WO1999059603A1

WO1999059603A1 - Remedies for joint diseases bound to hyaluronic acid

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Publication number: WO1999059603A1
Application number: PCT/JP1999/002600
Authority: WO
Inventors: Tatsuya Tamura; Akira Okamachi
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1998-05-20
Filing date: 1999-05-19
Publication date: 1999-11-25
Anticipated expiration: 2000-11-20
Also published as: EP1082963A4; AU752280B2; KR20010025040A; AU3849099A; CA2332802A1; EP1082963A1; AU752280C

Description

明細書

関節疾患治療薬とヒアルロン酸との結合体技術分野

本発明は、関節疾患治療薬を結合させたヒアルロン酸又はその誘導体又はそれらの塩に関する。さらに詳細には、本発明は、変形性関節症、慢性関節リウマチ等の治療に有効な、関節疾患治療薬と、ヒアルロン酸又はその誘導体又はそれらの塩とを化学的に結合させた結合体、その製造方法並びに上記結合体を含む医薬に関する。背景技術

関節軟骨は約 7 0 %の水分と、軟骨細胞および軟骨マトリックスとから構成されている。軟骨マトリックスを構成する主成分はコラーゲンとプロテオダリカンであり、網目構造を有するコラーゲンのネットワークに水分保持能に富むプロテォグリカンが含有されている。軟骨マトリックスは粘弾性に富み、軟骨にかかる刺激や負荷を軽減して、関節軟骨が正常な形態と機能を保持する上で重要な役割を果たしている。

変形性関節症（以下、 O Aとも称す）と慢性関節リウマチ（以下、 R Aとも称す）は、共に軟骨マトリックスの破壊を伴う代表的な疾患である。両疾患におけるマトリックスの破壊は、 O Aでは加齢に伴うメカニカルストレス、 R Aでは滑膜表層細胞の過剰増殖、パンヌス形成、炎症性細胞の浸潤などが引き金となり、いずれもプロテアーゼの誘導を介して惹起されると考えられている。軟骨マトリックスの分解は中性の p Hを持つ細胞外で行われることから、この領域の p Hを至適とするマトリックスメタ口プロテア一ゼ（以下、 MM Pとも称す。総称として用いる時には MM P sとも称す）が分解の中心的な担い手と言われている。

現在までに、 MM Pファミリ一に属するものとして、ヒトでは 1 6種類のプロテア一ゼが報告されており、それらと結合して活性を阻害する組織メタ口プロテァーゼインヒビ夕一（以下、 T I M Pとも称す。総称として用いる時は、 T I M P sとも称す）と呼ばれる生体内タンパク質も 4種類が見いだされている。 MM P ―

Sは生理的条件下では発生、血管新生、性周期、骨リモデリング、組織修復などさまざまな機能を担っている。これらの機能が適切に発現されるよう、 MM P s の産生、活性化および基質との相互作用の各段階は T I M P s等によって厳密にコントロールされている。換言すれば、病態でのマトリックスの破壊は、 MM P sの調節機構に何らかの破綻が生じ、 MM P sが過剰に産生、活性化されたことに起因すると考えられる。

それゆえ、 MM P sを阻害する薬物は、 O Aや R A等の関節疾患における軟骨マトリックスの破壊を抑制する薬物として極めて有望である。 MM P sを阻害する薬物はこれまでにも数多く報告されているが、阻害活性の強さと MM P sへの特異性の高さからヒドロキサム酸である MM P阻害剤が、現在、最も注目されている。既に経口投与でも MM P阻害作用を発揮するヒドロキサム酸が見いだされており、そのうちのいくつかは癌患者や関節炎患者を対象に、臨床試験が開始されている。

しかし、この種の MM P阻害剤は、程度の差こそあれ、すべての MM P sに対する阻害作用を持ち、生理的な機能に関わる MM P sをも抑制してしまうという重大な欠点がある。事実、癌患者を対象に進行中のヒドロキサム酸の臨床試験では、一過性ながら骨筋肉痛、腱炎などの副作用が報告されている。最近では、特定の MM P sへの特異性を高めた改良品の開発も進められているが、未だ病態のみに関与する MM P sは見いだされていない。また、続々と新規な MM P sが発見されていることから、全身投与時には MM P sの何らかの生理作用を抑制してしまう可能性が依然として残る。

上記問題点を解消する試みとしては、第 1に、ヒドロキサム酸の関節腔内への局所投与が考えられる。しかし、ヒドロキサム酸の局所濃度を維持するためには、頻回の投与が必要となり、長期の投与を余儀なくされる O Aや R Aの患者では、極めて困難である。他の試みとしては、ヒドロキサム酸を標的部位にのみ限定的に局在させる、いわゆるドラッグデリバリーシステムの使用が考えられる。しかし、従来技術では投与されたヒドロキサム酸を罹患関節内に限定的に局在または貯留させる方法は確立されていない。

このように、ヒドロキサム酸は優れた薬理作用を有しながらも、 O Aや尺八のような慢性疾患の治療薬として臨床応用するためには、依然として解決すべき問題点が存在する。

一方、現在、関節疾患、特に O Aや肩関節周囲炎においては、ヒアルロン酸（以下、 H Aとも称す）及びその架橋物（以下、ヒアルロン酸とその架橋物を総称して H A製剤とも称す）の関節内注入療法が臨床的に広く行われている。

ヒアルロン酸（H A) は、 N—ァセチルダルコサミンとグルクロン酸との繰り返し単位より構成される生体内多糖であり、関節液を構成する主成分として関節液の粘弾性、荷重吸収作用および潤滑作用の保持に重要な働きを果たしている。また、 H Aは、軟骨マトリックスにおいて、軟骨プロテオダリカンと結合して、ァグリカンと呼ばれる重合体を形成し、軟骨基質の水分保持能と粘弾性を維持する中心的な役割を担つている。

一般に、 H A製剤は、 MM P sを阻害する作用はないものの、潤滑剤として、更には関節での H A産生を促進するなどにより、関節機能の障害を緩和する作用を有すると言われている。 H Aは元々、細胞外マトリックスの構成成分でもあることから細胞外マトリックスに高い親和性を有し、またそれ自身高い粘弾性を有することから、関節内に注入された後、関節腔内に長時間局在する特徴を有している。実際、 " C標識 H Aを用いた実験では、ゥサギ膝関節腔内に投与された¹⁴ C標識 H Aは、関節液、滑膜組織、関節軟骨の表層などに分布し、それらの組織から消失するのに 3日間以上を要すると報告されている。また、 H Aは関節液中では分解を受けず、滑膜組織や関節軟骨では一部が分解されるものの、大半は徐々に滑膜を介して血中に移行し、肝臓にて低分子化を受けると言われている。

従って、 H A製剤に何らかの薬物を結合させた後、生体内に投与すれば、その薬物は H A製剤と共に特定部位に長時間貯留し、薬物単独を投与した場合に比べ、特定部位での薬物の作用時間は、大幅に延長することが期待される。また、こうした効果により、薬物の投与量、投与回数は従来の投与方法に比べ著しく低減でき、結果的に副作用を大幅に軽減させることが可能となることが期待される。

H Aと薬物との結合体としては、これまでに、特開平 5— 8 5 9 4 2号公報記載のィンターフェロン—ヒアルロン酸結合体、 WO 9 2 Z 0 6 7 1 4号公報記載のヒアルロン酸—抗癌剤結合物質、特開昭 6 2 - 6 4 8 0 2号公報記載のヒアルロン酸一コルチコステロイド結合体、及び特許第 2 7 0 1 8 6 5号公報記載のヒアルロン酸一抗生物質共役結合体等が知られている。

しかし、これらの例では殆どの場合、 H Aが低分子化を受けるか、 H Aと薬物の結合が加水分解を受けるなどして薬物が遊離し、その薬物が標的細胞または組織に取り込まれてはじめて薬効が発現する。発明の開示

本発明の目的の一つは、関節疾患治療薬（例えば、マトリックスメタ口プロテァーゼ阻害剤、特にヒドロキサム酸を関節腔内に貯留させることのできるマトリックスメタ口プロテアーゼ阻害剤；あるいはその他の非ステロイド抗炎症薬、シクロォキシゲナ一ゼー 2阻害薬、疾患修飾性抗リウマチ薬またはステロイド薬）とヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体又はそれらの塩との結合体を提供することである。

本発明の別の目的は、上記結合体の製造方法を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、上記結合体を含む医薬を提供することである。本発明者らは、 MM P阻害作用を有するヒドロキサム酸が人工的な多糖の一種であるァガロースにカツプリングした場合でも、 MM P sへの結合能を保持していることを証明した例があること（Moore W. M. & Sp i l burg C. A. , Bi ochemi s t ry 25, 5189-5195 (1986) ) 、並びに、これまで発見された全ての MM P sが細胞外あるいは細胞表層で機能を発現する酵素であることに着目し、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、関節疾患治療薬（例えば、 MM P阻害剤、あるいはその他の非ステロイド抗炎症薬、シクロォキシゲナーゼー 2阻害薬、疾患修飾性抗リウマチ薬またはステロイド薬）を H A又は H A誘導体又はそれらの塩に化学的に結合させることによって作製される結合体、例えばヒドロキサム酸と H A製剤との共有結合体は、両者が結合したままの状態でも MM P阻害作用を発現することを見い出し、本発明を完成するに至った。

