metabolism, or a hypoplasia or abnormal proliferation of hematopoietic cells, such as an inflammatory disease (rheumatic disease).
  • Hematopoietic stem cell depletion after bone marrow transplantation Cancer, Leukemia, platelets, B-cell or T-cell depletion after radiation or chemotherapy for leukemia, Anemia, Infectious disease, Cancer It is expected to be used as a preventive or therapeutic agent for leukemia, AIDS, abnormal bone metabolism (osteoporosis, etc.), various degenerative diseases (Alzheimer's disease, multiple sclerosis, etc.), or nerve damage.
  • polypeptide of the present invention may be used to divide ectoderm, mesoderm or endoderm-derived organs. It is expected to be used as a tissue repair agent for various organs (epidermal, bone, muscle, tendon, heart, kidney, stomach, intestine, liver, thymus, lung, trachea, etc.) You.
  • polypeptide of the present invention can be quantified in a living body using a polyclonal antibody or a monoclonal antibody of the polypeptide of the present invention, whereby studies on the relationship between the polypeptide and a disease or diagnosis of a disease can be performed. It can be used for such purposes.
  • Polyclonal and monoclonal antibodies can be prepared by a conventional method using the polypeptide of the present invention or a fragment thereof as an antigen.
  • polypeptide of the present invention preferably, the polypeptide of the extracellular domain thereof
  • an affinity column is prepared, and a known or unknown protein (binding) to the polypeptide of the present invention is bound.
  • Ligands can be identified, purified or their genes cloned.
  • polypeptide of the present invention preferably, a transmembrane region or a polypeptide of an intracellular domain
  • the polypeptide of the present invention is used, for example, by the West-West method, or the cDNA (preferably, a transmembrane region of the polypeptide of the present invention).
  • cDNA encoding the intracellular domain to identify downstream signal transmitting molecules that interact with the polypeptide of the present invention in the cytoplasm by, for example, the yeast 2-hybrid method, and to perform gene cloning. Can also.
  • polypeptide of the present invention screening for the polypeptide receptor of the present invention, an antagonist, an inhibitor between a receptor and a signaling molecule, and the like can be performed.
  • the cDNA of the present invention is not only an important and indispensable type ⁇ ⁇ when producing the polypeptide of the present invention, which is expected to have tremendous utility, as well as the diagnosis and treatment of genetic diseases (treatment of gene deficiency or Antisense DNA (RNA) can be used for therapy such as stopping expression of a polypeptide.
  • genomic DNA can be separated using the cDNA of the present invention as a probe.
  • the inheritance of a human related polypeptide highly homologous to the cDNA of the present invention It is also possible to isolate polypeptide genes highly homologous to the polypeptides of the present invention in offspring and organisms other than mice.
  • the polypeptide of the present invention or an antibody against the polypeptide of the present invention is usually administered systemically or locally, generally orally or parenterally.
  • Preferred are oral administration, intravenous administration and intraventricular administration.
  • the dosage varies depending on the age, body weight, symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, etc., but it is usually within the range of 100 to 110118 per adult per day. It is administered orally once to several times or parenterally in the range of 10 g to 100 mg per adult per day, once to several times a day.
  • the compound of the present invention When the compound of the present invention is administered, it is used as a solid composition, a liquid composition and other compositions for oral administration, an injection for parenteral administration, an external preparation, a suppository and the like.
  • Solid compositions for oral administration include tablets, pills, capsules, powders, granules and the like.
  • Capsules include soft capsules and hard capsules.
  • the one or more active substances include at least one inert diluent (e.g., lactose, mannitol, dulose, hydroxypropylcellulose, microcrystalline cellulose, starch). , Polyvinylpyrrolidone, magnesium aluminate metasilicate, etc.).
  • the composition is prepared according to a conventional method using additives other than an inert diluent, such as a lubricant (eg, magnesium stearate), a disintegrant (eg, calcium cellulose glycolate), a stabilizer (eg, human serum albumin, lactose, etc.). ), Dissolution aid (Al Ginine, aspartic acid, etc.).
  • Tablets or pills may be coated with a gastric or enteric film such as sucrose, gelatin, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose phthalate, etc., if necessary, or with two or more layers. May be. Also included are capsules of absorbable materials such as gelatin.
  • Liquid compositions for oral administration include pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups, elixirs and the like, and commonly used inert diluents (eg, purified water, Ethanol etc.). Such compositions may contain, in addition to the inert diluent, adjuvants such as wetting agents and suspending agents, sweetening agents, flavoring agents, flavoring agents, and preservatives.
  • adjuvants such as wetting agents and suspending agents, sweetening agents, flavoring agents, flavoring agents, and preservatives.
  • compositions for oral administration include sprays which contain one or more active substances and are formulated in a manner known per se.
  • This composition contains, in addition to the inert diluent, a stabilizer such as sodium bisulfite to provide isotonicity, an isotonic agent such as sodium chloride, sodium citrate or citrate. It may be.
  • a stabilizer such as sodium bisulfite to provide isotonicity
  • an isotonic agent such as sodium chloride, sodium citrate or citrate. It may be.
  • the method for producing sprays is described in detail, for example, in US Pat. Nos. 2,868,691 and 3,095,355.
  • Injections for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions.
  • aqueous or non-aqueous solution, suspension one or more active substances is mixed with at least one inert diluent.
  • Aqueous diluents include, for example, distilled water for injection and saline.
  • non-aqueous diluent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol, and Polysorbate 80 (registered trademark).
  • compositions may also contain adjuvants such as preserving, wetting, emulsifying, dispersing, and stabilizing agents (eg, human serum albumin, lactose, etc.) and solubilizing agents (eg, arginine, aspartic acid, etc.). It may contain an agent.
  • adjuvants such as preserving, wetting, emulsifying, dispersing, and stabilizing agents (eg, human serum albumin, lactose, etc.) and solubilizing agents (eg, arginine, aspartic acid, etc.). It may contain an agent.
  • Example 1 Clone ON 056
  • TRIzol reagent registered trademark, sold by GIBC0 BRL
  • mRNA Purification K trade name, sold by Pharmacia
  • NNNNNNNN-3 '(SEQ ID NO: 82) as a primer and double-stranded cDNA using Super Script Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (trade name, sold by GIBCO BRL) was synthesized.
  • An EcoR I adapter (sold by GIBCO BRL) was sold by DNA ligation kit ver.2 (trade name, Takara Shuzo Co., Ltd.) All subsequent ligation of cDNA was performed using this kit. ), Digested with Xhol, cut out 300-800 bp cDNA by agarose electrophoresis, fractionated, and placed in the EcoRI / NotI site of pSUC2 (see US Pat. No. 5,536,637). The resultant was ligated and transformed into E. coli DH10B by electroporation to obtain a cDNA library for yeast SST.
  • each emerging colony was streaked on the YPR plate again and incubated at 30 for 48 hours.Single colony was inoculated on YPD medium and incubated at 30 for 48 hours. A plasmid was prepared. Subsequently, PCR was performed according to a known method using two types of primers (the sense strand was a biotinylated primer) of the sequences at both ends of the cloning site of pSUC2, and after amplification of the insert cDNA, dynazyme was performed. The biotinylated single-stranded cDNA was purified using beads (Dynabeads) (trade name, sold by DYNAL), and the nucleotide sequence was determined.
  • the nucleotide sequence is determined by a fluorescent dye using DNA Sequencing Kit (Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction; trade name, sold by Alied Biosystems Inc.). And the reading was performed using an automatic DNA sequencer 373 (Applied Biosystems Inc.) (hereinafter, all the nucleotide sequences were determined by this method).
  • a homology search with the database was performed on the obtained nucleotide sequence and deduced amino acid sequence, and a clone identified as a novel cDNA that was not registered in the database was identified as a clone of the full-length cDNA. Attempted In addition, by comparing the deduced amino acid sequence with a known signal peptide, it was confirmed that each cDNA had a functional and structural signal peptide.
  • a 27-mer biotinylated primer ON 056—F 1: 5 ′ biot in-AAC AT GA AT CTTTCGC TCGTC CTGGCT—3 SEQ ID NO: 83
  • a plasmid specifically hybridizing with the biotinylated primer was recovered from the cDNA library according to the method of the GeneTrapper kit, and transformed into Escherichia coli DH10B. Further, using a random primer DNA Labeling kit (trade name, sold by Takara Shuzo Co., Ltd.) as a probe, ON 056 S ST c DNA labeled with 32 P-d CTP is used as a probe.
  • Colony hybridization was performed by the method, positive clones were isolated, and plasmids were prepared. First, the nucleotide sequence on the 5 ′ side was determined to confirm that the nucleotide sequence of the ⁇ N 056 SST cDNA was present. Then, the entire nucleotide sequence was determined, and the sequence shown in SEQ ID NO: 3 was obtained. Furthermore, the open reading frame was determined and translated into amino acids to obtain the sequences shown in SEQ ID NOS: 1 and 2.
  • clone ON056 the region between amino acid sequences 1-334 of SEQ ID NO: 1 and human cathepsin L (Human Cathepsin L (SwissProt Accession P07711)). Region), and clone QN056 (region between amino acid sequences 22 to 334 of SEQ ID NO: 1) and human cathepsin K (SwissProt. Accession P43235) (a region between 19 and 329). Based on these homologies, clone ON0566 is expected to retain at least the same activity as the Cathepsin L family.
  • the obtained full-length cDNA was expressed in Xhol (or EcoRI) of the expression vector pED6 for mammalian cells (see Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991)) /
  • Xhol or EcoRI
  • pED6 for mammalian cells
  • cDNA Cloning of full-length cDNA was performed using the GENETRAPPER cDNA Positive Selection System.
  • a dT-primed cDNA library was prepared from p1y (A) + RNA of human placental tissue using the plasmid pSPORT1 as a vector using the Super Script Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning.
  • a 28-mer biotinylated primer N 0 34—F 1: 5 ′ biotin-TGAAGCCCATCACTACATCGC CATTACG-3 ′ was prepared.
  • Plasmids that specifically hybridize with the biotinylated primer according to the method of the GeneTrapper kit were recovered from the cDNA library and transformed into E. coli DH10B. Further, using the Random Primer DNA Labeling kit, ON 034 S ST cDNA labeled with 32p-d CTP was used as a probe, and colony hybridization was performed by a known method to isolate a positive clone. Plasmids were prepared. Hereinafter, the entire nucleotide sequence was determined in the same manner as in ⁇ N056, and the sequence shown in SEQ ID NO: 6 was obtained. Further, the open reading frame was determined and translated into amino acids to obtain the sequences shown in SEQ ID NOS: 4 and 5.
  • Cloning of the full-length cDNA was performed using the 3 'RACE (Rapid Amplification of cDNA End) method using the Marathon cDNA Amplification Kit (trade name, sold by Clontech). .
  • the double-stranded cDNA was prepared from the origin of each clone, that is, the poly (A) + RNA of human placental tissue.
  • a 27-mer primer OX00-13 '(SEQ ID NO: 85) containing the predicted translation start site ATG region was prepared, and the adapter primer attached to the kit was prepared.
  • the nucleotide sequence on the 5 ′ side was determined to confirm that the nucleotide sequence of OX003SSTcDNA was present. After that, the entire nucleotide sequence was determined, and the sequence shown in SEQ ID NO: 9 was obtained. Further, the open reading frame was determined and translated into amino acids to obtain the sequences shown in SEQ ID NOS: 7 and 8.
  • a double-stranded cDNA to which an adapter was ligated was prepared from the RNA. Based on the information on the nucleotide sequence obtained by SST, a 27mer primer OA052-F1: 5'-ATGCCTAGAAGAGGAC TGATTCTTCAC-3 '(SEQ ID NO: 87) containing the putative translation initiation site ATG region was prepared. PCR was performed with the adapter primer attached to the kit. The cDNA specifically amplified to clone OA052 was recloned in the same manner as in ⁇ X003, the entire nucleotide sequence was determined, and the sequence shown in SEQ ID NO: 12 was obtained. Further, the open reading frame was determined and translated into amino acids to obtain the sequences shown in SEQ ID NOS: 10 and 11.
  • Cloning of the full-length cDNA was performed in the same manner as for OX003 using the 3 'RACE method with the Marathon cDNA Amplification kit.
  • the double-stranded cDNA was prepared from the origin of each clone, that is, po1y (A) + RNA from human adult brain tissue.
  • a 27-mer primer OC004-F1: 5′-ATGAGGAAAGGGAACCTTCTGCTGAGC-13 ′ (SEQ ID NO: 88) containing the putative translation start site ATG region was prepared, PCR was performed with the adapter primer attached to the kit.
  • the cDNA was not sufficiently amplified by one PCR, so an additional 18-mer primer ⁇ C 004—F 2: 5 ′ on the 3 ′ side of the OC 004—F 1 primer—TGAGCTTCCAGAG CTGTC -3 '(SEQ ID NO: 89) was prepared and subjected to nested PCR.
  • the cDNA specifically amplified to clone # C004 was recloned by the same method as that for # X003, the entire nucleotide sequence was determined, and the sequence shown in SEQ ID NO: 15 was obtained. Furthermore, the open reading frame was determined and translated into amino acids to obtain the sequences shown in SEQ ID NOS: 13 and 14.
  • Cloning of the full-length cDNA was performed in the same manner as in X003 using the 3 'RACE method with the Marathon cDNA Amplification kit.
  • the double-stranded cDNA was prepared from the origin of each clone, that is, poly (A) + RNA from human adult brain tissue.
  • a 27-mer primer OM017-3 '(SEQ ID NO: 90) containing the putative translation initiation site ATG region was prepared, and the adapter primer attached to the kit was prepared. And performed a CRC.
  • the cDNA was not sufficiently amplified by one PCR, so an additional 27 1116 1 "primer 01 ⁇ 01 7—?
  • BLASTX, BLASTP and FASTA were cloned OM017 (amino acid sequence 433-709, 42-225, 170-399, 1-2 of SEQ ID NO: 16).
  • -ATGAGGACTTACC ATTATATAC C ATTA-3 '(SEQ ID NO: 93) was prepared and subjected to nested PCR.
  • the cDNA specifically amplified to clone ⁇ M101 was recloned in the same manner as for ⁇ X003, the entire nucleotide sequence was determined, and the sequence shown in SEQ ID NO: 21 was obtained. Further, the open reading frame was determined and translated into amino acids to obtain the sequences shown in SEQ ID NOS: 19 and 20.
  • clone OM101 (the region between amino acid sequences 1 to 77 in SEQ ID NO: 19) has the amino acid sequence of human cadherin-6 (Human Cadherin-6 (SwissProt Accession P55285)):! And the human brain cadherin (amino acid sequence 1-78 of Human Brain-Cadherin (SwissProt Accession P55289)). It is shown that there is great homology. Based on these homologies, clone OM101 is expected to retain at least the activity associated with Human Cadherin-6 and other cadherin families.
  • Example 8 Clone ⁇ M 126
  • RNA was extracted from human adult brain tissue using TRIzol reagent, and po 1 y (A) + RNA was purified using mRNA Purification kit.
  • each clone that is, poly (A) + RNA of human adult brain tissue was prepared.
  • TG-3 ′ (SEQ ID NO: 94) was prepared, and PCR was performed with the adapter and one primer attached to the kit.
  • the cDNA specifically amplified to clone OM126 was recloned in the same manner as for OX003, the entire nucleotide sequence was determined, and the sequence shown in SEQ ID NO: 24 was obtained. Further, the open reading frame was determined and translated into amino acids to obtain the sequences shown in SEQ ID NOS: 22 and 23.
  • a dT-primed cDNA library was prepared from the RNA using plasmid pSPORT1 as a vector. Next, based on the information on the nucleotide sequence obtained by SST, a 27-mer biotinylated primer O M160-F1: 5 '
  • BLASTX, BLASTP and FASTA were cloned from OM160 (the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25 between 153 and 395) and from Drosophila melanogaster. It was shown that there was significant homology between the primordial secretory signal protein (amino acid sequence of Drosophila neurogenic secreted signaling protein (Genepept Accession U41449), a region between 80 and 317). Based on these homologies, clone OM160 is expected to retain at least the same activity as the Drosophila neurogenic secreted signaling protein.
  • Example 10 Clone OMA016
  • RNA was extracted from human adult brain tissue using TRIzol reagent, and poly (A) T RNA was purified using mRNA Purification kit.
  • Cloning of the full-length cDNA was performed in the same manner as in X003 using the 3 'RACE method with Marathon cDNA Amplification kit.
  • the double-stranded cDNA was prepared from the origin of each clone, that is, oly (A) + RNA of human adult brain tissue.
  • a 27-mer primer OMA TGG-3 '(SEQ ID NO: 96) containing the putative translation initiation site ATG region was prepared based on the information of the nucleotide sequence obtained by SST, and the adap PCR was performed with the primers.
  • the example of the clone # MB130 of the present invention used the same method as ON 056, except for the following points.
  • the double-stranded cDNA was prepared from the origin of each clone, that is, poly (A) + RNA from human adult brain tissue.
  • TCC-3 ′ (SEQ ID NO: 97) was prepared, and PCR was carried out with the adapu primer attached to the kit.
  • the cDNA specifically amplified to the clone OMB130 was recloned in the same manner as in OX003, and the entire nucleotide sequence was determined.
  • the sequence shown in SEQ ID NO: 36 was obtained.
  • the open reading frame was determined and translated into amino acids to obtain the sequences shown in SEQ ID NOs: 34 and 35.
  • BLASTX, BLASTP and FASTA are clone QMB130 (the region between amino acid sequences 10 and 177 of SEQ ID NO: 34) and monkey hepatitis A virus receptor (Monkey Hepatitis A virus receptor (PRF Code 2220266A (Genbank Accession X98252)). ) Has significant homology between the amino acid sequences 6 to 173). Based on these homologies, clone OMB130 is expected to retain at least activity associated with Monkey Hepatitis A virus receptor.
  • Example 12 Clone @ MB 142
  • the example of the clone # MB142 of the present invention used the same method as ON 056, except for the following points.
  • DNA cloning was performed in the same manner as for OX003, using the 3 'RACE method with the Marathon cDNA Amplification kit.
  • the double-stranded cDNA was prepared from the origin of each clone, that is, poly (A) + RNA of human adult brain tissue. Based on the nucleotide sequence information obtained by SST, putative translation start site ATG region containing 27 M primers OMB
  • GAT-3 ′ (SEQ ID NO: 98) was prepared, and PCR was carried out with the adapter Aichi Primer attached to the kit.
  • a 28mer primer OMB142-F1: 5 ' was added to the 3' side of the 142MB142—F2 primer—GGAGATGGT ACGGATCTTAAGGACTGTG — 3 ′ (SEQ ID NO: 99) was prepared and subjected to nested PCR.
  • the cDNA specifically amplified to clone OMB142 was recloned in the same manner as ⁇ X003, and the entire nucleotide sequence was determined. The sequence shown in SEQ ID NO: 39 was obtained.
  • RNA was extracted from the human fast lipoma cell line CCF—STTG1 (ATCC No. CRL-1718) using TRIzol reagent, and poly (A) + RNA was purified using mRNA Purification kit.
  • CAC-3 ′ (SEQ ID NO: 102) was prepared, and PCR was performed with the Adaptor Primer attached to the kit.
  • the cDNA specifically amplified for clone OVB100 is recloned in the same manner as ⁇ X003, The base sequence was determined, and the sequence shown in SEQ ID NO: 45 was obtained. Further, the open reading frame was determined and translated into amino acids to obtain the sequences shown in SEQ ID NOS: 43 and 44.
