WO1999054475A2 - Identification de genes de bacteries lactiques dans la biosynthese des exopolysaccharides - Google Patents

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WO1999054475A2
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saccharide
carbon
eps
glcp
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Francesca Stingele
Jacques Edouard Germond
Gilbert Lamothe
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Societe des Produits Nestle SA
Nestle SA
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Societe des Produits Nestle SA
Nestle SA
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins

Definitions

  • the present invention relates to new enzymatic functions of food lactic acid bacteria, as well as new enzymes and genes, involved in the biosynthesis of exopolysaccharides.
  • lactic acid bacteria are capable of producing in their culture medium two classes of polysaccharides, namely homopolysaccharides such as dextrans or levans which are formed by the repeated assembly of a single saccharide, and heteropolysaccharides commonly called exopolysaccharides or EPS (EPS is the abbreviation of the term "exopolysaccharide”) constituted by the assembly of several different saccharides forming a repeating unit (Cerning J., Lactic bacteria, Vol I, of Rossart H and Luquet FM, Lorica, 309- 329, 1994).
  • EPS exopolysaccharide
  • a lactic acid bacterium producing EPS can confer a stringy character and / or a smooth and creamy texture to an acidified milk (Cerning et al., FEMS Microbioi., JLZ, 113-130, 19/90).
  • PSE can also present biological activities of particular interest for human or animal health, such as
  • Vescovo et al. have demonstrated a plasmid of a strain Lactobacillus casei subsp. casei (mesophile) coding for a Muc + phenotype, i.e. for functions related to the production of exocellular thickeners (Vescovo et al., Biotechnology Letters, Vol II, 709-712, 1989).
  • a strain Lactobacillus casei subsp. casei (mesophile) coding for a Muc + phenotype i.e. for functions related to the production of exocellular thickeners.
  • the saccharide structure of this thickener is not known, the different functions of the enzymes encoded by this plasmid are also unknown.
  • EP-A-0750043 (Nestlé Products Company) describes a gene operon of the Streptococcus thermophllus CNCM 1-1590 strain involved in the synthesis of an EPS having the following repetitive structure:
  • Van Kranenburg et al. also described a gene operon, present on a plasmid of a strain
  • Lactococcu ⁇ lactis involved in the synthesis of an EPS with the following repetitive structure (Mol. Microbiology, 24, 387-397, 1997):
  • Another object of the present invention is to provide new saccharides, certain branches or elements of which can be advantageously used or treated to improve the organoleptic properties and the flavor (stability of the aromas of food products possibly incorporating such saccharides).
  • the present invention relates to any recombinant enzyme, which can be purified and which is capable of being involved in the biosynthesis of EPS by a bond in the form of an ⁇ or ⁇ isomer between carbon 1 carrying the aldehyde reducing function of an activated D-Galp and a phosphate of a lipophilic primer, in particular of the genus undecaprenol, or protein, in particular of the genus ACP (Acyl Carrier Protein); for example, so as to gradually ensure the formation of these exopolysaccharides with, at each step, the addition of a new saccharide unit which attaches by its semi-acetal function to an alcoholic hydroxyl of another unit of saccharide, which is at the end of a chain of saccharides linked to this primer.
  • said recombinant enzyme is chosen from the group consisting of: l) recombinant and / or purifiable enzymes involved in the biosynthesis of one exopolysaccharide having the following repeating saccharide unit: ⁇ -D-Galpl i
  • ⁇ -1,3 osidic bond between carbon 1 of an activated D-Galp and carbon 3 of the saccharide present at the non-reducing end of a saccharide chain in formation said chain being composed in particular of a main chain of 1 to 4 D-Galp and / or D-Glcp linked together by ⁇ -1,2 osidic bonds , ⁇ -1,3, ⁇ -1 / 4 and / or ⁇ -1,3, and said saccharide present at the non-reducing end being linked to a single other saccharide by its carbon 1;
  • ⁇ -1,3 osidic bond between the carbon 1 of an activated L-Rhap and the carbon 3 of the saccharide present at the non-reducing end of a saccharide chain in formation, said chain being composed in particular of a main chain from 1 to 4 D-Galp and / or D-Glcp linked to each other by ⁇ -1,2, ⁇ -1,3, ⁇ -1,4 and / or ⁇ -1,3 osidic bonds, and said saccharide present at the non-reducing end being linked to a single other saccharide by its carbon 1.
  • Another subject of the invention relates to any recombinant nucleotide sequence coding for the enzyme (s) of the invention, in particular any vector (including any vector of shuttle type and capable of being expressed in different cell lines), and / or any cell incorporating said nucleotide sequences and expressing the recombinant functional enzyme (s) of the invention.
  • Another aspect of the invention relates to the process for obtaining such an EPS in which:
  • nucleotide sequence of the invention is cloned into a vector, in particular a DNA fragment coding for at least one of the enzymes of the invention, said vector further comprising a sequence allowing autonomous replication or l integration into one or more (shuttle vector) host cell (s),
  • the host cell is transformed by said vector, said host cell using the enzyme (s) encoded by the vector, where appropriate in combination with other enzymes produced by the host cell, for biosynthesis said exopolysaccharide,
  • the transformed host cell is then cultured under conditions suitable for obtaining said exopolysaccharide.
  • Another subject of the invention relates to a process for the synthesis of an exopolysaccharide which consists of the repeated assembly of a single saccharide unit, itself formed of a main chain of saccharides whose ends are involved in the polymerization units, in which several enzymes or several recombinant nucleotide sequences are used according to the invention allowing the creation on the main chain of the saccharide unit of at least one lactose branching linked to a saccharide of the main chain by its glucose.
  • Another object of the invention relates to a new branched (branched) polysaccharide, constituted by the repeated assembly of a single saccharide unit, itself formed of a main chain of saccharides whose ends are involved in the polymerization of the units , characterized in that the main chain comprises at least one lactose branch linked to a saccharide of the main chain by its glucose, the galactose of this branching being also linked to an N-acetylgalactosamine, provided that this polysaccharide does not consist of the repetition of the following saccharide unit:
  • the enzymes and sequences of the invention are preferably enzymes or sequences isolated, purified or recombined from strains of food microorganisms such as Lactobacillus, Streptococcus, etc., in particular non-pathogenic strains.
  • the present invention also relates to food products such as yoghurts or cheeses incorporating the transformed cells of the invention and / or the saccharides obtained from such cells.
  • a final aspect of the present invention relates to the use of one of the enzymes or of a recombinant nucleotide sequence of the invention for the synthesis of an exopolysaccharide.
  • Figures 1 to 3 represent the physical map of 1 Operon involved in the synthesis of an exopolysaccharide respectively of the S strains. thermophilus CNCM 1-1879, CNCM 1-1449 and CNCM 1-800. The horizontal arrows indicate the presence of potential reading frames (ORF). The names of the genes corresponding to the ORFs are indicated below the arrows.
  • nucleotide sequences of the genes and primers used as well as the amino acid sequences of the recombinant enzymes of the invention are represented in the sequence list provided below.
  • This EPS is more particularly constituted by the repeated assembly of a single saccharide unit, itself formed of a main chain of saccharides whose ends are involved in the polymerization of the units.
  • This main chain can also comprise branches (or branches) of saccharides which are not involved in the polymerization of the units, said branches being grafted by osidic bonds on one or more saccharides of this chain.
  • a saccharide unit is represented by indicating:
  • each sugar link in the form of an arrow between the carbon numbers of two adjacent saccharides (the carbon numbers assigned on the cycle of a saccharide are those recognized by the international saccharide nomenclature: IUPAC) ; (3) the anomerism of each osidic bond in the form of the acronym ⁇ or ⁇ , said acronym being positioned to the left of a saccharide to indicate the anomerism of the osidic bond present to the right of this saccharide; (4) the pyranose or furanose nature of each saccharide by adding the letter p or f just after the acronym of each saccharide; and (5) the D or L series of each saccharide, by positioning the letter to the left of the saccharide concerned.
  • a first activated saccharide must first be linked to the phosphate of a lipophilic or protein primer.
  • the addition of a new activated saccharide unit on the chain will then be done by its semi-acetalic function at the level of an alcoholic hydroxyl of the saccharide present at the non-reducing end of this chain, that is to say say at the opposite end from where the primer is attached.
  • a saccharide chain is formed, in indicating the usual acronyms of saccharides, the types of osidic bonds, the position of the primer on the chain, the nature of the cycle and of the D or L series of each saccharide.
  • the acronym " ⁇ / ⁇ " is thus used in order to indicate that one of the two isomers is formed.
  • homologous sequence means any nucleotide or amino acid sequence, leading or giving an enzyme variant which catalyzes the assembly of saccharides, differing from the sequences according to the invention only by substitution, deletion or addition of a small number of nucleotide bases or amino acids, for example 1 to 150 base pairs (bp) or 1 to 50 amino acids.
  • enzyme variants can retain the same assembly specificity of saccharides as the enzymes from which they are derived.
  • substitution, deletion or addition of a small number of amino acids can however also lead to a change in the enzyme specificity.
  • the proteins encoded by the genes of the invention epsl to eps5, although being very close to the enzymes EpsA-D of the strain S. ther ophilus Sfi6 (EP-A-0750043) and the EpsE enzyme from S. salivarius, have different enzymatic specificities from the proteins EpsA-D and EpsE (see below).
  • nucleotide sequences which, due to the degeneration of the genetic code, code for the same polypeptide will be considered as homologs.
  • homologous two nucleotide sequences hybridizing under stringent conditions, that is to say always hybridizing after a hybridization step at 65 ° C.
  • hybridization buffer (SSPE 1, 5x: 0.225 M NaCl, 0.0015 M EPTA, 0.015 M NaH 2 P0 4 , pH7; 1% SDS and 1% dehydrated milk), followed by 6 successive 65 ° washing steps C in a buffer comprising different dilutions of SSC lOx (1.5 M NaCl, 0.15 M sodium citrate, pH7) and 0.1% SDS, respectively for 2 times 10 min with 2x SSC, for 2 times 10 min with 1x SSC, and for 2 times 5 min with 0, 1x SSC or as described by Sambrook et al. ( ⁇ 9.47-9.51 in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)).
  • two functional proteins which are recognized by the same antibody will be considered as homologs, the ratio of the values of intensity of recognition of the two proteins by the antibody not exceeding 1000 in an ELISA test, preferably 100, for example.
  • the amino acid sequences which have more than 70% identity with the sequences according to the invention, in particular more than 80%, 85%, 90% or more particularly more than 95%, will be considered more particularly as homologs.
  • the identity is determined by the ratio between the number of amino acids of a homologous sequence which are identical to those of a sequence according to the invention, and the total number of amino acids of said sequence according to the invention.
  • a nucleotide sequence of the invention in particular a recombinant DNA, it is possible to constitute a library of large DNA fragments of a lactic acid bacterium producing EPS in a lactic acid bacterium producing no EPS, then of select the clone (s) producing an EPS.
  • the genomic DNA of a lactic acid bacterium producing EPS is digested by a restriction enzyme which is specific for a relatively rare restriction site (BaHI, Sali, PstI) or by partial digestion with Sau3A, for example. .
  • the digestion product is cloned into an expression or integration plasmid which accepts large fragments (plasmid pSA3, Dao et al., Appl. Environ.
  • nucleotide sequences of the invention in particular DNAs, are likely to be large, and that they may contain a group of genes involved in the biosynthesis of EPS, it may be preferable to introduce the recombinant plasmids into the same strain of lactic acid bacteria from which fragments, with the difference that this strain has lost the ability to produce EPS following mutagenic treatment (UV, chemical or transposon treatment).
  • An alternative consists in constituting a plasmid library of DNA fragments of a strain of lactic acid bacteria producing an EPS, in transforming the same strain of lactic bacteria by plasmids incapable of replicating therein, in selecting the transformants having integrated a plasmid in their genome by homologous recombination (selection by resistance to an antibiotic, for example), to select the transformants no longer producing EPS, then to isolate and sequence the genomic DNA fragments of the selected transformants which are adjacent to the integrated plasmid .
  • the chromosome of the transformants can be digested, ligated, then carry out a reverse PCR using probes specific for the integrated plasmid or introduce the ligation product into a strain in which the recircularized plasmid is capable of replicating, for example.
  • Another alternative consists in transforming lactic acid bacteria producing EPS by a plasmid comprising a transposon, in subjecting the bacteria to conditions in which the transposon excises from the vector and integrates at random in the genome, in selecting the clones of bacteria having lost the capacity to produce EPS, to isolate the fragments of genomic DNA from said clones into which a transposon has integrated. This method is described in more detail by Stingele et al. , Dev. Biol. Stand., In Genetics of Streptococci, Enterococci and Lactococci, 85., 487-493, 1995 (ISSN: 0301-5149).
  • a last alternative consists in preparing nucleotide primers derived from known genes involved in the biosynthesis of an EPS, then in carrying out a PCR on the genomic DNA of a lactic acid bacterium producing an EPS and for which it is desired to identify the genes involved in the biosynthesis of this EPS.
  • This technique is however excessively difficult to implement, since the choice of the nucleotide sequence of the primers will be decisive in the isolation of a gene. Since the homologies between the sought-after genes and the known genes are not known in advance, this choice proceeds from an inventive step, due to the necessary selection made from a multiplicity of possible primers.
  • lactic acid bacteria in particular to mesophilic lactic acid bacteria such as, for example, Streptococcus cre oris, Streptococcus lactis, Lactobacillus casei subsp. casei and Lactobacillus sake, and thermophilic lactic acid bacteria such as, for example, Streptococcus thermophilus and Lactobacillus helveticus.
  • mesophilic lactic acid bacteria such as, for example, Streptococcus cre oris, Streptococcus lactis, Lactobacillus casei subsp. casei and Lactobacillus sake
  • thermophilic lactic acid bacteria such as, for example, Streptococcus thermophilus and Lactobacillus helveticus.
  • the skilled person has transformation techniques for each species of lactic acid bacteria.
  • the subject of the invention relates to the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 or its complementary strand, obtained from the Streptococcus thermophilus strain deposited on June 20, 1997 according to the Budapest Treaty with the National Collection of Culture of Microorganisms ( CNCM), 28 rue du Dondel Roux, 75724 Paris cedex 15, France (CNCM filing number 1-1897).
  • This Gram-positive strain presents under the microscope an appearance of non-flagellated shells forming chains, does not make spores and is anaerobic.
  • This sequence SEQ ID NO: 1 comprises genes coding for new enzymes involved in the synthesis of EPS having the following repeated structure:
  • the new recombinant enzymes have low homology with known enzymes. These new enzymes, identified from the sequence SEQ ID NO: 1, have one of the amino acid sequences chosen from the group of sequences SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 and the sequences which are homologous to them.
  • This sequence SEQ ID NO: 1 contains genes involved in the synthesis of this EPS (epsl -5), coding for proteins having very strong homologies with EpsA-D proteins from S. thermophilus Sfi6 (EP-A-0750043) and the EpsE protein of S. salivarius (GenBank: No. X94980). These high degrees of homology are unexpected in view of the fact that the structure of the EPS produced by the strain CNCM 1-1897 is sufficiently different from that of the strain Sfi6, so that one can expect that the enzymes of the CNCM 1-1897 strain are different from those of the Sfi6 strain.
  • the proteins encoded by these genes have new enzymatic specificities making them particularly attractive for the creation of new bonds between saccharides, or for varying the length of the EPS chain, or even for regulating the production of EPS differently.
  • One of these new enzymes is a glycosyltransferase having specifically the amino acid sequence SEQ ID NO: 6, the homologous sequences being of course excluded for reasons of novelty.
  • the other new enzymes are involved in the regulation of EPS production and chain length, and have specifically one of the amino acid sequences chosen from the group of sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, the homologous sequences being of course excluded for reasons of novelty.
  • the present invention also relates to any nucleotide sequence, in particular a recombinant DNA, coding for an enzyme according to the invention, that is to say one of the enzymes chosen from the group of sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11.
  • this DNA can comprise at least one gene having one of the nucleotide sequences chosen from the sequences delimited in the sequence SEQ ID NO: 1 by nucleotides 1-687, 690-1418, 1429-2119, 2131-2870, 2929-4244, 5933-7978, 8003-8969, 10138-11086, 11438-12852, 14220-15315 and the sequences which are homologous to the sequences delimited in the sequence SEQ ID NO: l by nucleotides 5933-7978 , 8003-8969, 10138-11086, 11438-12852 and 14220-15315.
  • the nucleotide sequence of the invention is the nucleotide sequence SEQ ID NO: 12 or its complementary strand, obtained from the strain Lactobacillus helveticus LH59 which was deposited on July 27, 1994 according to the Budapest Treaty with the National Collection of Culture of Microorganisms (CNCM), 28 rue du Dondel Roux, 75724 Paris cedex 15, France (CNCM deposit number 1-1449).
  • This Gram-positive strain presents under the microscope an aspect of unflagged rods, does not make spores and is anaerobic optional.
  • This sequence SEQ ID NO: 12 comprises genes coding for new enzymes involved in the synthesis of EPS having the following repeated structure:
  • ⁇ -1,4 osidic bond between carbon 1 of an activated D-Galp and carbon 4 of Glcp present at the non-reducing end of a saccharide chain in formation in particular the following chain: ⁇ -D -Glcp- (1— »3) - ⁇ -D-Gal - (1 ⁇ 3) - ⁇ -D-Galp- (l-3) - ⁇ -D-Glcp- (l-» 3) - ⁇ -D -Glcp-primer; and, - the ⁇ -1,5 osidic bond between the repetitive saccharide units of the EPS above.
  • the new recombinant enzymes identified from the sequence SEQ ID NO: 12, have one of the amino acid sequences chosen from the group of sequences SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, and the sequences which are homologous to them.
  • the present invention also relates to any nucleotide sequence, in particular any recombinant DNA coding for an enzyme according to the invention, that is to say the enzymes chosen from the group of sequences SEQ ID NO: 13,
  • this DNA can comprise at least one gene having one of the nucleotide sequences chosen from the sequences delimited in the sequence SEQ ID NO: 12 by nucleotides 1053-1730, 1734 -2849, 2852-3943, 3930-5084, 5077-6096, 6099-7091, 7096-8259, 8284-8910 and the sequences which are homologous to them.
  • the nucleotide sequence of the invention is the nucleotide sequence SEQ ID NO: 20 or its complementary strand, obtained from the strain Lactobacillus delbrueckii bulgaricus Sfi5 deposited on October 4, 1988 according to the treaty from Budapest, at the National Collection of Culture of Microorganisms (CNCM), 28 rue du Dondel Roux, 75724 Paris cedex 15, France (CNCM deposit number 1-800). Furthermore, this Gram-positive strain under the microscope has the appearance of non-flagellated rods, is non-sporulating and anaerobic optional.
  • This sequence SEQ ID NO: 20 comprises genes coding for new enzymes involved in the synthesis of EPS having the following repeated structure:
  • the saccharide chain in formation can be composed simply of a main chain without branching from 1 to 4 D-Galp and / or D-Glcp linked together by osidic bonds ⁇ -1,2, ⁇ -1,3, ⁇ -1.4 and / or ⁇ -1-3.
  • this chain can be chosen from the following tetra-sacchridic chains, as well as their mono-, di- or tri-saccharide precursors: ⁇ -D-Galp (l ⁇ 3) - ⁇ -D -Glc /. (L-3) - ⁇ -D-Gal (l ⁇ 4) - ⁇ / ⁇ -D-Galp-primer; ⁇ -D-Galp (l ⁇ 2) - ⁇ -D-Galp (l-> 3) - ⁇ -D-Glc / 7 (l ⁇ -3) - ⁇ / ⁇ -D-Galp-primer; ⁇ -D-Gal /?
  • the saccharide chain in formation can also be composed of a main chain further comprising 1 or 2 branched saccharides, such as D-Galp and / or L-
  • Rhap These branched saccharides can be • linked on the main chain to ⁇ -1,3, ⁇ -1,4 or ⁇ -1,3, for example.
  • this chain can be chosen from the following main tetra-sacchridic chains, as well as their mono-, di- or tri-saccharide precursors: ⁇ -D-Gal / 1 ⁇ 3) - ⁇ - D-Gl (1 ⁇ 3) - [ ⁇ -D-Galp (1 ⁇ 4)] - ⁇ -D-Gal /> (1 ⁇ 4) - [ ⁇ -LRhap (1 ⁇ 3)] - ⁇ / ⁇ - D-Gal /> - primer; ⁇ -D-Gal /.
  • one of the new enzymes according to the invention catalyzes the ⁇ -1,3 osidic bond between the carbon 1 of an activated L-Rhap and the carbon 3 of galactose present at the non-reducing end of one of the chains. saccharides above.
  • one of the new enzymes according to the invention catalyzes the ⁇ -1,3 osidic bond between the carbon 1 of an activated D-Galp and the carbon 3 of the galactose present at the non-reducing end of one of the chains. saccharides above.
  • one of the new enzymes according to the invention catalyzes the ⁇ -1,4 osidic bond between the carbon 1 of an activated D-Galp and the carbon 4 of galactose present at the non-reducing end of one of the saccharide chains above.
  • the new recombinant enzymes identified from the DNA sequence SEQ ID NO: 20, have one of the amino acid sequences chosen from the group of sequences SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, and the sequences which are homologous to them.
  • the present invention also relates to any nucleotide sequence, in particular any recombinant DNA coding for an enzyme according to the invention, that is to say one of the enzymes chosen from the group of sequences SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29.
  • this DNA can comprise at least one gene having one of the nucleotide sequences chosen from the sequences delimited in the sequence SEQ ID NO: 20 by nucleotides 9-353, 516-1292, 1323-1982, 2074-3174, 3246-4373, 4511- 5317.
  • IS portions arranged respectively upstream and downstream of the sequences coding for the enzymes of the invention.
  • These IS sequences advantageously make it possible to directly use the sequence of the invention as a "transposon" and optionally to practice a coculture of microorganisms without a vector and to obtain the expression of these enzymes in cells having lost the threading character initial, which allows the synthesis of exopolysaccharides by said transformed cells.
  • the present invention also relates to any recombinant vector comprising the nucleotide sequence of the invention.
  • This recombinant vector can be any fragment nucleic acid, such as single strand or double strand, linear or circular, expression or integration DNA, and comprising a nucleotide sequence of the invention, in particular all or part of the sequence SEQ ID N0: 1 , SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 20.