さらにまた、関節腔内に投与された関節疾患治療薬と H A又は H A誘導体又はそれらの塩との結合物は、 H A製剤同様、関節腔内に長期間貯留し、 MM P阻害剤に伴う全身性の副作用を軽減すると共に、関節疾患治療薬としての H Aの薬効を保持しうること、すなわち、局所において両者相俟つた相乗的な薬効が期待でき、生物学的有用性が改善された薬剤となりうることを見いだし、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明の第 1の側面によれば、（ 1 ) 1種以上の関節疾患治療薬と（2 ) ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体又はそれらの塩との結合体が提供される。本発明の一態様では、関節疾患治療薬とヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体又はそれらの塩との結合は共有結合である。

本発明の一態様では、関節疾患治療薬はマトリックスメタ口プロテアーゼ阻害剤である。

本発明の一態様では、マトリックスメタ口プロテアーゼ阻害剤はスぺーサーを介してヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体又はそれらの塩と結合している。本発明の結合体において、結合体全体に対するマトリックスメタ口プロテア一ゼ阻害剤の重量割合には特に制限はないが、好ましくは 0 . 0 1 ~ 5 0 %、特に好ましくは 0 . 1〜 1 0 %である。

本発明の結合体において好ましくは、マトリックスメタ口プロテア一ゼ阻害剤はヒドロキサム酸残基である。

マトリックスメタ口プロテア一ゼ阻害剤は特に好ましくは、一般式（1 ) ：

[式中、 R ,は、水素原子、水酸基、又は炭素数 1〜 8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表し； R ₂は、炭素数 1〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表し； R ₃は、シクロアルキル基、ァリール基もしくは複素環基で置換されていてもよい炭素数 1〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表し； R ₄は、水素原子、又は炭素数 1〜4の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表す。 ] で表されるヒドロキサム酸残基である。

本発明の結合体においては、マトリックスメタ口プロテアーゼ阻害剤とヒアルロン酸成分との間にスぺーサ一が存在する場合、スぺーサ一は特に好ましくは、一般式（2 ) ：

- R ₅ - R ₆- R₇- R₈- ( 2 )

[式中、 R ₅は、炭素数 1〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキレン基を表し； R ₆は、炭素数 1〜4の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基で置換されていてもよいメチレン基もしくはイミノ基、または酸素原子を表し； R₇は、：！〜 3個の酸素原子が挿入されていてもよい炭素数 1 ~ 1 0の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキレン基を表し； R₈は、酸素原子、硫黄原子、又は N R₉ (ここで、 R₉は、水素原子、又は炭素数 1〜4の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表す）を表す。 ] で表される。

本発明の結合体において、マトリックスメタ口プロテアーゼ阻害剤とスぺ一サ —との結合体の特に好ましい具体例は、一般式（3 ) ：

HO、

[式中、 R ₁₂は、 1個のイミノ基および又は 1〜 4個の酸素原子が挿入されていてもよい炭素数 2〜2 3の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキレン基を表し； R ₁₃ は、水素原子、又は炭素数 1〜4の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表す。 ] で表される。

また本発明の結合体を生体に投与した場合、マトリックスメタ口プロテア一ゼ阻害剤はヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体又はそれらの塩と結合した状態でマトリックスメタ口プロテア一ゼを阻害する。

本発明の第 2の側面によれば、関節疾患治療薬中の活性に影響を及ぼさない部位と、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体又はそれらの塩のカルボキシル基、水酸基または還元末端の官能基とを、直接の化学反応によって又はスぺーサーを介して結合させることを含む、本発明の結合体の製造方法が提供される。即ち、上記の製造方法においては、関節疾患治療薬（例えば、マトリックスメタ口プロテア一ゼ阻害剤）中の活性に影響を及ぼさない部位と、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体又はそれらの塩の力ルポキシル基、水酸基または還元末端の官能基とを、直接の化学反応によって結合させること、あるいは、結合反応を行う時、関節疾患治療薬（例えば、 MM P阻害剤）とスぺーサ一の先端にある反応点との間に空間が生じるため、関節疾患治療薬（例えば、 MM P阻害剤）の立体的影響を受けることなく H A又は H A誘導体又はそれらの塩と反応すること、及び Z又は、結合体において、 H A又は H A誘導体又はそれらの塩と関節疾患治療薬（例えば、 MM P阻害剤）との間に空間が生じるため、 MM Pが H A又は H A誘導体又はそれらの塩の立体的影響を受けることなく関節疾患治療薬（例えば、 MM P 阻害剤）に近づくこと、すなわち、 MM P阻害活性が結合した状態でも維持されること等を期待して、スぺーサーを介して結合させることが含まれる。

本発明の第 3の側面によれば、本発明の結合体を含む医薬が提供される。本発明の医薬は、特には関節疾患の治療薬、さらに具体的には変形性関節症、慢性関節リウマチ又は肩関節周囲炎の治療薬である。図面の簡単な説明

図 1は、本発明の結合体による各種 MM P sに対する阻害活性（上の図はコラゲナ一ゼー 1に対する阻害活性、下の図はストロメライシン— 1に対する阻害活性）を示すグラフである。

図 2は、本発明の結合体による各種 MM P sに対する阻害活性（上の図はゲラテナーゼ Aに対する阻害活性、下の図はゲラチナーゼ Bに対する阻害活性）を示すグラフである。

図 3は、本発明の結合体によるコラーゲンフィルム破壊阻害活性を示すグラフである。

図 4は、本発明の結合体の結合安定性（結合体 5の安定性、 3 7 °C、生理食塩水中）を示すグラフである。

図 5は、本発明の結合体の結合安定性（結合体 4の半透膜に対する透過性）を示すグラフである。

図 6は、本発明の結合体のラット関節腔貯留性を示すグラフである。

図 7は、本発明の結合体のラット関節腔貯留性を示すグラフである。

図 8は、本発明の結合体による各種 MM P sに対する阻害活性（上の図はコラゲナーゼー 1に対する阻害活性、下の図はストロメライシン一 1に対する阻害活性）を示すグラフである。

図 9は、本発明の結合体による各種 MM P sに対する阻害活性（上の図はゲラチナ一ゼ Aに対する阻害活性、下の図はゲラチナーゼ Bに対する阻害活性）を示すグラフである。

図 1 0は、本発明の結合体による関節軟骨コラーゲン破壊阻害活性を示すダラフである。図 1 0において、 *はィンターロイキン— 1 +プラスミノ一ゲン添加群と有意差があることを示す（p < 0 . 0 5、 Dunne t tの多重比較検定、平均値土標準誤差（n = 4 ) ) 。発明を実施するための好ましい形態

本発明において、関節治療楽としては、例えば；

( 1 ) サリチル酸系非ステロイド抗炎症薬（サザピリン、アスピリン、ジフル二サル、サリチルアミド等が挙げられる）、フエナム酸系非ステロイド抗炎症薬 (フルフエナム酸、フルフエナム酸アルミニウム、メフエナム酸、フロクタフエニン、トルフエナム酸等が挙げられる）、ァリール酢酸系非ステロイド抗炎症薬 (ジクロフェナクナトリウム、トルメチンナトリウム、スリンダク、フェンブフェン、インドメ夕シン、インドメタシンフアルネシル、ァセメタシン、マレイン酸プログルメ夕シン、アンフエナクナトリウム、ナブメトン、モフエゾラク、ェトドラク、アルクロフェナク等が挙げられる）、プロピオン酸系非ステロイド抗炎症薬（イブプロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、プラノプロフェン、フエノプロフェンカルシウム、チアプロフェン酸、ォキサプロジン、ロキソプロフェンナトリウム、アルミノプロフェン、ザルトプロフェン、チアプロフェン酸等が挙げられる）、ピラゾロン系非ステロイド抗炎症薬（ケトフエニルブタゾン等が挙げられる）、ォキシカム系非ステロイド抗炎症薬（ピロキシカム、テノキシカム、アンピロキシカム等が挙げられる）、塩基性非ステロイド抗炎症薬（塩酸チアラミド、塩酸チノリジン、塩酸べンジダミン、ェピリゾール、ェモルファゾン等が挙げられる）などの非ステロイド抗炎症薬；

(2) シクロォキシゲナーゼー 2阻害薬（セレコキシブ（celecoxib) ：サール、 MK-966：メルク、 ΠΕ522：日本たばこ等が挙げられる）；

(3) ぺニシラミン、口ベンザリットニナトリウム、オーラノフィン、ブシラミン、ァクタリット、サラゾスルファピリジン、金チオリンゴ酸ナトリウム、クロロキン、 TNF o;受容体製剤（例えば Eribr (登録商標）：アメリカン，ホーム-プロダクツ）、ミゾリビン、シクロスポリン、メトトレキセート、 leflunoinide：へキストマリオンルセル、ァザチォプリン、 FK- 506:藤沢薬品、 VX- 497:Vertex、 TAK-603:武田薬品工業、抗 TNFひ抗体 (例えば inf 1 iximab： Centocor、 D2E7:Knoll)、抗 IL-6受容体抗体（例えば、 MRA : 中外製薬）、 T- 614 :富山化学、 KE_298、大正製薬、 mycop enolate mof et i 1 :Roche> thai idomide： Celgen, j "几 CD 4抗体、 I L— 1受容体アンタゴニスト、抗 CD 5 2抗体、 p 3 8MAPキナーゼ阻害薬、 I CE阻害薬、 TACE阻害薬などの抗リウマチ薬；