  • Cloning of the full-length cDNA was performed in the same manner as in X003 using the 3 'RACE method with the Marathon cDNA Amplification kit.
  • the double-stranded cDNA was prepared from the origin of each clone, that is, poSy (A) + RNA of HAS303.
  • a 28mer primer OAF075-1-3 '(SEQ ID NO: 105) containing the predicted translation start site ATG region was prepared and attached to the kit. PCR was performed with the adapter primers.
  • BLASTX, BLASTP and FASTA are clones of OAF 075 (the region between amino acid sequences 1 to 421 of SEQ ID NO: 49) and amino acids of human carboxypeptidase A2 (SwissProt Accession P48052).
  • clone OAF075 is expected to retain at least the same activity as the Carboxypeptidase family member described above.
  • Example 17 clone O AG119
  • RNA Human bone marrow stromal cell line LP 101 (Assistant Professor Kei Togayama, Tokyo Medical University Provided by Shin Aizawa. ), The total RNA was extracted using TRIzol reagent, and po 1 y (A) T RNA was purified using mRNA Purification kit.
  • Cloning of full-length cDNA was performed in the same manner as for OX003 using the 3 'RACE method with Marathon cDNA Amplification kit.
  • the double-stranded cDNA was prepared from the origin of each clone, that is, the poly (A) + RNA of LP101.
  • a primer of 28 mers containing the ATG region of the predicted translation initiation site ATG was prepared.
  • a PCR was performed with the adapter primer.
  • the cDNA specifically amplified to clone # AG119 was recloned in the same manner as for OX003, the entire nucleotide sequence was determined, and the sequence shown in SEQ ID NO: 54 was obtained. Further, the open reading frame was determined and translated into amino acids to obtain the sequences shown in SEQ ID NOS: 52 and 53.
  • Cloning of the full-length cDNA was carried out in the same manner as in X003 using the RACE method with the Marathon cDNA Amplification kit.
  • the double-stranded cDNA was prepared from the origin of each clone, that is, poly (A) + RNA of HUV-EC-C.
  • a primer of 28 mers containing the ATG region at the predicted translation start site A AH040 -F 1: 5'-one TTAGC CC AC C CATGTTGATAGAAC ACCC-3 '(SEQ ID NO: 107) was prepared, and PCR was performed with the adapter primer attached to the kit.
  • the cDNA specifically amplified to clone OAH040 was recloned in the same manner as for OX003, the entire nucleotide sequence was determined, and the sequence shown in SEQ ID NO: 57 was obtained. Further, the open reading frame was determined and translated into amino acids to obtain the sequences shown in SEQ ID NOS: 55 and 56.
  • RNA was extracted from human umbilical vein vascular endothelial cell line HUV-EC-C (ATCC No. CRL-1730) using TRIzol reagent, and poly (A) + RNA was purified using mRNA Purification kit.
  • Cloning of the full-length cDNA was performed in the same manner as in X003 using the 3 'RACE method with the Marathon cDNA Amplification kit.
  • the double-stranded cDNA was prepared from the origin of each clone, that is, HUV_EC-C poly (A) + RNA.
  • a 28mer primer containing the ATG region at the predicted translation start site OAH058-F1: 5'-ACAATGTTGGCCTGTC TGC AAGCT TGTG-3 '(SEQ ID NO: 108) was prepared. Then, PCR was carried out with the adapter Yuichi primer attached to the kit.
  • AH058 was recloned in the same manner as for OX003, the entire nucleotide sequence was determined, and the sequence shown in SEQ ID NO: 60 was obtained. Furthermore, the open reading frame was determined and translated into amino acids to obtain the sequences shown in SEQ ID NOS: 58 and 59.
  • BLASTX, BLASTP and FASTA were cloned from OM011 (the region between amino acid sequences 26 to 396 of SEQ ID NO: 61) and human plasma cell darico protein PC-1 (Human Plasma-cell Glycoprotein PC-1).
  • Alkaline Phosphodiesterase I (SwissProt Accession P22413) showed significant homology to the amino acid sequence (region between 158 and 543). Based on these homologies, clone M011 is expected to retain at least the same activity as Human Plasma-cell Glycoprotein PC-1.
  • Example 21 Clone # M028
  • a plasmid specifically hybridizing with a biotinylated primer was recovered from the cDNA library according to the method of the GeneTrapper kit, and transformed into E. coli DH10B. Further, using OM028S ST cDNA labeled with 32 p-d CTP using Random Primer DNA Labeling kit as a probe, colony hybridization was performed by a known method, and a positive clone was isolated. A plasmid was prepared. Thereafter, the entire nucleotide sequence was determined in the same manner as in ON056, and the sequence shown in SEQ ID NO: 66 was obtained. Further, the open reading frame was determined and translated into amino acids to obtain the sequences shown in SEQ ID NOS: 64 and 65.
  • BLASTX, BLASTP and FASTA are clone OM028 (region between amino acid sequence 1 to 708 of SEQ ID NO: 64) and mouse leucine-rich repeat protein (Mouse Leu-rich repeat protein (PRF Code 2212307ACGENBANK Accession D49802)) (A region between amino acid sequences 1 to 707), and showed significant homology with proteins having a large number of leucine-rich repeats. Based on these homology, clone M028 is expected to retain at least the same activity as a protein having a certain Leu-rich repeat.
  • RNA of human adult brain tissue was prepared. Based on the nucleotide sequence information obtained by SST, a primer of 27mer MB 092—F1: 5, — ACTCAC CTGGATC C CTAAGGGC AC AGC—3 ′ (SEQ ID NO: 11) was prepared and the kit PCR was performed with the adapter primer attached to the kit.
  • a 28-mer primer OMB 092-further containing the ATG region at the 3 'side of the OMB 092 -F1 primer F 2: 5, — AGAATGAGC TATTACGGCAGCAGCTATC-3 '(SEQ ID NO: 112) was prepared and subjected to nested PCR.
  • the cDNA specifically amplified to clone OMB 092 was recloned in the same manner as for OX003, the entire nucleotide sequence was determined, and the sequence shown in SEQ ID NO: 69 was obtained. Further, the open reading frame was determined and translated into amino acids to obtain the sequences shown in SEQ ID NOs: 67 and 68.
  • BLASTX, BLASTP and FASTA were clone OMB 092 (region between amino acid sequence 1 to 254 of SEQ ID NO: 67) and rat endogenous rectifier calcium channel BIR9 (Rat Inward Rectifier Potassium Channel BIR9 (SwissProt Accession P52191) and significant homology with one of the many rheumatoid channel families, including the region between amino acid sequences 1-254 of P52191). Based on these homologies, clone OMB 092 is expected to retain at least the same activity as the calci-m channel.
  • Example 23 clone OMB 108
  • RNA was extracted from human adult brain tissue using TRIzol reagent, and po 1 y (A) + RNA was purified using mRNA Purification kit.
  • GCC-3 ′ (SEQ ID NO: 113) was prepared, and PCR was performed with the adapter primer attached to the kit.
  • the cDNA specifically amplified in clone # MB108 was recloned in the same manner as in # X003, the entire nucleotide sequence was determined, and the sequence shown in SEQ ID NO: 72 was obtained. Further, the open reading frame was determined and translated into amino acids to obtain the sequences shown in SEQ ID NOs: 70 and 71.
  • BLASTX, BLASTP and FASTA were cloned from clone OMB108 (amino acid sequence of SEQ ID NO: 70 between 164 and 256 and between 373 and 487) and human low-density lipoprotein receptor-related protein 1 (Human Low-Density Lipoprotein Receptor Related Protein 1). Protein 10 (SwissProt Accession Q07954)) and other LDL repeats. There is significant homology between the LDL repeat regions of the Yuichi family, and clone ⁇ MB108 (SEQ ID NO: 70 No. 47-158 and 259-370) and the CUB domain of human bone morphogenetic protein 1 (SwissProt Accession P13497) etc. That was shown.
  • OMB108 was found to have two CUB domains and five LDL repeats in the extracellular domain. Based on these homologies, clone # MB108 is expected to retain at least some of the same activity as proteins with LDL repeats as well as proteins with CUB domains.
  • Example 24 Clone OT007
  • the embodiment of the clone # T007 of the present invention used the same method as that of the clone # 056, except for the following points.
  • a dT-primed cDNA library was prepared from the RNA using the plasmid pSPORTl as a vector.
  • a 27-mer biotinylated primer OT007-F1: 5'biotin—A AAATGACTCCCCAGTCGCTGCTGCAG-3 '(SEQ ID NO: 115) was prepared. Plasmids that specifically hybridize with the biotinylated primer according to the kit method were recovered from the cDNA library and transformed into E. coli DH10B.
  • the embodiment of the clone 0AG051 of the present invention used the same method as ON 056, except for the following points.
  • RNA Human bone marrow stromal cell line LP 101 (Assistant Professor Kei Togayama, Tokyo Medical University Provided by Shin Aizawa. ), The total RNA was extracted using TRIzol reagent, and po 1 y (A) T RNA was purified using mRNA Purification kit.
  • Cloning of the full-length cDNA was performed in the same manner as in X003 using the 3 'RACE method with Marathon cDNA Amplification kit.
  • the double-stranded cDNA was prepared from the origin of each clone, ie, po101 (A) + RNA of LP101.
  • Predicted based on nucleotide sequence information obtained by SST Primer of 27mer including translation start point ATG region ⁇ AG05 1—F 1: 5 'GGAAATGTTTAC ATTTTT GTTGACGTG-3' (SEQ ID NO: 1 16 ) was prepared, and PCR was performed with the adapter primer attached to the kit.
  • the cDNA specifically amplified to clone OAG051 was recloned in the same manner as in OX003, the entire nucleotide sequence was determined, and the sequence shown in SEQ ID NO: 78 was obtained. Further, the open reading frame was determined and translated into amino acids to obtain the sequences shown in SEQ ID NOs: 76 and 77.
  • BLASTN and FASTA were searched for known nucleic acid sequences registered in the nucleic acid sequence database, and BLASTX, BLASTP, and FASTA were searched for amino acid sequences of known polypeptides registered in the amino acid sequence database.
  • BLASTX, BLASTP, and FASTA were searched for amino acid sequences of known polypeptides registered in the amino acid sequence database.
  • AGO51 there was no sequence corresponding to the polypeptide of the present invention, AGO51, and the nucleic acid sequence encoding the same. From this, it was found that the polypeptide of the present invention was a novel membrane protein.
  • the embodiment relating to the clone OUB068 of the present invention uses the same method as that of ON 056, except for the following points.
  • RNA was extracted from human osteosarcoma cell line U-2 ⁇ S (ATCC No. HTB-96) using TRIzol reagent, and po1y (A) ⁇ RNA was purified using mRNA Purification kit.