  • Recombinant enzymes can also be used to modify or synthesize in-vi tro an oligosaccharide or a polysaccharide such as EPS, for example.
  • Another object of the present invention relates to a cell comprising, integrated into its genome or by means of a replicable plasmid, a nucleotide sequence of the invention, and expressing a functional recombinant enzyme according to the invention.
  • This cell can be part of the group of molds, yeasts, bacteria and plants, for example.
  • the yeasts belong to the genera Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula and Pichia; the bacteria are Gram-negative or positive belonging to the genus Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus and Staphylococcus; plant cells belong to legumes, and cereal and woody species; while molds are the cells traditionally used to prepare a koji like Aspergillus, Rhizopus and / or Mucor.
  • Another object of the present invention relates to a method for producing an EPS, in which:
  • a fragment of a nucleotide sequence coding for at least one of the enzymes according to the invention is cloned into a vector, said vector further comprising a sequence allowing autonomous replication or integration into a host cell;
  • a host cell is transformed by said vector, said host cell using the enzymes encoded by the vector, where appropriate in combination with other enzymes produced by the host cell if the vector does not provide all the enzymes necessary for the biosynthesis of an EPS, for the biosynthesis of an EPS;
  • the transformed host cell is then cultured under conditions suitable for the production of EPS. If the method described in EP-A-0564966 is not implemented, the vector must also comprise at least one functional promoter sequence and at least one functional translational activation sequence, allowing the expression of the genes encoding for at least one of the enzymes according to the invention.
  • the present invention also relates to a new process for the synthesis of an EPS, which consists of the repeated assembly of a single saccharide unit, itself formed of a main chain of saccharides whose ends are involved in the polymerization of the units, in which several recombinant enzymes or several recombinant genes capable of being involved in the biosynthesis of EPS having the repetitive saccharide unit are used: ⁇ -D-Gal /.- (l ⁇ 4) - ⁇ -D-Glcp 1
  • the main chain of the saccharide unit consists of at least 2 saccharides chosen from D-Galp, D-Galf and / or D-Glcp.
  • the carbon 1 of the glucose of the lactose ramifications can be linked by a ⁇ sugar linkage to one of the carbons 2-6 of one of the saccharides of the main chain, for example, preferably carbon 3 or 6 d 'a D-Galf.
  • an enzyme or a gene which allows the binding between an N-acetyl-galactosamine and the galactose of the lactose branching can also be used. It is also possible, in addition, to use an enzyme or a gene which allows the link between N-acetyl-neuraminic acid and the galactose of the lactose branching, for example.
  • This synthesis process can be carried out in vi tro, using the recombinant enzymes and their appropriate substrates. It can also be implemented in vivo, by cloning the appropriate genes and making them express themselves so that the recombinant enzymes thus produced biosynthesize an EPS in the presence of their substrates, for example.
  • the present invention also relates to a new branched polysaccharide, constituted by the repeated assembly of a single saccharide unit, it- even formed from a main chain of saccharides whose ends are involved in the polymerization of the units, characterized in that the main chain comprises at least one lactose branching linked to a saccharide of the main chain by its glucose, the galactose of this branching being further bound to an N-acetylgalactosamine.
  • the carbon 1 of the glucose of the lactose branching can be linked by a ⁇ -sugar linkage to one of the carbons 2-6 of one of the saccharides of the main chain, preferably the carbon 3 or 6 of a D-Galf, for example.
  • this polysaccharide cannot be constituted by the repetition of the following saccharide unit:
  • the EPS produced by the L. helveticus TY1-2 strain can thus represent a target of choice (Y. Yamamoto et al., Carbohydrate Research, 261, 67-78, 1994), for example.
  • This EPS is constituted by the repetition of the following saccharide unit:
  • the new polysaccharide according to the invention can also comprise an N-acetyl-neuraminic acid linked to the galactose of the lactose branching.
  • an ⁇ -2, 6-sialyltransferase in particular those described by Simth et al. , Sjoberg et al. and / or Yamamoto et al. , (J. of Biol. Chem., 269, 15162-15171, 1994; J. Biochem., 271, 7450-7459, 1996; Biosci. Biotech. Biochem., £ 2, 210-214, 1998), or a ⁇ -2,3-sialyltransferase, in particular that marketed by Calbiochem® (Cat No.566218-M, USA), for example.
  • - LM17 M17 medium comprising 1% lactose.
  • - GM17 M17 medium comprising 1% glucose.
  • - HJL tryptone 3%, beef extract 0.2%, yeast extract 1%, lactose 1% and KH P0 4 pH 6.5 0.5%.
  • - Ruthenium red yeast extract 0.5%, skimmed milk powder 10%, sucrose 1%, agar 1.5% and 0.08 g / l of ruthenium red (see FR-2632968).
  • - MRS 1% peptone protein, 1% beef extract, 0.5% yeast extract, 2% dextrose, 0.1% tween 80, 0.2% ammonium citrate, 0.5% ammonium acetate , di-potassium phosphate 0.2%, magnesium sulfate 0, lg / l, and manganese sulfate 0.05 g / 1.
  • Example I cloning of the operon of S. thermophilus CNCM 1-1897 involved in the synthesis of an EPS
  • strain S The strains of lactic acid bacteria from the Nestlé collection are cultured in an HJL liquid medium and dilutions are spread on a Ruthenium Red solid medium.
  • the EPS producing strains remain white because the EPS prevents the dye from tinting their cell wall.
  • the non-producing strains stain red due to the affinity of the dye for the peptidoglycan of their cell wall.
  • the strain S was thus selected from the lactic acid bacteria producing EPS. thermophilus Sfi39, which has received the deposit number CNCM 1-1897 and which will be designated in the following examples by the expression "strain Sfi39".
  • the approach attempted in order to isolate the eps genes from the Sfi39 strain is based on the comparison of known eps genes (those of S. thermophilus) and their counterparts (cap, eps, rfb genes) of various species, and even phylogenically unrelated species, such as Gram-negative species. These comparisons thus make it possible to define conserved regions between the species, and to use nucleotide primers derived from these conserved regions in order to amplify by PCR an internal part of the eps operon. of the strain Sfi39.
  • This approach unfortunately encountered the impossibility of amplifying an eps gene, whatever the primers chosen. The reasons leading to these failures can be multiple, for example linked to a weak homology between the eps genes of the strain Sfi39 and those of the conserved regions, or to inadequate PCR conditions, etc.
  • genomic DNA of the strain Sfi39 was previously isolated according to the technique of Slos et al. (Appl. Environ. Microbiol., 57, 1333-1339, 1991). About 100 ng of genomic DNA and Taq polymerase are used.
  • a 143 bp PCR fragment was thus isolated, then cloned into the linearized plasmid pGEMT (Promega, USA).
  • the sequencing of this fragment by the dideoxynucleotide method indicates a sequence corresponding to nucleotides 4006 to 4149 of the sequence SEQ ID NO: 1.
  • This PCR fragment was used to screen a ⁇ -ZAP Express library (Stratagene, USA) containing DNA fragments of the Sfi39 strain.
  • a DNA preparation of said mutant is partially digested with Sau3A, the fragments are separated by agarose gel electrophoresis, the bands corresponding to fragments of 5 to 12 kb are cut from the gel, eluted the DNA, then it is ligated to the ⁇ -ZAP Express vector previously digested with BamHI.
  • the ligation product is encapsulated using the GigagoldlII system (Stratagene), the phages are then mixed with Escherichia coli XLIBlue (Stratagene) according to the supplier's recommendations, then the mixture is spread on a Petri dish.
  • the recombinant plaques are then analyzed by hybridization of their DNA transferred to a Hybond-N membrane (Amersham Life Sciences, UK) with the PCR fragment previously made radioactive (Random Primed DNA Labeling kit, Boehringer-Manheim).
  • sequence SEQ ID NO: 1 has 1 operon eps of the strain Sfi39 and comprises 10 complete ORFs, in the same orientation, which is called epsl, eps2, eps3, eps4, eps5, eps ⁇ , eps7, eps8, eps9 and ep ⁇ l O (see Figure 1).
  • nucleotides 4832-5527 and eps5 have more than 80% identity with the genes epsA, epsB, epsC and epsD of strain S. thermophilus Sfi6 described in EP750043 (Genbank, no. U40830), and with the epsE gene of S. salvarius (GenBank, no. X94980).
  • ORFs respectively code for proteins having more than 90% identity with the proteins EpsA, EpsB, EpsC, EpsD and EpsE of S. thermophilus and S. salivarius.
  • ORFs epsl, eps2, eps3, eps4 and eps5 respectively code for proteins having the amino acid sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.
  • the eps ⁇ ORF (nucleotides 8633-10678) codes for a protein (SEQ ID NO: 7) having approximately 20% identity with the RfbC protein of Klebsiella pneumaniae (Genbank, no. L41518). This homology confirms its role in the biosynthesis of EPS.
  • the ORF eps7 (nucleotides 10703-11668) codes for a protein (SEQ ID NO: 8) having approximately 33% identity with the protein Epsl of S. thermophilus Sfi6. This homology indicates that the protein is obviously a beta-glycosyltransferase.
  • the eps ⁇ ORF (nucleotides 12838-13785) codes for a protein (SEQ ID NO: 9) having approximately 30% identity with the protein Epsl of S. thermophilus Sfi6. This homology indicates that the protein is obviously a beta-glycosyltransferase.
  • the ORF eps9 (nucleotides 14138-15553) codes for a protein (SEQ ID NO: 10) having approximately 40% identity with the protein EpsK of Lactococcus lactis
  • the ORF epsl O (nucleotides 16919-18013) codes for a protein (SEQ ID NO: 11) having approximately 62% identity with the Galf protein of Escherichia coli
  • thermophilus Sfi39 which is clearly involved in the biosynthesis of EPS.
  • the epsl -10 gene of the operon is inactivated by homologous recombination to confirm their importance in the biosynthesis of EPS.
  • a fragment of each ORF originating from one of the pCMV vectors described in Example I above is amplified by PCR, the PCR product is ligated into the heat-sensitive plasmid pSA3 previously digested, the strain E is transformed. coli XLl-blue with the ligation product, transformants are selected, a recombinant plasmid is isolated, then the strain S is transformed by electroporation.
  • thermophilus Sfi39 with the recombinant plasmid using a method adapted from that described by Slos et al. (1991). We resuspend them cells subjected to a discharge of 2, lkV, 25 ⁇ F and 400 ⁇ in 1 ml of HJL medium which are incubated for 4 h at 37 ° C.
  • the cells are spread on a solid LM17 medium supplemented with 2.5 ⁇ g / ml of erythromycin which is incubated for 16 h at 37 ° C., then the transformed colonies which survive are selected. Then incubated selected colonies in 2 ml HJL medium supplemented with 2.5 ug / ml of erythromycin until the optical density at 600 nm (DOgoo) of ⁇ a culture reached 0.2, the culture was subjected at 45 ° C.
  • the colonies which integrated the recombinant pSA3 plasmid into one of the 10 eps genes exhibit an EPS (-) phenotype on a solid red Ruthenium medium, and have lost their threading character in an MSK milk.
  • Example III Biosynthesis of an EPS
  • a plasmid is prepared from the plasmid pSA3 (Dao et al., Appl. Environ. Microbiol., 49., 115-119, 1985), by adding a DNA fragment of the strain Sfi39 containing the 17.2 kb sequence described in Example I (see the sequence list), and by adding the regulatory parts of the eps operon of the strain S. thermophilus Sfi6 (EP750043), so that the expression (transcription and translation) of the eps genes of the strain Sfi39 can be correctly carried out in S. thermophilus.
  • a plasmid is prepared from the plasmid pSA3 by adding a DNA fragment of the strain Sfi39 containing the sequence SEQ ID NO: 1 described in example I (see the sequence list), and by adding the regulatory parts of 1 operon eps of strain S. thermophilus Sfi6 (EP750043), so that the expression (transcription and translation) of the eps genes of the strain Sfi39 can be carried out in S. thermophilus.
  • the S strain is then transformed by electroporation with this plasmid. thermophilus CNCM 1-1351 which was deposited on August 5, 1993 under the Budapest Treaty. Any other shooting strain of S. thermophilus could also have been used.
  • Genomic DNA of the CNCM 1-1897 strain is isolated by the method of Slos et al. (1991).
  • the DNA preparation is digested with PstI and BamHI, the DNA fragments are separated by electrophoresis on 0.7% agarose gel, the fragments larger than 20 kb are eluted, the DNA extracted is ligated to the vector pJIM2279 ( obtained from P. Renault, INRA, Jouy-en-Josas, Paris, France) previously digested with PstI and BarriHI then dephosphorylated.
  • the Lactococcus lactis MG1363 strain J.
  • the clones transformed are selected by hybridization of the genomic DNA of the clones with one of the probes derived from the sequence SEQ ID NO: 1. Among the transformants, positive clones are selected.
  • Example VI Preparation of functional genes homologous to the eps 6, eps7, eps 8 genes.
  • Esp9 and eps 10 Functional derivatives of the eps ⁇ , eps7, eps8, esp9 and eps10 genes are prepared by using a method adapted from that described by Adams. et al . (EP402450; Genencor). For this, each of the eps genes is isolated by PCR from the genomic DNA of the strain Sfi39. The primers used are chosen from the sequence SEQ ID NO: 1, so as to amplify only each gene.
  • Each PCR product is cloned into the vector pFG1 derived from the vector pSA3 (Dao et al., Appl. Environ. Microbiol., 49, 115-119, 1985) which contains, in addition to the selection gene erythromycin, the selection gene chloramphenicol and the promoter regulating the transcription and translation of the eps operon of the strain Sfi6 (EP750043).
  • Each PCR product is cloned functionally downstream of this promoter so that the eps gene can be normally expressed in S. thermophilus.
  • each vector is subjected to chemical mutagenesis in vitro with hydroxylamine, as described by Adams et al.
  • the strains of lactic acid bacteria transformed in an HJL liquid medium are cultivated, dilutions are spread on a Ruthenium Red solid medium, the producing strains are selected. of EPS which remain white, and the rheological properties of the EPS produced by each clone are compared to that of the EPS produced by the strain Sfi39. By observing in particular the viscosity and the normal strength of the EPS of each clone, it was thus possible to identify certain clones producing an EPS having a different property.
  • Example VII Synthesis of polysaccharides with the glycosyltransferases Eps6, Eps7. Eps8, Eps9 and EpslO
  • Each of the eps genes is isolated by PCR from the genomic DNA of the strain Sfi39.
  • the primers used are chosen from the sequence SEQ ID NO: 1
  • the vectors thus treated are then introduced into the E. coli DH5 ⁇ strain (Stratagen, US) which does not naturally have glycosyltransferase activity.
  • the transformed DH5 ⁇ strains are cultured in LB medium containing ampicillin up to an OD oo of ° 8 ', 1 mM IPTG is added to the culture medium, the cells are incubated for 2 h, the cells are centrifuged at 6000 g for 10 min at 4 ° C., they are washed in buffer A (50 mM Tris-acetate pH8, ImM of DTT, 1 mM EDTA and 10% glycerol), they are centrifuged again, they are resuspended the cells in buffer A additionally containing 1 mM PMSF (phenylmethane sulfonyl fluoride) and the suspension is subjected to 15000 psi.
  • PMSF phenylmethane sulfonyl fluoride
  • the whole cells are eliminated by centrifugation at 6000 g for 15 min at 4 ° C., the cell membranes of the supernatant are recovered by ultracentrifugation at 100,000 g for 1 h, and the aliquot is resuspended in buffer A.
  • This protocol thus generally allows '' get about 10 mg / ml protein.
  • the Sfi39 strain is cultivated in a medium containing D-Glcp, D-Galp and D-Galf, subjects the cells of this culture to 20,000 psi, the saccharide chains in formation (linked to a primer) are extracted from the membranes by treating the cellular debris with chloroform / methanol (2: 1), by evaporating the extract.
  • chloroform / methanol (2: 1) chloroform / methanol
  • the specificity of the glycosyltransferases present in the membranes is then determined by a method similar to that described by Kolkman et al. (Mol. Microbiol., 2 £, 197-208, 1997). For this, the reaction is carried out for 2 h, in a reaction volume of 150 ⁇ l, 100 ⁇ l (approximately 1 mg) of membranes, 50 mM of Tris-acetate pH8, 10 mM of MgCl 2 , ImM of EDTA, 1 ⁇ l ( approximately 25 nCi) of UDP [14C] _ Glcp, of UDP [ 14C ] -Qalp or of UDP [ 14C ] -Galf depending on the glycosyltransferase considered, and the deposit containing the unlabeled saccharide chains in formation isolated from the strain Sfi39 (see paragraph above).
  • the oligosaccharides are detached from their primer by carrying out a gentle hydrolysis in 50 mM of TFA (ac. Trifluoroacetic) at 90 ° C for 20 min.
  • TFA ac. Trifluoroacetic
  • the oligosaccharides are subjected to extensive hydrolysis in a 4M TFA solution for 1 h at 125 ° C.
  • hydrolysates are then dried and resuspended in 5 ml of transporting saccharides in 40% isopropanol (5 mg / ml of each of the following saccharides: Glc,
  • EPS produced by the strain Lactobacillus helveticus LH59 (CNCM 1-1449) has already been presented by Stingele et al. (Carbohydrate Research, 302, 197-202, 1997), and in patent application EP-A-0699689, the technical content of these documents being incorporated by reference.
  • This strain is used in particular for the fermentation of dairy products such as cheese.
  • This PCR fragment was used to screen a ⁇ -ZAP Express library (Stratagene, USA) containing DNA fragments of the LH59 strain according to the method described in Example 1. By cutting the nucleotide sequences of the different genomic inserts, it was thus possible to characterize the nucleotide sequence SEQ ID NO: 12 corresponding to the operon of the strain LH59 involved in the synthesis of an EPS (see FIG. 2).
  • the sequence SEQ ID NO: 12 contains the eps operon of the LH59 strain and comprises a transposition element oriented in the opposite direction to 11 complete ORFs presented in the same orientation, which is called epsl to epsll.
  • This transposition element is a fragment of cryptic plasmid of L. helveticus pLH3 (Pridmore et al., FEMS Microbiological Letters, 124, pp. 301-306 (1994)) (see FIG. 2).
  • the ORF epsl codes for a protein (SEQ ID NO: 13) having approximately 59% identity with undecaprenyl-phosphate-glycosyl-1-phosphate-transferases, in particular of S. salivarius (Genbank , no. P72577). This homology confirms its role in the biosynthesis of EPS.
  • the ORF eps2 codes for a protein (SEQ ID NO: 14) having approximately 36% identity with an ⁇ -glycosyltransferase from S. thermophilus (Genbank, no. Q56044), in particular at SX2EX7E motif present in all these enzymes. This homology confirms its role in the biosynthesis of EPS.
  • the EPS3 ORF (nucleotides 2851 -3942) codes for a protein (SEQ ID NO: 15) having approximately 32% identity with glycosyltransferases, in particular from Bacillus subtilis (Genbank, no. P71055). This ORF thus probably codes for an ⁇ -glycosyltransferase.
  • the ORF eps4 (nucleotides 3929 -5083) codes for a protein (SEQ ID NO: 16) having approximately 28% identity with glycosyltransferases, in particular of Bacillus subtilis (Genbank, n ° P71055). This ORF probably codes for an ⁇ -glycosyltransferase.
  • the ORF eps5 (nucleotides 5076 -6095) codes for a protein (SEQ ID NO: 17) having approximately 29% identity with ⁇ -glycosyltransferases, in particular of S. thermophilus (GenBank # O07339). This homology confirms its role in the biosynthesis of EPS.
  • the OR6 eps6 (nucleotides 6098 _7090) co d e for a protein (SEQ ID NO: 18) having approximately 29% identity with ⁇ -glycosyltransferases, in particular of S. thermophilus (GenBank # O07339). This homology confirms its role in the biosynthesis of EPS.
  • the EPS7 ORF (nucleotides 7095 -8258) codes for a protein (SEQ ID NO: 19) having approximately 27% identity with an EPS polymerase from S. pneumaniae (GenBank n ° O07867). This homology confirms its role in the biosynthesis of EPS.
  • the EPS8 ORF codes for a protein (SEQ ID NO: 20) having approximately 27% identity with glycogenins (GenBank n ° Q22997; P46976; P132780). These homologies confirm its role in the biosynthesis of EPS, probably as a glycosyltransferase.
  • ORF eps9 (nucleotides 9125 -10263) encodes a protein (SEQ ID NO: 21) similar to UDP-galactosyl-pyranose-mutase from E. coli K-12 involved in the conversion of UDP-galactopyranose to UDP- galactofuranosis.
  • the ORF eps9 must play a central role in the synthesis of exopolysaccharides, since it allows the transfer of phosphofuranose to the next repeating unit.
  • the ORF eps10 (nucleotides 10250-11662) codes for a protein (SEQ ID NO: 22) having similarities with the EpsK of Lactococcus lactis, the CpsL of Streptococcus pneumoneia, the TrsA of Hiersina enterocol tica and the RfbX of E. Coli (Yao and Valvano, Journal of Bacteriology, 176, pp. 4133-4143 (1994)). These homologies confirm its role as a transport unit for the polysaccharides formed.
  • ORF epsll codes for a protein (SEQ ID NO: 23) having similarities with protein 0331 from E. Coli and IcaC from Staphylococcus epidermidis (Elmann et al., Molecular Microbiology, 20 (5), pp 1083-1091 (1996)). These homologies confirm its role as a unit for the synthesis or export of exopolysaccharides.
  • the genomic inserts isolated from the pCMV vectors cover a genomic region of the L. helveticus LH59 strain which is manifestly involved in the biosynthesis of EPS.
  • the epsl -8 gene of 1 Operon is inactivated by homologous recombination to confirm their importance in the biosynthesis of EPS.
  • a fragment of each ORF originating from one of the pCMV vectors described in Example I above is amplified by PCR, the PCR product is ligated into the plasmid pSA3 suitably digested beforehand, the E. coli strain is transformed. XLl-blue with the ligation product, transformants are selected, a recombinant plasmid is isolated, then the L. helveticus LH59 strain is transformed with the recombinant plasmid using the method described by Thompson et al. (Appl. Micob.
  • the transformed cells are spread on an MRS solid medium supplemented with 2.5 ⁇ g / ml of erythromycin, which is then incubated for 16 h at 45 ° C., then the transformed colonies which survive are selected.