(4) ステロイド薬（酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、トリアムシノロンァセトニド、デキサメタゾン、パルミチン酸デキサメタゾン、ベタメ夕ゾン、酢酸パラメ夕ゾン、酢酸ハロプレドン、フアルネシル酸プレドニゾロン、酢酸テトラコサクチド等が挙げられる）；

(5) 塩酸プロ力イン、塩酸テトラカイン、塩酸リドカインなどの局所麻酔薬；並びに

(6) マトリックスメタ口プロテア一ゼ阻害剤などの軟骨保護薬；

が挙げられるが、好ましくはマトリックスメタ口プロテアーゼ阻害剤が挙げられる。

本発明において、マトリックスメタ口プロテア一ゼ（MMP) 阻害剤とは、任意の生体（好ましくは哺乳類、特に好ましくはヒト）由来の任意のマトリックスメタ口プロテア一ゼの活性を、例えばそれに結合すること等により、阻害することができる全ての物質を意味する。より具体的には、 MMP阻害剤とは、カルボン酸、リン酸、チオール、ヒドロキサム酸等の官能基を介して MM Pの活性中心の亜鉛に結合することで酵素阻害活性を発揮する化合物またはタンパク質（ポリペプチドを含む）を意味し、また、 MMP sあるいは、分子中にディスィンテグリンと MMP様のドメインを併せ持つタンパク分解酵素（例えば、 TN F a変換酵素、あるいはデイスインテグリン —メタ口プロテア一ゼファミリ一（ADAM) に属する一群のプロテアーゼ）の酵素活性の発現を阻害するものを意味する。これらの MMP阻害剤の活性は、例えば、 Cawston, T. E. & Barrett, A. J [Anal Biochem. , 99, 340-345 (1979) ]や Baici, Aら [Anal. Biochem. , 108, 230 - 232 (1980)]に記載された標識基質、 Masui'Y ら [Biochem. Med. , , 215-221 (1977)]に記載された合成基質の MM P sによる分解に対する阻害活性として測定することができ、簡便には、これらの方法に基づいて開発された市販の MM P活性測定キットを用いて同様に測定することもできる。また、コラーゲン等の基質のフィルム上で培養した細胞をサイト力インで刺激した際に産生 ·活性化される MMP sの活性を、培養液中への基質分解物の遊離を指標に測定する実験系 [Gavrilovic,； [ら： Cell. Biol. Int. Reports, 9, 1097- 1107 (1985)： Br. J, Pharmacol. , 100. 631- 635 (1990)中で引用されている] 、あるいは末梢白血球をリポポリサッカリド等で刺激して惹起される細胞膜表層からの TNF αの遊離を TNF α変換酵素の活性として評価する実験系 [DiMartino ら： Inflam.Res.， 46, 211-215 (1997) ]などにおいて、 MMP sや TNF a変換酵素の産生や活性化に対する阻害活性として測定することもできる。上記の MM P阻害剤は、これら測定系の少なくとも一つで 1 Omg/ml以下のいずれかの濃度で 50 %以上の抑制を示すことを特徴とする。さらに、その構造式中に化学修飾を施しても、これら測定系のいずれか一つにおいて、阻害活性が 1 OmgZm 1以下のいずれかの濃度で 45 %以上の抑制を示していれば、そのような化学修飾された阻害剤も含まれる。

MMP阻害剤の非限定的具体例としては、テトラサイクリン系化合物（テトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、及びテトラサイクリンの化学修飾体（例えば CMT 1〜4 ；コラゲネックス）等が挙げられる）、 T I MP s、及びヒドロキサム酸等が挙げられ、 MM P阻害活性の強さと MM P sへの特異性の高さの点から、好ましくはヒドロキサム酸が挙げられる。

このような MM P阻害剤の例は、例えば、特公平 9一 8082 5号公報、特許第 27 3628 5号公報、及びドラッグ ·ディスカバリー · トウディ、丄， 16- 26 (1996)等に記載されている。

ヒドロキサム酸とは、 N—ヒドロキシアミド基を有する化合物を意味し、非限定的具体例としては、 AG— 3340 (ァグロン（Agouron) ) 、 CD P - 845 (ゼネ力）、 CGS— 27023 A (ノバルティス）、 D 5410 (カイロサイエンス）、 L 7 58354 (メルク）、 CH— 1 38 (カイ口サイエンス）、マリマス夕ット（Marimastat、登録商標、プリティシュバイオテック）、ガラルデイン（Galardin、登録商標、グリコメッド）、 R o 3 1— 9790 (ロシュ）、 R032 - 3 55 5 (ロシュ）、 BAY 1 2— 9 566 (ベィァ一）及び R S 1 30830 (ロッシュバイオサイエンス）等が挙げられる。また本発明の結合体中のヒドロキサム酸残基の非限定的具体例としては、例えば一般式（1) ：

[式中、は、水素原子、水酸基、又は炭素数 1〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表し； R₂は、炭素数 1〜 8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表し； R₃は、シクロアルキル基、ァリール基もしくは複素環基で置換されていてもよい炭素数 1〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表し； R₄は、水素原子、又は炭素数 1〜4の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表す。 ] で示されるヒドロキサム酸残基が挙げられる。

一般式（1) で示される MMP阻害剤であるヒドロキサム酸残基の定義において、 R,の非限定的具体例としては、水素原子、水酸基、メチル基、ェチル基、 n 一プロピル基、 i一プロピル基、 n—ブチル基、 s e c—ブチル基、イソブチル基、 t—ブチル基、 n—ペンチル基、 n—へキシル基、 n—へプチル基、 n—ォクチル基等が挙げられるが、好ましくは水素原子である。

R₂の非限定的具体例としては、メチル基、ェチル基、 n—プロピル基、 i—プ PC 口ピル基、 n —ブチル基、 s e c —ブチル基、イソブチル基、 t—ブチル基、 n —ペンチル基、 n—へキシル基、 n _ヘプチル基、 n—才クチル基等が挙げられるが、好ましくはイソブチル基である。

R ₃における、シクロアルキル基、ァリール基もしくは複素環基で置換されていてもよい炭素数 1〜 8の直鎖もしくは分岐鎖状アルキル基の炭素数 1〜 8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基中のアルキル基成分の非限定的具体例としては、メチル基、ェチル基、 n _プロピル基、 i 一プロピル基、 n—ブチル基、 s e c —プチル基、イソブチル基、 t—ブチル基、 n —ペンチル基、 n—へキシル基、 n—ヘプチル基、 n—才クチル基等が挙げられるが、好ましくは、メチル基、ィソブチル基、 t 一ブチル基である。

また、上記アルキル基上に存在していてもよいシクロアルキル基、ァリール基もしくは複素環基の非限定的具体例としては；

炭素数 3〜 1 0、好ましくは炭素数 5〜 7のシクロアルキル基（例えば、シク口ペンチル基、シクロへキシル基、又はシクロへプチル基等）；

水酸基、メトキシ基等の置換基を有していてもよい炭素数 6〜 2 0、好ましくは炭素数 6〜 1 4のァリ一ル基（例えば、フエニル基、 p —ヒドロキシフエニル基、又はナフチル基等）；並びに

窒素原子、硫黄原子又は酸素原子の中から選択される同一又は異なる 1個以上、好ましくは 1から 3個、特に好ましくは 1個のへテロ原子を含む、原子数 5〜2 0、好ましくは原子数 5〜 1 0、特に好ましくは原子数 5、 6、 9又は 1 0の飽和又は不飽和の複素環（例えば、ピリジル基、キノリル基、又は 3—インドリル基等；特に好ましくは 3—インドリル基）が挙げられる。

代表的には、 R ₃は、ァリール基もしくは複素環基で置換されている炭素数 1〜 5の直鎖状のアルキル基が好ましく、なかでもべンジル基、 p —ヒドロキシベンジル基、 3 —インドリルメチル基が特に好ましく、 3—インドリルメチル基が最も好ましい。

R ₄の非限定的具体例としては、水素原子、メチル基、ェチル基、 n —プロピル基、 i—プロピル基、 n—ブチル基、 s e c —ブチル基、イソブチル基、 tーブチル基が挙げられるが、好ましくは水素原子である。一般式（1) で示されるヒドロキサム酸残基は 1個以上の不斉炭素中心を含むが、各不斉炭素中心について、その絶対配置が R配置及び S配置のいずれのものも、本発明に含まれる。

マトリックスメタ口プロテアーゼ阻害剤の重量割合は、結合体全体に対して好ましくは 0. 0 1〜50%であり、特に好ましくは 0. 1〜 1 0 %である。

なお、本発明の 1種以上の関節疾患治療薬とヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体又はそれらの塩との結合体において、好ましい関節疾患治療薬である MM P 阻害剤は、結合体の合成過程もしくは合成後で、その構造が変化する場合があり得るが、変化した場合でも、本明細書に記載した阻害活性（MMP阻害、コラーゲン分解抑制、および TNF αの遊離抑制のいずれか 1つ以上）を有していれば、本発明に含まれる。