  • a plasmid specifically hybridizing with the biotinylated primer was recovered from the cDNA library according to the method of the GeneTrapper kit, and transformed into Escherichia coli DH10B. Further, colony hybridization was performed by a known method using OUBO68 SST cDNA labeled with 32p-d CTP as a probe using a Random Primer DNA Labeling kit, a positive clone was isolated, and the plasmid was isolated. Prepared. Thereafter, the entire nucleotide sequence was determined in the same manner as in ON 056 to obtain the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 81. Further, the open reading frame was determined and translated into amino acids to obtain the sequences shown in SEQ ID NOs: 79 and 80.
  • BLASTX, BLASTP, and FASTA were cloned from OUB068 (a region between amino acid sequences 5 to 386 of SEQ ID NO: 79) and Xenopus Unknown Transmembrane Protein (Xenoopus Unknown Transmembrane Protein).
  • Genepept Accession X92871 showed significant homology between the amino acid sequence (region between 3 and 407). Based on these homologies, clone OUB068 is expected to retain at least the same activity as Xenopus Unknown Transmembrane Protein.

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Description

明 細 書 そのポリべプチドをコードする c D N A、 およびそれらの用
技術分野
本発明は、 新規なポリペプチド、 その製造方法、 そのポリペプチドをコー ドする c D N A、 その c D N Aからなるベクター、 そのベクターで形質転換 された宿主細胞、 そのポリペプチドの抗体、 およびそのペプチドまたは抗体 を含有する薬学的組成物に関する。 背景技術
従来、 ある特定のポリペプチドまたはそれをコードする c D N Aを得よう とする場合、 組織や細胞培養液中に目的とする生物活性を確認し、 次いでポ リペプチドの単離精製を経て、 遺伝子をクロ一ニングするという方法、 ある いはその生物活性を指標として遺伝子を発現クローニングする方法が一般的 に用いられてきた。 しかし、 生体内生理活性ポリペプチドは、 多様な生物活 性を有している場合が多いので、 あるひとつの活性を指標にして遺伝子をク ローニングした結果、 それが既知のポリペプチドと同一であることが後にな つて判明するという事例が増えている。 また、 微量しか産生されなかったり、 特別な生理的条件でのみ発現する因子も多く、 そのことが単離、 精製および 生物活性の確認を困難なものとしている。
近年、 c D N Aの作製技術やシークェンス技術は急速に発展し、 大量の c D N Aのシークェンスを迅速に行うことができるようになった。 そこでこ れらの技術を利用して、 様々な細胞や組織から c D N Aライブラリーを作製 し、 ランダムに c D N Aをクローニングして塩基配列を決定し、 新規なポリ ペプチドをコードする遺伝子を単離する方法が発展している。 この方法は、 生化学的、 遺伝学的な解析を一切必要とせずに遺伝子をクローニングし、 その塩基配列の情報を得ることができるという特徴を有しているが、 目的と する遺伝子の発見は偶発的要素が大きい。
本発明者らは、 これまで造血系や免疫系で働く増殖分化因子の遺伝子のク ローニングを研究してきた。 そして、 増殖分化因子 （例えば、 各種サイ トカ イン等） のような分泌蛋白質やそのレセプ夕一のような膜蛋白質 （以下、 こ れらをまとめて分泌蛋白質等と呼ぶ。 ） の大部分がその N末端にシグナルべ プチドと呼ばれる配列を有していることに着目して、 シダナルぺプチドをコ ードする遺伝子を効率的かつ選択的にクローニングする方法を鋭意検討した。 その結果、 動物細胞を用いて、 シグナルペプチドの有無を簡単に検索できる 方法 （シグナルシークェンストラップ （S ST) 法） を見出した （特願平 6- 13951号参照） 。 さらに同じ概念のもとに、 酵母を用いてさらに大量かつ簡便 にシグナルペプチドをコードする遺伝子を単離する方法 （酵母 S ST法） も 開発された （米国特許 No. 5, 536, 637 参照） 。 発明の開示
本発明者らは、 治療、 診断、 あるいは研究上有益な新規な因子 （ポリぺプ チド） 、 特に分泌シグナルを有する分泌蛋白質および膜蛋白質に着目してそ れを見出すべく、 鋭意検討を行なった。
その結果、 多種多様な分泌蛋白質および膜蛋白質を産生していると予想さ れる細胞株および組織、 例えばヒト胎盤、 成人の脳組織および脳組織由来の 細胞株、 ヒト骨および骨髄由来の細胞株、 およびヒト臍帯静脈内皮細胞株が 産生している新規な分泌蛋白質あるいは膜蛋白質、 およびそれをコードする cDNAを見出すことに成功し、 本発明を完成した。
本発明が提供する c DN A配列は、 クローン ON 0 5 6, ON 0 34 , 〇X 003として同定され、 前記酵母 S ST法によりヒト胎盤組織から作製 した c DN Aライブラリーより単離された。 クローン ON 0 5 6 , ON 0 34， 〇X 0 0 3は分泌蛋白質 （ここではそれぞれ ON 0 5 6， ON 034， OX 003蛋白質として表される。 ） をコードする完全な c DNA 配列を含む全長鎖 c DN Aである。
核酸配列デ一夕ベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列デ一夕ベースに登録されている既知のポ リペプチドのアミノ酸配列に対して BLASTX、 BLAST?および FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリペプチド〇N 056， ON 034, OX 003および それをコードする核酸配列と一致する配列はなかった。 このことから、 本発 明のポリぺプチドは、 新規な分泌蛋白質であることが判明した。
本発明が提供する c DN A配列は、 クローン OA 052， OC 004, OM01 7, OM101, OM 126, OM 160, OMA 016 a, OM A 016 b, OMB 130, OMB 142, 〇 V B 100として同定され、 前記酵母 S S T法により成人の脳組織および脳組織由来の細胞株 （Τ 98 G， I MR- 32, および CCF— STTG 1) から作製した c D N Aライブラ リーより単離された。 クローン OA 052, OC 004, OM017, OM 101， OM 126, OM 160 , OMA016 a, OMA 016 b, OM B 130 , OMB 142， OVB 100は分泌蛋白質 （ここではそれぞれ OA 0 52 , OC 004, OM 0 1 7 , OM 1 0 1 , OM 1 26 , OM 160, OMA 016 a, OMA 0 16 , OMB 130, OMB 142, OVB 100蛋白質として表される。 ） をコードする完全な c DNA配列を 含む全長鎖 c DN Aである。
核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列データベースに登録されている既知のポ リぺプチドのアミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリペプチド OA 052, 〇C 004， OM01 7, OM 101， 〇M126， OM 160, OMA016 a, OMA 0 16 b, OM B 130, OMB 142, O V B 100およびそれをコードする核酸配列と 一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新規な 分泌蛋白質であることが判明した。
本発明が提供する cDN A配列は、 クロ一ン OAF 062， OAF 075, 〇AG 1 19として同定され、 前記酵母 S ST法によりヒト骨および骨髄由 来の細胞株 （HAS 303， LP 101から作製した c DNAライブラリー より単離された。 クローン OAF 062, OAF 075, OAG 1 19は分 泌蛋白質 （ここではそれぞれ OAF 062， OAF 075 , OAG 1 1 9蛋 白質として表される。 ） をコードする完全な c DNA配列を含む全長鎖 c DNAである。
核酸配列デー夕ベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列データベースに登録されている既知のポ リペプチドのァミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリペプチド OAF 062， OAF 075, 〇AG 1 19 およびそれをコードする核酸配列と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新規な分泌蛋白質であることが判明した。
本発明が提供する c DN A配列は、 クローン OAH 040, OAH058 として同定され、 前記酵母 S ST法によりヒト臍帯静脈内皮細胞株 （HUV -EC-C) から作製した c DNAライブラリーより単離された。 クローン OAH 040, OAH058は分泌蛋白質 （ここではそれぞれ O AH 040， OAH 058蛋白質として表される。 ） をコードする完全な c DNA配列を 含む全長鎖 c DN Aである。
核酸配列デ一夕ベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列デ一夕ベースに登録されている既知のポ リペプチドのアミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリペプチド OAH 040 , OAH 058およびそれを コードする核酸配列と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポ リぺプチドは、 新規な膜蛋白質であることが判明した。
本発明が提供する c DN A配列は、 クローン OM0 1 1 , OM 028 , OMB 092, OMB 108, 0 T 007として同定され、 前記酵母 S ST 法により成人の脳組織および脳組織由来の細胞株 （I MR— 32) から作製 した c DNAライブラリ一より単離された。 クローン OM0 1 1 , OM 028， OMB 092, OMB 108, OT 007は膜蛋白質 （ここではそ れぞれ OM0 1 1, OM028, OMB 092, OMB 1 08, OT 007 蛋白質として表される。 ） をコードする完全な c DNA配列を含む全長鎖 c DNAである。
核酸配列デ一夕ベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTMこより、 またアミノ酸配列データベースに登録されている既知のポ リペプチドのァミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリペプチド OM0 1 1， OM02 8， OMB 0 92, OMB 1 08, OT 007およびそれをコ一ドする核酸配列と一致する配列 はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新規な膜蛋白質であ ることが判明した。
本発明が提供する c DN A配列は、 クローン〇 AGO 5 1， OUB 068 として同定され、 前記酵母 S ST法によりヒト骨および骨髄由来の細胞株 (LP 1 0 1および U— 2 OS) から作製した c DNAライブラリーより単 離された。 クローン OAG 05 1， OUB 068は膜蛋白質 （ここではそれ ぞれ O AG 05 1， OUB 068蛋白質として表される。 ） をコードする完 全な c DNA配列を含む全長鎖 c DNAである。
核酸配列デー夕ベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列データベースに登録されている既知のポ リペプチドのアミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリペプチド OAG 05 1， OUB 068およびそれを コードする核酸配列と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポ リぺプチドは、 新規な膜蛋白質であることが判明した。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 配列番号 1、 4、 7、 1 0、 1 3、 1 6、 1 9、 22、 25、 28、 3 1、 34、 37、 40、 43、 46、 49、 5 2、 5 5、 5 8、 6 1、 64、 6 7、 70、 73、 76または 7 9で示されるアミノ酸配列からなる ポリペプチド、 (2) 前記 （1) に記載したポリペプチドをコードする cDNA、
(3) 配列番号 2、 5、 8、 1 1、 14、 17、 20、 23、 26、 29、 32、 35、 38、 41、 44、 47、 50、 53、 56、 59、 62、 6 5、 6 8、 7 1 74、 7 7または 80で示される塩基配列を有する c DNA、
(4) 配列番号 3、 6、 9、 12、 15、 18、 21、 24、 27、 30、 33、 36、 39、 42、 45、 48、 5 1、 54、 57、 60、 63、 66、 6 9、 7 2 7 5、 7 8または 8 1で示される塩基配列を有する c DNAに関する。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1による各調製画分および不溶性画分の尿素による可溶化 画分の電気泳動 （SDS— PAGE) 後のアクリルアミドゲルをイメージ アナライザー （FUJI BAS2000) を用いて検出した結果のプリン夕一打ち出し 図であり、 ON 056蛋白質が大腸菌内において発現していることが図中の 矢印部に示されている。 発明の詳細な説明
本発明は、 実質的に純粋な形である配列番号 1、 4、 7、 1 0、 1 3、 16、 1 9、 22、 25、 28、 3 1、 34、 37、 40、 43、 46、 49、 52、 55、 58、 61、 64、 67、 70、 73、 76または 79 で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、 またはそのホモローグ、 そ の配列のフラグメントおよびそのホモローグからなるポリペプチドに関する。 本発明はさらにそれらのポリペプチドをコードする c DNAに関する。 よ り具体的には、 配列番号 2、 5、 8、 11、 14、 17、 20、 23、 26、 29、 32、 35、 38、 41、 44、 47、 50、 53、 56、 59、 62、 65、 68、 7 1、 74、 77、 80、 3、 6、 9、 12、 1 5、 18、 2 1、 24、 27、 30、 33、 36、 39、 42、 45、 48、 51、 54、 57、 60、 63、 66、 69、 72、 75、 78または 81 で示される塩基配列を有する c DNA、 および配列番号 2、 5、 8、 1 1、 14、 1 7、 20、 23、 26、 29、 32、 35、 38、 41、 44、 47、 50、 53、 56、 59、 62、 65、 68、 7 1、 74、 77、 80、 3、 6、 9、 1 2、 1 5、 1 8、 2 1、 24、 27、 30、 33、 36、 39、 42、 45、 48、 5 1、 54、 57、 60、 63、 66、 69、 72、 75、 78または 81で示される塩基配列に選択的にハイブリ ダイズするフラグメントを有する c DNAに関する。 ハイブリダィズする cDNAには、 前記配列の相補配列も含まれる。
実質的に純粋な形である配列番号 1、 4、 7、 10、 13、 16、 1 9、 22、 25、 28、 3 1、 34、 37、 40、 43、 46、 49、 52、 55、 58、 6 1、 64、 67、 70、 73、 76または 79で示される アミノ酸配列を有するポリペプチドとは、 一般に、 生産時のポリペプチドの 90%以上、 例えば、 95、 98または 99%が配列番号 1、 4、 7、 10、 13、 1 6、 19、 22、 25、 28、 3 1、 34、 37、 40、 43、 46、 49、 52、 55、 58、 6 1、 64、 67、 70、 73、 76また は 79で示されるアミノ酸配列を有するポリぺプチドであることを意味する。 配列番号 1、 4、 7、 10、 13、 16、 19、 22、 25、 28、 31、 34、 37、 40、 43、 46、 49、 52、 55、 58、 6 1、 64、 67、 70、 73、 76または 79で示されるアミノ酸配列からなるポリべ プチドのホモローグとは、 一般に少なくとも 20個、 好ましくは少なくとも 30個、 例えば 40、 60または 100個の連続したアミノ酸領域で、 少な くとも 70 %、 好ましくは少なくとも 80または 90 %、 より好ましくは 95%以上相同性であるものであり、 そのようなホモローグは、 以後本発明 のポリペプチドとして記載される。
さらに、 配列番号 1、 4、 7、 10、 1 3、 16、 1 9、 22、 25、 28、 3 1、 34、 37、 40、 43、 46、 49、 52、 55、 58、 61、 64、 67、 70、 73、 76または 79で示されるアミノ酸配列か らなるポリペプチドのフラグメント、 またはそれらのホモローグのフラグメ ントとは、 少なくとも 10アミノ酸、 好ましくは少なくとも 15アミノ酸、 例えば 20、 25、 30、 40、 50または 60アミノ酸部分を意味する。 配列番号 2、 5、 8、 1 1、 14、 17、 20、 23、 26、 29、 32、 35、 38、 41、 44、 47、 50、 53、 56、 59、 62、 65、 68、 7 1、 74、 77、 80、 3、 6、 9、 1 2、 1 5、 18、 2 1、 24、 27、 30、 33、 36、 39、 42、 45、 48、 5 1、 54、 57、 60、 63、 66、 69、 72、 75、 78または 81で示される塩 基配列を有する c DN Aに選択的にハイプリダイズする c DNAとは、 一般 に、 少なくとも 20個、 好ましくは少なくとも 30個、 例えば 40、 60ま たは 100個の連続した塩基配列領域で、 少なくとも 70%、 好ましくは少 なくとも 80または 90%、 より好ましくは 95 %以上相同性であるもので あり、 そのような cDNAは、 以後本発明の c DNAとして記載される。 配列番号 2、 5、 8、 11、 14、 17、 20、 23、 26、 29、 32、 35、 38、 41、 44、 47、 50、 53、 56、 59、 62、 65、 68、 7 1、 74、 77、 80、 3、 6、 9、 1 2、 1 5、 18、 2 1、 24、 27、 30、 33、 36、 39、 42、 45、 48、 5 1、 54、 57、 60、 63、 66、 69、 72、 75、 78または 81で示される塩 基配列を有する cDNAのフラグメントとは、 少なくとも 10塩基、 好まし くは少なくとも 15塩基、 例えば 20、 25、 30または 40塩基部分を意 味し、 そのようなフラグメントも本発明の c DN Aに含まれる。
さらに、 本発明には、 本発明の c DNAからなる複製または発現べクタ一 が含まれる。 ベクターとしては、 例えば、 o r i領域と、 必要により前記 c DNAの発現のためのプロモー夕一、 プロモーターの制御因子などからな るプラスミド、 ウィルスまたはファージベクターが挙げられる。 ベクタ一は ひとつまたはそれ以上の選択的マ一カー遺伝子、 例えばアンピシリン耐性遺 伝子を含んでいてもよい。 ベクタ一は、 イン ' ビトロ （in vitro) において、 例えば c DNAに対応する RNAの製造、 宿主細胞の形質転換に用いること ができる。
さらに、 本発明には、 配列番号 2、 5、 8、 1 1、 14、 1 7、 20、 23、 26、 29、 32、 35、 38、 41、 44、 47、 50、 53、 56、 59、 62、 65、 68、 7 1、 74、 77、 80、 3、 6、 9、 1 2、 1 5、 1 8、 2 1、 24、 27、 30、 33、 36、 39、 42、 45、 48、 5 1、 54、 57、 60、 63、 66、 69、 72、 75、 78または 8 1で示される塩基配列、 またはそれらのオープンリーディング フレームを有する c DNAを含む本発明の c DNAを複製または発現させる ためのベクタ一で形質転換された宿主細胞も含まれる。 細胞としては、 例え ば細菌、 酵母、 昆虫細胞または哺乳動物細胞が挙げられる。
さらに、 本発明には、 本発明のポリペプチドを発現させるための条件下で、 本発明の宿主細胞を培養することからなる本発明のポリぺプチドの製造方法 も含まれる。 培養は、 本発明のポリペプチドが発現し、 宿主細胞より製造さ れる条件下で行なわれることが好ましい。
本発明の c DNAは、 前記のようなベクタ一のアンチセンス領域に挿入す ることでアンチセンス RN Aを製造することもできる。 このようなアンチセ ンス RN Aは、 細胞中の本発明のポリぺプチドのレベルを制御することに用 いることもできる。
本発明は、 本発明におけるポリぺプチドのモノク口一ナルまたはポリク口 —ナル抗体をも含む。 さらに本発明におけるポリペプチドのモノクローナル またはポリクローナル抗体の製造方法をも含む。 モノクローナル抗体は、 本 発明のペプチドまたは、 その断片を抗原として用い、 通常のハイプリドーマ の技術により製造することができる。 ポリクローナル抗体は、 宿主動物 （例 えば、 ラットやゥサギ等） に本発明のポリペプチドを接種し、 免疫血清を回 収する、 通常の方法により製造することができる。
本発明には、 本発明のポリペプチド、 その抗体と薬学的に許容される賦形 剤およびノまたは担体を含有する薬学的組成物も含まれる。
( 1) の本発明のポリペプチドとしては、 配列番号 1、 4、 7、 10、 13、 1 6、 19、 22、 25、 28、 3 1、 34、 37、 40、 43、 46、 49、 52、 55、 58、 61、 64、 67、 70、 73、 76また は 79で示されたアミノ酸配列を有するもの以外に、 その一部が欠損したも の （例えば、 配列番号 1中、 生物活性の発現に必須な部分だけからなるポリ ペプチド等） 、 その一部が他のアミノ酸と置換したもの （例えば、 物性の類 似したアミノ酸に置換したもの） 、 およびその一部に他のアミノ酸が付加ま たは挿入されたものも含まれる。