  • the surviving colonies integrated the recombinant pSA3 plasmid into one of the 8 eps genes. This can be verified by Southern-Blot of a digested preparation of genomic DNA from the surviving colonies, and hybridization of the Southern-Blot filter with the PCR product made radioactive. The colonies having integrated the plasmid have different bands than those obtained under the same conditions with the wild strain. In addition, the colonies having integrated into one of the 8 eps genes the recombinant plasmid present have lost their spinning character in an MSK milk.
  • Example X Biosynthesis of an EPS
  • a plasmid is prepared from the plasmid pSA3 (Dao et al. (1985)), by adding a DNA fragment of the strain LH59 containing the nucleotide sequence SEQ ID NO: 12 described in Example VIII and by adding the parts regulators of the eps operon of the strain S. thermophilus Sfi6 (EP750043), so that the expression (transcription and translation) of the eps genes of the LH59 strain can be carried out in S. thermophilus.
  • the S strain is then transformed by electroporation with this plasmid. thermophilus CNCM 1-1422 which was deposited on May 18, 1994 according to the Budapest Treaty. Any other shooting strain S. thermophilus could also have been used.
  • Example XI Biosynthesis of an EPS
  • a plasmid is prepared from the plasmid pSA3 by adding a DNA fragment of the strain LH59 containing the nucleotide sequence SEQ ID NO: 12 described in Example I and by adding the regulatory parts of the S operon eps. thermophilus Sfi6 (EP750043), so that the expression (transcription and translation) of the eps genes of the LH59 strain can be carried out in S. thermophilus.
  • the S strain is then transformed by electroporation with this plasmid. thermophilus CNCM 1-1351 which was deposited on August 5, 1993 under the Budapest Treaty. Any other shooting strain S. thermophilus could also have been used.
  • Example XII Biosynthesis of an EPS
  • the genomic DNA of the LH59 strain is isolated by the method of Slos et al. (1991).
  • the DNA preparation is digested with SalI and BamHI, the DNA fragments are separated by electrophoresis on 0.7% agarose gel, the fragments greater than 5 kb are eluted, the DNA extracted is extracted with the vector pJIM2279 beforehand digested with Sali and BamHI then dephosphorylated.
  • the strain Lactococcus lactis MG1363 (1983) is transformed as described in Example V.
  • the clones transformed are selected by hybridization of the genomic DNA of the clones with one of the probes derived from the sequence SEQ ID NO: 12. Among the transformants, the positive clones are selected.
  • Example XIII Preparation ⁇ j_S functional genes homologous to the eps genes
  • Functional derivatives of the epsl-8 genes are prepared using a method adapted from that described by Adams et al. (EP-A-0402450; Genencor). For this, each of the eps genes is isolated by PCR from the genomic DNA of the LH59 strain. The primers used are chosen from the sequence SEQ ID NO: 12, so as to amplify only each gene. Each PCR product is cloned into the expression vector pQE60 (Qiagen, US) functionally downstream of an E. coli promoter regulating the transcription and translation of the eps gene.
  • pQE60 Qiagen, US
  • each vector is subjected to intra chemical mutagenesis with hydroxylamine, as described by Adams et al.
  • the E. coli DH5 ⁇ strain (Stratagen, US) which does not naturally have glycosyltransferase activity is transformed by the plasmids pQE60 treated with the mutagenic agent, then transformants are selected.
  • the enzymatic specificity of the enzymes expressed in each clone of 1 S. coli is analyzed, by means of the method described in Example VII.
  • Each of the eps genes coding for a glycosyltransferase is isolated by PCR from the genomic DNA of the LH59 strain.
  • the primers used are chosen from the sequence SEQ ID NO: 12, so as to amplify only each gene according to the method described in 1 example VII.
  • the LH59 strain is cultivated in a medium containing D-Glcp, D-Galp and D-Galf, the cells of this culture are subjected to 20,000 psi, the saccharide chains in formation (linked to a primer) are extracted from the membranes. by treating cell debris with chloroform / methanol and then evaporating the extract.
  • the procedure is the same with the strain LH59 cultivated in the presence of radioactive saccharides.
  • the specificity of the glycosyltransferases present in the membranes is then determined by a method similar to that described in Example VII.
  • the analysis of the plates makes it possible to confirm the function as glucosyltransferase of the operons epsl to eps4 by the functional analysis of their activity in the presence of a substrate.
  • Example XV Synthesis of a New Polysaccharide
  • the EPS is purified from a culture medium of the strain Lactobacillus helveticus TY1-2 (Y. Yamamoto et al., Carbohydrate Research, 261, 67-78, 1994). This EPS is constituted by the repetition of the following saccharide unit:
  • an N-acetylgalactosamine is grafted onto the galactose of the lactose branches of EPS, using a ⁇ -1,4-N-acetylgalactosaminyl transferase and its appropriate substrate, for example those described by Lutz et al. and Yamashiro et al. (J. of Biol. Chem., 269, 29227-29231, 1994; J. of Biol. Chem., 270. 6149-6155, 1995).
  • Example XVI Synthesis of a New Polysaccharide 5
  • the EPS of Example XV is subjected to ⁇ -2,3-sialyltransferase marketed by Calbiochem® (Cat No.566218 -M, USA) in the presence of its appropriate substrate .
  • Example XVII Synthesis of a New Polysaccharide 0
  • the EPS of Example XV is subjected to the ⁇ -2,6-sialyltransferase described by Sjoberg et al., Or to the ⁇ -2,6-sialyltransferase described by Yamamoto et al. , in the presence of their appropriate substrates (J. Biochem., 271, 7450-7459, 1996; Biosci. Biotech. Biochem., £ 2, 210-214, 1998). 5
  • the structure of the EPS produced by the strain 0 L. bulgaricus Lfi5 was determined by magnetic resonance, according to a technique similar to those described in EP 97111379.0 and EP 97111381.6.
  • the results show that the EPS consists of the following repeating unit: 5 ⁇ -D-Gal /? ⁇ -L-R ap ⁇ -D-Gal /.
  • a PCR fragment could thus be isolated and then cloned into the linearized plasmid pGEMT (Promega, USA).
  • the sequencing of this fragment by the dideoxynucleotide method indicates a sequence corresponding to nucleotides 1698 to 1841 of the sequence SEQ ID NO: 24.
  • This PCR fragment was used to screen a ⁇ -ZAP Express bank (Stratagene, USA) containing DNA fragments of the Lfi5 strain according to the protocol of Example 1.
  • the sequence SEQ ID NO: 24 presents the eps operon of the Lfi5 strain and comprises 14 complete ORFs, in the same orientation, which is called epsA to epsN (see FIG. 3).
  • the ORF epsA (nucleotides 295 - 1326; code for a protein (SEQ ID NO: 24) having 32% identity with the LytR protein from Synechocytis sp Pcc 6803 (Genbank no.
  • the EPSB ORF codes for a protein (SEQ ID NO: 25) having approximately 26% identity with the CapA protein of Staphylococcus aureus (Genbank no.
  • the epsC ORF (nucleotides 2514-2858) codes for a protein (SEQ ID NO: 27) having approximately 38% identity with the EpsB protein Lactococcus lactis (GenBank n ° O06030). This ORF thus probably codes for a regulatory protein involved in the control of the molecular weight and / or the length of the polysaccharide chain.
  • the ORF epsD (nucleotides 3020-3796) codes for a protein (SEQ ID NO: 28) having approximately 41% identity with the protein EpsC Lactococcus lactis (GenBank n ° O06031). This homology confirms the role of this ORF in the synthesis of an EPS.
  • the EPSE ORF codes for a protein (SEQ ID NO: 29) having approximately 44% identity with the protein Cpsl4E from Streptococcus pneumoniae
  • the EPSF ORF codes for a protein (SEQ ID NO: 30) having approximately 30% identity with the EpsF protein of Streptococcus thermophilus
  • the EPSG ORF codes for a protein (SEQ ID NO: 31) having approximately 34% identity with the EpsG protein of Streptococcus thermophilus (Genbank, no. Q56044). This ORF thus obviously codes for an ⁇ -glycosyltransferase.
  • the EPSH ORF codes for a protein (SEQ ID NO: 32) having approximately 37% identity with the protein YveO of Bacillus subtilis (Genbank, n ° P71054). This ORF thus obviously codes for a ⁇ -glycosyltransferase.
  • the epsl ORF (nucleotides 7839-8708) codes for a protein (SEQ ID NO: 33) having approximately 23% identity with the protein Cpsl4K from S. pneumaniae (Genbank, no. O07341). This ORF thus obviously codes for a glycosyltransferase.
  • the EPSJ ORF (nucleotides 9213-10196) codes for a protein (SEQ ID NO: 34) having approximately 33% identity with the Eps I protein of S. thermophilus (GenBank n ° Q56046). This ORF thus obviously codes for a ⁇ -glycosyltransferase.
  • the ORF epsK (nucleotides 10227-11288) codes for a protein (SEQ ID NO: 35) having approximately 24% identity with the protein YveQ Bacillus subtilus (GenBank P71056). This ORF thus probably codes for a protein responsible for the polymerization of repeat units.
  • the EPSL ORF (nucleotides 11358 -12284) codes for a protein (SEQ ID NO: 36) having approximately 20% identity with the RfaS protein of E. coli (GenBank n ° P27126). This homology demonstrates that this ORF is involved in the biosynthesis of an EPS.
  • the epsM ORF (nucleotides 12372-13382) codes for a protein (SEQ ID NO: 37) having approximately 38% identity with the CpsH protein of Streptococcus agaloctiae (GenBank n ° 087183). This homology shows that this ORF is involved in the biosynthesis of an EPS.
  • the ORF eps_V (nucleotides14269 - 1572b codes for a protein (SEQ ID NO: 38) having approximately 35% identity with the protein Cpsl9BJ of Streptococcus pneumonoiae
  • Example XIX Biosynthesis of an EPS
  • a plasmid is prepared from the plasmid pSA3 (Dao et al. (1985)), by adding a DNA fragment of the strain Lfi5 containing the sequence SEQ ID NO: 24 and by adding the regulatory parts of the eps operon of the S. thermophilus Sfi6 strain (EP750043), so that the expression (transcription and translation) of the eps genes of the Lfi5 strain can be carried out in S. thermophilus as proposed in Example X.
  • Example XX Biosynthesis of an EPS
  • a plasmid is prepared from the plasmid pSA3, by adding a DNA fragment of the strain Lfi5 containing the sequence SEQ ID NO: 24 and by adding the regulatory parts of the eps operon of the strain S. thermophilus Sfi6 (EP750043) , so that the expression (transcription and translation) of the eps genes of the Lfi5 strain can be carried out in S. thermophilus as proposed in Example XI.
  • Chromosomal DNA from the CNCM 1-800 strain is isolated, the DNA preparation is digested with Xbal, the DNA fragments are separated by electrophoresis on 0.7% agarose gel, the further fragments are eluted of 9 kb, the DNA extracted is ligated to the vector pJIM2279 (obtained from P. Renault, INRA, Jouy-en-Josas, Paris, France) previously digested with Xbal then dephosphorylated.
  • the Lactococcus lactis MG1363 strain is transformed as described in Example V.
  • the clones transformed are selected by hybridization of the genomic DNA of the clones with one of the probes derived from the sequence SEQ ID NO: 24.
  • each of the eps genes is isolated by PCR from the genomic DNA of the Lfi5 strain (CNCM 1-800).
  • the primers used are chosen from the sequence SEQ ID NO: 24, so as to amplify only each gene.
  • Each PCR product is cloned according to the method described in Example XIII.
  • the enzyme specificity of the enzymes expressed in each E. coli clone is analyzed, using the method described in Example XVII.
  • Example XXIII Synthesis of Polysaccharides with the Lfi5 Glycosyltransferases
  • Each of the eps genes coding for a glycosyltransferase is isolated by PCR from the genomic DNA of the Lfi5 strain (CNCM 1-800).
  • the primers used are chosen from the sequence SEQ ID NO: 24, so as to amplify only each gene according to the protocol described in Example VII using the expression vector pBAD (Invitrogen, USA).
  • the Lfi5 strain is cultivated in a medium containing D-Glcp, D-Galp and L-Rhap, the cells of this culture are subjected to 20,000 psi, the saccharide chains in formation (linked to a primer) are extracted from the membranes. by treating cell debris with chloroform / methanol (2: 1) and evaporating the extract.
  • chloroform / methanol (2: 1) As a control in the tests which will follow, the procedure is the same with the Lfi5 strain cultivated in the presence of radioactive saccharides.
  • the specificity of the glycosyltransferases present in the membranes is then determined by a method similar to that described in Example VII.
  • the epsA to epsM genes were amplified by PCR and inserted into the shuttle vector pTRKH2 (O 'Sullivan et al., Gene, 137, pp. 227-231 (1993)) and cloned into heterologous hosts Lactococcus lactis MG1363 so as to determine if such a fragment allows the production of EPS by this strain. After restriction analysis of the different PCR amplicons, it was shown that no detectable deletion or rearrangement took place during the cloning steps. The transformants analyzed on the plates by means of a toothpick test show a threading phenotype by the strains not having this phenotype at the origin. This proves that the esp genes introduced are responsible for the synthesis of EPS by these transformed strains.

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Abstract

La présente invention concerne une enzyme recombinée susceptible d'être impliquée dans la biosynthèse d'exopolysaccharides par une liaison sous forme d'un isomère alpha ou beta entre le carbone 1 portant la fonction réductrice aldéhyde d'un D-Galp activé et un phosphate d'une amorce lipophile, en particulier du genre undecaprénol ou protéinique, notamment du genre ACP (Acyl Carrier Protein), de manière à assurer de façon progressive la formation de ces exopolysaccharides avec à chaque étape l'addition d'une nouvelle unité de saccharide qui vient s'attacher par sa fonction semi-acétalique à un hydroxyle alcoolique d'une autre unité de saccharide, laquelle est à l'extrémité d'une chaîne de saccharides liée à cette amorce.

Description

IDENTIFICATION DE GENES DE BACTERIES LACTIQUES DANS LA BIOSYNTHESE DES EXOPOLYSACCHARIDES
nγ ή at. de 1 ' invention
La présente invention se rapporte à de nouvelles fonctions enzymatigues de bactéries lactiques alimentaires, ainsi que de nouveaux enzymes et gènes, impliqués dans la biosynthèse d ' exopolysaccharides .
τ;t-af. de la technicrue
Il est connu que les bactéries lactiques sont susceptibles de produire dans leur milieu de culture deux classes de polysaccharides, à savoir les homopolysaccharides comme les dextranes ou les levanes gui sont constitués par l'assemblage répété d'un seul saccharide, et les hétéropolysaccharides appelés communément exopolysaccharides ou EPS (EPS est l'abréviation du terme "exopolysaccharide") constitués par l'assemblage de plusieurs saccharides différents formant une unité répétitive (Cerning J. , Bactéries lactiques, Vol I, de Rossart H et Luquet F. M., Lorica, 309-329, 1994).
Une bactérie lactique alimentaire produisant un EPS peut conférer un caractère filant et/ou une texture lisse et crémeuse à un lait acidifié (Cerning et al . , FEMS Microbioi., JLZ, 113-130, 19/90). Les EPS peuvent aussi présenter des activités biologiques particulièrement intéressantes pour la santé humaine ou animale, comme des
activités anti-tumeurs ou probiotiques , par exemple (Oda M. et al . , Agric. Biol . Chem. , 47, 1623-1625, 1983; EP-94870139.6)
Par ailleurs, l'industrie alimentaire est confrontée à une instabilité génétique de la biosynthèse des EPS dans les bactéries lactiques. Ceci se traduit généralement au cours d'une fermentation par la perte de la production d ' EPS par tout ou partie des bactéries lactiques
(voir "Cerning J." ci-dessus). Les produits fermentes industriels sont ainsi sujets à des variations dans leur contenu en EPS, ce qui n'est pas toujours acceptable. Pour remédier à ces problèmes, l'industrie recourt actuellement à l'isolement et la caractérisation périodique de ses bactéries de manière à séparer celles qui ont perdu leur caractère originel .
On connaît des gènes de bactéries lactiques alimentaires impliqués dans la biosynthèse d ' EPS .
Le document O92/02142 révèle ainsi l'existence du plasmide pHV67 qui produit dans Lactococcus lactis subsp. lactis (mésophile) une substance capable d'augmenter la viscosité d'un lait fermenté. La structure saccharidique de cette substance n'étant pas connue, les différentes fonctions des enzymes codées par pHV67 sont également inconnues. Le document US-5,066,588 décrit deux plasmides provenant d'une souche de Streptococcus cremoris
(mésophile) capable de conférer un caractère épaississant à un Streptococcus lactis . La structure saccharidique de cet épaississant n'étant pas connue, les différentes fonctions des enzymes codées par ces plasmides sont également inconnues .
Vescovo et al . ont mis en évidence un plasmide d'une souche Lactobacillus casei subsp. casei (mésophile) codant pour un phénotype Muc+, c'est à dire pour des fonctions liées à la production d'épaississants exocellulaires (Vescovo et al . , Biotechnology Letters, Vol II, 709-712, 1989). La structure saccharidique de cet épaississant n'étant pas connue, les différentes fonctions des enzymes codées par ce plasmide sont également inconnues .
Le document EP-A-0750043 (Société des Produits Nestlé) décrit un opéron de gènes de la souche Streptococcus thermophllus CNCM 1-1590 impliqué dans la synthèse d'un EPS ayant la structure répétitive suivante :
→3)-β-D-Glcp(l→3)-α-D-Ga^NAc(l→3)-β-D-Galp(l→
6 t 1 α -D-Galp
Van Kranenburg et al . ont aussi décrit un opéron de gènes, présent sur un plasmide d'une souche
Lactococcuε lactis, impliqué dans la synthèse d'un EPS ayant la structure répétitive suivante (Mol. Microbiology, 24, 387-397, 1997) :
→4 β-D-G (l→4)-β-D-Glcp(l→4)-β-D-Glcp(l→
2 3 t î 1 P04 α-L-Rap t 1 α-D-Galp
Bien que les enzymes codant pour cet EPS soient maintenant connues, il reste encore à élucider leur spécificité. A ce jour, il existe toujours un besoin de disposer également de nouvelles enzymes impliquées dans la synthèse d'EPS; notamment des enzymes catalysant les liaisons spécifiques entre des saccharides pour améliorer les propriétés des produits alimentaires, en particulier des produits lactés tels que des yoghourts ou des fromages, en y incorporant de tels saccharides. La présente invention vise à remplir ces besoins. Un autre but de la présente invention vise à fournir de nouveaux saccharides dont certaines ramifications ou certains éléments peuvent être avantageusement utilisés ou traités pour améliorer les propriétés organoleptiques et la saveur (stabilité des arômes des produits alimentaires incorporant éventuellement de tels saccharides) .
Résumé de 1 ' invention La présente invention est relative à toute enzyme recombinée, que l'on peut purifier et qui est susceptible d'être impliquée dans la biosynthèse des EPS par une liaison sous forme d'un isomère α ou β entre le carbone 1 portant la fonction réductrice aldéhyde d'un D-Galp activé et un phosphate d'une amorce lipophile, en particulier du genre undecaprénol, ou protéique, notamment du genre ACP (Acyl Carrier Protein) ; par exemple, de manière à assurer de façon progressive la formation de ces exopolysaccharides avec à chaque étape, l'addition d'une nouvelle unité de saccharide qui vient s'attacher par sa fonction semi-acétalique à un hydroxyle alcoolique d'une autre unité de saccharide, laquelle est à l'extrémité d'une chaîne de saccharides liée à cette amorce.
De préférence, ladite enzyme recombinée est choisie parmi le groupe constitué par : l)les enzymes recombinées et/ou purifiables impliquées dans la biosynthèse de 1 ' exopolysaccharide ayant l'unité saccharidique répétitive suivante : β-D-Galpl i
6 →3)-β-D-Glcp-(l→3)-β-D-Gal/-(l→3)-α-D-Glcp-(l→
catalysant spécifiquement l'une des liaisons suivantes entre saccharides : - la liaison osidique β-1,3 entre le carbone 1 d'un D- Galf activé et le carbone 3 du Glcp présent à l'extrémité non-réductrice d'une chaîne saccharidique en formation, notamment la chaîne α/β-D-Glcp-amorce ; - la liaison osidique β-1,3 entre le carbone 1 d'un D- Glcp activé et le carbone 3 du Galf" présent à l'extrémité non-réductrice d'une chaîne saccharidique en formation, notamment la chaîne β-D-Galf" (l—»3) -α/β-D- Gl cp-amorce; - la liaison osidique β-1,6 entre le carbone 1 d'un D- Galp activé et le carbone 6 du Glcp présent à l'extrémité non-réductrice d'une chaîne saccharidique en formation, notamment la chaîne β-D-Glcp(l→3) β-D- Galf (l-»3) - /β-D-Glcp-amorce; et - la liaison osidique α-1,3 entre les unités saccharidiques répétitives de l 'EPS ci-dessus ; 2) les enzymes recombinées et/ou purifiables qui sont susceptibles d'être impliquées dans la synthèse des EPS ayant l'unité saccharidique répétitive suivante : β-D-Galp-(l→4)-β-D-Glc/71 3 →5)-β-D-Gal/-(l→3)-α-D-Galp-(l→3)-α-D-Glcp-(l→3)-β-D-Glςp-(l→ catalysant spécifiquement l'une des liaisons suivantes entre saccharides :
- la liaison osidique α-1,3 entre le carbone 1 d'un D- Glcp activé et le carbone 3 d'un Glcp appartenant à l'extrémité non-réductrice d'une chaîne saccharidique en formation, notamment la chaîne suivante : α/β-D- Glcp-amorce;
- la liaison osidique α-1,3 entre le carbone 1 d'un D- Galp activé et le carbone 3 d'un Glcp présent à l'extrémité non-réductrice d'une chaîne saccharidique en formation, notamment la chaîne suivante : α-D-Glcp- (l-»3) -β/α-D-Glcp-amorce;
- la liaison osidique β-1,3 entre le carbone 1 d'un D- Galf activé et le carbone 3 d'un Galp présent à l'extrémité non-réductrice d'une chaîne saccharidique en formation, notamment la chaîne suivante : α-D-Galp- (1→3) -α-D-Glcp- (l->3) -β/α-D-Glcp-amorce;
- la liaison osidique β-1,3 entre le carbone 1 d'un D- Glcp activé et le carbone 3 d'un Galf présent à l'extrémité non-réductrice d'une chaîne saccharidique en formation, notamment la chaîne suivante : β-D-Galf- (l->3) -α-D-Galp- (l-3) -α-D-Glcp- (l-»3) -β-D-Glcp-amorce ;
- la liaison osidique β-1,4 entre le carbone 1 d'un D- Galp activé et le carbone 4 du Glcp présent à l'extrémité non-réductrice d'une chaîne saccharidique en formation, notamment la chaîne suivante : β-D-Glcp- (l-»3) -β-D-Galf- (1→3) -α-D-Galp- (1→3) -α-D-Glcp- (1→3) - β-D-Glcp-amorce; et
- la liaison osidique β-1,5 entre les unités saccharidiques répétitives de 1 ' EPS ci-dessus; et
3) les enzymes recombinées et/ou purifiables qui sont susceptibles d'être impliquées dans la synthèse des EPS ayant l'unité saccharidique répétitive suivante : β-D-Galp α-L-Rha/. β-D-Gal/.