本発明において、「ヒアルロン酸（ΗΑ) 」とは、重量平均分子量 1 00, 0 00〜1 0, 000, 000を有する、グルクロン酸と Ν—ァセチルダルコサミンとから成る二糖の重合体、並びにこれらの混合物を意味する。ヒアルロン酸は、粘弾性の強さの点から、重量平均分子量 700, 000〜 1 0, 000, 000 を有するヒアルロン酸が好ましく、重量平均分子量 1, 000， 000〜 10， 000, 000のヒアルロン酸が特に好ましい。

本発明において「ヒアルロン酸誘導体」とは、ヒアルロン酸から誘導されるヒアルロン酸骨格を有する全ての物質を意味する。ヒアルロン酸誘導体の非限定的具体例としては；

(1) 糖成分であるグルクロン酸及び Ζ又は Ν—ァセチルダルコサミンが還元末端を有しているヒアルロン酸誘導体；

(2) ヒアルロン酸中の 1以上の水酸基がァセチル化されているァセチル化ヒアルロン酸；

(3) 重量平均分子量 100, 000〜： L 0, 000， 000を有するダルクロン酸と Ν—ァセチルダルコサミンとからなる二糖の重合体を、ホルムアルデヒドで架橋してさらに高分子化した誘導体（例えば、シンビスク（Synvisc、登録商標、バイオマトリックス）；並びに

(4) 本明細書中上記したヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体に 1以上の薬効成分、例えば制癌剤（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アルカロイド等が挙げられる）、免疫抑制剤、抗炎症剤（ステロイド剤、非ステロイド系抗炎症剤等が挙げられる）、抗リウマチ剤、抗菌剤（i3—ラクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、新キノロン系抗生物質、ポリペプチド系抗生物質、サルファ剤等が挙げられる）などを、スぺーサーを介して又は介さずに結合させることによって得られる誘導体：

等が挙げられる。

ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の塩の非限定的具体例としては、ナトリゥム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩などを挙げることができる。

H Aの由来には特に制限はないが、例えば、放線菌等のバクテリア、ヒト、ブタ、ニヮトリ等に由来する H Aを使用できる。

H A及びそれらの塩の非限定的具体例としては、例えば、スべニール（登録商標、日本ルセル）、ァルツ（登録商標、科研製薬）、オペガン（登録商標、参天製薬）、ヒアルガン（登録商標、フィーディア）、オルトビスク（登録商標、ァ二カセラピューティックス）、ヒアロン（登録商標、フアルマシア &アップジョン）等を挙げることでき、また、和光純薬工業（株）等の各種試薬メーカ一の力夕ログに記載の H A及びこれらの塩を挙げることもできる。

本発明の結合体においては、関節疾患治療薬（例えば、マトリックスメタロブ口テアーゼ阻害剤）と、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体又はそれらの塩とは、スぺ一サ一を介して又は介さずに結合している。関節疾患治療薬（例えば、マトリックスメタ口プロテアーゼ阻害剤）と、ヒアルロン酸又はヒアルロン誘導体又はそれらの塩との間の結合様式としては、スぺーサ一を介さない場合にはァミド結合、エーテル結合等の結合が挙げられ、あるいはスぺーサーを介して結合している。好ましくは、関節疾患治療薬（例えば、マトリックスメタ口プロテアーゼ阻害剤）と、ヒアルロン酸又はヒアルロン誘導体又はそれらの塩とは、スぺ一サーを介して結合している。

関節疾患治療薬（例えば、マトリックスメタ口プロテアーゼ阻害剤）とヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体又はそれらの塩とがスぺ一サーを介さずに結合している場合、これらの両者はそれらの活性を損なわない部位で結合している。また、関節疾患治療薬（例えば、マトリックスメタ口プロテア一ゼ阻害剤）とヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体又はそれらの塩とがスぺ一サーを介して結合している本発明の好ましい態様においては、スぺーサ一と関節疾患治療薬、並びにスぺーサ一と H A又は H A誘導体又はそれらの塩は、関節疾患治療薬及び H A又は H A誘導体又はそれらの塩が、その活性を損なわない部位でスぺーサ一と、それぞれ結合している。

そのような活性を損なわない部位としては、関節疾患治療薬（例えば、 MM P 阻害剤）においては、例えば、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、及びチォ一ル基等が挙げられる。また、 MM P阻害剤である関節疾患治療薬が一般式（1 ) で表されるヒドロキサム酸残基である本発明の好ましい態様の場合、その末端に位置する 1級もしくは 2級のアミノ基が挙げられる。 H A又は H A誘導体又はそれらの塩においては、例えば、水酸基又はカルボキシル基が挙げられるが、好ましくは力ルポキシル基である。

関節疾患治療薬（例えば、 MM P阻害剤）と H A又は H A誘導体又はそれらの塩、スぺ一サ一と関節疾患治療薬（例えば、 MM P阻害剤）、並びにスぺ一サーと H A又は H A誘導体又はそれらの塩との間の結合の種類は特に限定されないが、例えば、アミド結合、エーテル結合、エステル結合、スルフイド結合が挙げられる。

H A又は H A誘導体又はそれらの塩に結合する関節疾患治療薬は 1種である必要はなく、 2種以上の異なる関節疾患治療薬であってもよい。また、 1つの結合体にスぺーサーを介した結合部位とスぺーサ一を介さない結合部位とを有することを妨げない。さらには、 1つの結合体中に存在するスぺ一サ一が同一である必要もない。

スぺ—サ一の種類は、関節疾患治療薬（例えば、 MM P阻害剤）と H A又は H A誘導体又はそれらの塩の活性に重大な影響を及ぼさない限り特に限定されず、その非限定的具体例としては、例えば一般式（2 ) ：

- R ₅ - R ₆ - R ₇- R ₈- ( 2 ) ―

[式中、 R₅は、炭素数 1〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキレン基を表し； R ₆は、炭素数 1〜 4の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基で置換されていてもよいメチレン基もしくはイミノ基、または酸素原子を表し； R₇は、 1〜3個の酸素原子が挿入されていてもよい炭素数 1〜 1 0の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキレン基を表し； R₈は、酸素原子、硫黄原子、又は NR₉ (ここで、 R₉は、水素原子、又は炭素数 1〜4の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表す）を表す。 ] で示されるスぺ一サ一が挙げられる。

上記一般式（2) で示されるスぺーサ一は、 R₅—末端で関節疾患治療薬（例えば、 MMP阻害剤）と結合し、 R₈—末端で HA又は HA誘導体又はそれらの塩と結合する。

一般式（2) で示されるスぺ一サ一の定義において、 R₅の非限定的具体例としては、メチレン基、ェ夕ン一 1, 2—ジィル基、プロパン— 1, 3—ジィル基、ブタン— 1, 4—ジィル基、ペンタン一 1， 5—ジィル基、へキサン— 1， 6— ジィル基、ヘプタン— 1， 7—ジィル基、オクタン— 1， 8—ジィル基、 2—メチルペンタン— 1， 3—ジィル基、 2—メチルブタン— 1, 4一ジィル基、 3— メチルブタン— 1， 4一ジィル基、 3—メチルペンタン— 1, 5—ジィル基、 3 —ェチルペンタン— 1, 5—ジィル基、 3—メチルへキサン— 1, 6—ジィル基、 4—メチルへキサン— 1, 6—ジィル基、 4—メチルヘプタン— 1, 7—ジィル基などが挙げられ、好ましくはェタン— 1， 2—ジィル基、プロパン一 1, 3— ジィル基、ブタン一 1, 4—ジィル基である。

R₆における、炭素数 1〜 4の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基で置換されていてもよいメチレン基もしくはィミノ基の、炭素数 1〜4の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基としては、メチル基、ェチル基、 n—プロピル基、 i一プロピル基、 n—ブチル基、 s e c—ブチル基、 t一ブチル基が挙げられる。

代表的には R₆は、炭素数 1〜 3の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基で置換されていてもよいメチレン基、及び酸素原子が好ましく、メチレン基、及び酸素原子が特に好ましい。

R₇の非限定的具体例としては、メチレン基、ェ夕ン— 1, 2—ジィル基、プロパン一 1, 3—ジィル基、ブタン— 1， 4—ジィル基、ペンタン— 1, 5—ジィル基、へキサン— 1, 6—ジィル基、ヘプタン— 1， 7 _ジィル基、オクタン— 1， 8—ジィル基、ノナン— 1 , 9 _ジィル基、オクタン— 1， 1 0—ジィル基、