よく知られているように、 ひとつのアミノ酸をコードするコドンは 1〜6 種類 （例えば、 Me tは 1種類、 L e uは 6種類） 存在する。 従って、 ポリ ぺプチドのアミノ酸配列を変えることなく c DN Aの塩基配列を変えること ができる。
(2) で特定される本発明の c DN Aには、 （1) の配列番号 1、 4、 7、 10、 1 3、 16、 1 9、 22、 2 5、 28、 3 1、 34、 37、 40、 43、 46、 49、 52、 55、 58、 6 1、 64、 67、 70、 73、 7 6または 7 9で示されるポリペプチドをコードするすべての塩基配列群が 含まれる。 塩基配列を変えることによって、 ポリペプチドの生産性が向上す ることがある。
(3) で特定される cDNAは、 （2) で示される c DNAの一態様であ り、 天然型配列を表わす。
(4) に示される c DNAは、 （3) で特定される c D N Aに天然の非翻 訳部分を加えた配列を示す。
配列番号 3で示される塩基配列を有する c DNAの作製は、 以下の方法に 従って行われる。
はじめに酵母 S S T法 （米国特許 No.5, 536, 637に記載） の概要について説 明する。
サッカロマイセス 'セレヒシェ (Saccharomyces cerevisiae) などの酵母 がショ糖またはラフイノースをエネルギー源や炭素源として利用するために はィンベルターゼを培地中に分泌しなければならない （ィンベル夕一ゼはラ フィノースをショ糖とメリビオースに、 ショ糖をフルク 1 ^一スとグルコース に分解する酵素である。 ） 。 また数多くの既知の哺乳類のシグナルペプチド は酵母のィンベル夕一ゼを分泌させ得ることが知られている。 これらの知見 から、 酵母のインベルタ一ゼの分泌を可能にする新規のシグナルペプチドを 哺乳類の c DNAライブラリーからラフイノース培地上での酵母の生育を指 標にスクリーニングする方法として本方法は開発された。 翻訳開始点 ATG を除した非分泌型のインベル夕一ゼ遺伝子 S U C 2 (GENBANK accession No. V01311)を酵母の発現ベクター （発現用プロモーター （ADHプロモー ター） および夕一ミネ一ター （ADH夕一ミネ一夕一） は AAH5プラスミ ド （Gammerer, Methods in Enzyraol. χοχ, 192-201, 1983) 由来で、 酵母複製 起点は 2m o r i、 酵母選択マーカ一には TRP 1、 大腸菌複製起点は C o 1 E 1 o r i、 大腸菌 薬剤耐性マ一力一にはアンピシリンが使用されてい る。 ） に組み込んで酵母 S S T用べクタ一 p SUC 2を作製した。 その S UC 2遺伝子の上流に哺乳類の c DNAを組 み込んで、 酵母 S S T c DNAライブラリ一を調製した。 このライブラリ一を分泌型インベル夕一 ゼを欠損している酵母に形質転換した。 組み込まれた哺乳類 c DNAがシグ ナルぺプチドをコ一ドしている場合、 酵母で発現されたィンベルタ一ゼに対 しても分泌作用をもっと考えられ、 その結果ラフイノ一ス培地上での生育が 可能となる。 よって出現したコロニーから酵母を培養してプラスミドを調製 し、 インサート c DN Aの塩基配列を決定することによって、 新規なシグナ ルペプチドの検索を迅速かつ容易にした。
酵母 SST c DNAライブラリーの作製は、 - (1) 対象となる細胞より mRNAを単離し、 特定の制限酵素 （酵素 I) サ ィトを連結したランダムプライマーを用いて二本鎖 c DNAを合成し、
(2) 酵素 Iとは異なる特定の制限酵素 （酵素 II) サイトを含むアダプター を連結して、 酵素 Iで消化した後、 適当なサイズで分画し、
(3) 酵母発現べクタ一内のシグナルペプチドを削除したィンベルターゼ遺 伝子の上流に得られた c D N A断片を連結し、 形質転換する工程よりなる。 各工程を詳しく説明すると、 工程 （1) では、 対象となる哺乳類の臓器や 細胞株などより、 必要により適当な刺激剤で刺激した後、 公知の方法 （以下、 公知の方法は特に記載がなければ Molecular Cloning (Sambrook, J., Fr i tsch, E. F. および Maniat is, T. 著、 Cold Spring Harbor Laboratory Pressより 1989年に発刊） または Current Protocol in Molecular Biology (F.M. Ausubelら編、 〗ohn Wiley&Sons, Incより発刊） に記載の方法に従つ て行われる。 ） に従って mRN Aの単離が行われる。
対象となる細胞としては、 T 98 G (ヒトグリア芽細胞腫株： ATCC No. CRL-1690) 、 I MR— 32 (ヒト神経芽細胞腫株： ATCC No. CCL-127) 、 U - 2 OS (ヒト骨肉腫株： ATCC No. HTB-96) 、 CCF-STTG 1 (ヒトァ ストロ細胞 腫株： ATCC No. CRL-1718) 、 HAS 30 3 (ヒ卜骨髄ストロー マ細胞株：東京 医科大学第一内科外山圭助教授、 相沢信助手より供与。 J. Cell. Physiol. H8, 245-251, 1991および Experimental Hematol. 22, 482-487, 1994に記載） 、 LP 10 1 (ヒト骨髄ストローマ細胞株：東京医 科大学第一内科外山圭助教授、 相沢信助手より供与。 〗. Cell. Physiol. 148, 245-251, 1991および Experimental Hematol. 22, 482-487, 1994 に記載） ま たは HUV— EC— C (ヒ卜臍帯静脈血管内皮細胞： ATCC No. CRL-1730) が 挙げられる。 また組織としては、 ヒト胎盤およびヒト成人脳が挙げられる。 ランダムプライマ一を用いる二本鎖 c DN Aの合成は公知の方法により行わ れる。
アダプターに連結される制限酵素 （酵素 I) サイトと次の工程 （2) で用 いられる制限酵素 （酵素 II) サイトは、 互いに異なるものであれば何を用い てもよい。 好ましくは、 酵素 Iとして Xh o I、 酵素 IIとしては E c 0 R I が用いられる。
工程 （2) では T 4 DN Aポリメラーゼで末端を平滑化し、 酵素 Πァダプ 夕一を連結した後、 酵素 Iで消化し、 ァガロース電気泳動 （AGE) により 300〜800 b pの c DNAを分画する。 酵素 IIは、 前記したように酵素 Iと異なるものなら何でもよい。 工程 （3) は、 酵母発現用プラスミドベクターに連結されたシグナルぺプ チドを削除したインベル夕一ゼの遺伝子の上流に （2) で得られた c DNA 断片を組み込んで大腸菌に形質転換する工程である。 ここで酵母発現用ブラ スミドベクターとしては種々のものが知られているが、 例えば、 大腸菌内で も機能する YE p 24などが用いられるが、 好適には前述したプラスミド p SUC 2が用いられる。
形質転換のための宿主大腸菌株はすでに多くのものが知られており、 好ま しくは DH 1 0 Bのコンビテントセルである。 また形質転換方法は公知のい ずれを用いてもよいが、 好ましくはエレクトロポレーション法により行われ る。 形質転換体は常法により培養され、 酵母 S S T用の c DNAライブラ リーが得られる。
この c DNAライブラリ一は、 すべてのクローンが前記の c DNA断片を 含んでいるわけではないし、 またすべてが未知の （新規の） シグナルべプチ ドをコードする遺伝子断片とは限らない。 そこで、 次に前記ライブラリ一か ら未知のシグナルペプチドをコードする遺伝子断片をスクリーニングする必 要がある。
すなわち、 c DNAライブラリ一をィンベル夕ーゼ遺伝子をもたない酵母 Saccharomyces cerevisiae (例えば Y T 455株など） またはインベル夕一 ゼ遺伝子を人為的に欠損させた株 （公知の方法に従い作製可能） を用いるこ とができる。 酵母の形質転換は公知の方法、 例えば酢酸リチウム法によって 行われる。 形質転換体を選択培地で生育後、 ラフイノ一スを炭素源とする培 地に移し、 生育可能なコロニ一を選択し、 プラスミドを回収する。 ラフイノ —スを炭素源として酵母が生育したということは、 ライブラリ一中に何らか の分泌蛋白質のシグナルぺプチドが組み込まれていたことを示している。 次に、 単離した陽性クローンについて、 塩基配列を決定し、 未知の蛋白質 をコードすることが明らかになった c DNAについては、 それをプローブと して全長クローンを単離し、 全長の塩基配列を決定することができる。 これ らの操作は、 当業者にとってすベて公知の方法で行われる。 配列番号 2、 5、 8、 1 1、 14、 17、 20、 23、 26、 29、 32、 35、 38、 41、 44、 47、 50、 53、 56、 59、 62、 65、 68、 7 1、 74、 77、 80、 3、 6、 9、 12、 1 5、 1 8、 2 1、 24、 27、 30、 33、 36、 39、 42、 45、 48、 5 1、 54、 57、 60、 63、 66、 69、 72、 75、 78または 81で示される塩 基配列が、 一部、 好ましくは全てが確定されると哺乳類に存在する本発明の 蛋白質をコードする c DNAもしくは本発明蛋白質のホモローグおよびサブ セットをコ一ドする c DN Aを得ることができる。 適当な塩基配列を有する オリゴヌクレオチドを合成し、 それを用いて、 哺乳類由来の c DN Aライブ ラリーあるいは mRNAから P CR法により、 あるいは適当な塩基配列の断 片をプローブとしてハイブリダィズさせることにより、 他の哺乳類 c DNA ライブラリーあるいはそのゲノムライブラリ一から、 他の哺乳類型の本発明 蛋白質をコードする c DNAを得ることができる。
このようにして得られた c DNAが、 S STで得られた c DNA断片の塩 基配列 （またはその相同配列） を含んでいるならばシグナルペプチドをコー ドしていることになるので、 その cDNAが全長、 またはほぼ全長であるこ とは明らかである （シダナルぺプチドは例外なく蛋白質の N末端に存在する ことから、 cDNAのオープンリーディングフレームの 5 ' 末端にコードさ れている。 ） 。
さらに公知の方法に従い、 前記 c D NAをプローブとしてノザン (Northern)解析によつて全長の確認をしてもよい。 ハイプリダイズしたバン ドから得られる mRNAのサイズとその c DN Aのサイズを比較し、 ほぼ同 じであればその c DN Aはほぼ全長であると考えられる。
配列番号 2、 5、 8、 1 1、 14、 17、 20、 23、 26、 29、 32、 35、 38、 41、 44、 47、 50、 53、 56、 59、 62、 65、 68、 7 1、 74、 77、 80、 3、 6、 9、 12、 1 5、 1 8、 2 1、 24、 27、 30、 33、 36、 39、 42、 45、 48、 5 1、 54、 57、 60、 63、 66、 69、 72、 75、 78または 81で示される塩 基配列が一旦確定されると、 その後は、 化学合成によって、 あるいはこれら の塩基配列の断片を化学合成し、 これをプローブとしてハイブリダィズさせ ることにより、 本発明の c DNAを得ることができる。 さらに、 本 cDNA を含有するベクター cDN Aを適当な宿主に導入し、 これを増殖させること によって、 目的とする cDN Aを必要量得ることができる。
本発明のポリぺプチドを取得する方法としては、
(1) 生体または培養細胞から精製単離する方法、
(2) ペプチド合成する方法、 または
(3) 遺伝子組み換え技術を用いて生産する方法、
などが挙げられるが、 工業的には （3) に記載した方法が好ましい。
遺伝子組み換え技術を用いてポリペプチドを生産するための発現系 （宿主 一ベクター系） としては、 例えば、 細菌、 酵母、 昆虫細胞および哺乳動物細 胞の発現系が挙げられる。
例えば、 大腸菌で発現させる場合には、 成熟蛋白質部分をコードする cDNAの 5' 末端に開始コドン （ATG)を付加し、 得られた cDNAを、 適当なプロモータ一 （例えば、 t r pプロモーター、 l a cプロモーター、 λ PLプロモーター、 T 7プロモー夕一等） の下流に接続し、 大腸菌内で機 能するべクタ一 （例えば、 pBR322、 pUC 18、 pUC 19等） に挿 入して発現ベクターを作製する。
次に、 この発現ベクターで形質転換した大腸菌 （例えば、 E. Coli DH1、 E. Coli JM109、 E. Coli HB 101株等） を適当な培地で培養して、 その菌体より目的とするポリペプチドを得ることができる。 また、 パクテリ ァのシグナルペプチド （例えば、 p e 1 Bのシグナルペプチド） を利用すれ ば、 ペリブラズム中に目的とするポリペプチドを分泌することもできる。 さ らに、 他のポリペプチドとのフュージョン ·プロテイン （fusion protein) を生産することもできる。
また、 哺乳動物細胞で発現させる場合には、 例えば、 配列番号 3、 6、 9、 12、 1 5、 1 8、 2 1、 24、 27、 30、 33、 36、 39、 42、 45、 48、 5 1、 54、 57、 60、 63、 66、 69、 72、 75、 78または 81で示される塩基配列をコードする c DNAを適当なベクター (例えば、 レトロウイルスベクター、 パピローマウィルスベクター、 ヮクシ ニァウィルスベクター、 SV40系べクタ一等） 中の適当なプロモーター (例えば、 SV40プロモーター、 LTRプロモー夕一、 メタ口チォネイン プロモーター等） の下流に挿入して発現ベクターを作製する。 次に、 得られ た発現ベクターで適当な哺乳動物細胞 （例えば、 サル COS _ 7細胞、 チヤ ィニーズハムスター CHO細胞、 マウス L細胞等） を形質転換し、 形質転換 体を適当な培地で培養することによって、 本発明の蛋白質が分泌蛋白質の場 合と膜蛋白質の場合で、 次のように発現される。
本発明の蛋白質が分泌蛋白質の場合、 その細胞上清中に目的とするポリべ プチドが発現される。 さらに、 その他のポリペプチド、 例えば抗体の定常領 域 (Fc portion) をコードする c DNA断片と連結することによって、 フユ一 ジョン，プロテイン （fusion protein) を生産することもできる。
一方、 本発明の蛋白質が膜蛋白質の場合、 その細胞膜上に目的とするボリ ペプチドが発現される。 また配列番号 3、 6、 9、 12、 15、 18、 21、 24、 27、 30、 33、 36、 39、 42、 45、 48、 5 1、 54、 57、 60、 63、 66、 69、 72、 75、 78または 81で示される塩 基配列をコードする c DNAの膜貫通領域を欠いた欠失体を前記べクタ一に 挿入し、 これを用いて適当な哺乳類動物細胞を形質転換することによって、 その培養液中に目的とする可溶性ポリペプチドが分泌される。 さらにその膜 貫通領域を欠いた欠失体をコードする c DN A断片とその他のポリぺプチド、 例えば抗体の定常領域 (Fc portion) をコードする c D N A断片を連結するこ とによって、 フユ一ジョン ' プロテイン （fusion protein) を生産すること もできる。
以上のようにして得られたポリペプチドは、 一般的な生化学的方法によつ て単離精製することができる。 産業上の利用可能性
本発明のポリペプチドおよびそれをコードする c DN Aは、 一つあるいは それ以上の効果あるいは生物活性 （以下に列挙するアツセィに関連するもの を含む。 ） を示すことが考えられる。 本発明の蛋白質に関して記述される効 果あるいは生物活性は、 その蛋白質の投与あるいは使用により、 あるいは、 その蛋白質をコードする cDN Aの投与あるいは使用 （例えば、 遺伝子療法 や cDNA導入に適したベクター） により、 提供される。
[サイトカイン活性および細胞増殖 Z分化活性]
本発明の蛋白質は、 サイ ト力イン活性および細胞増殖 （誘導あるいは阻 害） Z分化活性 （誘導あるいは阻害） を示す可能性、 あるいはある細胞集団 に他のサイ トカインの産生を誘導あるいは抑制すると考えられる。 全ての既 知のサイト力インを含む、 現在発見されている多くの蛋白性因子は、 因子に 依存した一つあるいはそれ以上の細胞増殖アツセィ法で、 活性を示してきた ので、 それらのアツセィは、 サイト力イン活性の便利な確認法として機能す る。 本発明の蛋白質の活性は、 多くの従来の因子依存性の細胞株の細胞増殖 アツセィのうちのいずれかによつて証明され得る。
[免疫刺激ノ抑制活性]
本発明の蛋白質は、 免疫刺激活性および免疫抑制活性を示すと考えられる。 また、 ある蛋白質は、 例えば、 Tリンパ球および Bリンパ球あるいはどちら か一方の成長および増殖を制御 （刺激あるいは抑制） することや、 同様に N K細胞や他の集団の細胞傷害性活性に影響を与えることによって、 様々な免 疫不全および疾患 (severe combined immunodeficiency (S C I D) を含 む） の治療に効果を示すと考えられる。 これらの免疫不全は遺伝性である場 合もあるし、 例えば、 H I Vのようなウィルスや、 同様に細菌やカビの感染 が原因で起こる場合もある。 あるいは、 自己免疫疾患から由来する可能性も ある。 より特殊な場合に、 H I V、 肝炎ウィルス （hepatitis viruses), へ リレぺスゥイリレス (herpes viruses) 、 マイコノヾクテリア (mycobacteria) 、 リ一シュマニア （ leishmania) 、 マラリア （malaria) およびカンジダ (Cand ida) のような様々なカビ感染を含むウィルス、 細菌、 カビあるいは他 の感染による感染症の原因を、 本発明の蛋白質を用いることによって治療で きると考えられる。 もちろん、 この関連より、 本発明の蛋白質は、 免疫シス テムが増大していることが一般的に示唆される場所、 すなわち癌治療の箇所 において効果を示すと考えられる。
本発明の蛋白質は、 アレルギー反応および喘息や他の呼吸器系疾患のよう な状況の治療に効果にも効果を示すと考えられる。 免疫抑制が望まれるよう な、 例えば、 喘息や関連呼吸器疾患を含む他の状態にも、 本発明の蛋白質を 用いて治療できると考えられる。
本発明の蛋白質は、 例えば、 敗血病性のショックあるいは全身性炎症反応 症候群 （S I R S ) のような感染、 炎症性大腸炎、 クローン病に関連する、 あるいは、 I L _ 1 1により効果が証明された T N Fや I L一 1のようなサ ィ卜カインの過剰産生から由来する慢性あるいは急性の炎症を抑制する可能 性もある。
[造血細胞制御活性]
本発明の蛋白質は、 造血細胞の制御に、 またそれに応じて骨髄球様細胞あ るいはリンパ球様細胞の欠乏に対する治療にも効果を示すと考えられる。 コ ロニー形成細胞あるいは因子依存性細胞株の援助の下での極く弱い生物活性 でさえも、 造血細胞の制御に係わることを示唆する。 その生物活性とは、 次 に挙げる全てあるいはそのいずれかで例えられるようなものに係わるもので ある。 赤血球前駆細胞のみの成長および増殖を支持、 あるいは他のサイトカ インとの組み合わせ、 また、 それが示唆する有効性、 例えば様々な貧血の治 療、 あるいは赤血球前駆細胞および赤血球あるいはそのどちらかの産生を刺 激する放射線療法/化学療法と組み合わせての使用；顆粒球および単球 Zマ クロファ一ジのような骨髄球の成長および増殖を支持 （すなわち、 古典的な C S F活性） 、 化学療法に伴う骨髄抑制を防ぐための化学療法との併用；巨 核球の成長および増殖およびそれに続く血小板の成長および増殖の支持、 そ れによって血小板減少症のような様々な血小板障害を防御および治療を可能 とする血小板輸血の際あるいは相補的な一般的使用；前記造血細胞の幾つか あるいは全ての細胞へ成熟可能な造血幹細胞の成長および増殖の支持、 従つ て、 様々な幹細胞障害 （限定はされないが、 再生不良性貧血および発作性夜 間血色素尿症を含む、 移植で一般的に治療されるようなもの） に治療的効果 を見い出せる、 また、 正常細胞あるいは遺伝子療法のため遺伝的に操作され た細胞をイン · ビトロ （in vi t ro) あるいはェキソ · ビポ （ex vivo) (すな わち、 骨髄移植に伴う） どちらかで、 放射線療法ノ化学 療法後の幹細胞分画 の再構築を行うことも同様である。
本発明の蛋白質は、 他の方法の中で、 以下の方法により測定することが可 能である。
[組織生成 Z修復活性]
本発明の蛋白質は、 損傷治癒および組織修復、 また、 火傷、 切開、 および 潰瘍の治療と同様に、 骨、 軟骨、 腱、 靭帯、 および神経組織成長あるいは再 生のいずれかに使用されると考えられる。
骨を正常に形成しない環境での軟骨および骨あるいはいずれかの成長を誘 導するような本発明の蛋白質は、 ヒトおよび他の動物の骨折および軟骨損傷 あるいは欠損の治癒に適用される。 また、 本発明の蛋白質を使用する製剤は、 開放骨折と同様に閉鎖骨折の整復、 また人工関節の固定の改良や、 予防的使 用にも有効であると考えられる。 骨形成剤により誘導された新生骨形成は、 先天性、 外傷性、 癌切除術により誘発した頭蓋顔面の欠損の修復に貢献する。 また、 美容形成外科分野にも有効である。
本発明の蛋白質は、 歯根膜症の治療および他の歯の修復にも使用されると 考えられる。 そのような薬品は、 骨形成細胞を引き寄せ、 その細胞の増殖を 刺激し、 その前駆細胞の分化を誘導する環境を提供すると考えられる。 本発 明の蛋白質は、 骨および軟骨あるいはいずれかの修復を刺激することを通し て、 あるいは炎症あるいは炎症過程で介される組織破壊 （コラゲナーゼ活性 や破骨細胞の活性） の過程を阻止することにより、 骨粗鬆症および骨関節炎 の治療に有効であると考えられる。 本発明の蛋白質に起因すると考えられる組織再生活性の別のカテゴリ一は 腱 靭帯形成である。 本発明の蛋白質は、 腱/靭帯様組織あるいは他の組織 が正常に形成されない環境でそのような組織形成を誘導するものであるが、 ヒトおよび他の動物における腱/靭帯の裂傷、 奇形、 および他の腱 靭帯の 障害の治癒に適用できる。 腱 靭帯様組織を誘導する蛋白質を使用する製剤 は、 骨あるいは他の組織への腱/靭帯の固定の改良、 および腱 Z靭帯組織の 欠損の修復での使用はもちろん、 腱あるいは靭帯の損傷の防御に対する予防 的使用も考えられる。 本発明の構成物により誘導された新生腱 靭帯様組織 形成は、 先天性、 外傷、 あるいは他の起源の腱あるいは靭帯欠損の修復に貢 献する。 また、 腱あるいは靭帯の貼付あるいは修復という美容形成外科でも 有効である。 本発明の構成物は、 腱 靭帯形成細胞を引き寄せ、 その細胞の 増殖を刺激し、 その前駆細胞の分化を誘導する環境を提供すると考えられる。 あるいは、 組織修復を果たすためイン · ビポ （in v ivo) への返還に備えてェ キソ · ビポ （ex v ivo) で腱/靭帯細胞あるいはその前駆細胞を誘導する。 本 発明の構成物は、 腱炎、 手根トンネル症候群 （Carpal tunne l syndrome) 、 および他の腱あるいは靭帯欠損の治療にも有効である。 本発明の構成物には、 適当なマトリックスおよびキャリアーと同様に当業者に良く知られている錯 化 (Seques ter ing) 剤も含まれる。
本発明の蛋白質は、 神経細胞の増殖、 および、 神経および脳組織の再生、 すなわち、 神経細胞あるいは神経組織の変性、 死、 あるいは外傷を含む機械 的および外傷的障害と同様に中枢および末梢神経系疾患および神経病の治療 に対しても効果を示すと考えられる。 より特異的には、 ある蛋白質は、 末梢 神経障害、 末梢神経症、 および局所的神経症のような末梢神経系の疾患、 お よびアルツハイマー病、 パーキンソン病、 ハンチントン病、 筋萎縮性側策症 (amyo t rophic l ateral) , およびシャイ一ドレ一ガー （Shy- Drager) 症候群 のような中枢神経系の疾患の治療に有効であると考えられる。 更に本発明に 応じて治療され得る条件には、 脊髄障害、 頭部外傷、 および脳卒中等の脳血 管疾患のような機械的および外傷的障害を含む。 化学療法あるいは他の治療 力 起因する末梢神経症も本発明の蛋白質を用いて治療可能である。