1 1 1
4 3 3
→3)-β-D-Gal/>(1→4)-α-D-Galp(1→2)-α-D-Gal/.(1→3)-β-D-Glcp(1 → et catalysant spécifiquement l'une des liaisons suivantes entre saccharides :
- la liaison osidique β-1,3 entre le carbone 1 d'un D- Galp activé et le carbone 3 du saccharide présent à l'extrémité non-réductrice d'une chaîne saccharidique en formation, ladite chaîne étant composée notamment d'une chaîne principale de 1 à 4 D-Galp et/ou D-Glcp liés entre-eux par des liaisons osidiques α-1,2, α-1,3, β-1/4 et/ou β-1,3, et ledit saccharide présent à l'extrémité non-réductrice étant lié à un seul autre saccharide par son carbone 1;
- la liaison osidique β-1,4 entre le carbone 1 d'un D- Galp activé et le carbone 4 du saccharide présent à l'extrémité non-réductrice d'une chaîne saccharidique en formation, ladite chaîne étant composée notamment d'une chaîne principale de 1 à 4 D-Galp et/ou D-Glcp liés entre-eux par des liaisons osidiques α-1,2, α-1,3, β-1,4 et/ou β-1,3, et ledit saccharide présent à l'extrémité non-réductrice étant lié à un seul autre saccharide par son carbone 1; et
- la liaison osidique α-1,3 entre le carbone 1 d'un L- Rhap activé et le carbone 3 du saccharide présent à l'extrémité non-réductrice d'une chaîne saccharidique en formation, ladite chaîne étant composée notamment d'une chaîne principale de 1 à 4 D-Galp et/ou D-Glcp liés entre-eux par des liaisons osidiques α-1,2, α-1,3, β-1,4 et/ou β-1,3, et ledit saccharide présent à l'extrémité non-réductrice étant lié à un seul autre saccharide par son carbone 1.
Un autre objet de l'invention concerne toute séquence nucléotidique recombinée codant pour la ou les enzyme (s) de l'invention, notamment tout vecteur (y compris tout vecteur de type navette et susceptible de s'exprimer dans différentes lignées cellulaires) , et/ou toute cellule incorporant lesdites séquences nucléotidiques et exprimant la ou les enzyme (s) recombinée (s) fonctionnelle (s) de 1 ' invention. Un autre aspect de l'invention concerne le procédé d'obtention d'un tel EPS dans lequel :
(1) on clone dans un vecteur la séquence nucléotidique de l'invention, en particulier un fragment d'ADN codant pour au moins l'une des enzymes de l'invention, ledit vecteur comprenant en outre une séquence permettant la réplication autonome ou l'intégration dans une ou plusieurs (vecteur navette) cellule (s) hôte (s),
(2) on transforme la cellule hôte par ledit vecteur, ladite cellule hôte utilisant la ou les enzyme (s) codée (s) par le vecteur, le cas échéant en combinaison avec d'autres enzymes produites par la cellule hôte, pour la biosynthèse dudit exopolysaccharide,
(3) on cultive ensuite la cellule hôte transformée dans des conditions appropriées pour l'obtention dudit exopolysaccharide .
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de synthèse d'un exopolysaccharide qui est constitué par l'assemblage répété d'une seule unité saccharidique, elle-même formée d'une chaîne principale de saccharides dont les extrémités sont impliquées dans la polymérisation des unités, dans lequel on utilise plusieurs enzymes ou plusieurs séquences nucléotidiques recombinées selon l'invention permettant la création sur la chaîne principale de l'unité saccharidique d'au moins une ramification lactose liée à un saccharide de la chaîne principale par son glucose.
Un autre objet de l'invention concerne un nouveau polysaccharide ramifié (branché) , constitué par l'assemblage répété d'une seule unité saccharidique, elle- même formée d'une chaîne principale de saccharides dont les extrémités sont impliquées dans la polymérisation des unités, caractérisé en ce que la chaîne principale comprend au moins une ramification lactose liée à un saccharide de la chaîne principale par son glucose, le galactose de cette ramification étant en outre lié à un N-acétyl- galactosamine, pour autant que ce polysaccharide ne consiste pas en la répétition de l'unité saccharidique suivante :
β-D-Gal/.Nac-(l→4)-β-D-Gal/>(l→4)-β-D-Glc/.
1 71
3
>5)-β-D-Gal/-(l→3)-α-D-Galp-(l→3)-α-D-Glςp-(l→3)-β-D-Glcp(l→
Les enzymes et les séquences de l'invention sont de préférence des enzymes ou des séquences isolées, purifiées ou recombinées à partir de souches de microorganismes alimentaires tels que des Lactobacillus, des Streptococcus, etc., en particulier des souches non pathogènes .
La présente invention concerne également les produits alimentaires tels que des yoghourts ou des fromages incorporant les cellules transformées de l'invention et/ou les saccharides obtenus de telles cellules .
Un dernier aspect de la présente invention concerne l'utilisation d'une des enzymes ou d'une des séquences nucléotidiques recombinées de l'invention pour la synthèse d'un exopolysaccharide.
La présente invention sera décrite en détails dans les exemples d'exécution non limitatifs présentés ci- dessous en référence aux figures annexées.
Brève description des figures
Les figures 1 à 3 représentent la carte physique de 1 Opéron impliqué dans la synthèse d'un exopolysaccharide respectivement des souches S . thermophilus CNCM 1-1879, CNCM 1-1449 et CNCM 1-800. Les flèches horizontales indiquent la présence de cadres de lecture (ORF) potentiels. Les noms des gènes correspondants aux ORFs sont indiqués en dessous des flèches .
Description détaillée de l' invention
Dans la suite de la description, les séquences nucléotidiques des gènes et des amorces utilisés ainsi que les séquences en acides aminés des enzymes recombinées de l'invention sont représentées dans la liste de séquences fournie ci-après.
Le terme "EPS" désigne un polymère formé par la condensation d'un grand nombre de molécules de saccharides (=oses) de types différents. Cet EPS est plus particulièrement constitué par l'assemblage répété d'une seule unité saccharidique, elle-même formée d'une chaîne principale de saccharides dont les extrémités sont impliquées dans la polymérisation des unités. Cette chaîne principale peut comprendre en outre des ramifications (ou branchements) de saccharides qui ne sont pas impliquées dans la polymérisation des unités, lesdites ramifications étant greffées par des liaisons osidiques sur un ou plusieurs saccharides de cette chaîne. On représente une unité saccharidique en indiquant :
(1) les sigles usuels des saccharides (Glc: glucose; Gai: galactose; Rha : rhamnose; etc.);
(2) le type de chaque liaison osidique sous la forme d'une flèche entre les numéros de carbone de deux saccharides adjacents (les numéros de carbone attribués sur le cycle d'un saccharide sont ceux reconnus par la nomenclature internationale des saccharides: IUPAC) ; (3) l'anomérie de chaque liaison osidique sous la forme du sigle α ou β, ledit sigle étant positionné à gauche d'un saccharide pour indiquer l'anomérie de la liaison osidique présente à la droite de ce saccharide; (4) la nature pyranose ou furanose de chaque saccharide en adjoignant la lettre p ou f juste après le sigle de chaque saccharide; et (5) la série D ou L de chaque saccharide, en positionnant la lettre à gauche du saccharide concerné. Dans une chaîne saccharidique en formation, la réaction directe entre une fonction semi-acétalique d'une nouvelle unité de saccharide et un hydroxyle alcoolique du saccharide présent à l'extrémité non- réductrice de la chaîne ne se fait pas spontanément, et c'est pourquoi le groupement semi-acétalique doit au préalable être activé, c'est-à-dire rendu plus réactif en vue de la formation de la liaison osidique. Cette activation est catalysée par des enzymes bactériennes formant un saccharide nucléotidique, et plus particulièrement un uridine-diphosphate de D-Glcp (UDP- Glcp) , D-Galp (UDP-Galp) ou D-Galf (UDP-Galf) dans le contexte de la présente invention. Pour initier la formation d'un chaîne saccharidique, un premier saccharide activé doit d'abord être lié sur le phosphate d'une amorce lipophilique ou protéique. L'addition d'une nouvelle unité de saccharide activé sur la chaîne se fera ensuite par sa fonction semi-acétalique au niveau d'un hydroxyle alcoolique du saccharide présent à l'extrémité non- réductrice de cette chaîne, c'est-à-dire à l'extrémité opposée de celle où l'amorce est fixée.
Des travaux menés sur les enzymes de l'invention ont permis de montrer que la biosynthèse des exopolysaccharides se fait de manière progressive avec, à chaque étape, l'addition d'une nouvelle unité de saccharide qui vient s'attacher par sa fonction semi-acétalique à un hydroxyle alcoolique d'une autre unité de saccharide, laquelle est à l'extrémité d'une chaîne de saccharides liée à une amorce . Ces enzymes catalysent ou contrôlent ainsi spécifiquement les fonctions suivantes :
(1) La liaison sous forme d'un isomère α ou β entre le carbone 1 (qui porte la fonction réductrice aldéhyde) d'un D-Galp activé et un phosphate d'une amorce lipophilique notamment du genre undecaprénol, ou protéique notamment du genre ACP (Acyl Carrier Protein) , par exemple.
(2) La liaison osidique α-1,3 entre le carbone 1 d'un GalpNAc activé (UDP-GalpNAc) et le carbone 3 du D-Galp lié à son amorce.
(3) La liaison osidique β-1,3 entre le carbone 1 d'un D- Glcp activé (UDP-D-Glcp) et le carbone 3 du saccharide présent à l'extrémité non-réductrice de la chaîne β-D- Galp(l→3) -α/β-D-Galp-amorce. (4) La liaison osidique α-1,6 entre le carbone 1 d'un D- Galp activé et le carbone 6 du saccharide présent à l'extrémité non-réductrice de la chaîne β-D- Glcp(l→3) β-D-Galp(l→3) -α/β-D-Galp-amorce .
(5) Le transport des unités saccharidiques répétitives de 1 'EPS décrit ci-dessus à l'extérieur de la cellule bactérienne.
(6) La liaison osidique β-1,3 entre les unités saccharidiques répétitives de l'EPS ci -dessus.
(7) La régulation du nombre d'unités saccharidiques dans l'EPS, et donc de son poids moléculaire final.
Dans la suite de la description, on représente une chaîne saccharidique en formation, en indiquant les sigles usuels des saccharides, les types de liaisons osidiques, la position de l'amorce sur la chaîne, la nature du cycle et de la série D ou L de chaque saccharide. Enfin, du fait que l'on ne sait pas encore quel isomère est formé lorsque le premier saccharide d'une chaîne est lié à une amorce, par commodité d'écriture, on utilise ainsi le sigle "α/β" afin d'indiquer que l'un des deux isomères est formé.
Au sens de la présente invention, on entend par "séquence homologue" toute séquence nucleotidique ou d'acides aminés, conduisant ou donnant un variant d'enzyme qui catalyse l'assemblage des saccharides, ne différant des séquences selon 1 ' invention que par la substitution, la délétion ou l'addition d'un petit nombre de bases nucléotidiques ou d'acides aminés, par exemple 1 à 150 paires de bases (pb) ou 1 à 50 acides aminés. Ces variants d'enzyme peuvent conserver la même spécificité d'assemblage de saccharides que les enzymes dont ils dérivent. La substitution, la délétion ou l'addition d'un petit nombre d'acides aminés peut cependant aussi conduire à changer la spécificité enzymatique. Par exemple, les protéines codées par les gènes de l'invention epsl à eps5, bien qu'étant très proches des enzymes EpsA-D de la souche S . ther ophilus Sfi6 (EP-A- 0750043) et de l'enzyme EpsE de S . salivarius, présentent des spécificités enzymatiques différentes des protéines EpsA-D et EpsE (voir ci-après) .
La sélection d'une séquence homologue est à la portée de l'homme du métier, en mettant en œuvre des méthodes de mutagénèse classiques, et notamment en adaptant les méthodes décrites par Adams et al . (EP-A-0402450 ; Genencor) , par Dunn et al . (Protein Engineering, 2 , 283- 291, 1988), par Greener et al . (Stratégies, 7, 32-34, 1994) et/ou par Deng et al . (Anal. Biochem, 200, 81, 1992), par exemple .
Dans ce cadre, on considérera en particulier comme homologues deux séquences nucléotidiques qui, du fait de la dégénérescence du code génétique, codent pour un même polypeptide. De même, on peut aussi considérer comme homologue deux séquences nucléotidiques s'hybridant dans des conditions stringentes, c'est-à-dire s'hybridant toujours après une étape d'hybridation à 65 °C pendant 15h dans un tampon d'hybridation (SSPE l,5x: 0,225 M de NaCl, 0,0015 M d'EPTA, 0,015 M de NaH2P04, pH7 ; 1% de SDS et 1% de lait déshydraté) , suivie de 6 étapes successives de lavage à 65 °C dans un tampon comprenant différentes dilutions de SSC lOx (1,5 M de NaCl , 0,15 M de citrate de sodium, pH7) et 0,1% SDS, respectivement pendant 2 fois 10 min avec du SSC 2x, pendant 2 fois 10 min avec du SSC lx, et pendant 2 fois 5 min avec du SSC 0 , lx ou telles que décrites par Sambrook et al. (§§ 9.47-9.51 in Molecular Cloning : A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)).
On peut aussi considérer comme homologues les séquences nucléotidiques présentant plus de 50% d'identité avec les séquences selon 1 ' invention, en particulier plus de 70%, l'identité étant déterminée par le rapport entre le nombre de bases nucléotidiques d'une séquence homologue qui sont identiques à celles d'une séquence selon l'invention, et le nombre total de bases nucléotidiques de ladite séquence selon l'invention, par exemple.
De même, on considérera comme homologues deux protéines fonctionnelles qui sont reconnues par un même anticorps, le rapport des valeurs d'intensité de reconnaissance des deux protéines par l'anticorps n'excédant pas 1000 dans un test ELISA, de préférence 100, par exemple. On considérera plus particulièrement comme homologues les séquences en acides aminés qui présentent plus de 70% d'identité avec les séquences selon l'invention, en particulier plus de 80%, de 85%, de 90% ou plus particulièrement plus de 95%. Dans ce dernier cas, l'identité est déterminée par le rapport entre le nombre d'acides aminés d'une séquence homologue qui sont identiques à celles d'une séquence selon l'invention, et le nombre total d'acides aminés de ladite séquence selon 1 ' invention.
Pour isoler une séquence nucleotidique de l'invention, en particulier un ADN recombiné, il est possible de constituer une banque de grands fragments d'ADN d'une bactérie lactique produisant un EPS dans une bactérie lactique ne produisant pas d'EPS, puis de sélectionner le ou les clone (s) produisant un EPS. Pour cela, on digère l'ADN génomique d'une bactérie lactique produisant un EPS par une enzyme de restriction qui est spécifique d'un site de restriction relativement rare (BaHI, Sali, PstI) ou par une digestion partielle avec Sau3A, par exemple. On clone le produit de digestion dans un plasmide d'expression ou d'intégration qui accepte de grands fragments (plasmide pSA3, Dao et al . , Appl . Environ. Microbiol . , 19., 115-119, 1985) , on introduit les plasmides recombinants dans la même espèce de bactérie lactique ne produisant pas d'EPS, on sélectionne au moins un clone transformé produisant un EPS, puis on identifie, on isole et on séquence classiquement le fragment d'ADN responsable de la production d'EPS.
Vu que les séquences nucléotidiques de l'invention, en particulier les ADNs, sont susceptibles d'être de grande taille, et qu'elles peuvent contenir un groupe de gènes impliqués dans la biosynthèse d'EPS, on peut préférer introduire les plasmides recombinants dans la même souche de bactérie lactique dont proviennent les fragments, à la différence près que cette souche a perdu la capacité de produire des EPS suite à un traitement mutagénique (traitement U.V. , chimique ou par transposon) . Une alternative consiste à constituer une banque plasmidique de fragments d'ADN d'une souche de bactérie lactique produisant un EPS, à transformer la même souche de bactérie lactique par les plasmides incapables de s'y répliquer, à sélectionner les transformants ayant intégré un plasmide dans leur génome par recombinaison homologue (sélection par une résistance à un antibiotique, par exemple) , à sélectionner les transformants ne produisant plus d'EPS, puis à isoler et séquencer les fragments d'ADN génomique des transformants sélectionnés qui sont adjacents au plasmide intégré. Pour cela, on peut digérer le chromosome des transformants, le liguer, puis effectuer une PCR-inverse à l'aide de sondes spécifiques du plasmide intégré ou introduire le produit de ligation dans une souche dans laquelle le plasmide recircularisé est capable de se répliquer, par exemple. Une autre alternative consiste à transformer des bactéries lactiques produisant un EPS par un plasmide comprenant un transposon, à soumettre les bactéries à des conditions dans lesquelles le transposon s'excise du vecteur et s'intègre au hasard dans le génome, à sélectionner les clones de bactéries ayant perdu la capacité de produire des EPS, à isoler les fragments d'ADN génomique desdits clones dans lesquels un transposon s'est intégré. Cette méthode est décrite plus en détail par Stingele et al . , Dev. Biol . Stand., In Genetics of Streptococci, Enterococci and Lactococci, 85., 487-493, 1995 (ISSN:0301-5149) .
Une dernière alternative consiste à préparer des amorces nucléotidiques dérivées de gènes connus impliqués dans la biosynthèse d'un EPS, puis à réaliser une PCR sur l'ADN génomique d'une bactérie lactique produisant un EPS et pour laquelle on désire identifier les gènes impliqués dans la biosynthèse de cet EPS. Cette technique est cependant excessivement difficile à mettre en œuvre, car le choix de la séquence nucleotidique des amorces sera déterminante dans l'isolement d'un gène. Puisque l'on ne connaît pas d'avance les homologies entre les gènes recherchés et les gènes connus, ce choix procède d'une démarche inventive, de par la nécessaire sélection opérée parmi une multiplicité d'amorces possibles.
Quelques critères peuvent cependant être retenus, tels que:
(1) la sélection d'une fonction enzymatique retrouvée souvent lors de la biosynthèse d'un EPS; (2) la sélection de séquences nucléotidiques conservées en comparant des gènes de diverses bactéries codant pour cette fonction enzymatique;
(3) la sélection de séquences conservées dont le contenu en nucléotides GC se rapproche le plus possible de l'organisme cible, même si pour cela on doit prendre comme point de départ de la sélection des séquences nucléotidiques retrouvées dans des organismes éloignés phylogéniquement de l'organisme cible (E. coli ) ;
(4) l'identification d'une partie dans les séquences conservées qui est naturellement plus riche en nucléotides GC;
(5) l'identification d'une partie dans les séquences conservées qui est peu dégénérée, c'est-à-dire codant pour des acides aminés qui sont eux-mêmes codées naturellement par 1 ou 2 codons, tel que la méthionine, le tryptophane, la glutamine ou l'acide glutamique, par exemple; etc.
Il faut remarquer que les méthodes de sélection décrites brièvement ci-dessus peuvent être appliquées à toutes les bactéries lactiques connues, notamment aux bactéries lactiques mésophiles comme par exemple Streptococcus cre oris, Streptococcus lactis, Lactobacillus casei subsp. casei et Lactobacillus sake, et les bactéries lactiques thermophiles comme par exemple Streptococcus thermophilus et Lactobacillus helveticus . A cet effet, l'homme du métier dispose de techniques de transformation pour chaque espèce de bactérie lactique.
De plus, ces méthodes de sélection permettent le plus souvent d'isoler seulement une partie d'un gène ou d'un groupe de gènes impliqués dans la biosynthèse d'un EPS. Néanmoins, l'homme du métier peut facilement identifier la partie restante du gène ou du groupe de gènes en sélectionnant dans une banque génomique, à l'aide de sondes nucléotidiques basées sur un fragment isolé, un ou plusieurs clones renfermant la partie restante, par exemple .
De préférence, l'objet de l'invention concerne la séquence nucleotidique SEQ ID NO : 1 ou son brin complémentaire, obtenue de la souche Streptococcus thermophilus déposée le 20 juin 1997 selon le traité de Budapest auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganisme (C.N.C.M.), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, France (numéro de dépôt CNCM 1-1897) . Cette souche Gram-positif présente au microscope un aspect de coques non flagellées formant des chaînettes, ne fait pas de spores et est anaéorobe facultative.
Cette séquence SEQ ID NO : 1 comprend des gènes codant pour de nouvelles enzymes impliquées dans la synthèse de l'EPS ayant la structure répétée suivante :
β-D-Galσl
6 →3)-β-D-Glc/.-(l-3)-β-D-Gal-(l→3)-α-D-Glc/.-(l→ Grâce aux connaissances acquises sur la biosynthèse des EPS décrits dans la littérature, notamment de l'EPS décrit dans EP-A-0750043 , on a pu identifier les nouvelles fonctions enzymatiques impliquées dans la biosynthèse de l'EPS ci-dessus. Les nouvelles enzymes impliquées dans la synthèse de cet EPS peuvent catalyser spécifiquement l'une des nouvelles liaisons suivantes entre saccharides :
- la liaison osidique β-1,3 entre le carbone 1 d'un D-Galf activé et le carbone 3 du Glcp présent à l'extrémité non-réductrice d'une chaîne saccharidique en formation, notamment la chaîne α/β-D-Glcp-amorce;
- la liaison osidique β-1,3 entre le carbone 1 d'un D-Glcp activé et le carbone 3 du Galf présent à l'extrémité non-réductrice d'une chaîne saccharidique en formation, notamment la chaîne β-D-Galf (l-»3) -α/β-D-Glcp-amorce;
- la liaison osidique β-1,6 entre le carbone 1 d'un D-Galp activé et le carbone 6 du Glcp présent à l'extrémité non- réductrice d'une chaîne saccharidique en formation, notamment la chaîne β-D-Glcp(l->3 ) β-D-Galf(l-»3) -α/β-D- Glcp-amorce; et,
- la liaison osidique α-1,3 entre les unités saccharidiques répétitives de l'EPS ci-dessus.