2—メチルペンタン— 1, 3—ジィル基、 2—メチルブタン一 1, 4一ジィル基、

3—メチルブタン— 1， 4—ジィル基、 3—メチルペンタン一 1， 5—ジィル基、 3—ェチルペンタン— 1， 5—ジィル基、 3—メチルへキサン— 1, 6 _ジィル基、 4ーメチルへキサン— 1， 6—ジィル基、 4一メチルヘプタン— 1, 7—ジィル基、 1—ォキサ一プロパン一 1 , 3—ジィル基、 2—ォキサブタン一 1, 4 —ジィル基、 3 _ォキサペンタン— 1, 5—ジィル基、 2—ォキサへキサン— 1， 6—ジィル基、 3—ォキサへキサン— 1, 6—ジィル基、 1， 4—ジォキサへキサン— 1, 6—ジィル基、 3 _ォキサヘプタン— 1， 7 _ジィル基、 2, 5—ジォキサヘプタン— 1, 7—ジィル基、 4—ォキサオクタン— 1， 8—ジィル基、 2， 6—ジォキサオクタン— 1， 8—ジィル基、 3, 6—ジォキサノナン一 1， 9—ジィル基、 3， 6—ジォキサ— 4—メチルノナン— 1， 9一ジィル基、 3， 6—ジォキサ— 5—ェチルノナン— 1， 9—ジィル基、 1, 4, 7 _トリオキサオクタン一 1， 10 _ジィル基などが挙げられ、好ましくはェタン一 1 , 2—ジィル基、プロパン— 1, 3—ジィル基、ブタン— 1, 4—ジィル基、 3, 6—ジォキサノナン— 1， 9 _ジィル基などが挙げられる。

R₈の非限定的具体例としては、酸素原子、硫黄原子、イミノ基、メチルイミノ基、ェチルイミノ基、 n—プロピルイミノ基、 i一プロピルイミノ基、 n—プチルイミノ基、 s e c—プチルイミノ基、イソプチルイミノ基、 t一プチルイミノ基が挙げられるが、好ましくはィミノ基またはメチルイミノ基などが挙げられ、特に好ましくはィミノ基である。

一般式（2) で示されるスぺーサ一の好ましい具体例としては、 ― (CH₂) ₄ — NH -、 - (CH₂) ₅— NH―、 - (CH₂) ₆— NH -、 ― (CH₂) ₇_NH―、一 (CH₂) ₈— NH―、 - (CH₂) ₉—NH -、 ― (CH₂) ,。—題—、 ― (CH ₂) n—NH -、 - (CH₂) ₁₂— NH―、 - (CH₂) ₂-0— (CH₂) 「匪一、 ― (CH₂) 3-0- (CH₂) ₃— NH―、 - (CH₂) ₄— 0_ (CH₂) 「匪—、 - (CH₂) 3-0- (CH₂) ₂-0- (CH₂) ₂-0- (CH₂) ₃— NH—等が挙げられる。さらに、関節疾患治療薬（例えば、マトリックスメタ口プロテアーゼ阻害剤）とヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体又はそれらの塩とがスぺーサーを介して結合している結合体において、関節疾患治療薬（例えば、マトリックスメタロブ口テアーゼ阻害剤）とスぺーサ一との結合体の好ましい非限定的具体例としては、一般式（3) ：

[式中、 R_l2は、 1個のイミノ基および又は 1〜4個の酸素原子が挿入されていてもよい炭素数 2〜23の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキレン基を表し； R₁₃ は、水素原子、又は炭素数 1〜4の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表す。 ] で示される結合体を挙げることができる。

一般式（3)で示される結合体のうち、ビドロキサム酸残基部分は、一般式（1) で示される好ましい MM P阻害剤の例と同一である。

また、 R₁₂の非限定的具体例としては、ェ夕ン— 1， 2 _ジィル基、プロパン — 1， 3—ジィル基、ブタン— 1， 4—ジィル基、ペンタン一 1， 5—ジィル基、へキサン一 1, 6—ジィル基、ヘプタン— 1, 7—ジィル基、オクタン一 1， 8 —ジィル基、ノナン一 1, 9—ジィル基、デカン— 1, 10—ジィル基、ゥンデカン— 1, 1 1—ジィル基、ドデカン— 1， 1 2—ジィル基、 2—メチルペン夕ン— 1 , 3—ジィル基、 2—メチルブタン— 1, 4—ジィル基、 3—メチルブ夕ンー 1， 4—ジィル基、 3—メチルペンタン— 1， 5—ジィル基、 3—ェチルぺン夕ン— 1， 5—ジィル基、 3—メチルへキサン一 1， 6—ジィル基、 4—メチルへキサン一 1, 6—ジィル基、 4一メチルヘプタン— 1 , 7—ジィル基、 — （C H₂) ₂—〇一 (CH₂) ₂—、 - (CH₂) 3-0- (CH₂) ₃—、 - (CH₂) ₄—〇一 ―

(CH₂) ₄一、 - (CH₂) 3-O- (CH₂) 「0— (CH₂) ₂—〇— (CH₂) ₃_ などが挙げられ、好ましくはブタン— 1， 4—ジィル基、ペンタン— 1， 5—ジィル基、へキサン— 1, 6—ジィル基、ヘプタン— 1, 7—ジィル基、オクタン一 1， 8—ジィル基、ノナン— 1， 9—ジィル基、デカン— 1 , 10—ジィル基、ゥンデカン— 1， 1 1—ジィル基、ドデカン— 1, 1 2—ジィル基、一（CH₂) ₂—〇ー (CH₂) ₂_、 ― (CH₂) 3-O- (CH₂) ₃—、一 (CH₂) ₄-0- (C H₂) ₄—、 - (CH₂) ₃—0— (CH₂) ₂-0- (CH₂) ₂-0- (CH₂) ₃_などが挙げられる。 R₁₃の非限定的具体例としては、水素原子、メチル基、ェチル基、 n—プロピル基、 i—プロピル基、 n—ブチル基、 s e c—ブチル基、イソブチル基、 t一ブチル基などが挙げられるが、好ましくは水素原子及びメチル基などが挙げられ、特に好ましくは水素原子が挙げられる。

本発明の、一般式（2) で表されるスぺーサ一、及び一般式（3) で表される結合体は、分子内に不斉炭素原子を有する場合があり、その絶対配置が R配置、 S配置である立体異性体が存在する場合があるが、その各々、あるいはそれらの任意の割合の構造単位（スぺ一サ一及び結合体）のいずれも本発明に包含される。本発明の結合体の製造方法としては、例えば、関節疾患治療薬（例えば、 MM P阻害剤）中の活性に影響を及ぼさない部位（例えば、アミノ基、力ルポキシル基、水酸基、及びチォ一ル基等が挙げられる）と、 HA又は HA誘導体又はそれらの塩の力ルポキシル基、水酸基、又は還元末端由来のアルデヒド基とを、化学反応によって結合させる方法が挙げられる。これらは、既知の手法（新生化学実験講座第 1巻タンパク質 I (東京化学同人）、蛋白質 ·酵素の基礎実験法（南江堂）などに記載）で行うことができる。

具体的には、

(1) 脱水縮合剤を用いて、関節疾患治療薬（例えば、 MMP阻害剤）あるいは HA又は HA誘導体又はそれらの塩中のカルボキシル基を活性化し、アミド結合、エステル結合またはチォエステル結合を形成させる方法；

(2) 関節疾患治療薬（例えば、 MMP阻害剤）中の水酸基を臭化シアンを用いて活性化した後、 HA又は HA誘導体又はそれらの塩中のアミノ基と結合させる方法、及び H A又は H A誘導体又はそれらの塩中の水酸基を臭化シアンを用いて活性化した後、関節疾患治療薬（例えば、 MM P阻害剤）中のアミノ基と結合させる方法；

( 3 ) ェピクロルヒドリン等のェピハロヒドリンもしくは 1， 4—ブタンジォールジグリシジルエーテル等のジエポキシド、あるいは、トシルクロリドゃトレシルクロリド等のスルホニルクロリドを用いて、関節疾患治療薬（例えば、 MM P 阻害剤）あるいは H A又は H A誘導体又はそれらの塩中の水酸基を活性化し、ェ一テル結合ゃィミノ結合またはスルフィド結合を形成させる方法；並びに

( 4 ) H A又は H A誘導体又はそれらの塩中の還元末端を還元して生じた 1級水酸基を酸化してアルデヒド基として、関節疾患治療薬（例えば、 MM P阻害剤）中のァミンと還元的アルキル化を行う方法：

などが挙げられる。

また、（1 ) から（4 ) の方法を二つ以上組み合わせた方法も含まれる。

脱水縮合剤を用いて、関節疾患治療薬（例えば、 MM P阻害剤）あるいは H A 又は H A誘導体又はそれらの塩中の力ルポキシル基を活性化し、アミド結合ゃェステル結合またはチォエステル結合を形成させる方法の場合、一般の有機合成に用いられる縮合剤を用いることができるが、好ましくはカルポジイミド類、ホスホニゥム類、ゥロニゥム類等を用いる。カルポジイミド類としては、ジイソプロピルカルポジイミド、ジシクロへキシルカルポジイミド等の非水溶性カルポジィミド、及び 1 一ェチル— 3— （3—ジメチルァミノプロピル）カルポジイミド等の水溶性カルポジイミドがあり、ホスホニゥム類としては、ベンゾトリアゾ一ル — 1—ィルォキシトリス（ジメチルァミノ）ホスホニゥムへキサフルォロホスフエート、 7—ァザべンゾトリァゾ一ル— 1ーィルォキシトリス（ジメチルァミノ）ホスホニゥムへキサフルォロホスフェート等があり、ゥロニゥム類としては、 O —ベンゾトリアゾ一ル— 1—ィル— N， N , N， N—テトラメチルゥロニゥムへキサフルォロホスフェート、 O— 7—ァザべンゾトリァゾールー 1 —ィル—N， N， N， N—テトラメチルゥロニゥムへキサフルォロホスフェート等がある。また、これら縮合剤に反応促進性の添加剤を加えてもよい。添加剤として、 N —ヒドロキシスクシンイミド、 N—ヒドロキシ一 5 —ノルボルネン一 2， 3—ジカルボキシミド、 p—二トロフエノール、ペンタフルオロフエノ一ル、 1—ヒドロキシベンゾトリァゾ一ル、 1ーヒドロキシー 7 —ァザべンゾトリアゾ一ル等が挙げられる。