本発明の蛋白質は、 例えば、 塍臓、 肝臓、 腸、 腎臓、 皮膚、 内皮を含む臓 器、 平滑、 骨格あるいは心臓筋肉、 および血管内皮を含む血管組織のような 他の組織を生成する活性、 あるいはそのような組織を構成する細胞の増殖を 促進する活性を示す可能性も期待される。 望まれる効果の一部は、 正常組織 を再生させる繊維性瘢痕 （scarr ing) の阻害によっても担われると考えられ る。
本発明の蛋白質は、 消化管保護あるいは再生、 および肺あるいは肝臓の繊 維化、 様々な組織の再還流損傷、 および全身性サイト力イン障害に起因する 状態に対する治療にも有効であると考えられる。
[ァクチビン Zインヒビン活性]
本発明の蛋白質は、 ァクチビン/インヒビンに関連した活性を示すと考え られる。 ァクチビンは濾胞刺激ホルモン （F S H) の放出を刺激する活性に よって特徵づけられるが、 インヒビンは、 濾胞刺激ホルモン （F S H) の放 出を阻害する活性によって特徴づけられる。 よって、 本発明の蛋白質は、 単 独あるいはインヒビン aフアミリーのメンバーとのヘテロダイマーで、 哺乳 類動物の雌の受精率を減少させ、 雄の精子形成を減少させるインヒビンの活 性に基づく避妊調節剤として有効であると考えられる。 充分量の他のインヒ ビンの投与によって、 哺乳動物の不妊を誘導可能である。 一方、 本発明の蛋 白質は、 インヒビン bグループの他の蛋白質サブユニットとのホモダイマ一 あるいはヘテロダイマーで、 前脳下垂体の細胞から F S Hの放出を刺激する ァクチビン分子の活性に基づいた治療的な不妊誘導として有効であると考え られる （米国特許 4, 798， 885を参照） 。 本発明の 蛋白質は、 牛、 羊、 および 豚のような家畜の生涯出産能力可能な期間を延ばすために、 性的に未熟な哺 乳類動物における妊娠開始を早めることに有効であると考えられる。
[走化性/化学運動性活性]
本発明の蛋白質は、 例えば、 単球、 好中球、 T細胞、 マスト細胞、 好酸球、 および内皮細胞、 あるいはそのいずれかを含む、 哺乳動物の細胞に対して、 例えばケモカインとして働く走化性 z化学運動性活性を有すると考えられる。 走化性 Z化学運動性蛋白質は、 反応の望まれる部位へ、 望まれる細胞集団を 固定化あるいは引き寄せるため使用されることが可能である。 走化性 Z化学 運動性蛋白質は、 局所的な感染と同様に、 創傷および他の外傷の治療に特別 な優位性を提供する。 例えば、 リンパ球、 単球、 あるいは好中球を腫瘍ある いは感染部位へ引き寄せることは、 腫瘍あるいは感染部位に対する免疫応答 を改善する結果となると考えられる。
蛋白質やペプチドは、 もしそれが直接あるいは間接的に特殊な細胞集団に 対して指示された方向あるいは運動を刺激可能であれば、 そのような細胞集 団に対する走化性活性を保持している。 望ましくは、 その蛋白質やペプチド は、 細胞の指示された運動を直接的に刺激する活性を保持する。 特別な蛋白 質がある集団の細胞に対し走化性活性を保持するか否かは、 どんな既知の細 胞走化性のアツセィ法にそのような蛋白質あるいはペプチドを使用しても容 易に決定できる。
[凝血および血栓活性]
本発明の蛋白質は、 凝血あるいは血栓活性も示すと考えられる。 結果とし て、 そのような蛋白質は、 様々な凝固障害 （血友病のような遺伝性障害を含 む。 ） の治療に有効であると期待される。 あるいは、 外傷、 手術または他の 原因により生じた創傷の治療における凝固および他の凝血事象を促進させる ことが期待される。 本発明の蛋白質は、 血栓の形成の溶解あるいは阻害 （血 栓あるいは卒中等） 、 およびそれより生じる状態の治療および予防にも効果 があると考えられる。
[受容体 Zリガンド活性]
本発明の蛋白質は、 受容体、 受容体 リガンドあるいは受容体 リガンド のインヒビ夕一あるいはァゴニストとしての活性を示す可能性もある。 その ような受容体およびリガンドの例として、 サイトカイン受容体およびそのリ ガンド、 受容体キナーゼおよびそのリガンド、 受容体フォスファタ一ゼおよ びそのリガンド、 細胞間相互作用に関連した受容体 （Sel ec t in, Integur in, およびそのリガンド 、 受容体キナーゼ等の細胞接着分子を含む。 ） およびそ のリガンド、 および抗原提示、 抗原認識、 および細胞性および液性免疫反応 の発達に係わる受容体 Zリガンドの組み合わせが挙げられるが、 これらに制 限されるものではない。 受容体およびリガンドは、 その相互作用に対する可 能なぺプチドあるいは小分子のインヒビ夕一のスクリーニングにも有効であ る。 本発明の蛋白質は、 それ自身受容体 リガンド （受容体およびリガンド の断片を含むが、 制限されるものではない。 ） の相互作用のインヒビ夕一と して有効であると考えられる。
[その他の活性]
本発明の蛋白質は、 以下に示す付加的な活性あるいは効果の一つあるいは それ以上を示すと考えられる ：細菌、 ウィルス、 カビ、 および他の寄生虫を 含む感染性の物質を殺傷する；身長、 体重、 髪の色、 目の色、 肌あるいは他 の組織の色素沈着、 あるいは器官の大きさ （例えば、 胸部増量あるいは減 量） 等の身体的特徴を抑制あるいは促進する効果を及ぼす；食餌脂肪、 蛋白 質、 あるいは炭水化物の分解に効果を及ぼす；食欲、 性欲、 ストレス、 認識 (認識障害） 、 鬱病、 暴力行動を含む行動特徴に効果を及ぼす；鎮痛効果あ るいは他の痛みを減少させる効果を及ぼす；胚性幹細胞の造血系以外の他の 系統への分化および増殖を促進する ；および、 酵素の場合、 その酵素の欠失 を補う、 また関連疾患を治療する。
前記活性を有する蛋白質は、 例えば、 B細胞、 T細胞、 肥満細胞の増殖ま たは細胞死、 免疫グロブリンのクラススイツチ促進によるクラス特異的誘導、 B細胞の抗体産生細胞への分化、 顆粒球前駆細胞の増殖または分化、 細胞死、 単球 ·マクロファージ前駆細胞の増殖または分化、 細胞死、 好中球、 単球， マクロファージ、 好酸球、 好塩基球の増殖または機能亢進、 細胞死、 巨核球 前駆細胞の増殖または細胞死、 好中球前駆細胞の増殖または分化、 細胞死、 Bまたは T前駆細胞の増殖または分化、 細胞死、 赤血球の産生促進、 赤血球、 好中球、 好酸球、 好塩基球、 単球 ·マクロファージ、 肥満細胞、 巨核球前駆 細胞の増殖支持、 好中球、 単球 ·マクロファージ、 B細胞または T細胞の遊 走促進、 胸腺細胞の増殖または細胞死、 脂肪細胞の分化抑制、 ナチュラルキ ラー細胞の増殖または細胞死、 造血幹細胞の増殖または細胞死、 幹細胞およ び各種造血前駆細胞の増殖抑制、 間葉系幹細胞からの骨芽細胞、 軟骨細胞へ の分化促進または増殖、 細胞死、 あるいは破骨細胞の活性化や単球から破骨 細胞への分化促進による骨吸収の促進の作用を本発明のポリペプチドのみで、 またリガンドーレセプ夕一間の結合を介して、 あるいは他の分子と相乗的に 働くことにより有すると考えられる。
また本発明のペプチドは神経系にも作用することが予測されるので、 各種 神経伝達物質作動性神経細胞への分化ならびにそれらの生存維持または細胞 死、 グリア細胞の増殖促進または細胞死、 神経突起の伸展、 神経節細胞の生 存維持または細胞死、 ァストロサイトの増殖または分化促進または細胞死、 末梢神経の増殖または生存維持、 細胞死、 シュワン細胞の増殖または細胞死、 運動神経の増殖または生存維持、 細胞死の作用もあると考えられる。
さらに、 本発明のポリペプチドは初期胚の発生過程において、 外胚葉誘導 作用による表皮、 脳、 背骨、 神経の器官形成、 中胚葉誘導作用による背索結 合組織 （骨、 筋肉、 腱） 、 血球細胞、 心臓、 腎臓、 生殖巣の器官形成、 ある いは内胚葉誘導作用による消化器系臓器 （胃、 腸、 肝臓、 塍臓） 、 呼吸器系
(肺、 気管） の形成に促進的または抑制的に作用すると考えられるとともに、 生体においても前記器官の増殖あるいは増殖抑制作用を有すると考えられる。 したがって、 本発明のポリペプチドはそれ自身で、 免疫系または神経系も しくは骨代謝の機能の低下または亢進に関する疾患、 または造血系細胞の発 育不全または異常増殖、 例えば、 炎症性疾患 （リウマチ、 潰瘍性大腸炎等） 、 骨髄移植後の造血幹細胞の減少症、 ガン、 白血病に対する放射線照射または 化学療法剤投与後の白血球、 血小板、 B細胞または T細胞の減少症、 貧血、 感染症、 ガン、 白血病、 A I D S、 骨代謝異常 （骨粗鬆症等） 、 各種変性疾 患 （アルツハイマー病、 多発性硬化症等） 、 あるいは神経損傷の予防または 治療薬として用いることが期待される。
また本発明のポリペプチドは、 外胚葉、 中胚葉または内胚葉由来器官の分 化または増殖作用を有すると考えられるので、 各器官 （表皮、 骨、 筋肉、 腱、 心臓、 腎臓、 胃、 腸、 肝臓、 滕臓、 肺、 気管等） の組織修復剤として用いる ことも期待される。
また、 本発明のポリペプチドのポリクロ一ナル抗体またはモノクローナル 抗体を用いて、 生体における本発明のポリペプチドの定量が行なえ、 これに よつて本ポリぺプチドと疾患との関係の研究あるいは疾患の診断等に利用す ることができる。 ポリクロ一ナル抗体およびモノクローナル抗体は本発明の ポリペプチドあるいはその断片を抗原として用いて常法により作製すること ができる。
また本発明のポリペプチド （好ましくは、 その細胞外ドメインのポリぺプ チド） を用いることにより、 例えばァフィ二ティーカラムを作製して、 本発 明のポリペプチドと結合する既知または未知の蛋白質 （リガンド） の同定、 精製あるいはその遺伝子クロ一ニングを行うことができる。
また本発明のポリペプチド （好ましくは、 その膜貫通領域または細胞内ド メインのポリペプチド） を用いて、 例えばウェスト—ウエスタン法により、 または前記 c D N A (好ましくは、 本発明ポリペプチドの膜貫通領域または 細胞内ドメインをコードする c D N A) を用いて、 例えば酵母 2—ハイブ リッド法により本発明のポリペプチドと細胞質内で相互作用する下流のシグ ナル伝達分子の同定、 遺伝子クロ一ニングを行うこともできる。
さらに本発明のポリペプチドを用いることによって、 本発明のポリべプチ ドレセプ夕一ァゴニスト、 アンタゴニストおよび受容体一シグナル伝達分子 間の阻害剤等のスクリーニングを行うこともできる。
本発明の c D N Aは、 多大な有用性が期待される本発明のポリペプチドを 生産する際の重要かつ必須の铸型となるだけでなく、 遺伝病の診断や治療 (遺伝子欠損症の治療またはアンチセンス D N A ( R N A) によって、 ポリ ペプチドの発現を停止させることによる治療等） に利用できる。 また、 本発 明の c D N Aをプローブとしてジエノミック （genomic) D NAを分離できる。 同様にして、 本発明 c D N Aと相同性の高いヒトの関連ポリペプチドの遺伝 子、 またマウス以外の生物における本発明ポリペプチドと相同性の高いポリ ぺプチドの遺伝子を分離することも可能である。
[医薬品への適用]
前記の疾患に適応するために、 本発明のポリペプチド、 あるいは本発明の ポリペプチドに対する抗体は通常、 全身的又は局所的に、 一般的には経口ま たは非経口の形で投与される。 好ましくは、 経口投与、 静脈内投与および脳 室内投与である。
投与量は、 年齢、 体重、 症状、 治療効果、 投与方法、 処理時間等により異 なるが、 通常、 成人一人あたり、 一回につき、 1 0 0 8から 1 0 0 111 8の 範囲で、 一日一回から数回経口投与されるか、 または成人一人あたり、 一回 にっき、 1 0 gから 1 0 O m gの範囲で、 一日一回から数回非経口投与さ れる。
もちろん前記したように、 投与量は、 種々の条件により変動するので、 前 記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、 また範囲を越えて必要な場合 fcある。
本発明化合物を投与する際には、 経口投与のための固体組成物、 液体組成 物およびその他の組成物、 非経口投与のための注射剤、 外用剤、 坐剤等とし て用いられる。
経口投与のための固体組成物には、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 散剤、 顆粒 剤等が含まれる。 カプセルには、 ソフトカプセルおよびハードカプセルが含 まれる。
このような固体組成物においては、 一つまたはそれ以上の活性物質が、 少 なくとも一つの不活性な希釈剤 （例えば、 ラクト一ス、 マンニトール、 ダル コース、 ヒドロキシプロピルセルロース、 微結晶セルロース、 デンプン、 ポ リビニルピロリドン、 メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等） と混合される。 組成物は、 常法に従って、 不活性な希釈剤以外の添加物、 例えば、 潤滑剤 (ステアリン酸マグネシウム等） 、 崩壊剤 （繊維素グリコール酸カルシウム 等） 、 安定化剤 （ヒト血清アルブミン、 ラクトース等） 、 溶解補助剤 （アル ギニン、 ァスパラギン酸等） を含有していてもよい。
錠剤または丸剤は、 必要により白糖、 ゼラチン、 ヒドロキシプロピルセル ロース、 ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレ一ト等の胃溶性あるい は腸溶性のフィルムで被膜してもよいし、 また 2以上の層で被膜してもよい。 さらにゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも包含される。
経口投与のための液体組成物は、 薬学的に許容される乳濁剤、 溶液剤、 懸 濁剤、 シロップ剤、 エリキシル剤等を含み、 一般に用いられる不活性な希釈 剤 （例えば、 精製水、 エタノール等） を含んでいてもよい。 この様な組成物 は、 不活性な希釈剤以外に湿潤剤、 懸濁剤のような補助剤、 甘味剤、 風味剤、 芳香剤、 防腐剤を含有していてもよい。
経口投与のためのその他の組成物としては、 ひとつまたはそれ以上の活性 物質を含み、 それ自体公知の方法により処方されるスプレー剤が含まれる。 この組成物は不活性な希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリゥムのような安定剤と 等張性を与えるような安定化剤、 塩化ナトリウム、 クェン酸ナトリウムある いはクェン酸のような等張剤を含有していてもよい。 スプレー剤の製造方法 は、 例えば米国特許第 2, 868, 691号および同第 3, 095, 355号明細書に詳しく記 載されている。
本発明による非経口投与のための注射剤としては、 無菌の水性または非水 性の溶液剤、 懸濁剤、 乳濁剤を包含する。 水性または非水性の溶液剤、 懸濁 剤としては、 一つまたはそれ以上の活性物質が、 少なくとも一つの不活性な 希釈剤と混合される。 水性の希釈剤としては、 例えば注射用蒸留水および生 理食塩水が挙げられる。 非水性の希釈剤としては、 例えばプロピレングリコ ール、 ポリエチレングリコール、 オリ一ブ油のような植物油、 エタノールの ようなアルコール類、 ポリソルべ一ト 8 0 (登録商標） 等が挙げられる。 このような組成物は、 さらに防腐剤、 湿潤剤、 乳化剤、 分散剤、 安定化剤 (例えば、 ヒト血清アルブミン、 ラクトース等） 、 溶解補助剤 （例えば、 ァ ルギニン、 ァスパラギン酸等） のような補助剤を含んでいてもよい。 発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、 これら は本発明の範囲を制限するものではない。 実施例 1 ：クローン ON 056
(1) o 1 y (A) +RNAの調製
ヒト胎盤組織より TR I z o 1試薬 （TRIzol reagent) (登録商標、 GIBC0 BRL社より販売） を用いて全 RNAを抽出し、 mRNAピユリフィケ一シヨン キット （mRNA Purification K ） （商品名、 Pharmacia社より販売） を用いて po l y (A) +RNAを精製した。
(2)酵母 S ST c DNAライブラリ一の調製
前記の p o l y (A) +RN Aを铸型に Xh o I部位を連結したランダム 9
NNNNNNNN- 3 ' (配列番号 82 ) をプライマーとして、 スーパ一 ' スクリプト ·プラスミドシステム （Super Script Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning) (商品名、 GIBCO BRL社より販売) を用いて 2本鎖 c DNAの合成を行なった。 Ec oR Iアダプター （GIBCO BRL社より 販売） を DNAライゲーシヨンキット 2 (DNA ligation kit ver.2) (商品名 宝酒造 （株） より販売。 以後 c DNAの連結はすべて本キットを使用し た。 ） を用いて連結した後、 Xh o lで消化し、 ァガロース電気泳動で 300〜800 b pの c DNAを切り出して分画し、 pSUC2 (米国特許 5536637号参照） の E c o R I /N o t I部位に連結し、 大腸菌 DH 10 B株 にエレクトロポレーシヨン法で形質転換して酵母 S S T用の c DNAライブ ラリーを得た。
(3) S STによるスクリーニングおよび S ST陽性クローンの塩基配列の決定 この c DNAライブラリ一のプラスミ ドを調製し、 酢酸リチウム法 (Current Protocols In Molecular Biology 13.7.1を参照） により酵母 YT Kl 2株を形質転換し、 トリブトファン （T r p) を含まない酵母形質転換 体の選択培地 （CMD— T r p培地） のプレート上にまき、 30でで48時 間インキュベートした後、 ァクトラン · レプリカ · プレー夕一 （Accutran Replica Plater) (商品名、 Schleicher&Schuel 土より販売) を用いて得られ たコロニー （形質転換体） のレプリカ をラフイノースを炭素源とする YPR プレートにとり、 30 で 14日間インキュベートした。 3日目以降、 出現 してきた各々のコロニーを一つずつ再度 YP Rプレートにストリークして 30 で 48時間インキュベートした後、 シングルコロニーを YPD培地に 植菌し、 30でで 48時間インキュベートした後、 プラスミドを調製した。 続いて p SUC 2のクローニングサイ卜の両端の配列の 2種類のプライマ一 (センス鎖はピオチン化プライマ一） を用いて公知の方法に従って P CRを 行ない、 インサート c DN Aを増幅した後、 ダイナビーズ （Dynabeads) (商 品名、 DYNAL社より販売） を用いてピオチン化 1本鎖 cDNAを精製し、 塩基 配列の決定を行なった。 塩基配列の決定は DNAシ一ケンシングキット （DNA Sequencing kit) (Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction；商品 名、 A卯 lied Biosystems Inc. より販売） を用いた蛍光ダイ夕一ミネ一夕一 サイクルシークェンス法で反応を行ない、 自動 DNAシークェンサ一 373 (Applied Biosystems Inc. ) で読み取りを行なった （以下、 塩基配列決定は すべて本方法で行なった。 ） 。
得られた塩基配列および推定されるアミノ酸配列についてデータベースと の相同性検索を行ない、 データベースに登録されていない新規な c DN Aで あることが明らかとなったクローンについて、 全長 c DN Aのクロ一ニング を試みた。 また推定されるァミノ酸配列を既知のシグナルぺプチドと比較す ることにより各 c D N Aが機能的かつ構造的にもシグナルべプチドを有する ことを確認した。
(4)全長 c DNAのクロ一ニングおよび塩基配列の決定
全長 c DN Aのクロ一ニングはジーントラッパ一 · c DNAポジティブ · セレクションシステム （GENETRAPPER cDNA Positive Selection System) (GIBCO BRL社より販売） を用いて行なった。 まず Super Script Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloningを用いてヒト胎盤組織の p o l y (A) +RNAよりプラスミド p S PORT 1 (GIBCO BRL社より販 売） をベクターとして dT— primed c DN Aライブラリ一を作製した。 つぎ に S STで得られた塩基配列の情報に基づいて 27me rのピオチン化ブラ イマ一 ON 056— F 1 ： 5 ' biot in- A A C AT G A AT C T T T C G C TCGTC CTGGCT— 3， （配列番号 83 ) を作製した後、 ジーントラ ッパー （GeneTrapper) キットの方法にしたがってピオチン化プライマ一 と 特異的にハイブリダィズするプラスミドを前記の c DNAライブラリ一から 回収し、 大腸菌 DH 1 0 Bに形質転換した。 さらにランダムプライマ一 DNAラベリングキット （Random Primer DNA Labeling kit) (商品名、 宝酒 造（株） より販売） を用いて32 P- d CTPでラベルした ON 056 S ST c DNAをプローブとして、 公知の方法によりコロニーハイブリダイゼ一シ ヨンを行ない、 陽性クローンを単離して、 プラスミ ドを調製した。 初めに 5 ' 側の塩基配列を決定して〇N 056 S ST cDNAの塩基配列が存在 することを確認した後、 全塩基配列を決定し、 配列番号 3に示す配列を得た。 さらにオープンリーディングフレームを決定し、 アミノ酸に翻訳して配列番 号 1および 2に示す配列を得た。
核酸配列デ一夕ベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列データベースに登録されている既知のポ リペプチドのアミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリペプチド〇N 056およびそれをコードする核酸配列 と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新規 な分泌蛋白質であることが判明した。
しかし、 BLASTX、 BLASTPおよび FASTAは、 クローン ON 056 (配列番号 1 のアミノ酸配列 1〜 3 3 4間の領域） とヒ ト ' カテブシン L (Human Cathepsin L(SwissProt Accession P07711)のアミノ酸配列 1〜 334間の領 域） の間に、 またクロ一ン QN 0 56 (配列番号 1のアミノ酸配列 2 2〜 3 3 4間の領域） とヒト ' カテブシン K (Human Cathepsin K(SwissProt Accession P43235)のアミノ酸配列 19〜329間の領域） の間に有為な相同 性があることを示した。 これらの相同性に基づいて、 クローン ON 0566 は、 少なくともカテブシン L (Cathepsin L) フアミ リーと同様な活性を保 持すると期待される。
(5)大腸菌を用いた蛋白質発現
得られた全長 c D N Aよりシグナルペプチドをコードする部分を除去した コーディング領域の c DN Aを PC Rにより増幅し、 大腸菌用発現ベクター p ET (Novagen社より販売） の翻訳開始点 AT Gの下流にフレームを合わせ て連結し、 発現用プラスミドを構築した。 得られたプラスミドを大腸菌 BL 21 (DE 3) に形質転換し、 培養を行ない I PTGを添加して蛋白質発現 を誘導した。 得られた大腸菌を集菌後、 超音波破碎または界面活性剤により 溶菌し、 不溶性画分は尿素により可溶化して SDS— PAGEを行ない、 ク マシ一染色にて ON 056蛋白質の発現を確認した （図 1中矢印部分） 。