Les nouvelles enzymes recombinées présentent une faible homologie avec des enzymes connues. Ces nouvelles enzymes, identifiées à partir de la séquence SEQ ID NO : 1 , ont l'une des séquences en acides aminés choisie dans le groupe de séquences SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 et les séquences qui leur sont homologues.
Cette séquence SEQ ID NO : 1 contient des gènes impliqués dans la synthèse de cet EPS ( epsl -5) , codant pour des protéines ayant de très fortes homologies avec les protéines EpsA-D de S . thermophilus Sfi6 (EP-A-0750043) et de la protéine EpsE de S. salivarius (GenBank: N°X94980) . Ces hauts degrés d'homologie sont inattendus compte tenu du fait que la structure de l'EPS produit par la souche CNCM 1-1897 est suffisamment différent de celui de la souche Sfi6, pour que l'on puisse s'attendre à ce que les enzymes de la souche CNCM 1-1897 soient différentes de celles de la souche Sfi6.
Les protéines codées par ces gènes présentent des spécificités enzymatiques nouvelles les rendant particulièrement attractives pour la création de nouvelles liaisons entre saccharides, ou pour faire varier la longueur de la chaîne d'EPS, ou même pour réguler différemment la production de l'EPS. Une de ces nouvelles enzymes est une glycosyltransférase ayant spécifiquement la séquence en acides aminés SEQ ID NO : 6 , les séquences homologues étant bien entendu exclues pour des raisons de nouveauté. Les autres nouvelles enzymes sont impliquées dans la régulation de la production de l'EPS et de la longueur de la chaîne, et ont spécifiquement l'une des séquences en acides aminés choisie dans le groupe de séquences SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 et SEQ ID NO:5, les séquences homologues étant bien entendu exclues pour des raisons de nouveauté. La présente invention vise également toute séquence nucleotidique, en particulier un ADN recombiné, codant pour une enzyme selon l'invention, c'est à dire l'une des enzymes choisies dans le groupe de séquences SEQ ID NO:2, SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO: 10 et SEQ ID NO: 11. En particulier, cet ADN peut comprendre au moins un gène ayant l'une des séquences nucléotidiques choisie parmi les séquences délimitées dans la séquence SEQ ID NO:l par les nucléotides 1-687, 690-1418, 1429-2119, 2131-2870, 2929-4244, 5933-7978, 8003-8969, 10138-11086, 11438-12852, 14220-15315 et les séquences qui sont homologues aux séquences délimitées dans la séquence SEQ ID NO:l par les nucléotides 5933-7978, 8003-8969, 10138-11086, 11438-12852 et 14220-15315.
Selon une deuxième forme d'exécution préférée de l'invention, la séquence nucleotidique de l'invention est la séquence nucleotidique SEQ ID NO: 12 ou son brin complémentaire, obtenue de la souche Lactobacillus helveticus LH59 qui a été déposée le 27 juillet 1994 selon le traité de Budapest auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganisme (C.N.C.M.), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, France (numéro de dépôt CNCM 1-1449) . Cette souche Gram-positif présente au microscope un aspect de bâtonnets non flagellées, ne fait pas de spores et est anaéorobe facultative.
Cette séquence SEQ ID NO: 12 comprend des gènes codant pour de nouvelles enzymes impliquées dans la synthèse de 1 ' EPS ayant la structure répétée suivante :
β-D-Gal/ (l→4)-β-D-Glc/.1 i
→5)-β-D-Gal/-(l→3)-α-D-Gal/7-(l→3)-α-D-Glc/j-(l→3)-β-D-Glcp-(l-
Ces nouvelles enzymes impliquées dans la synthèse de cet EPS peuvent ainsi catalyser spécifiquement l'une des nouvelles liaisons suivantes entre saccharides :
- la liaison osidique α-1,3 entre le carbone 1 d'un D-Glcp activé et le carbone 3 d'un Glcp appartenant à l'extrémité non-réductrice d'une chaîne saccharidique en formation, notamment la chaîne suivante : α/β-D-Glcp- amorce ;
- la liaison osidique α-1,3 entre le carbone 1 d'un D-Galp activé et le carbone 3 d'un Glcp présent à l'extrémité non-réductrice d'une chaîne saccharidique en formation, notamment la chaîne suivante : α-D-Glcp- (l-»3) -β/α-D- Glcp-amorce;
- la liaison osidique β-1,3 entre le carbone 1 d'un D-Galf activé et le carbone 3 d'un Galp présent à l'extrémité non-réductrice d'une chaîne saccharidique en formation, notamment la chaîne suivante : α-D-Galp- (1—>3) -α-D-Glcp- (l-»3) -β/α-D-Glcp-amorce;
- la liaison osidique β-1,3 entre le carbone 1 d'un D-Glcp activé et le carbone 3 d'un Galf présent à l'extrémité non-réductrice d'une chaîne saccharidique en formation, notamment la chaîne suivante : β-D-Galf- (l-*3) -α-D-Galp- (1→3) -α-D-Glcp- (1-.3) -β-D-Glcp-amorce;
- la liaison osidique β-1,4 entre le carbone 1 d'un D-Galp activé et le carbone 4 du Glcp présent à l'extrémité non- réductrice d'une chaîne saccharidique en formation, notamment la chaîne suivante : β-D-Glcp- (1—»3) -β-D-Gal - (1→3) -α-D-Galp- (l-3) -α-D-Glcp- (l-»3) -β-D-Glcp-amorce; et, - la liaison osidique β-1,5 entre les unités saccharidiques répétitives de l'EPS ci-dessus.
Les nouvelles enzymes recombinées, identifiées à partir de la séquence SEQ ID NO: 12, ont l'une des séquences en acides aminés choisie dans le groupe de séquences SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, et les séquences qui leur sont homologues.
La présente invention vise également toute séquence nucleotidique, en particulier tout ADN, recombinée codant pour une enzyme selon l'invention, c'est à dire les enzymes choisies dans le groupe de séquences SEQ ID NO: 13,
SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19. En particulier, cet ADN peut comprendre au moins un gène ayant 1 ' une des séquences nucléotidiques choisies parmi les séquences délimitées dans la séquence SEQ ID NO: 12 par les nucléotides 1053-1730, 1734-2849, 2852-3943, 3930-5084, 5077-6096, 6099-7091, 7096-8259, 8284-8910 et les séquences qui leur sont homologues .
Selon une troisième forme d'exécution préférée de l'invention, la séquence nucleotidique de l'invention est la séquence nucleotidique SEQ ID NO:20 ou son brin complmentaire, obtenue de la souche Lactobacillus delbrueckii bulgaricus Sfi5 déposée le 4 octobre 1988 selon le traité de Budapest, auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganisme (C.N.C.M.), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, France (numéro de dépôt CNCM 1-800) . Par ailleurs, cette souche Gram-positif présente au microscope un aspect de bâtonnets non-flagellés, est non- sporulante et anaéorobe facultative.
Cette séquence SEQ ID NO: 20 comprend des gènes codant pour de nouvelles enzymes impliquées dans la synthèse de l'EPS ayant la structure répétée suivante :
β-D-Galp α-L-Rhap β-D-Galp
1 1 1
>3)-β-D-Gal/7(1→4)-α-D-Galp(1→2)-α-D-Galp(1→3)-β-D-Glcp(1-
Ces nouvelles enzymes impliquées dans la synthèse de cet EPS peuvent ainsi catalyser spécifiquement l'une des nouvelles liaisons suivantes entre saccharides :
- la liaison osidique β-1,3 entre le carbone 1 d'un D-Galp activé et le carbone 3 du saccharide présent à l'extrémité non-réductrice d'une chaîne saccharidique en formation, ladite chaîne étant composée notamment d'une chaîne principale de 1 à 4 D-Galp et/ou D-Glcp liés entre-eux par des liaisons osidiques α-1,2, α-1,3, β-1,4 et/ou β-1,3, et ledit saccharide présent à l'extrémité non-réductrice étant lié à un seul autre saccharide par son carbone 1 ; - la liaison osidique β-1,4 entre le carbone 1 d'un D-Galp activé et le carbone 4 du saccharide présent à l'extrémité non-réductrice d'une chaîne saccharidique en formation, ladite chaîne étant composée notamment d'une chaîne principale de 1 à 4 D-Galp et/ou D-Glcp liés entre-eux par des liaisons osidiques α-1,2, α-1,3, β-1,4 et/ou β-1,3, et ledit saccharide présent à l'extrémité non-réductrice étant lié à un seul autre saccharide par son carbone 1 ; - la liaison osidique α-1,3 entre le carbone 1 d'un L-Rhap activé et le carbone 3 du saccharide présent à l'extrémité non-réductrice d'une chaîne saccharidique en formation, ladite chaîne étant composée notamment d'une chaîne principale de 1 à 4 D-Galp et/ou D-Glcp liés entre-eux par des liaisons osidiques α-1,2, α-1,3, β-1,4 et/ou β-1,3, et ledit saccharide présent à l'extrémité non-réductrice étant lié à un seul autre saccharide par son carbone 1.
La chaîne saccharidique en formation peut être composée simplement d'une chaîne principale sans ramification de 1 à 4 D-Galp et/ou D-Glcp liés entre-eux par des liaisons osidiques α-1,2, α-1,3, β-1,4 et/ou β-1-3.
A titre d'exemple, cette chaîne peut être choisie parmi les chaînes tetra-sacchridiques suivantes, ainsi que leurs précurseurs mono-, di- ou tri- saccharidique (s) : α-D-Galp(l→3)-β-D-Glc/.(l-3)-β-D-Gal(l→4)-α/β-D-Galp-amorce; α-D-Galp(l→2)-α-D-Galp(l->3)-β-D-Glc/7(l→-3)-β/α-D-Galp-amorce; β-D-Gal/?(l→'4)-α-D-Galp(l→2)-α-D-Galp(l→3)-β/α-D-Glc/7-amorce ; et β-D-Glcp(1→3)-β-D-Gφ(l→4)-α-D-Gφ(l→2)-β/α-D-Gal/.-amorce.
La chaîne saccharidique en formation peut être aussi composée d'une chaîne principale comprennant en outre 1 ou 2 saccharides ramifiés, tels que D-Galp et/ou L-
Rhap. Ces saccharides ramifiés peuvent être • liés sur la chaîne principale en β-1,3, β-1,4 ou α-1,3, par exemple.
A titre d'exemple, cette chaîne peut être choisie parmi les chaînes principales tetra-sacchridiques suivantes, ainsi que leurs précurseurs mono-, di- ou tri- saccharidique (s) : α-D-Gal/ 1→3)-β-D-Gl (1→3)-[β-D-Galp(1→4)]-β-D-Gal/>(1→4)-[α-LRhap(1→3)]-α/β-D-Gal/>-amorce ; α-D-Gal/.(1→2)-[β-D-Galp(1→3)]-α-D-Gal/>(l→3)-β-D-Glçp(1→3)-[β-D-Gal/.(1→4)]-β/α-D-Gal/>-amorce ; β-D-Galp(l→4)-[α-Rhap(l→3)]-α-D-Gal^(l→2) β-D-Galp(l→3)]-α-D-Galp(l→3)-β/α-D-Glcp-amorce;et β-D-Glc/>(1→3)-[β-D-Gal/>(1→4)]-β-D-Galp(l→4)-[α-LRhap(1→3)]-α-D-Gal/.(1→2)-[β-D-Gal/>(1→3)]- β/α-D-Gal -amorce.
De préférence, une des nouvelles enzymes selon l'invention catalyse la liaison osidique α-1,3 entre le carbone 1 d'un L-Rhap activé et le carbone 3 du galactose présent à l'extrémité non-réductrice d'une des chaînes saccharidiques ci-dessus.
De préférence, une des nouvelles enzymes selon l'invention catalyse la liaison osidique β-1,3 entre le carbone 1 d'un D-Galp activé et le carbone 3 du galactose présent à l'extrémité non-réductrice d'une des chaînes saccharidiques ci-dessus.
De préférence aussi, une des nouvelles enzymes selon l'invention catalyse la liaison osidique β- 1,4 entre le carbone 1 d'un D-Galp activé et le carbone 4 du galactose présent à l'extrémité non-réductrice d'une des chaînes saccharidiques ci -dessus. Les nouvelles enzymes recombinées, identifiées à partir de la séquence d'ADN SEQ ID NO: 20, ont l'une des séquences en acides aminés choisie dans le groupe de séquences SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, et les séquences qui leur sont homologues .
La présente invention vise également toute séquence nucleotidique, en particulier tout ADN, recombinée codant pour une enzyme selon l'invention, c'est à dire l'une des enzymes choisie dans le groupe de séquences SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 et SEQ ID NO: 29. En particulier, cet ADN peut comprendre au moins un gène ayant l'une des séquences nucléotidiques choisie parmi les séquences délimitées dans la séquence SEQ ID NO: 20 par les nucléotides 9-353, 516-1292, 1323-1982, 2074-3174, 3246-4373, 4511-5317. 5335-6204, 6709-7692, 7723-8784, et les séquences qui leur sont homologues. De manière inattendue, les inventeurs ont identifié sur certaines séquences de 1 ' invention, en particulier sur la séquence SEQ ID NO : 1 , des portions IS disposées respectivement en amont et en aval des séquences codant pour les enzymes de l'invention. Ces séquences IS permettent de manière avantageuse d'utiliser directement la séquence de l'invention comme un "transposon" et de pratiquer éventuellement une coculture de microorganismes sans vecteur et d'obtenir l'expression de ces enzymes dans les cellules ayant perdu le caractère filant initial, ce qui permet la synthèse d' exopolysaccharides par lesdites cellules transformées.
La présente invention vise aussi tout vecteur recombinant comprenant la séquence nucleotidique de l'invention. Ce vecteur recombinant peut être tout fragment d'acide nucléique, tel qu'un ADN simple brin ou double brin, linéaire ou circulaire, d'expression ou d'intégration, et comprenant une séquence nucleotidique de l'invention, notamment tout ou partie de la séquence SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 20. Dans le cas où le procédé décrit dans EP564966 ne serait pas utilisé (voir ci -après) , il faut veiller à ce que le vecteur exprime l'ADN selon l'invention par des séquences nucléotidiques adaptées (promoteur; site d'attachement du ribosome; codon préféré par l'organisme hôte, etc.), et le cas échéant à ce qu'il comprenne une ou plusieurs origines de réplication cellulaire, notamment d' Escherichia coli et/ou d'un Streptococcus, pour former le vecteur navette de 1 ' invention. Ainsi, pour opérer la biosynthèse d'un EPS, on peut intégrer tout ou partie de la séquence nucleotidique de l'invention comprenant au moins un des gènes précités dans une cellule hôte au moyen du procédé décrit dans EP-A-0564966, ledit procédé étant incorporé par référence dans l'enseignement de la présente invention. En résumé, ce procédé permet de pouvoir :
(1) transformer la cellule hôte avec un plasmide donneur qui ne s'y réplique pas, ledit plasmide comprenant ledit fragment placé fonctionnellement (le cadre de lecture est conservé) dans une partie d'un opéron issu de la cellule hôte;
(2) identifier les transformants ayant intégré la totalité du plasmide;
(3) sélectionner des transformants ayant uniquement intégré dans le chromosome le fragment selon l'invention, les autres séquences du plasmide s 'étant excisées du chromosome ; et
(4) cultiver les transformants sélectionnés dans des conditions appropriées pour la production d'un EPS. On peut noter que ce procédé permet de ne pas utiliser des séquences promotrice et d'activation traductionnelle fonctionnelles. De plus, les conditions de culture appropriées pour la production d'EPS sont à la portée de l'homme du métier, qui peut utiliser des milieux de culture standards, et choisir le pH, la température et l'agitation du milieu optimum selon la souche utilisée.
On peut aussi choisir de cloner tout ou partie de la séquence SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 20, comprenant au moins un des gènes précités dans un plasmide d'expression auto-réplicatif en aval de séquences promotrice et d'activation traductionnelle fonctionnelles, et le cas échéant en amont d'un terminateur, puis de transformer une cellule hôte par le plasmide recombinant. On peut aussi utiliser les enzymes recombinées pour modifier ou synthétiser in-vi tro un oligosaccharide ou un polysaccharide comme un EPS, par exemple. Pour cela, il est préférable de purifier au moins une de ces enzymes, en sur-exprimant classiquement leur gène dans une cellule, et en les isolant classiquement, par précipitation et/ou chromatographie (du milieu de culture et/ou de la partie membranaire des cellules), par exemple.
Un autre objet de la présente invention concerne une cellule comprenant, intégré dans son génome ou par le moyen d'un plasmide réplicable, une séquence nucleotidique de l'invention, et exprimant une enzyme recombinée fonctionnelle selon l'invention. Cette cellule peut faire partie du groupe des moisissures, des levures, des bactéries et des plantes, par exemple. De préférence, les levures appartiennent aux genres Saccharomyces, Kluyveromyces , Hansenula et Pichia ; les bactéries sont Gram-négative ou positive appartenant au genre Escherichia , Bacillus, Lactobacillus , Lactococcus, Streptococcus et Staphylococcus ; les cellules de plantes appartiennent aux légumineuses, et aux espèces céréalières et ligneuses ; tandis que les moisissures sont les cellules traditionnellement utilisées pour préparer un koji comme les Aspergillus, Rhizopus et/ou Mucor. Un autre objet de la présente invention concerne un procédé de production d'un EPS, dans lequel :
(1) on clone dans un vecteur un fragment d'une séquence nucleotidique codant pour au moins l'une des enzymes selon l'invention, ledit vecteur comprenant en outre une séquence permettant la réplication autonome ou l'intégration dans une cellule hôte;
(2) on transforme une cellule hôte par ledit vecteur, ladite cellule hôte utilisant les enzymes codées par le vecteur, le cas échéant en combinaison avec d'autres enzymes produites par la cellule hôte si le vecteur n'apporte pas tous les enzymes nécessaires à la biosynthèse d'un EPS, pour la biosynthèse d'un EPS; et
(3) on cultive ensuite la cellule hôte transformée dans des conditions appropriées pour la production d'un EPS. Si l'on ne met pas en œuvre le procédé décrit dans EP-A-0564966, le vecteur doit alors comprendre en outre au moins une séquence promotrice fonctionnelle et au moins une séquence d'activation traductionnelle fonctionnelle, permettant l'expression des gènes codant pour au moins l'une des enzymes selon l'invention.
La présente invention a aussi pour objet un nouveau procédé de synthèse d'un EPS, qui est constitué par l'assemblage répété d'une seule unité saccharidique, elle- même formée d'une chaîne principale de saccharides dont les extrémités sont impliquées dans la polymérisation des unités, dans lequel on utilise plusieurs enzymes recombinées ou plusieurs gènes recombinants susceptibles d'être impliqués dans la biosynthèse de l'EPS ayant l'unité saccharidique répétitive : β-D-Gal/.-(l→4)-β-D-Glcp 1
3 →5)-β-D-Gal/-(l->3)-α-D-Gal/7-(l→3)-α-D-Glc/j-(l→3)-β-D-Gl -(l→ caractérisé en ce que ces enzymes ou ces gènes, notamment choisis parmi les enzymes ou les gènes selon l'invention, permettent la création sur la chaîne principale de l'unité saccharidique d'une ou plusieurs ramifications lactose (β- D-Galp- (1—>4) -β-D-Glcp) liées à un saccharide de la chaîne principale par leur glucose.
De préférence, la chaîne principale de l'unité saccharidique est constituée d'au moins 2 saccharides choisis parmi D-Galp, D-Galf et/ou D-Glcp. De plus, le carbone 1 du glucose de la ramifications lactose peut être lié par une liaison osidique β à l'un des carbones 2-6 d'un des saccharides de la chaîne principale, par exemple, de préférence le carbone 3 ou 6 d'un D-Galf.
Lors de la mise oeuvre de ce procédé, on peut utiliser en outre une enzyme ou un gène qui permet la liaison entre un N-acétyl-galactosamine et le galactose de la ramification lactose. On peut aussi utiliser en outre une enzyme ou un gène qui permet la liaison entre l'acide N-acétyl-neuraminique et le galactose de la ramification lactose, par exemple.
Ce procédé de synthèse peut être mis en oeuvre in vi tro, en utilisant les enzymes recombinantes et leurs substrats appropriés. On peut aussi le mettre en oeuvre in vivo, en clonant les gènes appropriés et en les faisant s'exprimer de sorte que les enzymes recombinées ainsi produites biosynthétisent un EPS en présence de leurs substrats, par exemple.
La présente invention a également pour objet un nouveau polysaccharide branché, constitué par l'assemblage répété d'une seule unité saccharidique, elle- même formée d'une chaîne principale de saccharides dont les extrémités sont impliquées dans la polymérisation des unités, caractérisé en ce que la chaîne principale comprend au moins une ramification lactose liée à un saccharide de la chaîne principale par son glucose, le galactose de cette ramification étant en outre lié à un N-acétyl- galactosamine .
Le carbone 1 du glucose de la ramifications lactose peut être lié par une liaison osidique β à l'un des carbones 2-6 d'un des saccharides de la chaîne principale, de préférence le carbone 3 ou 6 d'un D-Galf, par exemple.
Pour des raisons de nouveauté, ce polysaccharide ne peut pas être constitué par la répétition de l'unité saccharidique suivante :
β-D-Gal/>Nac-(l→4)-β-D-Galp-(l→4)-β-D-Glc/>
1 71 3
→5)-β-D-Gal/-(l->3)-α-D-Galp-(l→3)-α-D-Glcp-(l-3)-β-D-Glcp(l- En effet, le brevet NZ-272795 (Société des
Produits Nestlé) préconise déjà d'ajouter par voie enzymatique un N-acétylgalactosamine sur le galactose des ramifications contenues dans l'EPS de la souche LH59.