脱水縮合剤を用いて、関節疾患治療薬（例えば、 MM P阻害剤）あるいは H A 又は H A誘導体又はそれらの塩中のカルボキシル基を活性化し、アミド結合ゃェステル結合またはチォエステル結合を形成させる方法の非限定的具体例である、水溶性カルポジイミドによる縮合法では、 0 . 1〜 1 % (重量容量）の H A水溶液にカルポジイミドを加えた後、アミノ基を有する関節疾患治療薬（MM P阻害剤）を加え、 0〜3 5 °Cで 1〜9 6時間反応させることができる。この間、塩酸ゃリン酸などの酸を添加し、反応液の p Hを 4〜6に維持することもできる。また、用いる関節疾患治療薬（例えば、 MM P阻害剤）の、水に対する溶解性が低い場合、 1〜5 0 %の有機溶媒（例えば、 N， N—ジメチルホルムアミド、 N—メチルピロリドン、ジォキサン、エタノール、ピリジンなど）を含む水溶液を反応溶媒とすることも可能であり、この場合、反応系に関節疾患治療薬（例えば、 MM P阻害剤）を予め加え、溶けていることを確認した後、カルポジイミドを加えてもよい。

さらに、反応促進性の添加剤（例えば、 N—ヒドロキシスクシンイミド、 N— ヒドロキシ— 5 —ノルポルネン— 2， 3—ジカルボキシミド、 p—ニトロフエノール、ペンタフルオロフエノ一ル、 1—ヒドロキシベンゾトリアゾ一ル、 1—ヒドロキシ— 7—ァザべンゾトリアゾール等）と H Aとを予め脱水縮合剤で処理し、 H Aのカルボキシル基を活性エステルとしたものを、一旦単離した後、関節疾患治療薬（例えば、 MM P阻害剤）を加えて反応させることもできる。

関節疾患治療薬（例えば、 MM P阻害剤）中の水酸基を臭化シアンを用いて活性化した後、 H A又は H A誘導体又はそれらの塩中のアミノ基と結合させる方法、及び H A又は H A誘導体又はそれらの塩中の水酸基を臭化シアンを用いて活性化した後、関節疾患治療薬（例えば、 MM P阻害剤）中のアミノ基と結合させる方法の非限定的具体例として挙げられるものを以下に記す：

H A又は H A誘導体又はそれらの塩の水溶液に、臭化シアンを加え、 0〜 1 0 で 5〜 3 0分間反応させる。この間、水酸化ナトリウムやリン酸緩衝液などで p Hを 1 0〜 1 2に維持することもできる。その後、ァセトニトリルを加えて沈殿させ、過剰の臭化シアンを取り除き、再度水溶液とし、アミノ基を有する関節疾患治療薬（例えば、 MMP阻害剤）を加え、 4〜 25 で 1〜 24時間反応させる。この間、炭酸水素ナトリウムや水酸化ナトリウムなどで反応液の pHを 8〜 1 0に維持することもできる。

HA又は HA誘導体又はそれらの塩中の還元末端を還元して生じた 1級水酸基を酸化してアルデヒド基として、関節疾患治療薬（例えば、 MMP阻害剤）中のァミンと還元的アルキル化を行う方法の非限定的具体例を以下に記す：

水素化ホウ素ナトリゥムなどの還元剤で処理した後、過ヨウ素酸ナトリゥムなどの酸化剤で処理することにより得られる、還元末端にアルデヒド基を有する H A又は HA誘導体又はそれらの塩の水溶液に、アミノ基を有する関節疾患治療薬 (例えば、 MMP阻害剤）を加え、さらに、水素化シァノホウ素ナトリウムを加え、 1 5〜30°Cで 1〜24時間反応させる。この間、酢酸、塩酸、リン酸などの酸を加え、 pHを 4〜6に維持することもできる。

いずれの縮合法においても、反応後、反応液にエタノール、アセトン等の有機溶媒を加え沈殿させ、沈殿物を、アルコール沈殿、ゲルろ過、透析、イオン交換クロマトグラフィーなどの手段により精製することにより、目的とする結合体を得ることができる。

本発明の関節疾患治療薬とヒアルロン酸との結合体を医薬として適用する場合、本発明の結合体は、薬学的に許容できる賦形剤、又は安定剤などと一緒に製剤化してから使用することが好ましい。

医薬の投与形態は特に限定されず、経口投与でも非経口投与でもよく、また、全身投与でも局所投与でもよい。一般的には、本発明の医薬は非経口的に局所投与するのが好ましく、例えば、注射剤として、関節内、静脈内、筋肉内又は皮下に投与することができ、あるいはスプレー剤、局所用クリーム又は軟膏として経皮的に投与することができる。

本発明の医薬の投与量は、患者の症状、年齢、性別などに応じて適宜選択できるが、注射剤として用いる場合は一般的には、有効成分である結合体の量として 0. 0 lmg/体重 k 日〜 10 Omg/体重 k gZ日、好ましくは 0. lm gZ体重 k g_ 日〜 101118 体重1^ gZ日である。前記 1日当たりの投与量の医薬は、一日に数回に分けて投与してもよいし、あるいは 1日 1回、または 2日〜28日に 1回投与してもよい。実施例

実施例 1 ： MM P阻害剤合成

(a) N—ベンジルォキシカルボニル— 1， 4—ジァミノブタン

1 , 4—ジアミノブタン（ 10 g、 1 1 3mmo 1 ) を水一エタノール（ 10 0m l ： 300m l ) に溶解し、氷冷攪拌下、ベンジルォキシカルボニルクロライド（ 1 9. 35 g、 1 13mmo 1 ) の 1， 2—ジメトキシェタン（50m l ) 溶液を約 30分間で滴下した。 2N水酸化ナトリウム水溶液 2m 1を添加後、そのまま 3時間氷冷攪拌し、 4°Cにて 1 5時間攪拌した。大部分の溶媒を減圧で留去した後、水に溶解し、濃塩酸で酸性にした。クロ口ホルム（1 00m l X 2) 洗浄後、水層を 2 N水酸化ナトリゥム水溶液にてアル力リ性にしてクロ口ホルムにて抽出した。得られた有機層を、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧で留去して、 1 1. 0 gの油状物を得た。（収率 44%)

Ή-NMR (270MHz , CDC 1₃) ： δ 1. 4— 1. 5 (4H、 m；) 、 2. 7 (2H、 t) 、 3. 2 (2H、 t) 、 5. 1 (2H、 s) 、 7. 3— 7. 4 (5 H、 m)

MS : 222 (M⁺)

(b) N— 9一フルォレニルメチルォキシカルポ二ルー L一トリプトファン— N— （4一 N—ベンジルォキシカルボニルアミノブチル）アミド

氷冷攪拌下、 N— 9—フルォレニルメチルォキシカルボニルトリブトファン（ 2. 22 g、 4. 5mmo l ) 、 1—ヒドロキシベンゾトリアゾ一ル（ 0. 90 g、 5. 8 5mmo 1 ) の N， N—ジメチルホルムアミド（DMF) 溶液（20m l ) に、 1—ェチルー 3— (3—ジメチルァミノプロピル）カルポジイミド塩酸塩（E DC) (1. 1 2 g、 5. 85mmo l ) を添加し、 1時間攪拌した。反応液に、上記得られた N—ベンジルォキシカルボニル— 1 , 4ージアミノブタン（l g、 4. 5mmo 1 ) を加え、そのまま氷冷下で攪拌後、 1 5〜 30 °Cにて 1 5時間攪拌を続けた。大部分の溶媒を減圧で留去した後、クロ口ホルム（100m l ) に転溶し、 0. 5 N塩酸水溶液（4 0m I X 2) 、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（5 0m l ) 、および飽和食塩水（5 0m l ) で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥後、濃縮して得られた残留物をクロ口ホルム一メタノールを溶出液としたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、無色の粉末 2. l gを得た。（収率 7 4 %)

Ή-NMR (2 7 0MH z、 CD C 1₃) : 6 2. 2— 3. 4 ( 1 0 H、 m) 、 4. 2 ( 1 H、 t ) 、 4. 3— 4. 5 (3 H、 m) 、 5. 1 (2 H、 s ) 、 7. 0 - 8. 0 ( 1 8 H、 m)

( c) L—卜リプ卜ファン一 N— （4一 N—べンジルォキシカルボニルァミノプチル）アミド

上記（b) で得られた縮合体（2. l g) を DMF ( 5 0m l ) に溶かし、ピペリジン（3m l ) を添加して 1 5〜 3 0°Cで 3 0分間攪拌した。大部分の溶媒を減圧で留去した後、残留物をクロ口ホルム/メタノールを溶出液としたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、透明の油状物 1. 0 gを得た。（収率 7 4 %)