(6)哺乳動物細胞を用いた蛋白質発現
得られた全長 c DN Aを哺乳動物細胞用発現ベクター p ED 6 (Kaufman et.al., Nucleic Acids Res. 19, 4485 - 4490 (1991)参照） の Xh o l (また は E c oR I) /No t I部位に連結し、 分泌蛋白質または膜蛋白質の発現 用プラスミドを構築した。 得られたプラスミドをリポフエクチン （商品名、 GIBCO BRL社より販売） を用いて Co s 7細胞に導入し、 24時間後に Me t および Cy sフリーの培地に交換した後、 35s—Me tおよび35 S— Cy sを 添加して 5時間培養を行なった。 細胞上清を回収後、 セントリコン— 1 0
(商品名、 Amicon社より販売） にて約 1 0倍に濃縮し、 SDS— PAGEを 行なった。 アクリルアミドゲルを乾燥させた後、 35sでラベルされた蛋白質の 発現を BAS2000 (富士フィルム社より販売） を用いて検出した。 実施例 2 ：クローン ON 034
本発明のクローン ON 034に関する実施例は、 ON 056と同様な手法 を用いたが、 以下の点のみ異なる。 (1) o 1 y (A) +RNAの調製
ヒ ト胎盤組織より TRIzol reagentを用いて全 RNAを抽出し、 mRNA Purification Kitを用いて p o 1 y (A) TRNAを精製した。
(2)全長 c DNAのクロ一ニングおよび塩基配列の決定
全長 c D N Aのクローニングは GENETRAPPER cDNA Positive Selection Systemを用いて行なった。 まず Super Script Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloningを用いてヒト胎盤組織の p o 1 y (A) + RNAよりプラスミ ド p S P ORTlをベクターとして d T - primed c DNAライブラリ一を作製した。 つぎに S STで得られた塩基配列の情報 に基づいて 2 8 m e rのピオチン化プライマ一〇 N 0 34— F 1 ： 5 ' biotin-TGAAGCCCATCACTACATCGC CATTACG- 3 ' (配列番号： 84) を作製した後、 GeneTrapperキットの方法にしたがつ てピオチン化プライマーと特異的にハイブリダィズするプラスミドを前記の c DNAライブラリーから回収し、 大腸菌 DH 10 Bに形質転換した。 さら に Random Primer DNA Labeling kitを用いて 32p-d C T Pでラベルした ON 034 S ST c DNAをプロ一ブとして、 公知の方法によりコロニーハイ ブリダィゼーシヨンを行ない、 陽性クローンを単離して、 プラスミドを調製 した。 以下〇N 056と同様に全塩基配列を決定し、 配列番号 6に示す配列 を得た。 さらにオープンリーディングフレームを決定し、 アミノ酸に翻訳し て配列番号 4および 5に示す配列を得た。
核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列デ一夕ベースに登録されている既知のポ リペプチドのァミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリペプチド ON 034およびそれをコードする核酸配列 と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新規 な分泌蛋白質であることが判明した。 実施例 3 ： クローン OX 003
本発明のクローン〇X 003に関する実施例は、 ON 056と同様な手法 を用いたが、 以下の点のみ異なる。
(1) p o 1 y (A) TRNAの調製
ヒト胎盤組織より TRIzol reagentを用いて全 R N Aを抽出し、 mRNA Purification Kitを用いて po 1 y (A) +RNAを精製した。
(2)全長 c DNAのクローニングおよび塩基配列の決定
全長 c DN Aのクロ一ニングはマラソン c DN Aアンプリフィケ一シヨン キット （Marathon cDNA Amplification Kit) (商品名、 Clontech社より販売） による 3' RACE (Rapid Amplification of cDNA End) 法を用いて行なつ た。 2本鎖 c DNAの調製には、 各クローンの由来、 すなわちヒト胎盤組織 の po l y (A) +RNAより作製した。 S S Tで得られた塩基配列の情報に 基づいて推定翻訳開始点 AT G領域を含む 27 me rのプライマー OX 00 一 3' (配列番号 85) を作製して、 前記キットに添付されたアダプタープ ライマ一とで P CRを行なった。 また、 1回の P CRで c DNAが十分に増 幅されなかったので、 OX 003— F 1プライマーの 3 ' 側にさらに 23 me rのプライマ一 OX 003— F 2 ： 5 ' 一 TCACCAAGGCTAA CATGGTGGCC- 3 ' (配列番号 86) を作製してネステッド P C R (nested P CR) を行なった。 クローン〇X 003に特異的に増幅された c DNAをァガ口一ス電気泳動で分画後、 pT 7ブル一 2 · Τベクター （ρΤ7 Blue-2 T-Vector) (商品名、 Novagen社より販売） に連結し、 大腸菌 DH5 a に形質転換してブラ スミドを調製した。 初めに 5' 側の塩基配列を決定して OX 003 S ST c DN Aの塩基配列が存在することを確認した後、 全塩 基配列を決定し、 配列番号 9に示す配列を得た。 さらにオープンリーデイン グフレームを決定し、 アミノ酸に翻訳して配列番号 7および 8に示す配列を 得た。
核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列データベースに登録されている既知のポ リペプチドのアミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリペプチド OX 003およびそれをコードする核酸配列 と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新規 な分泌蛋白質であることが判明した。 実施例 4 ：クロ一ン OA052
本発明のクローン〇A052に関する実施例は、 ON 056と同様な手法 を用いたが、 以下の点のみ異なる。
(1) o 1 y (A) +RNAの調製
ヒトグリア芽腫細胞株 T 98 G (ATCC No. CRL-1690) より TRIzol reagent を用いて全 RNAを抽出し、 mRNA Purification kitを用いて p o 1 y (A) T
RNAを精製した。
(2)全長 c DN Aのクローニングおよび塩基配列の決定
全長 c D N Aのクローニングは Marathon cDNA Amplification kitによる 3 ' RACE法を用いて、 OX 003と同様の方法で行なった。 前記キット の方法に従って 各クローン由来、 すなわち T 98 G細胞株の p o 1 y (A) +
RNAよりアダプタ一を連結した 2本鎖 c DNAの調製した。 S STで得ら れた塩基配列の情報に基づいて推定翻訳開始点 AT G領域を含む 27me r のプライマー OA 052 -F 1 ： 5 ' -ATGCCTAGAAGAGGAC TGATTCTTCAC- 3 ' (配列番号 87 ) を作製して、 前記キットに 添付されたアダプタープライマーとで P CRを行なった。 クロ一ン OA 05 2に特異的に増幅された c DNAを〇X 003と同様な手法でリクローニン グし、 全塩基配列を決定し、 配列番号 12に示す配列を得た。 さらにオーブ ンリーディングフレームを決定し、 アミノ酸に翻訳して配列番号 10および 11に示す配列を得た。
核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列デー夕べ一スに登録されている既知のポ リペプチドのァミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリペプチド OA 052およびそれをコードする核酸配列 と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新規 な分泌蛋白質であることが判明した。 実施例 5 ：—クローン〇C 004
本発明のクローン〇C 004に関する実施例は、 ON 056と同様な手法 を用いたが、 以下の点のみ異なる。
(1) p o 1 y (A) +RNAの調製
ヒト成人脳組織より TRIzol reagentを用いて全 RN Aを抽出し、 mRNA Purification kitを用いて po 1 y (A) +RNAを精製した。
(2)全長 cDN Aのクローニングおよび塩基配列の決定
全長 c DNAのクロ一ニングは Marathon cDNA Amplification kitによる 3 ' RACE法を用いて、 OX 003と同様の方法で行なった。 2本鎖 c DNAの調製には、 各クローンの由来、 すなわちヒト成人脳組織の p o 1 y (A) +RNAより作製した。 S S Tで得られた塩基配列の情報に基 づいて推定翻訳開始点 AT G領域を含む 27me rのプライマー OC 004 - F 1 ： 5 ' -ATGAGGAAAGGGAACCTTCTGCTGAGC 一 3' (配列番号 88) を作製して、 前記キットに添付されたアダプタープ ライマーとで PCRを行なった。 また、 1回の P CRで c DNAが十分に増 幅されなかったので、 OC 004— F 1プライマーの 3 ' 側にさらに 1 8 me rのプライマー〇C 004— F 2 ： 5' — TGAGCTTCCAGAG CTGTC- 3 ' (配列番号 89) を作製して nested PCRを行なった。 ク ローン〇C 004に特異的に増幅された c DNAを、 〇X 003と同様な手 法でリクローニングし、 全塩基配列を決定し、 配列番号 15に示す配列を得 た。 さらにオープンリーディングフレームを決定し、 アミノ酸に翻訳して配 列番号 13および 14に示す配列を得た。
核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列デ一夕ベースに登録されている既知のポ リペプチドのアミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリペプチド OC 004およびそれをコードする核酸配列 と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新規 な分泌蛋白質であることが判明した。 実施例 6 ： クローン〇M017
本発明のクローン OM0 17に関する実施例は、 ON 056と同様な手法 を用いたが、 以下の点のみ異なる。
(1) p o 1 y (A) +RNAの調製
ヒ ト成人脳組織より TRIzol reagentを用いて全 RN Aを抽出し、 mRNA Purification kitを用いて po 1 y (A) +RNAを精製した。
(2)全長 c DNAのクローニングおよび塩基配列の決定
全長 c DN Aのクロ一ニングは Marathon cDNA Amplification kitによる 3 ' RACE法を用いて、 〇X 003と同様の方法で行なった。 2本鎖 c DNAの調製には 、 各クローンの由来、 すなわちヒト成人脳組織の p o l y (A) +RNAより作製した。 S S Tで得られた塩基配列の情報に基 づいて推定翻訳開始点 AT G領域を含む 27 me rのプライマー OM017 - 3 ' (配列番号 90) を作製して、 前記キットに添付されたアダプタープ ライマーとで P CRを行なった。 また、 1回の P CRで c DNAが十分に増 幅されなかったので、 OM0 1 7— F 3プライマーの 3 ' 側にさらに 27 1116 1"のプラィマ一01^01 7—? 1 ： 5 ' — ATGAAACATTTCT GT AAC CTGCTTTGT— 3 ' (配列番号 9 1 ) を作製して nested PCRを行なった。 クロ 一ン〇M017に特異的に増幅された c DNAを、 OX 003と同様な手法でリクローニングし、 全塩基配列を決定し、 配列番 号 18に示す配列を得た。 さらにオープンリーディングフレームを決定し、 アミノ酸に翻訳して配列番号 16および 17に示す配列を得た。 核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列デ一夕ベースに登録されている既知のポ リペプチドのァミノ酸配列に対して BLASTX, BLASTPおよび FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリペプチド OM0 1 7およびそれをコードする核酸配列 と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新規 な分泌蛋白質であることが判明した。
しかし、 BLASTX、 BLASTPおよび FASTAは、 クローン OM0 1 7 (配列番号 1 6のアミノ酸配列 433〜 709、 42〜 225、 1 70〜 399、 1〜2
24間の領域） とヒト ' DXS 6673 E (Human DXS6673E (Candidate gene for Mental Retardation) (PRF Code 2218282A(Genbank Accession X95808)) のアミノ酸配列 1 083〜 1 358、 758〜 932、 850〜 108 1、 739〜965間の領域） の間にそれぞれ有為な相同性があることを示した。 これらの相同性に基づいて、 クローン OM 0 1 7は、 少なくとも Human DXS6673Eに関連した活性を保持すると期待される。 実施例 7 ： クローン OM 101
本発明のクローン OM1 0 1に関する実施例は、 ON 056と同様な手法 を用いたが、 以下の点のみ異なる。
(1) p o 1 y (A) +RNAの調製
ヒト成人脳組織より TRIzol reagentを用いて全 RN Aを抽出し、 mRNA Purification kitを用いて po 1 y (A) +RNAを精製した。
(2)全長 c DN Aのクローニングおよび塩基配列の決定
全長 c D N Aのクロ一ニングは Marathon cDNA Amplification kitによる
3 ' RAC E法を用いて、 〇X 0 0 3と同様の方法で行なった。 2本鎖 c DNAの調製には、 各クローンの由来、 すなわちヒト成人脳組織の p o l y (A) +RNAをより作製した。 S S Tで得られた塩基配列の情報に 基づいて推定翻訳開始点 AT G領域を含む 27 me rのプライマー〇M1 0 1 - F 3 ： 5 ' - C- 3 ' (配列番号 92) を作製して、 前記キットに添付されたアダプター プライマーとで P CRを行なった。 また、 1回の P CRで c DNAが十分に 増幅されなかったので、 OM 1 0 1— F 3プライマーの 3 ' 側にさらに 27 me rのプライマ一〇M 1 0 1— F 1 ： 5 ' -ATGAGGACTTACC ATTATATAC C ATTA— 3 ' (配列番号 9 3 ) を作製して nested P CRを行なった。 クローン〇M 1 0 1に特異的に増幅された c DNAを、 〇X 003と同様な手法でリクローニングし、 全塩基配列を決定し、 配列番 号 2 1に示す配列を得た。 さらにオープンリーディングフレームを決定し、 アミノ酸に翻訳して配列番号 19および 20に示す配列を得た。
核酸配列デ一夕ベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列データベースに登録されている既知のポ リぺプチドのアミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリペプチド OM 1 0 1およびそれをコードする核酸配列 と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新規 な分泌蛋白質であることが判明した。
しかし、 BLASTX、 BLASTPおよび FASTAは、 クローン OM10 1 (配列番号 1 9のァミノ酸配列 1〜 7 7間の領域） がヒト · カドヘリン— 6 (Human Cadherin-6(SwissProt Accession P55285)のアミノ酸配列：！〜 7 7間の領 域） およびヒ ト · 脳カ ドヘ リ ン （Human Brain-Cadherin(SwissProt Accession P55289)のアミノ酸配列 1〜78間の領域） をはじめとする多数の 力ドヘリンファミリーに有為な相同性があることを示した。 これらの相同性 に基づいて、 クローン OM1 0 1は、 少なくとも Human Cadherin- 6その他の カドヘリンフアミリーに関連した活性を保持すると期待される。 実施例 8 ：クローン〇M 126
本発明のクローン〇M 1 26に関する実施例は、 ON 056と同様な手法 を用いたが、 以下の点のみ異なる。
(1) p o 1 y (A) +RNAの調製 ヒト成人脳組織より TRIzol reagentを用いて全 RN Aを抽出し、 mRNA Purification kitを用いて p o 1 y (A) +RNAを精製した。
(2)全長 c DN Aのクローニングおよび塩基配列の決定
2本鎖 c DN Aの調製には、 各クローンの由来、 すなわちヒト成人脳組織 の p o l y (A) +RNAをより作製した。 S S Tで得られた塩基配列の情報 に基づいて 推定翻訳開始点 AT G領域を含む 27 me rのプライマ一 OM1
TG- 3 ' (配列番号 94) を作製して、 前記キットに添付されたアダプタ 一プライマーとで P CRを行なった。 クローン OM1 26に特異的に増幅さ れた c DNAを、 OX 003と同様な手法でリクローニングし、 全塩基配列 を決定し、 配列番号 24に示す配列を得た。 さらにオープンリーディングフ レームを決定し、 アミノ酸に翻訳して配列番号 22および 23に示す配列を 得た。
核酸配列デー夕ベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列デ一夕ベースに登録されている既知のポ リぺプチドのアミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリペプチド OM1 26およびそれをコードする核酸配列 と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新規 な分泌蛋白質であることが判明した。
しかし、 BLASTX、 BLASTPおよび FASTAは、 クローン OM126 (配列番号 2 2のアミノ酸配列 25〜1 1 5間の領域） がィムノグロブリンドメインに有 為な相同性があることを示した。 これらの相同性に基づいて、—クローン OM 126は、 少なくともある種のィムノグロプリンスーパ一ファミリーに関連 した活性を保持すると期待される。 実施例 9 ：クロ一ン〇M 160
本発明のクローン〇M 1 60に関する実施例は、 ON056と同様な手法 を用いたが、 以下の点のみ異なる。 (1) p o 1 y (A) +RNAの調製
ヒト成人脳組織より TRIzol reagentを用いて全 RN Aを抽出し、 mRNA Purification kitを用いて p o 1 y (A) +RNAを精製した。
(2)全長 c DNAのクローニングおよび塩基配列の決定
全長 c DN Aのクローニングは GENETRAPPER cDNA Positive Selection Systemを用いて行なった。 まず Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloningを用いてヒト成人脳組織の p o 1 y (A) +
RNAよりプラスミ ド p S P ORT lをベクターとして d T - primed c DNAライブラリーを作製した。 つぎに S S Tで得られた塩基配列の情報 に基づいて 2 7 me rのピオチン化プライマ一 O M 1 6 0 - F 1 ： 5 '
(配列番号 9 5) を作製した後、 Gene Trapperのキッ卜の方法にしたがって ピオチン化プライマーと特異的にハイプリダイズするプラスミ ドを前記の c DNAライブラリ一から回収し、 大腸菌 DH 1 0 Bに形質転換した。 さら に Random Primer DNA Labeling ki tを用いて 32 p-d C T Pでラベルした OM 1 60 S ST c DNAをプローブとして、 公知の方法によりコロニーハイ ブリダィゼ一シヨンを行ない、 陽性クローンを単離して、 プラスミドを調製 した。 以下〇N 056と同様に全塩基配列を決定し、 配列番号 27に示す配 列を得た。 さらにオープンリーディングフレームを決定し、 アミノ酸に翻訳 して配列番号 2 5および 2 6に示す配列を得た。
核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列デー夕ベースに登録されている既知の ポリぺプチドのァミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検索 した結果、 本発明のポリペプチド OM1 60およびそれをコードする核酸配 列と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新 規な分泌蛋白質であることが判明した。
しかし、 BLASTX、 BLASTPおよび FASTAは、 クローン OM160 (配列番号 2 5のアミノ酸配列 1 53〜395間の領域） とキイ口ショウジヨウバエ ·神 経原性分泌シグナルプロテイ ン ( Drosophila neurogenic secreted signaling protein(Genepept Accession U41449)のァミ ノ酸配列 8 0〜 317間の領域） の間に有為な相同性があることを示した。 これらの相同性 に基づいて、 クローン OM 1 60は、 少なくとも Drosophila neurogenic secreted signaling proteinと同様な活性を保持すると期待される。 実施例 10 ：クローン OMA016
本発明のクローン OMA016に関する実施例は、 OA052と同様な手 法を用いたが、 以下の点のみ異なる。
(1) o 1 y (A) +RNAの調製
ヒト成人脳組織より TRIzol reagentを用いて全 R N Aを抽出し、 mRNA Purification kitを用いて po l y (A) TRNAを精製した。
(2)全長 c DN Aのクローニングおよび塩基配列の決定
全長 c D N Aのクローニングは Marathon cDNA Amplification kitによる 3 ' RACE法を用いて、 〇X 003と同様の方法で行なった。 2本鎖 c DNAの調製には 、 各クローンの由来、 すなわちヒト成人脳組織の o l y (A) +RNAより作製した。 S S Tで得られた塩基配列の情報に基 づいて推定翻訳開始点 ATG領域を含む 2 7 m e rのプライマー OMA TGG- 3' (配列番号 96) を作製して、 前記キットに添付されたァダプ 夕一プライマーとで PCRを行なった。 クローン OMA016に特異的に増 幅された c DNAは 2種類存在したため OMAO 16 a, OMA016 bと 命名し、 OX003と同様な手法でリクローニングし、 全塩基配列を決定し、 それぞれ配列番号 30および 33に示す配列を得た。 さらにオープンリーデ イングフレームを決定し、 アミノ酸に翻訳して配列番号 28、 3 1および 29、 32に示す配列を得た。