Pour obtenir- ce nouveau polysaccharide, il suffit par exemple de mettre en oeuvre le procédé de synthèse décrit ci-dessus de sorte à obtenir un EPS différent de celui produit par la souche LH59, puis d'utiliser une β-1, 4-N-acétylgalactosaminyltransférase en présence de son substrat, notamment celle décrite par Lutz et al . et Yamashiro et al . (J. of Biol . Chem. , 269, 29227- 29231, 1994; J. of Biol. Chem., 220, 6149-6155, 1995). On peut aussi purifier d'un milieu de culture un EPS différent de celui produit par la souche LH59, puis de lui adjoindre un N-acétylgalactosamine sur le galactose des ramifications lactose. L'EPS produit par la souche L. helveticus TY1-2 peut ainsi représenter une cible de choix (Y. Yamamoto et al . , Carbohydrate Research, 261 , 67-78, 1994), par exemple. Cet EPS est constitué par la répétition de l'unité saccharidique suivante :
β-D-Gal/.-(l→4)-β-D-Glcp 1 6
-6)-β-D-Glc/>(1→3)-β-D-Glc/?-(1→6)-α-D-GlçpNac-(1→3)-β-D-Gal/.(l→
1 .__
4 β-D-Gφ
Le nouveau polysaccharide selon 1 ' invention peut également comprendre un acide N-acétyl-neuraminique lié sur le galactose de la ramification lactose. Pour cela, on peut utiliser une α-2 , 6-sialyltransférase, notamment celles décrites par Simth et al . , Sjoberg et al . et/ou Yamamoto et al . , (J. of Biol. Chem., 269, 15162-15171, 1994; J. Biochem. , 271, 7450-7459, 1996; Biosci . Biotech. Biochem. , £2, 210-214, 1998), ou une α-2,3- sialyltransférase, notamment celle commercialisée par Calbiochem® (Cat No.566218-M, USA), par exemple.
La présente invention est décrite plus en détail ci-après à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'obtention de fragments d'ADN, de plasmides recombinants et de bactéries transformées selon l'invention. Ces exemples sont précédés d'une description des milieux de culture. Il va de soi, toutefois, que ces exemples sont donnés à titre d'illustration de l'objet de l'invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. La manipulation de l'ADN, le clonage et la transformation de cellules bactériennes sont, en l'absence de précisions contraires, effectués selon les protocoles décrits dans l'ouvrage de Sambrook et al . (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S. ., 1989). Les pourcentages sont donnés en poids/poids, sauf indication contraire.
Milieux : (rajouter 1,5% de Bacto-agar pour un milieu solide)
- M17 (Difco,USA) : tryptone 0,5%, soytone 0,5%, viande hydrolysée 0,5%, extrait de levure 0,25%, acide ascorbique 0,05%, sulphate de magnésium 0,025%, disodium- beta-glycérophosphate 1,9% et de l'eau.
- LM17: milieu M17 comprenant 1% de lactose. - GM17: milieu M17 comprenant 1% de glucose.
- MSK: lait écrémé (poudre reconstituée à 10%) comprenant 0,1% d'extrait de levure.
- HJL: tryptone 3%, extrait de boeuf 0,2%, extrait de levure 1%, lactose 1% et KH P04 pH 6,5 0,5%. - Rouge de Ruthénium: extrait de levure 0,5%, lait en poudre écrémé 10%, sucrose 1%, agar 1,5% et 0,08g/l de rouge de ruthénium (voir FR-2632968) .
- MRS: protêose peptone 1%, extrait de bœuf 1%, extrait de levure 0,5%, dextrose 2%, tween 80 0,1%, citrate d'ammonium 0,2%, acétate d'ammonium 0,5%, phosphate de di-potassium 0,2%, sulfate de magnésium 0,lg/l, et sulfate de manganèse 0,05 g/1.
- LB: tryptone 0,5%, extrait de levure 0,25%, et NaCl 1%. Exemples
Exemple I : clonage de 1 ' opéron de S . thermophilus CNCM 1-1897 impliqué dans la synthèse d'un EPS
1 . Sélection d ' une souche S. thermophilus productrice d 'EPS
On cultive les souches de bactéries lactiques de la collection Nestlé dans un milieu liquide HJL et on en étale des dilutions sur un milieu solide Rouge de Ruthénium. Les souches productrices d'EPS demeurent de couleur blanche car les EPS empêchent le colorant de teinter leur paroi cellulaire. Par contre, les souches non- productrices se colorent en rouge du fait de l'affinité du colorant pour le peptidoglycane de leur paroi cellulaire. On a ainsi sélectionné parmi les bactéries lactiques productrices d'EPS la souche S . thermophilus Sfi39, qui a reçu le numéro de dépôt CNCM 1-1897 et que l'on désignera dans la suite des exemples par l'expression "souche Sfi39".
2 . Structure répétée de l 'EPS La structure de l'EPS produit par la souche
Sfi39 a déjà été présentée dans la demande de brevet EP-97111381.6, dont le contenu technique est incorporé par référence dans la description.
3. Clonage
L'approche tentée afin d'isoler les gènes eps de la souche Sfi39 est basée sur la comparaison de gènes eps connus (ceux de S . thermophilus) et de leurs homologues (gènes cap, eps, rfb) d'espèces variées, et même d'espèces non-apparentées phylogeniquement, comme des espèces Gram- négatif. Ces comparaisons permettent ainsi de définir des régions conservées entre les espèces, et d'utiliser des amorces nucléotidiques dérivées de ces régions conservées afin d'amplifier par PCR une partie interne de 1 ' opéron eps de la souche Sfi39. Cette approche s'est malheureusement heurtée à une impossibilité d'amplifier un gène eps, quelles que soient les amorces choisies. Les raisons ayant conduit à ces échecs peuvent être multiples, par exemple liées à une faible homologie entre les gènes eps de la souche Sfi39 et ceux des régions conservées, ou à des conditions de PCR inadéquates, etc.
Face à ces échecs, on a décidé de sélectionner, puis d'utiliser dans une PCR, des amorces nucléotidiques particulièrement dégénérées. Le choix de ces amorces spécifiques a en fait été déterminant pour l'amplification d'un gène eps de la souche Sfi39, et a été motivé par les considérations suivantes :
(1) la sélection d'une fonction enzymatique retrouvée souvent lors de la biosynthèse d'un EPS;
(2) la sélection de séquences nucléotidiques conservées en comparant des gènes de diverses bactéries codant pour cette fonction enzymatique;
(3) la sélection de séquences conservées dont le contenu en nucléotides GC se rapproche le plus possible de l'organisme cible, même si pour cela on doit prendre comme point de départ de la sélection des séquences nucléotidiques retrouvées dans des organismes éloignés phylogeniquement de l'organisme cible (E. coli) ; (4) l'identification d'une partie dans les séquences conservées qui est naturellement plus riche en nucléotides GC;
(5) l'identification d'une partie dans les séquences conservées qui est peu dégénérée, c'est-à-dire codant pour des acides aminés qui sont eux-mêmes codés naturellement par 1 ou 2 codons, tel que la méthionine, le tryptophane, la glutamine ou l'acide glutamique, par exemple; etc. Parmi les amorces testées, celles ayant les séquences nucléotidiques SEQ ID NO: 39 et SEQ ID NO: 40, ont permis d'amplifier un fragment de gène eps dans les conditions de PCR suivantes : successivement 2 min à 95°C, 1 min à 42°C, 20 s à 72°C, puis 35 fois de suite le cycle de 30 s à 94°C, 1 min à 42°C et 20 s à 72°C. Pour cela, l'ADN génomique de la souche Sfi39 a été au préalable isolée selon la technique de Slos et al . (Appl . Environ. Microbiol., 57, 1333-1339, 1991). On utilise environ 100 ng d'TADN génomique et la Taq polymérase.
Un fragment de PCR de 143 pb a ainsi pu être isolé, puis clone dans le plasmide linéarisé pGEMT (Promega, USA) . Le séquencage de ce fragment par la méthode des didéoxynucléotides (kit f-mol® DNA Sequencing System, Promega) indique une séquence correspondant aux nucléotides 4006 à 4149 de la séquence SEQ ID NO:l.
Ce fragment de PCR a été utilisé pour cribler une banque λ-ZAP Express (Stratagene, USA) renfermant des fragments d'ADN de la souche Sfi39. Pour cela, selon les recommandations du fournisseur on digère partiellement une préparation d'ADN dudit mutant par Sau3A, on sépare les fragments par une électrophorèse sur gel d'agarose, on coupe du gel les bandes correspondant à des fragments de 5 à 12kb, on élue l'ADN, puis on le ligue au vecteur λ-ZAP Express préalablement digéré par BamHI. On encapside in- vi tro le produit de ligation à l'aide du système GigagoldlII (Stratagene) , on mélange ensuite les phages avec des Escherichia coli XLIBlue (Stratagene) selon les recommandations du fournisseur, puis on étale le mélange sur boîte de Pétri. On analyse ensuite les plaques recombinantes par hybridation de leur ADN transféré sur une membrane Hybond-N (Amersham Life Sciences, UK) avec le fragment de PCR préalablement rendu radioactif (kit Random Primed DNA Labeling, Boehringer-Manheim) .
Parmi les nombreuses plaques recombinantes, on a pu sélectionner par hybridation plusieurs plaques positives, desquelles on a ensuite isolé les vecteurs λ-ZAP Express, puis excisé les vecteurs pBK-PCMV (pCMV) renfermant 1 ' insert génomique (voir les recommandations du fournisseur Stratagene) . On a ensuite séquence les inserts génomiques de ces vecteurs pCMV (kit f-mol® DNA Sequencing System) . En recoupant les séquences nucléotidiques des différents inserts génomiques, on a pu ainsi caractériser la séquence SEQ ID NO:l correspondant à 1 'opéron de la souche Sfi39 impliqué dans la synthèse d'un EPS (voir la figure 1) . Cette séquence comprend également en amont et en aval de ses séquences codantes, des séquences IS permettant l'utilisation directe des séquences de l'invention en transfection par coculture sans vecteur.
4. Analyse de la séquence SEQ ID NO: l La séquence SEQ ID NO : 1 présente 1 Opéron eps de la souche Sfi39 et comprend 10 ORFs complets, dans la même orientation, que l'on appelle epsl, eps2, eps3 , eps4, eps5, epsβ, eps7 , eps8, eps9 et epεl O (voir figure 1) . La comparaison des séquences en acides aminés codées par les ORFs avec celles de protéines présentes dans la banque de donnée Swiss-Prot, à l'aide des logiciels FASTA, PEPPLOT et PILEUP de GCG-soft ear, isconsin, USA, permet de déduire la fonction de ces protéines. Les résultats sont présentés ci-après . Les ORFs epsl (nucléotides 2703-3389), eps2
(nucléotides 3390-4118) , eps3 (nucléotides 4130-4819) , eps4
(nucléotides 4832-5527) et eps5 (nucléotides 5629-6993) ont plus de 80% d'identité avec les gènes epsA, epsB, epsC et epsD de la souche S . thermophilus Sfi6 décrits dans EP750043 (Genbank, n°U40830) , et avec le gène epsE de S. salvarius (GenBank, n°X94980) . Ces ORFs codent respectivement pour des protéines ayant plus de 90% d'identité avec les protéines EpsA, EpsB, EpsC, EpsD et EpsE de S. thermophilus et S. salivarius . Ces hauts degrés d'identité sont inattendus compte tenu du fait que la structure de l'EPS produit par la souche Sfi39 est suffisamment différent de celui de la souche Sfi6, pour que l'on puisse supposer que les enzymes de la souche Sfi39 soient différentes de celles de la souche Sfi6. Les protéines codées par les gènes epsl -5, bien que très proches des protéines EpsA-D et EpsE, présentent cependant des spécificités enzymatiques nouvelles (voir ci-dessus) les rendant particulièrement attractives pour la création de nouvelles liaisons entre saccharides ( eps5) , ou pour faire varier la longueur de la chaîne d'EPS ou même pour réguler différemment la production de l'EPS ( epsl -4) . Les ORF epsl , eps2 , eps3 , eps4 et eps5 codent respectivement pour des protéines ayant les séquences en acides aminés SEQ ID NO:2, SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO: 6.
L'ORF epsβ (nucléotides 8633-10678) code pour une protéine (SEQ ID NO: 7) ayant environ 20% d'identité avec la protéine RfbC de Klebsiella pneumaniae (Genbank, n°L41518) . Cette homologie confirme son rôle dans la biosynthèse de l'EPS.
L'ORF eps7 (nucléotides 10703-11668) code pour une protéine (SEQ ID NO: 8) ayant environ 33% d'identité avec la protéine Epsl de S . thermophilus Sfi6. Cette homologie indique que la protéine est de toute évidence une beta-glycosyltransférase .
L'ORF epsδ (nucléotides 12838-13785) code pour une protéine (SEQ ID NO: 9) ayant environ 30% d'identité avec la protéine Epsl de S . thermophilus Sfi6. Cette homologie indique que la protéine est de toute évidence une beta-glycosyltransférase .
L'ORF eps9 (nucléotides 14138-15553) code pour une protéine (SEQ ID NO: 10) ayant environ 40% d'identité avec la protéine EpsK de Lactococcus lactis
(GenBank n°U93364) . Cette homologie indique que la protéine est probablement le transporteur de l'unité répétitive dans le milieu extérieur. L'ORF epsl O (nucléotides 16919-18013) code pour une protéine (SEQ ID NO: 11) ayant environ 62% d'identité avec la protéine Galf d' Escherichia coli
(GenBank n°U03041) . Cette homologie confirme son rôle dans la biosynthèse de l'EPS, en catalysant la conversion de la forme pyranose à la forme furanose d'un β-D-Gal.
En conclusion, les inserts génomiques isolés des vecteurs pCMV couvrent une région génomique de la souche S . thermophilus Sfi39 qui est manifestement impliquée dans la biosynthèse de l'EPS.
Exemple II : inactivation des gènes eps
On inactive par recombinaison homologue les gène epsl -10 de 1 ' opéron pour confirmer leur importance dans la biosynthèse de l'EPS. Pour cela, on amplifie par PCR un fragment de chaque ORF provenant d'un des vecteurs pCMV décrits à l'exemple I ci -dessus, on ligue le produit de PCR dans le plasmide thermo-sensible pSA3 préalablement digéré, on transforme la souche E. coli XLl-blue par le produit de ligation, on sélectionne des transformants, on isole un plasmide recombinant, puis on transforme par électroporation la souche S . thermophilus Sfi39 avec le plasmide recombinant au moyen d'une méthode adaptée de celle décrite par Slos et al . (1991) . On resuspend les cellules soumises à une décharge de 2,lkV, 25μF et 400Ω dans 1 ml de milieu HJL que l'on incube 4h à 37°C
(température permissive) , on étale les cellules sur un milieu solide LM17 supplémenté de 2 , 5μg/ml d' erythromycine que l'on incube 16 h à 37°C, puis on sélectionne les colonies transformées qui survivent. On incube ensuite les colonies sélectionnées dans 2 ml de milieu HJL supplémenté de 2,5 μg/ml d ' erythromycin jusqu'à ce que la densité optique à 600 nm (DOgoo) de ^a culture atteigne 0,2, on soumet la culture à 45°C jusqu'à ce que la DOgoo atteigne 1,0 (le plasmide ne se réplique plus), puis on étale des dilutions de la culture sur un milieu LM17 solide supplémenté de 2,5 μg/ml d ' erythromycine que l'on incube 12 h à 45°C. Les colonies qui survivent ont intégré dans un des 10 gènes eps le plasmide pSA3 recombinant. Ceci peut être vérifié par Southern-Blot d'une préparation d'ADN génomique des colonies survivantes digérée par EcoRI (coupe une seule fois dans pSA3), et hybridation du filtre de Southern-Blot avec le produit de PCR rendu radioactif. Les colonies ayant intégré le plasmide pSA3 présentent des bandes différentes que celles obtenues dans les mêmes conditions avec la souche sauvage. De plus, les colonies ayant intégré dans un des 10 gènes eps le plasmide pSA3 recombinant présentent un phénotype EPS(-) sur un milieu solide Rouge de Ruthénium, et ont perdu leur caractère filant dans un lait MSK.
Exemple III : Biosynthèse d'un EPS On prépare un plasmide à partir du plasmide pSA3 (Dao et al . , Appl . Environ. Microbiol . , 49. , 115-119, 1985) , en ajoutant un fragment d'ADN de la souche Sfi39 contenant la séquence de 17,2 kb décrite à l'exemple I (voir la liste de séquence), et en ajoutant les parties régulatrices de 1 ' opéron eps de la souche S . thermophilus Sfi6 (EP750043), de sorte que l'expression (la transcription et la traduction) des gènes eps de la souche Sfi39 puisse être correctement effectuée dans S . thermophilus . On transforme ensuite par electroporation, avec ce plasmide, la souche S. thermophilus CNCM 1-1422 qui a été déposée le 18 mai 1994 selon le traité de Budapest. N'importe quelle autre souche filante de S . thermophilus aurait pu aussi être utilisée. Cette souche présente au microscope un aspect de coques non flagellées formant des chaînettes, elle ne fait pas de spores, elle est anaéorobe facultative, et elle produit un EPS ayant la composition Glc:Gal=2:2.
Exemple IV : Biosynthèse d'un EPS
On prépare un plasmide à partir du plasmide pSA3 en ajoutant un fragment d'ADN de la souche Sfi39 contenant la séquence SEQ ID NO : 1 décrite à l'exemple I (voir la liste de séquence) , et en ajoutant les parties régulatrices de 1 ' opéron eps de la souche S . thermophilus Sfi6 (EP750043) , de sorte que l'expression (la transcription et la traduction) des gênes eps de la souche Sfi39 puisse être effectuée dans S. thermophilus . On transforme ensuite par electroporation, avec ce plasmide, la souche S . thermophilus CNCM 1-1351 qui a été déposée le 5 août 1993 selon le traité de Budapest. N'importe quelle autre souche filante de S . thermophilus aurait pu aussi être utilisée. Cette souche présente au microscope un aspect de coques non flagellées formant des chaînettes, elle ne fait pas de spores, elle est anaéorobe facultative, et elle produit un EPS ayant la composition Glc:Gal:Rha=l:3 :2 Exemple V : Biosynthèse d'un EPS
On isole de l'ADN génomique de la souche CNCM 1-1897 par le méthode de Slos et al . (1991) . On digère la préparation d'ADN par PstI et BamHI , on sépare les fragments d'ADN par électrophorese sur gel d'agarose 0,7%, on élue les fragments supérieurs à 20 kb, on ligue l'ADN extrait au vecteur pJIM2279 (obtenu de P. Renault, INRA, Jouy-en-Josas, Paris, France) préalablement digéré par PstI et BarriHI puis déphosphorylé . On transforme la souche Lactococcus lactis MG1363 (J. Bacteriol . , 154 , 1-9, 1983), cultivée sur milieu GM17 à 30°C, par la méthode de De Vos et al . (Gène, , 169-176, 1989). On sélectionne les clones transformés par hybridation du DNA génomique des clones avec l'une des sondes dérivées de la séquence SEQ ID NO:l. Parmi les transformants, on sélectionne les clones positifs .
Exemple VI : Préparation de gènes fonctionnels homologues aux gènes eps 6 , eps7, eps 8. esp9 et eps 10 On prépare des dérivés fonctionnels des gènes epsβ , eps7, eps8, esp9 et epslO en mettant en oeuvre une méthode adaptée de celle décrite par Adams et al . (EP402450; Genencor) . Pour cela, on isole chacun des gènes eps par PCR à partir de l'ADN génomique de la souche Sfi39. Les amorces utilisées sont choisies à partir de la séquence SEQ ID NO:l, de sorte à amplifier uniquement chaque gène. On clone chaque produit de PCR dans le vecteur pFGl dérivé du vecteur pSA3 (Dao et al . , Appl . Environ. Microbiol . , 49 , 115-119, 1985) qui contient, en plus du gène de sélection erythromycine, le gène de sélection chloramphenicol et le promoteur régulant la transcription et la traduction de l'opéron eps de la souche Sfi6 (EP750043) . On clone chaque produit de PCR fonctionnellement en aval de ce promoteur de sorte que le gène eps puisse être normallement exprimé dans S . thermophilus . On soumet enfin chaque vecteur à une mutagenèse chimique in -vi tro avec de 1 'hydroxylamine, comme décrit par Adams et al .
On transforme la souche E . coli XLl-blue par les plasmides pFGl traités avec l'agent mutagène, on sélectionne des transformants, on isole un plasmide recombinant, puis on incorpore le plasmide recombinant par electroporation dans un mutant de la souche S . thermophilus Sfi39 dont le gène eps qui est aussi porté par le plasmide pFGl a été au préalable inactivé comme décrit à l'exemple II. La transformation est réalisée par une méthode adaptée de celle décrite par Slos et al . (Appl . Environ. Microbiol., 57, 1333-1339, 1991), au cours de laquelle, on soumet les cellules à une décharge de 2,1 kV, 25 μF et 400 Ω, on les resuspend dans 1 ml de milieu HJL que l'on incube 4 h à 37°C, on étale les cellules sur un milieu solide LM17 supplémenté de 2,5 μg/ml d' erythromycine et de 3 μg/ml de chloramphenicol que l'on incube 16 h à 37°C, puis on sélectionne les colonies transformées qui survivent. Pour sélectionner des dérivés fonctionnels des gènes eps6 , eps7 , eps8, esp9 et epsl O, on cultive les souches de bactéries lactiques transformées dans un milieu liquide HJL, on en étale des dilutions sur un milieu solide Rouge de Ruthénium, on sélectionne les souches productrices d'EPS qui demeurent de couleur blanche, et on compare les propriétés rhéologiques des EPS produits par chaque clone à celle de l'EPS produit par la souche Sfi39. En observant notamment la viscosité et la force normale des EPS de chaque clone, on a pu ainsi identifier certains clones produisant un EPS ayant une propriété différente. L'analyse des gêne eps portés sur les plasmide pFGl des clones sélectionnés montre que ceux-ci ne différent du gène eps original que par la substitution, la délétion ou l'addition d'un petit nombre de bases nucléotidiques conduisant à des modifications de la séquence en acides aminés de la glycosyltransférase .