Ή-NMR ( 2 7 0 MH z、 CDC 1₃) : 6 1. 4 (4H、 m) 、 3. 0— 3. 4 (6 H、 m) 、 3. 7 ( 1 H、 m) 、 5. 1 (2 H、 s ) 、 7. 0— 7. 7 ( 9 H、 m)

MS : 4 0 8 (M+)

(d) (4 - (N—ベンジルォキシァミノ） _ 2—イソブチルサクシニル）一 L _トリプトファン— N— (4—N—ベンジルォキシカルポニルアミノブチル）アミド：（化合物 1 a)

L—トリブトファン— N—（4—N—べンジルォキシカルポニルアミノブチル）アミド（1. 1 8 g、 2. 9mmo 1 ) を DMF 3 0m l に溶解させ、氷冷攪拌下、公知の方法（特開平 6— 1 4 5 1 4 8) に基づいて合成した 4一（N—ベンジルォキシァミノ） — 2 Γノブチルこはく酸（7 3 2 mg、 2. 6mmo 1 ) と、 ED C ( 5 5 2mg、 2. 9mmo 1 ) を順次加え、反応温度を氷冷〜水冷とし、 3日間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、クロ口ホルムにて希釈し、クロ口ホルム層を 0. 1 N塩酸、水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて順次洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過後、ろ過残さと水層を酢酸ェチルで再抽出し、酢酸ェチル層とクロ口ホルム層を合わせて減圧濃縮した。得られた粗生成物はシリカゲルクロマトグラフィー精製（WAKO、 C - 200 , 溶出溶媒クロロホルム、及びクロ口ホルム：アセトン = 1 ： 1) を行い、得られたフラクシヨンをまとめて減圧濃縮、乾燥し、標題化合物 1 aを 1. 20 g (68 %) 得た。

MS ： 670 (M + H+)

(e) (4一（N—ヒドロキシァミノ） _ 2 (R) 一イソプチルサクシニル）一 L—トリブトファン一 N— (4— N—アミノブチル）アミド：（化合物 2) (4— (N—ヒドロキシァミノ）一 2 (S) —イソブチルサクシニル） —L—トリブトフアン— N— （4— N—アミノブチル）アミド：（化合物 3)

(4一（N—ベンジルォキシァミノ）一 2—イソブチルサクシニル）一 Lートリブトフアン— N— （4 _N—べンジルォキシカルポニルアミノブチル）アミド (化合物 l a) (1. 20 g、 1. 8mmo 1 ) をメタノール 50m 1に溶解させ、水素雰囲気常圧下、 1 0%P dZC 14 Omgにて 16時間接触還元した。反応液をセライトろ過後、減圧濃縮した。得られた粗生成物を逆相 HP LC (力ラム： YMC— P a c k、〇DS、 25 OmmX 2 Omm I . D. 、溶出溶媒：

0. 1 %トリフルォロ酢酸（TFA) を含む水ーァセトニトリル系、流速： 10 m l Z分）にて、ジァステレオマーをそれぞれ分取精製し、凍結乾燥を行い、標題化合物 2 (親水性側のピーク）の TFA塩 283mgと、標題化合物 3 (疎水性側のピーク）の TFA塩 493mgとを、それぞれ得た。

化合物 2 ：

Ή-NMR (27 OMHz , CD₃OD) : 0. 70 (3H、 d、 J = 6 H z ) 、 0. 7 7 (3H、 d、 J = 6Hz) 、 1. 02 - 1. 53 (7H、 m) 、 2. 1 2 (1 H、 d d、 J = 14、 5 H z ) 、 2. 29 (1H、 d d、 J = 14、 9 H z) 、 2. 59 - 2. 68 (lH、 m) 、 2. 80— 2. 85 (2 H、 m；) 、 3. 10— 3. 36 (4H、 m) 、 4. 49 - 4. 58 (lH、 m) 、 6. 96— 7. 09 (3H、 m) 、 7. 30 (1H、 d、 J = 8 H z ) 、 7. 57 (1H、 d、 J = 8Hz) 、 7. 9 5 - 8. 04 (2H、 m) MS ： 446 (M + H+)

化合物 3 ：

Ή-NMR (270 z、 CD₃OD) : 0. 5 1 (3H、 d、 J = 6Hz 0. 56 (3H、 d、 J = 6Hz 0. 63— 0. 92 (2H、 m 1. 1 1— 1. 2 1 (l H、 m 1. 56 - 1. 58 (4H、 m 2. 02 (1 H、 d d、 J = 1 5、 2Hz 2. 3 1 (1H、 d d、 J = 1 5、 l lHz 2. 48 - 2. 60 (lH、 m 2. 86 - 3. 45 (6H、 m 4. 64-4. 72 (l H、 m 6. 9 1— 7. 04 (3H、 m 7. 27 (1 H、 d、 J = 8Hz 7. 54 (1 H、 d、 J = 8Hz 7. 97— 8. 08 (2H、 m)

MS ： 446 (M + H+)

( f ) N—ベンジルォキシカルボ二ルー 1 , 8—ジァミノオクタン

上記（a) における N—ベンジルォキシカルポ二ルー 1 , 4_ジァミノブタンの合成と同様に、 1, 4—ジァミノブタンの代わりに、 1， 8—ジアミノォクタンを出発原料として標題化合物を油状物 6. 8 gとして得た（収率 58 %) 。

Ή-NMR (270MHz、 CDC 1 ,) δ 3 (8Η、 s ) 、 4 - 1

5 (4Η、 m) 、 2. 7 (2Η、 t、 J = 7 Η ζ ) 、 3. 2 (2Η、 m) 、 5. 1 (2Η、 s) 、 7. 3 - 7. 4 (5Η、 m)

MS : 278 (Μ⁺)

(g) Ν— 9一フルォレニルメチルォキシカルボ二ルー L—トリプ卜ファン一 N— ( 8— N—ベンジルォキシカルポニルアミノォクチル）アミド

氷冷攪拌下、 N- 9一フルォレニルメチルォキシカルボニルトリブトファン（ 7. 8 g、 1 5. 8mmo l ) 、 1ーヒドロキシベンゾトリアゾ一ル（ 3. 1 5 g、 20. 5mmo 1 ) の DM F溶液（1 00m l ) に、 EDC (3. 90 g、 20. 5mmo 1 ) を添加し、 1時間攪拌した。反応液に、上記得られた N—ベンジルォキシカルボニル一 1 , 8—ジァミノオクタン（4. 4 g、 1 5. 8mmo 1 ) を加え、そのまま氷冷下で攪拌後、 1 5〜30°Cにて 1 5時間攪拌を続けた。大部分の溶媒を減圧で留去した後、クロ口ホルム（200m l ) に転溶し、 0. 5 N塩酸水溶液（ 50m 1 X 3) 、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（100m l ) 、および飽和食塩水（5 0m l ) で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥後濃縮し、精製せずにそのまま次の反応に用いた。

(h) L一トリブトファン一 N— ( 8—N—ベンジルォキシカルボニルァミノォクチル）アミド

上記（g) で得られた縮合体を DMF ( 1 5 0m l ) に溶かし、ピペリジン（ 1 0m l ) を添加して 1 5〜 3 0°Cで 3 0分間攪拌した。大部分の溶媒を減圧で留去した後、残留物をクロ口ホルム/メタノールを溶出液としたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、黄色の油状物 6. l gを得た。（N—べンジルォキシ力ルポ二ルー 1， 8—ジァミノオクタンからの収率 7 4 %)

Ή-NMR ( 2 7 0 MH z , CDC 1₃) ： (5 1. 2— 1. 6 ( 1 2 H、 m) 、 2. 9— 3. 4 ( 6H、 m) 、 3. 7 ( 1 H、 m) 、 5. 1 (2 H、 s ) 、 7. 0— 7. 7 ( 9 H、 m)

MS : 4 6 5 (M+)

( i ) (4— (N—ベンジルォキシァミノ）一 2—イソプチルサクシニル） ― L—トリプトフアン一 N— (8—N—べンジルォキシカルポニルアミノォクチル）アミド：（化合物 4)

化合物 1 aの合成例と同様に、 L一トリブトファン— N— (4— N—ベンジルォキシカルポニルアミノブチル）アミドの代わりに L一トリプトファン一 N— (8 —N—べンジルォキシカルボニルァミノォクチル）アミド（2. 0 7 g、 4. 5 mmo 1 ) を原料として、標題化合物 2. 5 gを得た（収率 8 5 %) 。但し、反応溶媒は DMF 3 Om 1とし、反応時間は 2日間とした。また、減圧濃縮した反応残さは酢酸ェチルにて希釈し、再抽出は行わなかった。シリカゲルクロマトグラフィー精製の溶出溶媒には、クロ口ホルム、及びクロ口ホルム：アセトン = 2 ： 1を用いた。得られた標題化合物は、そのまま次の反応に使用した。

( j ) _ (4 - (N—ヒドロキシァミノ） — 2 (R) _—イソプチルサクシニル）

—L一トリブトファン一 N— ( 8 —N—アミノォクチル）アミド：（化合物 5)

(4一（N—ヒドロキシアミノ） - 2 (S) —イソプチルサクシニル） — Lートリプ卜ファン一 N— (8 -N —ァミノォクチル）アミド：（化合物 6)