核酸配列デ一夕ベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列データベースに登録されている既知のポ リペプチドのァミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリペプチド OMA0 1 6 a, bおよびそれをコードする 核酸配列と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチド は、 新規な分泌蛋白質であることが判明した。 実施例 1 1 ： クロ一ン OMB 130
本発明のクローン〇MB 1 30に関する実施例は、 ON 056と同様な手 法を用いたが、 以下の点のみ異なる。
(1) p o 1 y (A) +RNAの調製
ヒ ト成人脳組織より TRIzol reagentを用いて全 R N Aを抽出し、 mRNA Purification kitを用いて p o 1 y (A) TRNAを精製した。
(2)全長 c DNAのクローニングおよび塩基配列の決定
2本鎖 c DNAの調製には、 各クローンの由来、 すなわちヒト成人脳組織 の p o l y (A) +RNAより作製した。 S S Tで得られた塩基配列の情報に 基づいて推定翻訳開始点 AT G領域を含む 2 7 me rのプライマー OMB
TCC- 3 ' (配列番号 97) を作製して、 前記キットに添付されたァダプ 夕一プライマ一とで P CRを行なった。 クローン OMB 1 30に特異的に増 幅された cDNAを、 OX 003と同様な手法でリクロー ニングし、 全塩基 配列を決定し、 配列番号 36に示す配列を得た。 さらにオープンリーデイン グフレームを決定し、 アミノ酸に翻訳して配列番号 34および 35に示す配 列を得た。
核酸配列デー夕ベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列データベースに登録されている既知のポ リペプチドのアミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリペプチド OMB 1 30およびそれをコードする核酸配 列と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新 規な分泌蛋白質であることが判明した。 しかし、 BLASTX、 BLASTPおよび FASTAは、 クローン QMB 130 (配列番号 34のアミノ酸配列 10〜177間の領域） とサル A型肝炎ウィルスレセプ 夕一 （Monkey Hepatitis A virus receptor (PRF Code 2220266A(Genbank Accession X98252))のアミノ酸配列 6〜 173間の領域） の間に有為な相同 性があることを示した。 これらの相同性に基づいて、 クローン OMB 130 は、 少なくとも Monkey Hepatitis A virus receptorに関連した活性を保持す ると期待される。 実施例 12 ：クローン〇MB 142
本発明のクローン〇MB 142に関する実施例は、 ON 056と同様な手 法を用いたが、 以下の点のみ異なる。
(1) o 1 y (A) +RNAの調製
ヒト成人脳組織より TRIzol reagentを用いて全 R N Aを抽出し、 mRNA Purification kitを用いて p o 1 y (A) TRNAを精製した。
(2)全長 c DN Aのクローニングおよび塩基配列の決定
全長。 DNAのクローニングは Marathon cDNA Amplification kitによる 3 ' RACE法を用いて、 OX 003と同様の方法で行なった。 2本鎖 c DNAの調製には 、 各クローンの由来、 すなわちヒト成人脳組織の po l y (A) +RNAより作製した。 S S Tで得られた塩基配列の情報に基 づいて推定翻訳開始点 AT G領域を含む 2 7 m e rのプライマー OMB
GAT— 3' (配列番号 98) を作製して、 前記キットに添付されたァダプ 夕一プライマ一とで P CRを行なった。 また、 1回の P CRで c DNAが十 分に増幅されなかったので、 〇MB 142— F 2プライマ一の 3 ' 側にさら に 28me rのプライマー OMB 142 - F 1 ： 5 ' — GGAGATGGT ACGGATCTTAAGGACTGTG— 3 ' (配列番号 99 ) を作製し て nested PCRを行なった。 クローン OMB 142に特異的に増幅された cDNAを、 〇X 003と同様な手法でリクローニングし、 全塩基配列を決 定し、 配列番号 39に示す配列を得た。 さらにオープンリーディングフレー ムを決定し、 アミノ酸に翻訳して配列番号 37および 38に示す配列を得た。 核酸配列デー夕ベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列データベースに登録されている既知のポ リペプチドのアミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリペプチド OMB 142およびそれをコードする核酸配 列と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新 規な分泌蛋白質であることが判明した。 実施例 13 ： クローン OTB 033
本発明のクローン OTB 033に関する実施例は、 ON 056と同様な手 法を用いたが、 以下の点のみ異なる。
(1) P o 1 y (A) +RNAの調製
ヒト神経芽腫細胞株 I MR— 32 (ATCC No. CCL-127) より TRIzol reagent を用いて全 RNAを抽出し、 mRNA Purification kitを用いて p o 1 y (A) +
RNAを精製した。
(2)全長 c DNAのクロ一ニングおよび塩基配列の決定
全長 c D N Aのクロ一ニングは Marathon cDNA Amplification kitによる 3 ' RACE法を用いて、 〇X 003と同様の方法で行なった。 2本鎖 c DNAの調製には、 各クローンの由来、 すなわち IMR— 32の p o l y (A) +RNAをより作製した。 S STで得られた塩基配列の情報に基づいて 推定翻訳開始点 AT G領域を含む 27me rのプライマ一 OTB 033 -
3' (配列番号 100) を作製して、 前記キットに添付されたアダプタープ ライマーとで PCRを行なった。 また、 1回の P CRで c DNAが十分に増 幅されなかったので、 OTB 033 _F 1プライマーの 3 ' 側にさらに 19 me rのプライマ一OTB 003 -F 2 ： 5 ' — CCATGTACACAG TGGGGGC— 3， （配列番号 101 ) を作製して nested P C Rを行 な つた。 クローン OTB 033に特異的に増幅された c DNAを、 OX003 と同様な手法でリクローニングし、 全塩基配列を決定し、 配列番号 42に示 す配列を得た。 さらにオープンリーディングフレームを決定し、 アミノ酸に 翻訳して配列番号 40および 41に示す配列を得た。
核酸配列デ一夕ベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列デ一夕ベースに登録されている既知のポ リぺプチドのアミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリペプチド〇TB 033およびそれをコードする核酸配 列と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新 規な分泌蛋白質であることが判明した。 実施例 14 ： クローン OVB 100
本発明のクローン OVB 100に関する実施例は、 ON 056と同様な手 法を用いたが、 以下の点のみ異なる。
(1) p o 1 y (A) +RNAの調製
ヒト · ァスト口腫細胞株 C C F— S TTG 1 (ATCC No. CRL-1718) より TRIzol reagentを用いて全 RNAを抽出し、 mRNA Purification kitを用いて po l y (A) +RNAを精製した。
(2)全長 c DNAのクローニングおよび塩基配列の決定
全長 c DN Aのクローニングは Marathon cDNA Amplification kitによる 3 ' RACE法を用いて、 〇X 003と同様の方法で行なった。 2本鎖 cDNAの調製には 、 各クローンの由来、 すなわち CCF— STTG 1の po l y (A) +RNAより作製した。 S S Tで得られた塩基配列の情報に基 づいて推定翻訳開始点 AT G領域を 含む 27me rのプライマ一 OVB
CAC- 3 ' (配列番号 102) を作製して、 前記キットに添付されたァダ プ夕一プライマ一とで P CRを行なった。 クローン OVB 100に特異的に 増幅された cDNAを、 〇X 003と同様な手法でリクローニングし、 全塩 基配列を決定し、 配列番号 45に示す配列を得た。 さらにオープンリ一ディ ングフレームを決定し、 アミノ酸に翻訳して配列番号 43および 44に示す 配列を得た。
核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列データベースに登録されている既知のポ リペプチドのァミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび F ASTAにより検索し た結果、 本発明のポリペプチド OVB 100およびそれをコードする核酸配 列と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新 規な分泌蛋白質であることが判明した。 実施例 15 ：クローン OAF 062
本発明のクローン OAF 062に関する実施例は、 ON 056と同様な手 法を用いたが、 以下の点のみ異なる。
(1) o 1 y (A) +RNAの調製
ヒト骨髄ストローマ細胞株 H A S 303 (東京医科大学第一内科外山圭助 教授、 相沢信助手より供与。 ） より TRIzol reagentを用いて全 RNAを抽出 し、 mRNA Purification kitを用いて po 1 y (A) +RNAを精製した。
(2)全長 c DNAのクローニングおよび塩基配列の決定
全長 c D N Aのクロ一ニングは Marathon cDNA Amplification kitによる 3 ' RACE法を用いて、 〇X 003と同様の方法で行なった。 2本鎖 c DNAの調製には、 各クローンの由来、 すなわち HAS 303の p o 1 y
(A) +RNAより作製した。 S STで得られた塩基配列の情報に基づいて推 定翻訳開始点 AT G領域を含む 27me rのプライマ一 OAF 06 2—
3' (配列番号 103) を作製して、 前記キットに添付されたアダプタープ ライマーとで P CRを行なった。 また、 1回の P CRで c DNAが十分に増 幅されなかったので、 OAF 062—F 2プライマ一の 3， 側にさらに 27 me rのプライマー OAF 062— F 3 : 5 ' -TAGAGGAC AGAA ATGCAGTTCATGAAC— 3 ' (配列番号 1 04) を作製して nested PCRを行なった。 クローン O A F 062に特異的に増幅された cDNAを、 OX003と同様な手法でリ クロ一ニングし、 全塩基配列を決 定し、 配列番号 48に示す配列を得た。 さらにオープンリーディングフレー ムを決定し、 アミノ酸に翻訳して配列番号 46および 47に示す配列を得た。 核酸配列デ一夕ベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列デ一夕ベースに登録されている既知のポ リペプチドのァミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリペプチド OAF 062およびそれをコードする核酸配 列と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新 規な分泌蛋白質であることが判明した。 実施例 16 ：クロ一ン OAF 075
本発明のクローン OAF 075に関する実施例は、 ON 056と同様な手 法を用いたが、 以下の点のみ異なる。
(1) o 1 y (A) +RNAの調製
ヒト骨髄ストローマ細胞株 H A S 303 (東京医科大学第一内科外山圭助 教授、 相沢信助手より供与。 ） より TRIzol reagentを用いて全 RNAを抽出 し、 mRNA Purification kitを用いて p o 1 y (A) TRNAを精製した。 (2)全長 cDN Aのクローニングおよび塩基配列の決定
全長 c DNAのクロ一ニングは Marathon cDNA Amplification kitによる 3 ' RACE法を用いて、 〇X 003と同様の方法で行なった。 2本鎖 c DNAの調製は、 各クローンの由来、 すなわち HA S 303の p o 1 y (A) +RNAより作製した。 S STで得られた塩基配列の情報に基づいて推 定翻訳開始点 AT G領域を含む 28me rのプライマー OAF 0 7 5— 一 3' (配列番号 105) を作製して、 前記キットに添付されたアダプター プライマーとで P CRを行なった。 クローン OAF 075に特異的に増幅さ れた cDNAを、 〇X 003と同様な手法でリクローニングし、 全塩基配列 を決定し、 配列番号 51に示す配列を得た。 さらにオープンリーディングフ レームを決定し、 アミノ酸に翻訳して配列番号 49および 50に示す配列を 得た。
核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列データベースに登録されている既知のポ リぺプチドのアミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリペプチド OAF 07 5およびそれをコードする核酸配 列と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新 規な分泌蛋白質であることが判明した。
しかし、 BLASTX、 BLASTPおよび FASTAは、 クローン OAF 075 (配列番号 49のアミノ酸配列 1〜42 1間の領域） とヒト ·力ルポキシぺプチダ一ゼ A 2 (Human Carboxypept idase A2 (SwissProt Accession P48052)のアミノ酸 配列 1〜4 1 7間の領域） 、 ヒト ·カルボキシぺプチダーゼ A 1 (Human Carboxypept idase Al (SwissProt Accession P15085)のアミノ酸配列 1〜 4 1 7間の領域） 、 ヒト '力ルポキシぺプチダーゼ B (Human Carboxypept idase B (SwissProt Accession P15086)のアミノ酸配列 5〜 416間の領域） および ヒ ト · マス ト細胞カルボキシぺプチダ一ゼ A ( Human Mas t Cell Carboxypept idase A (SwissProt Accession PI 5088)のアミノ酸配歹 ij 1〜 4 1 2間の領域） の間に有為な相同性があることを示した。 これらの相同性に基 づいて、 クロ一ン OAF 07 5は、 少なくとも前記のカルボキシぺプチ夕一 ゼ （Carboxypept idase) ファミリ一と同様な活性を保持すると期待される。 実施例 17 ： クローン O AG 1 19
本発明のクローン 0 AG 1 1 9に関する実施例は、 ON 056と同様な手 法を用いたが、 以下の点のみ異なる。
(1) p o 1 y (A) TRNAの調製
ヒト骨髄ストローマ細胞株 L P 101 (東京医科大学第一内科外山圭助教 授、 相沢信助手より供与。 ） より TRIzol reagentを用いて全 RNAを抽出し、 mRNA Purification kitを用いて p o 1 y (A) TRNAを精製した。
(2)全長 c DN Aのクローニングおよび塩基配列の決定
全長 c D N Aのクロ一ニングは Marathon cDNA Amplification kitによる 3 ' RACE法を用いて、 OX 003と同様の方法で行なった。 2本鎖 c DN Aの調製は、 各クローンの由来、 すなわち L P 1 0 1の p o l y (A) +RNAより作製した。 S STで得られた塩基配列の情報に基づいて推 定翻訳開始点 ATG領域を含む 28me rのプライマ一〇AG 1 19— F 3 ' (配列番号 106) を作製して、 前記キットに添付されたアダプタープ ライマ一とで P CRを行なった。 クローン〇AG 1 19に特異的に増幅され た cDNAを、 OX 003と同様な手法でリクローニングし、 全塩基配列を 決定し、 配列番号 54に示す配列を得た。 さらにオープンリーディングフレ ームを決定し、 アミノ酸に翻訳して配列番号 52および 53に示す配列を得 た。
核酸配列デ一夕ベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列データベースに登録されている既知のポ リペプチドのァミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリペプチド 0 AG 1 19およびそれをコードする核酸配 列と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新 規な分泌蛋白質であることが判明した。 実施例 18 ：クローン OAH040
本発明のクローン〇AH 040に関する実施例は、 ON 056と同様な手 法を用いたが、 以下の点のみ異なる。
(1) o 1 y (A) TRNAの調製
ヒト臍帯静脈血管内皮細胞株 HUV— EC— C (ATCC No. CRL-1730) より TRIzol reagentを用いて全 RNAを抽出し、 mRNA Purification kitを用いて p o l y (A) +RNAを精製した。
(2)全長 c DNAのクローニングおよび塩基配列の決定
全長 c DNAのクローニングは Marathon cDNA Amplification kitによる 3， RACE法を用いて、 〇X 003と同様の方法で行なった。 2本鎖 c DNAの調製は、 各クロ一ンの由来、 すなわち HU V— E C— Cの p o l y (A) +RNAより作製した。 S S Tで得られた塩基配列の情報に基 づいて推定翻訳開始点 AT G領域を含む 28me rのプライマー O AH 040 - F 1 ： 5 ' 一 TTAGC C C AC C CATGTTGATAGAAC ACCC-3' (配列番号 107) を作製して、 前記キットに添付されたァ ダプタープライマーとで P CRを行なった。 クローン OAH040に特異的 に増幅された cDNAを、 OX 003と同様な手法でリクローニングし、 全 塩基配列 を決定し、 配列番号 57に示す配列を得た。 さらにオープンリー ディングフレームを決定し、 アミノ酸に翻訳して配列番号 55および 56に 示す配列を得た。
核酸配列デ一夕ベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列データベースに登録されている既知のポ リペプチドのァミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリべプチド OAH 040およびそれをコ一ドする核酸配 列と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新 規な分泌蛋白質であることが判明した。 実施例 19 ： クローン OAH058
本発明のクローン〇AH 058に関する実施例は、 ON 056と同様な手 法を用いたが、 以下の点のみ異なる。
(1) p o 1 y (A) 'RNAの調製
ヒト臍帯静脈血管内皮細胞株 HUV— EC— C (ATCC No. CRL-1730) より TRIzol reagentを用いて全 RNAを抽出し、 mRNA Purification kitを用いて po l y (A) +RNAを精製した。 (2)全長 c DNAのクローニングおよび塩基配列の決定
全長 c DNAのクローニングは Marathon cDNA Amplification kitによる 3 ' RACE法を用いて、 〇X 003と同様の方法で行なった。 2本鎖 c DNAの調製は、 各クローンの由来、 すなわち HUV_ E C— Cの po l y (A) +RNAより作製し た。 S S Tで得られた塩基配列の情報に基 づいて推定翻訳開始点 ATG領域を含む 2 8me rのプライマ一 OAH 058 - F 1 ： 5 ' -ACAATGTTGGCCTGTC TGC AAGCT TGTG- 3 ' (配列番号 108) を作製して、 前記キットに添付されたァ ダプ夕一プライマーとで P C Rを行なった。 クローン〇AH 058に特異的 に増幅された cDNAを、 OX 003と同様な手法でリクローニングし、 全 塩基配列 を決定し、 配列番号 60に示す配列を得た。 さらにオープンリーデ ィングフレームを決定し、 アミノ酸に翻訳して配列番号 58および 59に示 す配列を得た。
核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列デ一夕ベースに登録されている既知のポ リペプチドのァミノ酸配列に対して BLASTX、 BLAST?および FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリペプチド OAH 058およびそれをコードする核酸配 列と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新 規な分泌蛋白質であることが判明した。 実施例 20 ：クローン OM01 1
本発明のクローン〇M 01 1に関する実施例は、 ON 056—と同様な手法 を用いたが、 以下の点のみ異なる。
(1) p o 1 y (A) +RNAの調製
ヒ ト成人脳より TRIzol reagentを用いて全 R N Aを抽出し、 mRNA Purification kitを用いて p o 1 y (A) +RNAを精製した。
(2)全長 c DNAのクローニングおよび塩基配列の決定
全長 c D N Aのクロ一ニングは GENETRAPPER cDNA Positive Selection Systemを用いて行なった。 まず Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloningを用いてヒト成人脳組織の p o 1 y (A) + RNAよりプラスミ ド p S P ORT lをべクタ一として d T - primed c DN Aライブラリーを作製した。 つぎに S STで得られた塩基配列の情報 に基づいて 2 7 m e rのピオチン化プライマー OM 0 1 1— F 1 ： 5 '
(配列番号 1 09) を作製した後、 GeneTrapperのキットの方法にしたがって ピオチン化プライマーと特異的にハイブリダィズするプラスミドを c DNA ライブラリーから回収し、 大腸菌 DH 10 Bに形質転換した。 さらに Random Primer DNA Labeling ki tを用いて 32 p - d C T Pでラベルした O M 0 1 1 S ST c DNAをプローブとして、 公知の方法によりコロニーハイブリダィ ゼーシヨンを行ない、 陽性クローンを単離して、 プラスミドを調製した。 以 下 ON 056と同様に全塩基配列を決定し、 配列番号 63に示す配列を得た。 さらにオープンリーディングフレームを決定し、 アミノ酸に翻訳して配列番 号 61および 62に示す配列を得た。