Exemple VII : Synthèse de polysaccharides avec les glycosyltransférases Eps6, Eps7. Eps8, Eps9 et EpslO
On isole chacun des gènes eps par PCR à partir de l'ADN génomique de la souche Sfi39. Les amorces utilisées sont choisies à partir de la séquence SEQ ID
NO : 1 , de sorte à amplifier uniquement chaque gène. On clone chaque produit de PCR dans un vecteur d'expression pQE60
(Qiagen, US) . Les vecteurs ainsi traités sont ensuite introduits dans la souche E. coli DH5α (Stratagen, US) qui ne possède pas naturellement d'activité glycosyltransférase. On cultive les souches DH5α transformées dans du milieu LB contenant de 1 ' ampicilline jusqu'à une DO oo de ° 8' on ajoute au milieu de culture 1 mM d'IPTG, on incube les cellules pendant 2 h, on centrifuge les cellules à 6000 g pendant 10 min à 4°C, on les lave dans le tampon A (50 mM de Tris-acétate pH8 , ImM de DTT, 1 mM d ' EDTA et 10% de glycérol) , on les centrifuge à nouveau, on resuspend les cellules dans le tampon A contenant en outre 1 mM de PMSF (fluorure de phénylméthane sulfonyle) et on soumet la suspension à 15000 psi. On élimine les cellules entières par centrifugation à 6000 g pendant 15 min à 4°C, on récupère les membranes cellulaires du surnageant par ultracentrifugation à 100000 g pendant 1 h, et resuspend l'aliquot dans le tampon A. Ce protocole permet ainsi généralement d'obtenir environ 10 mg/ml de protéines .
Parallèlement, on cultive la souche Sfi39 dans un milieu contenant du D-Glcp, D-Galp et D-Galf, on soumet les cellules de cette culture à 20000 psi, on extrait des membranes les chaînes saccharidiques en formation (liées à une amorce) en traitant les débris cellulaires avec du chloroforme/méthanol (2:1), en évaporant l'extrait. A titre de témoin dans les essais qui vont suivre, on procède de la même manière avec la souche Sfi39 cultivée en présence de saccharides radioactifs.
On détermine ensuite la spécificité des glycosyltransférases présentes dans les membranes par un procédé similaire à celui décrit par Kolkman et al . (Mol. Microbiol., 2£, 197-208, 1997). Pour cela, on fait réagir pendant 2 h, dans un volume réactionnel de 150 μl, 100 μl (environ 1 mg) de membranes, 50 mM de Tris-acétate pH8 , 10 mM de MgCl2, ImM d'EDTA, 1 μl (environ 25 nCi) d'UDp[14C]_ Glcp, d'UDP[14C] -Qalp ou d'UDP [14C] -Galf selon la glycosyltransférase considérée, et le dépôt contenant les chaînes saccharidiques en formation non-marquées isolées de la souche Sfi39 (voir le paragraphe ci-dessus) . Pour arrêter la réaction, on ajoute au volume réactionnel 2 ml de chloroforme :méthanol (2:1), on agite vigoureusement le mélange, et on le laisse reposer pendant 30 min. On élimine les saccharides nucléotidiques en extrayant la phase organique 3 fois de suite dans 0,4 ml de PSUP (pour 1 litre: 15 ml de chloroforme, 250 ml de méthanol, 1,83 g de KCl et 235 ml d'eau) . La phase inférieure contenant toutes les chaînes saccharidiques liées à une amorce est ensuite séchée sous vide, resuspendue dans 200 μl de 1-butanol et séparée dans deux tubes .
Dans la première série de tubes, on détache les oligosaccharides de leur amorce en effectuant une hydrolyse douce dans 50 mM de TFA (ac. trifluoroacétique) à 90°C pendant 20 min. Dans la deuxième série de tubes, on soumet les oligosaccharides à une hydrolyse poussée dans une solution de 4M TFA pendant 1 h à 125°C
On sèche ensuite les hydrolysats et on les resuspend dans 5 ml de saccharides transporteurs dans 40% d' isopropanol (5 mg/ml de chaque saccharide suivant: Glc,
Gai, GalN, maltose, maltotriose, maltotetraose) . Les saccharides hydrolysées de chaque série de tubes sont alors déposés sur une plaque HPTLC silicagel 60 (Merck) que l'on soumet à un éluant composé de chloroforme, d'acide acétique et d'eau (respectivement 6:7:1). On autoradiographie ensuite la plaque pendant 16 à 24 h avec un film Biomax MS
(Kodak) . On visualise les saccharides transporteurs en diffusant sur la plaque une solution d'éthanol comprenant 5% d'H2S04, et en chauffant la plaque à 100°C pendant 15 min. L'analyse des plaques permet ensuite l'identification précise des fonctions enzymatiques codées par les gènes eps de la souche Sfi39.
Exemple VIII : Clonage de 1 ' opéron de Lactobacillus helveticus CNCM 1-1449 impliqué dans la synthèse d'un EPS
1 . Structure répétée de l 'EPS
La structure de l'EPS produit par la souche Lactobacillus helveticus LH59 (CNCM 1-1449) a déjà été présentée par Stingele et al . (Carbohydrate Research, 302, 197-202, 1997), et dans la demande de brevet EP-A-0699689, le contenu technique de ces documents étant incorporé par référence. Cette souche est notamment utilisée pour la fermentation de produits lactés tels que le fromage.
2 . Clonage
Parmi les amorces testés, celles ayant les séquences nucléotidiques SEQ ID NO: 41 et SEQ ID NO: 42, ont permis d'amplifier un fragment de gène eps dans les mêmes conditions que celles de l'exemple I. Pour cela, l'ADN génomique de la souche LH59 a été au préalable isolé selon la technique de Slos et al . (1991) . Un fragment de PCR de 140 pb a ainsi pu être isolé, puis clone dans le plasmide linéarisé pGEMT (Promega, USA) . Le séquençage de ce fragment par la méthode des didéoxynucléotides (kit f-mol® DNA Sequencing System, Promega) indique une séquence correspondant aux nucléotides 1385 à 1526 de la séquence SEQ ID NO: 12.
Ce fragment de PCR a été utilisé pour cribler une banque λ-ZAP Express (Stratagene, USA) renfermant des fragments d'ADN de la souche LH59 selon le procédé décrit dans 1 ' exemple 1. En recoupant les séquences nucléotidiques des différents inserts génomiques, on a pu ainsi caractériser la séquence nucleotidique SEQ ID NO: 12 correspondant à l 'opéron de la souche LH59 impliqué dans la synthèse d'un EPS (voir la figure 2) .
3 . Analyse de la séquence SEQ ID NO : 12
La séquence SEQ ID NO: 12 contient 1 ' opéron eps de la souche LH59 et comprend un élément de transposition orienté dans la direction opposée à 11 ORFs complets présentés dans la même orientation, que l'on appelle epsl à epsll . Cet élément de transposition est un fragment de plasmide cryptique de L. helveticus pLH3 (Pridmore et al., FEMS Microbiological Letters, 124, pp. 301-306 (1994)) (voir figure 2). La comparaison des séquences en acides aminés codées par les ORFs avec celles de protéines présentes dans la banque de donnée Swiss-Prot, à l'aide des logiciels FASTA, PEPPLOT et PILEUP de GCG- softwear, isconsin, USA, permet de déduire la fonction de ces protéines. Les résultats sont présentés ci-après.
L'ORF epsl (nucléotides 1052 - 1729) code pour une protéine (SEQ ID NO: 13) ayant environ 59% d'identité avec des undecaprenyl-phosphate-glycosyl-1-phosphate- transferases, en particulier de S. salivarius (Genbank, n°P72577) . Cette homologie confirme son rôle dans la biosynthèse de l'EPS.
L'ORF eps2 (nucléotides 1733 - 2848) code pour une protéine (SEQ ID NO: 14) ayant environ 36% d'identité avec une α-glycosyltransférase de S. thermophilus (Genbank, n°Q56044) , en particulier au niveau du motif SX2EX7E présent dans toutes ces enzymes . Cette homologie confirme son rôle dans la biosynthèse de l'EPS. L'ORF eps3 (nucléotides 2851 -3942) code pour une protéine (SEQ ID NO: 15) ayant environ 32% d'identité avec des glycosyltransferases, en particulier de Bacillus subtilis (Genbank, n°P71055) . Cet ORF code ainsi probablement pour une α-glycosyltransférase. L'ORF eps4 (nucléotides 3929 -5083) code pour une protéine (SEQ ID NO: 16) ayant environ 28% d'identité avec des glycosyltransferases, en particulier de Bacillus subtilis (Genbank, n°P71055) . Cet ORF code probablement pour une α-glycosyltransférase. L'ORF eps5 (nucléotides 5076 -6095) code pour une protéine (SEQ ID NO: 17) ayant environ 29% d'identité avec des β-glycosyltransferases, en particulier de S . thermophilus (GenBank n°O07339) . Cette homologie confirme son rôle dans la biosynthèse de l'EPS. L'ORF eps6 (nucléotides 6098 _7090) code pour une protéine (SEQ ID NO: 18) ayant environ 29% d'identité avec des β-glycosyltransferases, en particulier de S. thermophilus (GenBank n°O07339) . Cette homologie confirme son rôle dans la biosynthèse de l'EPS.
L'ORF eps7 (nucléotides 7095 -8258) code pour une protéine (SEQ ID NO: 19) ayant environ 27% d'identité avec une polymerase d'EPS de S. pneumaniae (GenBank n°O07867) . Cette homologie confirme son rôle dans la biosynthèse de l'EPS.
L'ORF eps8 (nucléotides 8283 -9122) code pour une protéine (SEQ ID NO:20) ayant environ 27% d'identité avec des glycogenines (GenBank n°Q22997; P46976; P132780) . Ces homologies confirment son rôle dans la biosynthèse de l'EPS probablement en tant que glycosyltransférase .
L'ORF eps9 (nucléotides 9125 -10263) code pour une protéine (SEQ ID NO:21) similaire au UDP-galactosyl- pyranose-mutase de E. coli K-12 impliquée dans la conversion de 1 'UDP-galactopyranose en UDP-galactofuranose . L'ORF eps9 doit jouer un rôle central dans la synthèse des exopolysaccharides, puisqu'il permet le transfert de phosphofuranose sur l'unité répétitive suivante. L'ORF epslO (nucléotides 10250-11662) code pour une protéine (SEQ ID NO: 22) présentant des similarités avec l'EpsK de Lactococcus lactis, le CpsL de Streptococcus pneumoneia, le TrsA de Hiersina enterocol tica et le RfbX de E. Coli (Yao et Valvano, Journal of Bacteriology, 176, pp. 4133-4143 (1994)). Ces homologies confirment son rôle en tant qu'unité de transport des polysaccharides formés.
L'ORF epsll (nucléotides 1166413181) code pour une protéine (SEQ ID NO: 23) présentant des similarités avec la protéine 0331 de E. Coli et IcaC de Staphylococcus epidermidis (Elmann et al., Molecular Microbiology, 20 (5), pp. 1083-1091 (1996)). Ces homologies confirment son rôle en tant qu'unité pour la synthèse ou l'exportation des exopolysaccharides . En conclusion, les inserts génomiques isolés des vecteurs pCMV couvrent une région génomique de la souche L. helveticus LH59 qui est manifestement impliquée dans la biosynthèse de l'EPS.
Exemple IX : Inactivation des gènes eps
On inactive par recombinaison homologue les gène epsl -8 de 1 Opéron pour confirmer leur importance dans la biosynthèse de l'EPS. Pour cela, on amplifie par PCR un fragment de chaque ORF provenant d'un des vecteurs pCMV décrits à l'exemple I ci-dessus, on ligue le produit de PCR dans le plasmide pSA3 préalablement digéré convenablement, on transforme la souche E. coli XLl-blue par le produit de ligation, on sélectionne des transformants, on isole un plasmide recombinant, puis on transforme la souche L. helveticus LH59 avec le plasmide recombinant au moyen de la méthode décrite par Thompson et al . (Appl . Micob. Biotec . , 35, 334-338, 1991). On étale les cellules transformées sur un milieu solide MRS supplémenté de 2,5 μg/ml d' erythromycine, que l'on incube ensuite 16 h à 45°C, puis on sélectionne les colonies transformées qui survivent.
Les colonies qui survivent ont intégré dans un des 8 gènes eps le plasmide pSA3 recombinant . Ceci peut être vérifié par Southern-Blot d'une préparation d'ADN génomique des colonies survivantes digérée, et hybridation du filtre de Southern-Blot avec le produit de PCR rendu radioactif. Les colonies ayant intégré le plasmide présentent des bandes différentes que celles obtenues dans les mêmes conditions avec la souche sauvage. De plus, les colonies ayant intégré dans un des 8 gènes eps le plasmide recombinant présentent ont perdu leur caractère filant dans un lait MSK. Exemple X : Biosynthèse d'un EPS
On prépare un plasmide à partir du plasmide pSA3 (Dao et al . (1985)), en ajoutant un fragment d'ADN de la souche LH59 contenant la séquence nucleotidique SEQ ID NO: 12 décrite à l'exemple VIII et en ajoutant les parties régulatrices de 1 ' opéron eps de la souche S . thermophilus Sfi6 (EP750043), de sorte que l'expression (la transcription et la traduction) des gènes eps de la souche LH59 puisse être effectuée dans S . thermophilus . On transforme ensuite par electroporation, avec ce plasmide, la souche S . thermophilus CNCM 1-1422 qui a été déposée le 18 mai 1994 selon le traité de Budapest. N'importe qu'elle autre souche filante S . thermophilus aurait pu aussi être utilisée. Cette souche présente au microscope un aspect de coques non flagellées formant des chaînettes, elle ne fait pas de spores, elle est anaéorobe facultative, et elle produit un EPS ayant la composition Glc:Gal=2:2.
Exemple XI : Biosynthèse d'un EPS On prépare un plasmide à partir du plasmide pSA3 en ajoutant un fragment d'ADN de la souche LH59 contenant la séquence nucleotidique SEQ ID NO: 12 décrite à l'exemple I et en ajoutant les parties régulatrices de l'opéron eps de la souche S . thermophilus Sfi6 (EP750043) , de sorte que l'expression (la transcription et la traduction) des gènes eps de la souche LH59 puisse être effectuée dans S. thermophilus . On transforme ensuite par electroporation, avec ce plasmide, la souche S . thermophilus CNCM 1-1351 qui a été déposée le 5 août 1993 selon le traité de Budapest. N'importe qu'elle autre souche filante S . thermophilus aurait pu aussi être utilisée. Cette souche présente au microscope un aspect de coques non flagellées formant des chaînettes, elle ne fait pas de spores, elle est anaéorobe facultative, et elle produit un EPS ayant la composition Glc :Gal :Rha=l : 3 : 2
Exemple XII : Biosynthèse d'un EPS On isole de l'ADN génomique de la souche LH59 par la méthode de Slos et al . (1991) . On digère la préparation d'ADN par Sali et BamHI, on sépare les fragments d'ADN par électrophorese sur gel d'agarose 0,7%, on élue les fragments supérieurs à 5 kb, on ligue l'ADN extrait au vecteur pJIM2279 préalablement digéré par Sali et BamHI puis déphosphorylé . On transforme la souche Lactococcus lactis MG1363 (1983) comme décrit dans l'exemple V. On sélectionne les clones transformés par hybridation du DNA génomique des clones avec l'une des sondes dérivées de la séquence SEQ ID NO: 12. Parmi les transformants, on sélectionne les clones positifs.
Exemple XIII : Préparation ςj_S gènes fonctionnels homologues aux gènes eps On prépare des dérivés fonctionnels des gènes epsl - 8 en mettant en oeuvre une méthode adaptée de celle décrite par Adams et al . (EP-A-0402450 ; Genencor) . Pour cela, on isole chacun des gènes eps par PCR à partir de l'ADN génomique de la souche LH59. Les amorces utilisées sont choisies à partir de la séquence SEQ ID NO: 12, de sorte à amplifier uniquement chaque gène. On clone chaque produit de PCR dans le vecteur d'expression pQE60 (Qiagen, US) fonctionnellement en aval d'un promoteur E. coli régulant la transcription et la traduction du gène eps . On soumet enfin chaque vecteur à une mutagénèse chimique in- vi tro avec de 1 ' hydroxylamine, comme décrit par Adams et al . On transforme la souche E. coli DH5α (Stratagen, US) qui ne possède pas naturellement d'activité glycosyltransférase, par les plasmides pQE60 traités avec l'agent mutagène, puis on sélectionne des transformants. Pour identifier parmi les transformants des gènes eps codant pour des variants d'enzymes, on analyse la spécificité enzymatique des enzymes exprimées dans chaque clone d1 S. coli, au moyen de la méthode décrite à l'exemple VII. L'analyse des gènes eps portés sur les plasmide pQE60 des clones ainsi sélectionnés montre que ceux-ci ne différent du gène eps original que par la substitution, la délétion ou l'addition d'un petit nombre de bases nucléotidiques conduisant à des modifications de la séquence en acides aminés de la glycosyltransférase .
Exemple XIV : Synthèse de polysaccharides avec les lycosyltransférases de LH59
On isole chacun des gènes eps codant pour une glycosyltransférase par PCR à partir de l'ADN génomique de la souche LH59. Les amorces utilisées sont choisies à partir de la séquence SEQ ID NO: 12, de sorte à amplifier uniquement chaque gène selon le procédé décrit dans 1 'xemple VII .
Parallèlement, on cultive la souche LH59 dans un milieu contenant du D-Glcp, D-Galp et D-Galf, on soumet les cellules de cette culture à 20000 psi, on extrait des membranes les chaînes saccharidiques en formation (liées à une amorce) en traitant les débris cellulaires avec du chloroforme/méthanol puis en évaporant l'extrait. A titre de témoin dans les essais qui vont suivre, on procède de la même manière avec la souche LH59 cultivée en présence de saccharides radioactifs. On détermine ensuite la spécificité des glycosyltransférases présentes dans les membranes par un procédé similaire à celui décrit dans l'exemple VII.
L'analyse des plaques permet de confirmer la fonction en tant que glucosyltransferase des opérons epsl à eps4 par l'analyse fonctionnelle de leur activité en présence d'un substrat.
Exemple XV : Synthèse d'un nouveau polysaccharide On purifie l'EPS d'un milieu de culture de la souche Lactobacillus helveticus TY1-2 (Y. Yamamoto et al . , Carbohydrate Research, 261, 67-78, 1994) . Cet EPS est constitué par la répétition de l'unité saccharidique suivante :
β-D-Gal/.-(l→4)-β-D-Glc/. 1 i 6 →6)-β-D-Glc/.-(1→3)-β-D-Glc/.-(1→6)-α-D-Glc/?Nac-(1→3)-β-D-Gal.(1 →
1
:__
4 β-D-Gal/. Pour cela, on ajoute un volume d'acide trichloroacétique (40%) au milieu de culture, on centrifuge
(17000 g, 20 min), on récupère le surnageant, on ajoute un volume d'acétone, on centrifuge à nouveau (17000 g, 20 min), on récupère la partie précipitée que l'on dissout dans de l'eau distillée à pH 7, on la dialyse dans de l'eau (12 h) , puis on élimine les insolubles par ultracentrifugation (110000 g, 1 h) .
Ensuite, on greffe un N-acétylgalactosamine sur le galactose des ramifications lactose de l'EPS, en utilisant une β-1 , 4-N-acétylgalactosaminyl-transférase et son substrat approprié, par exemple celles décrites par Lutz et al . et Yamashiro et al . (J. of Biol. Chem., 269 , 29227-29231, 1994; J. of Biol. Chem., 270. 6149-6155, 1995) .
Exemple XVI : Synthèse d'un nouveau polysaccharide 5 On soumet l'EPS de l'exemple XV à l'α-2,3- sialyltransférase commercialisée par Calbiochem® (Cat No.566218 -M, USA) en présence de son substrat approprié.
Exemple XVII : Synthèse d'un nouveau polysaccharide 0 On soumet l'EPS de l'exemple XV à l'α-2,6- sialyltransférase décrite par Sjoberg et al., ou à l'α-2,6- sialyltransférase décrite par Yamamoto et al . , en présence de leurs substrats appropriés (J. Biochem., 271, 7450-7459, 1996; Biosci. Biotech. Biochem., £2, 210-214, 1998). 5
Exemple XVIII : clonage de 1 ' opéron de L. bul aricus CNCM
1-800 impliqué dans la synthèse d'un EPS 1. Structure répétée de l 'EPS
La structure de 1 ' EPS produit par la souche 0 L. bulgaricus Lfi5 (CNCM 1-800) a été déterminée par résonance magnétique, selon une technique similaire à celles décrites dans EP 97111379.0 et EP 97111381.6. Les résultats montrent que l'EPS est constitué de l'unité répétitive suivante : 5 β-D-Gal/? α-L-R ap β-D-Gal/.
1 1 1
4 3 3 o →3)-β-D-Gal/?(l→4)-α-D-Gal/.(l→2)-α-D-Gal/.(l→3)-β-D-Glc/7(l→
2 . Clonage
Parmi les amorces testées, celles ayant les séquences nucléotidiques SEQ ID NO: 43 et SEQ ID NO: 44, ont 5 permis d'amplifier un fragment de gène eps dans les mêmes conditions que celles de l'exemple I. Pour cela, l'ADN génomique de la souche Sfi39 a été au préalable isolée selon la technique de Slos et al . (1991) .
Un fragment de PCR a ainsi pu être isolé, puis clone dans le plasmide linéarisé pGEMT (Promega, USA) . Le séquençage de ce fragment par la méthode des didéoxynucléotides (kit f-mol® DNA Sequencing System, Promega) indique une séquence correspondant aux nucléotides 1698 à 1841 de la séquence SEQ ID NO: 24. Ce fragment de PCR a été utilisé pour cribler une banque λ-ZAP Express (Stratagene, USA) renfermant des fragments d'ADN de la souche Lfi5 selon le protocole de 1 ' exemple I .
On a pu ainsi caractériser une séquence correspondant à 1 ' opéron de la souche Lfi5 impliqué dans la synthèse d'un EPS.