核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列デ一夕ベースに登録されている既知のポ リぺプチドのアミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリペプチド OM01 1およびそれをコードする核酸配列 と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新規 な膜蛋白質であることが判明した。
しかし、 BLASTX、 BLASTPおよび FASTAは、 クローン OM0 1 1 (配列番号 6 1のアミノ酸配列 26〜 3 96間の領域） とヒト · プラズマ細胞ダリコ プロテイ ン P C— 1 ( Human Plasma-cell Glycoprotein PC-1 (Alkal ine Phosphodiesterase I) (SwissProt Accession P22413)のアミノ酸配列 1 5 8 〜543間の領域） の間に有為な相同性があることを示した。 これらの相同 性に基づいて、 クロ一ン〇M 0 1 1は、 少なく とも Human Plasma-cell Glycoprotein PC-1と同様な活性を保持すると期待される。 実施例 21 ：クローン〇M028
本発明のクローン OMO 28に関する実施例は、 ON 056と同様な手法 を用いたが、 以下の点のみ異なる。
(1) o 1 y (A) +RNAの調製
ヒト成人脳組織より TRIzol reagentを用いて全 RN Aを抽出し、 mRNA Purification kitを用いて p o 1 y (A) +RNAを精製した。
(2)全長 c DN Aのクローニングおよび塩基配列の決定
全長 c DN Aのクローニングは GENETRAPPER cDNA Positive Selection Systemを用いて行なった。 まず Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloningを用いてヒト成人脳組織の p o 1 y (A) + RNAよりプラスミ ド p S P ORT lをべクタ一として d T - primed c DN Aライブラリーを作製した。 つぎに S STで得られた塩基配列の情報 に基づいて 2 7 me rのピオチン化プライマー〇 M 0 2 8— F 1 ： 5 '
(配列番号 1 1 0) を作製した後、 GeneTrapperのキットの方法にしたがって ピオチン化プライマーと特異的に八イブリダィズするプラスミドを c DNA ライブラリーから回収し、 大腸菌 DH 1 0 Bに形質転換した。 さらに Random Primer DNA Labeling ki tを用いて 32 p - d C T Pでラベルした O M 0 2 8 S ST c DNAをプロ一 ブとして、 公知の方法によりコロニーハイブリダ ィゼーシヨンを行ない、 陽性クローンを単離して、 プラスミドを調製した。 以下 ON056と同様に全塩基配列を決定し、 配列番号 66に示す配列を得 た。 さらにオープンリーディングフレームを決定し、 アミノ酸に翻訳して配 列番号 64および 65に示す配列を得た。
核酸配列デ一夕ベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列データベースに登録されている既知のポ リぺプチドのァミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリペプチド OM028およびそれをコードする核酸配列 と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新規 な膜蛋白質であることが判明した。
しかし、 BLASTX、 BLASTPおよび FASTAは、 クローン OM028 (配列番号 6 4のアミノ酸配列 1〜708間の領域） とマウス · ロイシンリツチ · リピー トプロテイン （Mouse Leu-rich repeat protein(PRF Code 2212307ACGENBANK Accession D49802))のアミノ酸配列 1〜 707間の領域） の間をはじめとし て、 多数のロイシンリッチ · リピート （Leu-rich repeat) を有する蛋白質と 有為な相同性があることを示した。 これらの相同性に基づいて、 クローン〇 M028は、 少なくともある種の Leu- rich repeatを有する蛋白質と同様な活 性を保持すると期待される。 実施例 22 ：クローン OMB 092
本発明のクローン OMB 092に関する実施例は、 ON 056と同様な手 法を用いたが、 以下の点のみ異なる。
(1) o 1 y (A) +RNAの調製
ヒト成人脳組織より TRIzol reagentを用いて全 RN Aを抽出し、 mRNA Purification kitを用いて p o 1 y (A) TRNAを精製した。
(2)全長 c DNAのクローニングおよび塩基配列の決定
全長 c DN Aのクローニングは Marathon cDNA Amplification kitによる 3 ' RAC E法を用いて、 〇X 0 0 3と同様の方法で行なった。 2本鎖 c DNAの調製には、 各クローンの由来、 すなわちヒト成人脳組織の o l y (A) +RNAをより作製した。 S S Tで得られた塩基配列の情報に 基づいて 27me rのプライマ一〇MB 092—F 1 ： 5， — ACTCAC CTGGATC C CTAAGGGC AC AGC— 3 ' (配列番号 1 1 1 ) を 作製して、 前記キットに添付されたアダプタープライマ一とで PCRを行な つた。 また、 1回の P CRで c DNAが十分に増幅されなかったので、 OM B 092 -F 1プライマーの 3 ' 側にさらに推定翻訳開始点 AT G領域を含 む 28me rのプライマ一 OMB 092 - F 2 ： 5， — AGAATGAGC TATTACGGCAGCAGCTATC— 3 ' (配列番号 1 12 ) を作製 して nested PCRを 行なった。 クローン OMB 092に特異的に増幅され た cDNAを、 OX003と同様な手法 でリクローニングし、 全塩基配列を 決定し、 配列番号 69に示す配列を得た。 さらにオープンリーディングフ レームを決定し、 アミノ酸に翻訳して配列番号 67および 68に示す配列を 得た。
核酸配列デ一夕ベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列データベースに登録されている既知のポ リぺプチドのアミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリペプチド OMB 092およびそれをコードする核酸配 列と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新 規な膜蛋白質であることが判明した。
しかし、 BLASTX、 BLASTPおよび FASTAは、 クロ一ン OMB 092 (配列番号 67のアミノ酸配列 1〜254間の領域） とラット内在性整流型カルシウム チ ャ ンネル B I R 9 ( Rat Inward Rectifier Potassium Channel BIR9(SwissProt Accession P52191)のアミノ酸配列 1〜 254間の領域） の 間をはじめとする多数の力リウ ムチャンネルファミリ一と有為な相同性があ ることを示した。 これらの相同性に基づいて、 クローン OMB 092は、 少 なくともカリゥムチヤンネルファミリーと同様な活性を保持すると期待され る。 実施例 23 ： クローン OMB 108
本発明のクローン〇MB 108に関する実施例は、 ON056と同様な手 法を用いたが、 以下の点のみ異なる。
(l)po l y (A) +RNAの調製
ヒト成人脳組織より TRIzol reagentを用いて全 RNAを抽出し、 mRNA Purification kitを用いて po 1 y (A) +RNAを精製した。 (2)全長 c DN Aのクローニングおよび塩基配列の決定
全長 c D N Aのクロ一ニングは Marathon cDNA Amplification kiUこよる 3 ' RACE法を用いて、 〇X 003と同様の方法で行なった。 2本鎖 c DNAの調製には 、 各クローンの由来、 すなわちヒト成人脳組織の o l y (A) +RNAより作製した。 S S Tで得られた塩基配列の情報に基 づいて推定翻訳開始点 ATG領域を含む 2 7me rのプライマー OMB
GCC- 3 ' (配列番号 1 13) を作製して、 前記キットに添付されたァダ プタープライマ一とで P CRを行なった。 また、 1回の PCRで cDNAが 十分に増幅されなかったので、 OMB 108— F 1プライマ一の 3 ' 側にさ らに 22me rのプライマ一OMB 108— F 2 ： 5 ' 一 TGGTTATG GCCTGTCGCTGGAG— 3 ' (配列番号 1 14) を作製して nested PCRを行なった。 クローン〇MB 108に特異的に増幅された c DN Aを、 〇X003と同様な手法でリクローニングし、 全塩基配列を決定し、 配列番 号 72に示す配列を得た。 さらにオープンリーディングフレームを決定し、 アミノ酸に翻訳して配列番号 70および 71に示す配列を得た。
核酸配列デー夕ベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列データベースに登録されている既知のポ リペプチドのァミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリペプチド〇MB 108およびそれをコードする核酸配 列と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新 規な膜蛋白質であることが判明した。
しかし、 BLASTX、 BLASTPおよび FASTAは、 クローン OMB 108 (配列番号 70のアミノ酸配列 164〜256間および 373〜487間の領域） とヒ ト低密度リポ蛋白質レセプター関連蛋白質 1 ( Human Low-Density Lipoprotein Receptor Related Protein 10(SwissProt Accession Q07954) ) をはじめとする LDLレセプ夕一ファミリ一の LDLリピートの領域の間に 有為な相同性があること、 またクローン〇MB 108 (配列番号 70のアミ ノ酸配列 47〜 158間および 259〜370間の領域） とヒト骨形成蛋白 質 1 Human Bone Morphogenet ic Protein 1 (SwissProt Access ion P13497)) 等が有する CUBドメインの間に有為な相同性があることを示した。 すなわち OMB 108は細胞外ドメインに 2ケ所の CUBドメインと 5ケ所 の LDLリピートを有していることが判明した。 これらの相同性に基づいて、 クローン〇MB 108は、 LDLリピートを有する蛋白質ならびに C U Bド メインを有する蛋白質と同様な活性の少なくとも幾つかを保持すると考えら れる。 実施例 24 ：クローン OT 007
本発明のクローン〇T 007に関する実施例は、 ΟΝ 056と同様な手法 を用いたが、 以下の点のみ異なる。
(1) ρ ο 1 y (A) +RNAの調製
ヒト神経芽腫細胞株 I MR— 32 (ATCC No. CCL-127) より TRIzol reagent を用いて全 RNAを抽出し、 mRNA Purification kitを用いて po 1 y (A) +
RNAを精製した。
(2)全長 c DN Aのクローニングおよび塩基配列の決定
全長 c DN Aのクロ一ニングは GENETRAPPER cDNA Positive Selection Systemを用いて行なった。 まず Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloningを用いて I MR— 32の p o 1 y (A) +
RNAよりプラスミド p SPORT lをべクタ一として d T— primed c DN Aライブラリーを作製した。 つぎに S S Tで得られた塩基配列の情報に基づ いて 27me rのピオチン化プライマ一 O T 007 -F 1 ： 5 ' biotin— A AAATGACTCCCCAGTCGCTGCTGCAG- 3 ' (配列番号 1 15) を作製した後、 GeneTrapperのキットの方法にしたがってピオチン化 プライマーと特異的にハイブリダィズするプラスミドを c DNAライブラリ —から回収し、 大腸菌 DH10Bに形質転換した。 さらに Random Primer DNA Labeling kitを用いて32 P- d CTPでラベルした〇T 0 0 7 S S T c DNAをプローブとして、 公知の方法によりコロニーハイブリダィゼーシ ヨンを行ない、 陽性クローンを単離して、 プラスミドを調製した。 以下 ON 056と同様に全塩基配列を決定し、 配列番号 7 5に示す配列を得た。 さら にオープンリーディングフレームを決定し、 アミノ酸に翻訳して配列番号 73および 74に示す配列を得た。
核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列デ一夕ベースに登録されている既知のポ リペプチドのァミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリペプチド OT 007およびそれをコードする核酸配列 と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新規 な膜蛋白質であることが判明した。 しかし、 BLASTX、 BLASTPおよび FASTAは、 クローン〇T 0 0 7 (配列番号 7 3のアミノ酸配列 2 1 7〜6 60間の領 域ノ とヒト 7回膜 通型レセフ夕一 (Human Seven Transmembrane- domain receptor (Genepept Accession X82892)) 、 ラット ' ラトロフイリン関連蛋白 質 1 (Rat Latrophi 1 in-related protein 1 (Genepept Accession U78105)) 、 ヒト CD 9 7 (Human CD97 (SwissProt Accession P48960)) などの 7回膜貫 通型セク レチン/バソアクティ ブ · イ ンテスティ ナルペプチ ド (Secretin/Vasoactive Intestinal Peptide) レセプ夕一ス一ノ、°ーフアミ リーの膜貫通領域の間に有為な相同性があることを示した。 これらの相同性 に基づいて、 クローン OT 0 0 7は、 少なくともある種の 7回膜貫通型 Secretin/Vasoactive Intestinal Peptideレセプタース一パ一ファミリ一と 同様な活性を保持すると期待される。 実施例 25 ： クローン OAG051
本発明のクローン 0AG051に関する実施例は、 ON 056と同様な手法を用 いたが、 以下の点のみ異なる。
(1) o 1 y (A) TRNAの調製
ヒト骨髄ストローマ細胞株 L P 101 (東京医科大学第一内科外山圭助教 授、 相沢信助手より供与。 ） より TRIzol reagentを用いて全 RNAを抽出し、 mRNA Purification kitを用いて p o 1 y (A) TRNAを精製した。
(2)全長 c DNAのクローニングおよび塩基配列の決定
全長 c D N Aのクローニングは Marathon cDNA Amplification kitによる 3 ' RAC E法を用いて、 〇X 0 0 3と同様の方法で行なった。 2本鎖 c DNAの調製には 、 各クローンの由来、 すなわち L P 1 0 1の p o 1 y (A) +RNAより作製した。 S STで得られた塩基配列の情報に基づいて推 定翻訳開始点 AT G領域を含む 27me rのプライマー〇 AG 05 1— F 1 ： 5 ' 一 GGAAATGTTTAC ATTTTT GTTGACGTG - 3' (配列番号 1 1 6) を作製して、 前記キットに添付されたアダプタープ ライマ一とで P CRを行なった。 クロ一ン OAG 0 5 1に特異的に増幅され た c DNAを、 OX 003と同様な手法でリクローニングし、 全塩基配列を 決定し、 配列番号 7 8に示す配列を得た。 さらにオープンリーディングフ レームを決定し、 アミノ酸に翻訳して配列番号 76および 77に示す配列を 得た。
核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列データベースに登録されている既知のポ リペプチドのァミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリペプチド〇 AGO 51およびそれをコードする核酸配 列と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新 規な膜蛋白質であることが判明した。
しかし、 BLASTX、 BLASTPおよび FASTAは、 クローン OAG05 1 (配列番号 7 6のアミ ノ酸配列 4〜 7 0 3間の領域） と Mouse Frizzled - 6 (PRF Code2208383E (GenebankAccess ion U43319)のアミノ酸配列 6〜 7 0 8間の領 域） の間、 またクローン〇 AG O 5 1 (配列番号 7 6のアミノ酸配列 1〜 6 2 7 間の領域） と Mouse Frizzled- 3 (PRF Code 2208383E (Genebank Accession U43205)のアミノ酸配列 7〜 6 1 8間の領域） の間をはじめとする 多数の Frizzledファミリ一と有為な相同性があることを示した。 これらの相 同性に基づいて、 クロ一ン OAG 0 5 1は、 少なくとも Frizzledファミリ一 と同様な活性を保持すると期待される。 実施例 26 ： クローン OUB068
本発明のクロ一ン OUB068に関する実施例は、 ON 0 5 6と同様な手法を用 いたが、 以下の点のみ異なる。
(1) o 1 y (A) +RNAの調製
ヒト骨肉腫細胞株 U— 2〇S (ATCC No.HTB-96) より TRIzol reagentを用 いて全 RNAを抽出し、 mRNA Purification kitを用いて p o 1 y (A) τ RNAを精製した。
(2)全長 c DNAのクローニングおよび塩基配列の決定
全長 c D N Aのクロ一ニングは GENETRAPPER cDNA Positive Selection Systemを用いて行なった。 まず Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloningを用いて U— 2〇 Sの p o 1 y (A) +RNA よりプラスミド p S PORT 1をべクタ一として dT— primed c DNAライ ブラリーを作製した。 つぎに S S Tで得られた塩基配列の情報に基づいて 2 7 me rのピオチン化プライマ一 OUB 0 6 8 -F 1 ： 5 ' biotin— CA
1 7 ) を作製した後、 GeneTrapperのキットの方法にしたがってピオチン化プ ライマ一と特異的にハイブリダィズするプラスミドを c DNAライブラリ一 から回収し、 大腸菌 DH 1 0 Bに形質転換した。 さらに Random Primer DNA Labeling kitを用いて 32p- d C T Pでラベルした OUB O 6 8 S S T c DNAをプローブとして、 公知の方法によりコロニーハイブリダィゼーシ ヨンを行ない、 陽性クローンを単離して、 プラスミドを調製した。 以下 ON 0 5 6と同様に全塩基配列を決定し 、 配列番号 8 1に示す塩基配列を得た。 さらにオープンリーディングフレームを決定し、 アミノ酸に翻訳して配列番 号 7 9および 8 0に示す配列を得た。
核酸配列デ一夕ベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTNお よび FASTAにより、 またアミノ酸配列デ一夕ベースに登録されている既知のポ リペプチドのァミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAにより検索し た結果、 本発明のポリペプチド〇UB 0 6 8およびそれをコードする核酸配 列と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリペプチドは、 新 規な膜蛋白質であることが判明した。
しかし、 BLASTX、 BLASTPおよび FASTAは、 クローン OUB 0 6 8 (配列番号 7 9のアミノ酸配列 5〜 3 8 6間の領域） とアフリカッメガエル ·アンノウ ン膜貝通型蛋白質 ( Xenopus Unknown Transmembrane Protein(Genepept Accession X92871)のアミノ酸配列 3〜40 7間の領域） の間に有為な相同性 があることを示した。 これらの相同性に基づいて、 クローン OUB 0 6 8は、 少なくとも Xenopus Unknown Transmembrane Proteinと同様な活性を保持する と期待される。

Claims

請求の範囲
1. 実質的に純粋な形である配列番号 1、 4、 7、 1 0、 13、 16、 1 9、 22、 25、 28、 3 1、 34、 37、 40、 43、 46、 49、 52、 55、 58、 61、 64、 67、 70、 73、 76または 79で示さ れるアミノ酸配列からなるポリペプチド、 またはそのホモローグ、 そのフラ グメントまたはそのフラグメントのホモローグからなるポリペプチド。
2. 配列番号 1、 4、 7、 10、 13、 16、 19、 22、 25、 28、 3 1、 34、 37、 40、 43、 46、 49、 52、 55、 58、 6 1、
64、 67、 70、 73、 76または 79で示されるアミノ酸配列からなる 請求の範囲第 1項記載のポリぺプチド。
3. 請求の範囲第 1項に記載されたポリぺプチドをコ一ドする c DN A。
4. 配列番号 2、 5、 8、 1 1、 14、 17、 20、 23、 26、 29、
32、 35、 38、 41、 44、 47、 50、 53、 56、 59、 62、
65、 68、 7 1、 74、 77または 80で示される塩基配列を有する請求 の範囲第 3項記載の c D N A、 またはその配列に選択的にハイプリダイズす るフラグメントからなる c DNA。
5. 配列番号 3、 6、 9、 12、 15、 18、 21、 24、 27、 30、
33、 36、 39、 42、 45、 48、 5 1、 54、 57、 60、 63、
66、 69、 72、 75、 78または 81で示される塩基配列を有する請求 の範囲第 3項記載の c DNA、 またはその配列に選択的にハイブリダィズす るフラグメントからなる c DNA。
6. 請求の範囲第 3項から第 5項のいずれかの項に記載の c DN Aからな る複製または発現べクタ一。
7 . 請求の範囲第 6項記載の複製または発現べクタ一で形質転換された宿 主細胞。
8 . 請求の範囲第 1項または第 2項に記載されたポリぺプチドを発現させ るための条件下で請求の範囲第 7記載の宿主細胞を培養することからなる請 求の範囲第 1項または第 2項記載のポリぺプチドの製造方法。
9 . 請求の範囲第 1項または第 2項に記載されたポリペプチドのモノ クロ一ナルまたはポリクローナル抗体。
1 0 . 請求の範囲第 1項または第 2項に記載されたポリペプチドまたは請 求の範囲第 9項記載の抗体および薬学的に許容される賦形剤および Zまたは 担体を含有することを特徴とする薬学的組成物。
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