Afin de récupérer les séquences bordant le fragment initial, d'autres criblages de la banque Lambda Zap ont été effectués mais aucun n'a permis d'isoler de nouveaux fragments. Certaines séquences de Lb . bulgaricus contenant par exemple des promoteurs sont connues pour être toxiques et donc instables chez E. coli . Cela explique sûrement les difficultés à isoler les fragments d'ADN adjacents. Afin de contourner cet obstacle et de cloner les régions d'ADN bordant ce clone, les techniques de PCR reverse et de SSP-PCR (Single Spécifie Primer PCR) ont été utilisées. Cela a permis d'amplifier plusieurs fragments correspondant aux extrémités 5' et 3' de l' opéron eps . En recoupant les séquences nucléiques des différents fragments chromosomiques isolés, on a pu ainsi caractériser la séquence SEQ ID NO: 24 (voir la figure 3) . 3 . Analyse de la séquence SEQ ID NO: 24
La séquence SEQ ID NO: 24 présente 1 ' opéron eps de la souche Lfi5 et comprend 14 ORFs complets, dans la même orientation, que l'on appelle epsA à epsN (voir la figure 3) . La comparaison des séquences en acides aminés codées par les ORFs avec celles de protéines présentes dans la banque de donnée Swiss-Prot, à l'aide des logiciels FASTA, PEPPLOT et PILEUP de GCG-softwear, isconsin, USA, permet de déduire la fonction de ces protéines . Les résultats sont présentés ci-après.
L'ORF epsA (nucléotides 295 - 1326; code pour une protéine (SEQ ID NO:24) ayant 32% d'identité avec la protéine LytR de Synechocytis sp Pcc 6803 (Genbank n°
P74136) . Cet ORF code de toute évidence pour un atténuateur de transcription influençant la régulation.
L'ORF epsB (nucléotides 1326 -2225 ) code pour une protéine (SEQ ID NO:25) ayant environ 26% d'identité avec la protéine CapA de Staphylococcus aureus (Genbank n°
P39850) . Cet ORF intervient de toute évidence dans la détermination de la longueur des chaînes de saccharides.
L'ORF epsC (nucléotides 2514-2858) code pour une protéine (SEQ ID NO: 27) ayant environ 38% d'identité avec la protéine EpsB Lactococcus lactis (GenBank n°O06030) . Cet ORF code ainsi probablement pour une protéine de régulation impliquée dans le contrôle du poids moléculaire et/ou la longueur de la chaîne polysaccharidique .
L'ORF epsD (nucléotides 3020-3796) code pour une protéine (SEQ ID NO:28) ayant environ 41% d'identité avec la protéine EpsC Lactococcus lactis (GenBank n°O06031) . Cette homologie confirme le rôle de cet ORF dans la synthèse d'un EPS.
L'ORF epsE (nucléotides 3827-4483) code pour une protéine (SEQ ID NO: 29) ayant environ 44% d'identité avec la protéine Cpsl4E de Streptococcus pneumoniae
(Genbank, n°P72513) . Cet ORF code ainsi de toute évidence pour une galactosyl- ou glucosyl-phospho-transférase catalysant le transfert du premier saccharide sur le transporteur lipidique ou protéique.
L'ORF epsF (nucléotides 4878-5678) code pour une protéine (SEQ ID NO: 30) ayant environ 30% d'identité avec la protéine EpsF de Streptococcus thermophilus
(Genbank, n°Q56043) . Cet ORF code ainsi de toute évidence pour une α-glycosyltransférase.
L'ORF epsG (nucléotides 5750-6877) code pour une protéine (SEQ ID NO: 31) ayant environ 34% d'identité avec la protéine EpsG de Streptococcus thermophilus (Genbank, n°Q56044) . Cet ORF code ainsi de toute évidence pour une α-glycosyltransférase.
L'ORF epsH (nucléotides 7015-7821) code pour une protéine (SEQ ID NO: 32) ayant environ 37% d'identité avec la protéine YveO de Bacillus subtilis (Genbank, n°P71054) . Cet ORF code ainsi de toute évidence pour une β-glycosyltransférase.
L'ORF epsl (nucléotides 7839-8708) code pour une protéine (SEQ ID NO: 33) ayant environ 23% d'identité avec la protéine Cpsl4K de S. pneumaniae (Genbank, n°O07341) . Cet ORF code ainsi de toute évidence pour une glycosyltransférase.
L'ORF epsJ (nucléotides 9213-10196) code pour une protéine (SEQ ID NO: 34) ayant environ 33% d'identité avec la protéine Eps I de S. thermophilus (GenBank n°Q56046) . Cet ORF code ainsi de toute évidence pour une β-glycosyltransférase .
L'ORF epsK (nucléotides 10227-11288) code pour une protéine (SEQ ID NO: 35) ayant environ 24% d'identité avec la protéine YveQ Bacillus subtilus (GenBank n°P71056) . Cet ORF code ainsi probablement pour une protéine responsable de la polymérisation des unités répétées .
L'ORF epsL (nucléotides 11358 -12284) code pour une protéine (SEQ ID NO: 36) ayant environ 20% d'identité avec la protéine RfaS de E. coli (GenBank n°P27126) . Cette homologie démontre que cet ORF est impliqué dans la biosynthèse d'un EPS.
L'ORF epsM (nucléotides 12372- 13382) code pour une protéine (SEQ ID NO: 37) ayant environ 38% d'identité avec la protéine CpsH de Streptococcus agaloctiae (GenBank n°087183) . Cette homologie montre que cet ORF est impliqué dans la biosynthèse d'un EPS.
L'ORF eps_V (nucléotides14269 - 1572b code pour une protéine (SEQ ID NO: 38) ayant environ 35% d'identité avec la protéine Cpsl9BJ de Streptococcus pneumonoiae
(GenBank n°O07342) . Cet ORF code probablement pour une protéine responsable de l'exportation de l'EPS.
En conclusion, les homologies observées indiquent que les différents ORFs identifiés dans les inserts chromosomiques sont impliqués dans la biosynthèse de l'EPS.
Exemple XIX : Biosynthèse d'un EPS On prépare un plasmide à partir du plasmide pSA3 (Dao et al . (1985)), en ajoutant un fragment d'ADN de la souche Lfi5 contenant la séquence SEQ ID NO:24 et en ajoutant les parties régulatrices de 1 ' opéron eps de la souche S. thermophilus Sfi6 (EP750043) , de sorte que l'expression (la transcription et la traduction) des gènes eps de la souche Lfi5 puisse être effectuée dans S . thermophilus comme proposé à l'exemple X. Exemple XX : Biosynthèse d'un EPS
On prépare un plasmide à partir du plasmide pSA3 , en ajoutant un fragment d'ADN de la souche Lfi5 contenant la séquence SEQ ID NO: 24 et en ajoutant les parties régulatrices de 1 ' opéron eps de la souche S. thermophilus Sfi6 (EP750043), de sorte que l'expression (la transcription et la traduction) des gènes eps de la souche Lfi5 puisse être effectuée dans S. thermophilus comme proposé à l'exemple XI.
Exemple XXI : Biosynthèse d'un EPS
On isole de l'ADN chromosomique de la souche CNCM 1-800, on digère la préparation d'ADN par Xbal , on sépare les fragments d'ADN par électrophorese sur gel d'agarose 0,7%, on élue les fragments de plus de 9 kb, on ligue l'ADN extrait au vecteur pJIM2279 (obtenu de P. Renault, INRA, Jouy-en-Josas, Paris, France) préalablement digéré par Xbal puis déphosphorylé . On transforme la souche Lactococcus lactis MG1363 comme décrit à l'exemple V. On sélectionne les clones transformés par hybridation de l'DNA génomique des clones avec l'une des sondes dérivées de la séquence SEQ ID NO: 24.
Exemple XXII : Préparation de σènes fonctionnels homologues aux gènes epsl -9
On prépare des dérivés fonctionnels des gènes epsl -9 en mettant en oeuvre une méthode adaptée de celle décrite par Adams et al . (EP402450; Genencor) . Pour cela, on isole chacun des gènes eps par PCR à partir de l'ADN génomique de la souche Lfi5 (CNCM 1-800) . Les amorces utilisées sont choisies à partir de la séquence SEQ ID NO: 24, de sorte à amplifier uniquement chaque gène. On clone chaque produit de PCR selon le procédé décrit à 1 'exemple XIII . Pour identifier parmi les transformants des gènes eps codant pour des variants d'enzymes, on analyse la spécificité enzymatique des enzymes exprimées dans chaque clone d' E. coli , au moyen de la méthode décrite à l'exemple XVII. L'analyse des gènes eps portés sur les plasmides pQE60 des clones ainsi sélectionnés montre que ceux-ci ne différent du gène eps original que par la substitution, la délétion ou l'addition d'un petit nombre de bases nucléotidiques conduisant à des modifications de la séquence en acides aminés de la glycosyltransférase.
Exemple XXIII : Synthèse de polysaccharides avec les αlycosyltransférases de Lfi5 On isole chacun des gènes eps codant pour une glycosyltransférase par PCR à partir de l'ADN génomique de la souche Lfi5 (CNCM 1-800) . Les amorces utilisées sont choisies à partir de la séquence SEQ ID NO: 24, de sorte à amplifier uniquement chaque gène selon le protocole décrit à l'exemple VII en utilisant le vecteur d'expression pBAD (Invitrogen, USA) .
Parallèlement, on cultive la souche Lfi5 dans un milieu contenant du D-Glcp, D-Galp et L-Rhap, on soumet les cellules de cette culture à 20000 psi, on extrait des membranes les chaînes saccharidiques en formation (liées à une amorce) en traitant les débris cellulaires avec du chloroforme/méthanol (2:1) et en évaporant l'extrait. A titre de témoin dans les essais qui vont suivre, on procède de la même manière avec la souche Lfi5 cultivée en présence de saccharides radioactifs. On détermine ensuite la spécificité des glycosyltransferases présentes dans les membranes par un procédé similaire à celui décrit dans l'exemple VII.
L'analyse des plaques permet ensuite l'identification précise de différentes fonctions enzymatiques codées par les gènes eps de la souche Lfi5. Ces constructions ayant incorporé notamment les gènes epsE à espJ ont permis de confirmer 1 ' activité de glucosyltransferase du gène epsE par une analyse fonctionnelle de leur activité en présence de leur substrat de glucose.
Exemple XXIV Construction d'un vecteur navette
Les gènes epsA à epsM ont été amplifiés par PCR et insérés dans le vecteur navette pTRKH2 (O' Sullivan et al., Gène, 137, pp. 227-231 (1993)) et clones dans des hôtes hétérologues Lactococcus lactis MG1363 de manière à déterminer si un tel fragment permet la production d'EPS par cette souche. Après analyse de restriction des différents amplicons de PCR, il a été montré qu'aucune délétion détectable ou réarrangement n'a eu lieu durant les étapes de clonage. Les transformants analysés sur les plaques au moyen d'un test par cure-dent montrent un phénotype filant par les souches ne présentant pas ce phénotype à l'origine. Ceci prouve que les gènes esp introduits sont responsables de la synthèse d'EPS par ces souches transformées.

Claims

REVENDICATIONS
1. Enzyme recombinée susceptible d'être impliquée dans la biosynthèse d' exopolysaccharides par au moins une étape comprenant la formation d'une liaison sous forme d'un isomère α ou β entre le carbone 1 portant la fonction réductrice aldéhyde d'un D-Galp activé et un phosphate d'une amorce lipophile ou protéinique, de manière à assurer de façon progressive la formation de ces exopolysaccharides avec à chaque étape l'addition d'une nouvelle unité de saccharide qui vient s'attacher par sa fonction semi-acétalique à un hydroxyle alcoolique d'une autre unité de saccharide, laquelle est à l'extrémité d'une chaîne de saccharides liée à cette amorce.
2. Enzyme recombinée selon la revendication 1, susceptible d'être impliquée dans la biosynthèse de l'EPS ayant l'unité saccharidique répétitive β-D-Galpl
I
6 -3)-β-D-Glc/j-(l→3)-β-D-Gal/-(l→3)-α-D-Glc/?-(l→ catalysant spécifiquement l'une des liaisons suivantes entre saccharides :
- la liaison osidique β-1,3 entre le carbone 1 d'un D-Galf activé et le carbone 3 du Glcp présent à l'extrémité non-réductrice d'une chaîne saccharidique en formation;
- la liaison osidique β-1,3 entre le carbone 1 d'un D-Glcp activé et le carbone 3 du Galf présent à l'extrémité non-réductrice d'une chaîne saccharidique en formation; - la liaison osidique β-1, 6 entre le carbone 1 d'un D-Galp activé et le carbone 6 du Glcp présent à l'extrémité non- réductrice d'une chaîne saccharidique en formation; et
- la liaison osidique α-1,3 entre les unités saccharidiques répétitives de l'EPS ci-dessus.
3. Enzyme recombinée selon la revendication 2, ayant l'une des séquences en acides aminés choisie dans le groupe formé par les séquences SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, et les séquences qui leur sont homologues .
4. Enzyme recombinée selon la revendication 2, ayant l'une des séquences en acides aminés choisie dans le groupe formé par les séquences SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO:4, SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO : 6.
5. Séquence nucleotidique codant pour une enzyme recombinée selon l'une quelconque des revendications précédentes .
6. Séquence nucleotidique selon la revendication 5, comprenant au moins un gène ayant une séquence nucleotidique choisie parmi les séquences délimitées dans la séquence SEQ ID NO : 1 par les nucléotides 8633-10678, 10703-11668, 12838-13785, 14138-15553, 16919- 18013, et les séquences qui leur sont homologues.
7. Séquence nucleotidique selon la revendication 5, comprenant au moins un gène ayant une séquence nucleotidique choisie parmi les séquences délimitées dans la séquence SEQ ID NO:l par les nucléotides 2703-3389, 3390-4118, 4130-4819, 4832-5527 et 5629-6993.
8. Enzyme recombinée selon la revendication 1, susceptible d'être impliquée dans la biosynthèse de l'EPS ayant l'unité saccharidique répétitive β-D-Gal/.-(l→4)-β-D-Glc/.1
3 →5)-β-D-Gal-(l→3)-α-D-Gal/.-(l→3)-α-D-Glc/.-(l→3)-β-D-Glc/.-(l→
catalysant spécifiquement l'une des liaisons suivantes entre saccharides :
- la liaison osidique α-1,3 entre le carbone 1 d'un D-Glcp activé et le carbone 3 d'un Glcp appartenant à l'extrémité non-réductrice d'une chaîne saccharidique en formation;
- la liaison osidique α-1,3 entre le carbone 1 d'un D-Galp activé et le carbone 3 d'un Glcp présent à l'extrémité
5 non-réductrice d'une chaîne saccharidique en formation;
- la liaison osidique β-1,3 entre le carbone 1 d'un D-Galf activé et le carbone 3 d'un Galp présent à l'extrémité non-réductrice d'une chaîne saccharidique en formation;
- la liaison osidique β-1,3 entre le carbone 1 d'un D-Glcp 0 activé et le carbone 3 d'un Galf présent à l'extrémité non-réductrice d'une chaîne saccharidique en formation;
- la liaison osidique β-1,4 entre le carbone 1 d'un D-Galp activé et le carbone 4 du Glcp présent à l'extrémité non- réductrice d'une chaîne saccharidique en formation; et 5 - la liaison osidique β-1, 5 entre les unités saccharidiques répétitives de l'EPS ci-dessus.
9. Enzyme recombinée selon la revendication 8, ayant l'une des séquences en acides aminés choisie dans le groupe formé par les séquences SEQ ID NO: 13, SEQ ID 0 NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, et les séquences qui leur sont homologues .
10. Séquence nucleotidique codant pour une enzyme recombinée selon la revendication 8 ou 9. 5 11. Séquence nucleotidique selon la revendication 10, comprenant au moins un gène ayant une séquence nucleotidique choisie parmi les séquences délimitées dans la séquence SEQ ID NO: 12 par les nucléotides 1052-1729,1733-2848, 2851-3942, 3929-5083, 5076- Q 6095, 6098-7090, 7095-8258, 8283-9122, 9125-10263, 10250-
11662, 11664-13181 et les séquences qui leur sont homologues .
12. Enzyme recombinée selon la revendication 1, susceptible d'être impliquée dans la biosynthèse de l'EPS ayant l'unité saccharidique répétitive β-D-Gal/. α-L-Rha/. β-D-Gal/. 1 1 1
I I I
4 3 3
→3)-β-D-Gal/.(1→4)-α-D-Gal/.(1→2)-α-D-Gal.(1→3)-β-D-Glc.(1→ et catalysant spécifiquement l'une des liaisons suivantes entre saccharides :
- la liaison osidique β-1,3 entre le carbone 1 d'un D-Galp activé et le carbone 3 du saccharide présent à l'extrémité non-réductrice d'une chaîne saccharidique en formation, ladite chaîne étant composée notamment d'une chaîne principale de 1 à 4 D-Galp et/ou D-Glcp liés entre-eux par des liaisons osidiques α-1,2, α-1,3, β-1,4 et/ou β-1,3, et ledit saccharide présent à l'extrémité non-réductrice étant lié à un seul autre saccharide par son carbone 1 ; - la liaison osidique β-1,4 entre le carbone 1 d'un D-Galp activé et le carbone 4 du saccharide présent à l'extrémité non-réductrice d'une chaîne saccharidique en formation, ladite chaîne étant composée notamment d'une chaîne principale de 1 à 4 D-Galp et/ou D-Glcp liés entre-eux par des liaisons osidiques α-1,2, α-1,3, β-1,4 et/ou β-1,3, et ledit saccharide présent à l'extrémité non-réductrice étant lié à un seul autre saccharide par son carbone 1; et
- la liaison osidique α-1,3 entre le carbone 1 d'un L-Rhap activé et le carbone 3 du saccharide présent à l'extrémité non-réductrice d'une chaîne saccharidique en formation, ladite chaîne étant composée notamment d'une chaîne principale de 1 à 4 D-Galp et/ou D-Glcp liés entre-eux par des liaisons osidiques α-1,2, α-1,3, β-1,4 et/ou β-1,3, et ledit saccharide présent à l'extrémité non-réductrice étant lié à un seul autre saccharide par son carbone 1.
13. Enzyme recombinée selon la revendication 12, ayant ayant l'une des séquences en acides aminés choisie dans le groupe formé par les séquences SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID N0:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO: 33, et les séquences qui leur sont homologues.
14. Séquence nucleotidique codant pour une enzyme recombinée selon la revendication 12 ou 13.
15. Séquence nucleotidique selon la revendication 14, comprenant au moins un gène ayant une séquence nucleotidique choisie parmi les séquences délimitées dans la séquence SEQ ID NO: 24 par les nucléotides 2514-2858, 3020-3796, 3827-4483, 4878-5678, 5750-6877, 7015-7821, 7839-8708, 9213-10196, 10227-11288 et les séquences qui leur sont homologues.
16. Vecteur recombinant comprenant une séquence nucleotidique selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, 10, 11, 14 et 15.
17. Cellule comprenant, intégré dans son génome ou par le moyen d'un plasmide réplicable, une séquence nucleotidique recombinée selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, 10, 11, 14 et 15, et exprimant au moins une enzyme recombinée fonctionnelle selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, 8, 9, 12 et 13.
18. Cellule selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'elle est une bactérie lactique.
19. Procédé de production d'un EPS, dans lequel :
(1) on clone dans un vecteur un fragment d'7ADN codant pour au moins l'une des enzymes selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, 8, 9, 12 et 13, ledit vecteur comprenant en outre une séquence permettant la réplication autonome ou l'intégration dans une ou plusieurs cellules hôtes (vecteur navette) , (2) on transforme la cellule hôte par ledit vecteur, ladite cellule hôte utilisant les enzymes codées par le vecteur, le cas échéant en combinaison avec d'autres enzymes produites par la cellule hôte, pour la biosynthèse dudit exopolysaccharide, (3) on cultive ensuite la cellule hôte transformée dans des conditions appropriées pour l'obtention dudit exopolysaccharide .
20. Procédé selon la revendication 19, dans lequel le vecteur comprend en outre au moins une séquence promoteur fonctionnelle et au moins une séquence d'activation traductionnelle fonctionnelle, permettant l'expression des ADN codant pour au moins l'une des enzymes selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, 8, 9, 12 et 13.
21. Procédé de synthèse d'un EPS, qui est constitué par l'assemblage répété d'une seule unité saccharidique, elle-même formée d'une chaîne principale de sucres dont les extrémités sont impliquées dans la polymérisation des unités, dans lequel on utilise plusieurs enzymes recombinées ou plusieurs gènes recombinants susceptibles d'être impliqués dans la biosynthèse de l'EPS ayant l'unité saccharidique répétitive β-D-Gφ-(l→4)-β-D-Glcp 1 3
→5)-β-D-Gal/-(l→3)-α-D-Gφ-(l→3)-α-D-Glcp-(l→3)-β-D-Glcp-(l→
caractérisé en ce que ces enzymes ou ces gènes, notamment choisis parmi les enzymes revendiquées à la revendication 8 ou 9, ou les gènes revendiqués à la revendication 10 ou 11, permettent la création sur la chaîne principale de l'unité saccharidique d'une ou plusieurs ramifications lactose liées à un sucre de la chaîne principale par leur glucose.
22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que la chaîne principale de l'unité saccharidique est constitué d'au moins 2 sucres choisis parmi D-Galp, D-Galf et/ou D-Glcp.
23. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que le glucose de la ramifications lactose est lié par une liaison osidique β-1,3 à un des sucres de la chaîne principale.
24. Procédé selon l'une quelconque des revendications 21 à 23, caractérisé en ce que l'on utilise en outre une enzyme ou un gène qui permet la liaison entre un N-acétyl-galactosamine et le galactose de la ramification lactose.
25. Procédé selon l'une aca des revendications 21 à 24, caractérisé en ce que l'on utilise en outre une enzyme ou un gène qui permet la liaison entre l'acide N-acétyl-neuraminique et le galactose de la ramification lactose.
26. Procédé selon l'une quelconque des revendications 21 à 25, caractérisé en ce que la synthèse est effectuée in vi tro et/ou in vivo .
27. Polysaccharide susceptible d'être synthétisé selon le procédé revendiqué aux revendications 21 à 26, constitué par l'assemblage répété d'une seule unité saccharidique, elle-même formée d'une chaîne principale de saccharides dont les extrémités sont impliquées dans la polymérisation des unités, caractérisé en ce que la chaîne principale comprend au moins une ramification lactose liée à un saccharide de la chaîne principale par son glucose, le galactose de cette ramification étant en outre lié à un N-acétylgalactosamine, pour autant que ce polysaccharide ne consiste pas en la répétition de l'unité saccharidique suivante
Figure imgf000072_0001
28. Polysaccharide branché selon la revendication 27, caractérisé en ce que le galactose de la ramification lactose est également lié à un acide N-acétyl- neuraminique .
29. Utilisation d'une enzyme recombinée selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, 8, 9, 12 et 13 ou d'une séquence nucleotidique selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, 10, 11, 14 et 15, pour la synthèse d'un EPS.
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