化合物 2および化合物 3の合成例と同様に、（4一（N—ベンジルォキシアミ - 2—イソブチルサクシニル） — L—トリプトファン一 N— （4— N—ベンジルォキシカルボニルァミノブチル）アミド（丄）の代わりに（4一（N—ベンジルォキシァミノ）一.2—イソプチルサクシニル）一 L一トリブトファン— N— (8—N—べンジルォキシカルボニルアミノォクチル）アミド（化合物 4) 2. 5 g (3. 4mmo 1 ) を原料として、標題化合物 5および標題化合物 6のジァステレオ混合物（化合物 7) 1. 7 gを得た（収率 1 0 0 %) 。このジァステレォ混合物のうち、 36 Omgを逆相 HPLCにて、ジァステレオマ一をそれぞれ分取精製し、凍結乾燥を行い、標題化合物 5 (親水性側のピーク）の TFA塩 1 5 1mgと、標題化合物 6 (疎水性側のピーク）の TFA塩 1 47mgとを、それぞれ得た。

化合物 5 ：

Ή-NMR ( 2 7 OMH z , DMSO - d₆) ： 0. 74 (3H、 d、 J - 6 H z) 、 0. 7 9 (3H、 d、 J = 6Hz) 、 0. 9 7— 1. 5 9 (1 5H、 m) 、 1. 9 1 ( 1 H、 d d、 J = 14、 8Hz) 、 2. 0 3 (1 H、 d d、 J = 14、 7Hz) , 2. 62 - 2. 8 3 (3 H、 m) .、 2. 8 9 - 3. 1 2 (4H、 m) 、 4. 40 -4. 48 (l H、 m) 、 6. 9 5 (1 H、 d d、 J = 7、 7Hz) 、 7. 04 ( 1H、 d d、 J =7、 7Hz) 、 7. 1 1 (1 H、 d、 J = 2H z) , 7. 3 0 ( 1 H、 d、 J = 8H z) 、 7. 54 ( 1 H、 d、 J = 8 H z ) , 7. 58 - 7. 8 1 (4H、 m) 、 8. 0 1 ( 1 H、 d、 J = 8H z) 、 8. 7 3 (1 H、 s) 、 1 0. 38 ( 1 H、 s) 、 1 0. 7 8 ( 1 H、 s )

MS : 5 0 2 (M + H+)

化合物 6 ：

Ή-NMR (2 7 0MHz , DMSO— d₆) : 0. 5 5 (3H、 d、 J = 5 H z) 、 0. 6 6 (3H、 d、 J = 5Hz) 、 0. 7 5— 1. 5 9 ( 1 5 H, m) , 1. 94 ( 1 H、 d d、 J = 1 5、 5 H z ) 、 2 · 14 ( 1 H、 d d、 J = 1 5、 9Hz) 、 2. 5 7— 3. 3 8 (7H、 m) 、 4. 32 -4. 44 ( l H、 m) 、 6. 9 5 ( 1 H、 d d、 J = 7 7Hz) 、 7. 04 (1H、 d d、 J = 7、 7 Hz) 、 7. 1 0 (1 H、 b r s) 、 7. 30 ( 1 H、 d、 J = 8Hz) 、 7. 5 3 ( 1 H、 d, J = 8H z) 、 7. 6 5 (3H、 b r s ) , 7. 90 ( 1 H、 t、 J = 6H z) 、 8. 1 9 ( l H、 d、 J = 8H z) 、 8. 7 3 (1 H、 b r s ) 、 1 0. 45 ( 1 H、 s ) , 1 0. 7 8 ( 1 H、 s )

MS : 50 2 (M + H⁺)

(k) N—べンジルォキシカルボ二ルー 4， 7， 1 0—トリオキサー 1 , 丄 3 -トリデカンジァミン

上記（a) における N—ベンジルォキシカルボニル— 1 , 4—ジァミノブタンの合成と同様に、 1, 4ージアミノブタンの代わりに、 4， 7, 1 0—トリオキサ— 1， 1 3—トリデカンジァミンを出発原料として標題化合物を油状物 5. 0 gとして得た（収率 3 9 ) 。

Ή-NMR (2 7 0MHz、 CDC ") δ 1. 6 - 1. 7 (4H、 m) 、 2. 8 (2H、 t、 J = 6. 7 H z ) 、 3. 3 (2H、 m) 、 3. 5 - 3. 6 (1 2 H、 m) 、 5. 1 (2H、 s) 、 5. 6 ( 1 H、 b r s ) 、 7. 3— 7. 4 ( 5 H、 m)

MS ： 3 54 (M+)

( 1 ) N— 9—フルォレニルメチルォキシカルボ二ルー L—トリブトファン— N— ( 1 3— N—べンジルォキシカルボニルァミノー 4， 7， 1 0—トリオキサ -トリデカニル）アミド

上記（b) における N— 9—フルォレニルメチルォキシカルボ二ルー L一トリブトファン一 N— (4— N—ベンジルォキシカルボニルアミノブチル）アミドの合成と同様に、 N—ベンジルォキシカルボ二ルー 1， 4ージアミノブタンの代わりに、 N—べンジルォキシカルボニル— 4， 7, 1 0—トリオキサ— 1, 1 3— トリデカンジァミンを出発原料として標題化合物を油状物 8. 0 gとして得た（収率 3 9 %) 。

Ή-NMR ( 2 7 0 MHz , C D C 1₃) : (5 1. 42— 1. 5 9 ( 2 H, m) , 1. 64 - 1. 7 5 ( 2 H, m) , 3. 0 9— 3. 3 2 ( 1 0H、 m) 、 3. 4 2— 3. 6 0 (8H、 m) 、 4. 20 (1 H、 t、 J = 6. 8 H z ) 、 4. 3 1 - 4. 50 (3H、 m) 、 5. 06 (2H、 s) 、 5. 24 ( 1H、 b r s) 、 5. 70 ( 1 H、 b r s) 、 6. 08 ( 1 H、 b r s) 、 6. 9 9 (1 H、 s) 、 7. 07 - 7. 1 9 (2H、 m) 、 7. 2 7 - 7. 42 ( 1 0H、 m) 、 7. 5 4 - 7. 58 (2H、 m) 、 7. 66 (1H、 d、 J - 7. 3Hz) 、 7. 76 (2H、 d、 J = 7. 6 H z ) 、 8. 89 ( 1 H、 b r s )

MS : 78 5. 6 (M + N a⁺)

(m) L—トリプトファン— N— （ 1 3—N—ベンジルォキシカルボニルアミノ— 4, 7， 1 0—トリオキサートリデカニル）アミド

上記（c) における L—トリプトファン— N— (4— N—ベンジルォキシカルボニルアミノブチル）アミドの合成と同様に、 N— 9—フルォレニルメチルォキシカルボニル— L一トリブトファン一 N— (4—N—ベンジルォキシカルボニルアミノブチル）アミドの代わりに、 N— 9一フルォレニルメチルォキシカルボ二ル—L—トリプトファン— N— ( 1 3— N—べンジルォキシカルボニルァミノ— 4, 7, 1 0—トリオキサートリデカニル）アミドを出発原料として、標題化合物を油状物 4. 2 gとして得た（収率 78 %) 。

Ή-NMR (27 OMH z CD C 1₃) : 5 1. 64— 1. 77 (4H、 m) 、 2. 9 5 - 3. 04 (l H、 m) 、 3. 23 - 3. 36 (7H、 m；) 、 3. 45 — 3. 69 (l lH、 m) 、 5. 08 (2H、 s) 、 5. 34 (1H、 b r s) 、 7. 05 - 7. 2 1 (3H、 m) 、 7. 26— 7. 38 (6H、 m) 、 7. 66 (1H、 d、 J = 7. 6Hz) 、 8. 5 1 (1 H、 b r s)

MS : 541 (M⁺)

(n) (4一（N—ベンジルォキシァミノ） ― （2 R) —イソプチルサクシ二ル） —L一トリプトファン— N— ( 1 3—N—ベンジルォキシカルボニルァミノ一 4， 7, 1 0—トリオキサ—トリデカニル）アミド（化合物 8)

化合物 1 aの合成例と同様に、 L一トリブトファン一 N— (4— N_ベンジルォキシカルボニルァミノブチル）アミドの代わりに L_トリブトファン一 N_(l 3—N—ベンジルォキシカルポニルァミノ— 4, 7, 10—トリオキサ—トリデ力ニル）アミド（1. 30 g、 2. 4mmo 1 ) と、公知の方法（特開平 6— 1 45 148) に基づいて合成した 4一（N—ベンジルォキシァミノ） ― (2 R) 一イソブチルこはく酸（0. 56 g、 2. Ommo 1 ) を原料として、標題化合物 8を 1. 1 5 g (収率 72 %) の無色のアモルファスとして得た。但し、反応溶媒は DM F 2 Om 1とし、反応温度は 1 5〜30で、反応時間は 6時間とした。また、減圧濃縮した反応残さは酢酸ェチルにて希釈し、クロ口ホルム層を硫酸水素カリウム水溶液、水、飽和炭酸カリウム水溶液、飽和食塩水にて順次洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。シリカゲルクロマトグラフィー精製の溶出溶媒には、酢酸ェチル及びジクロロメタン：メタノール = 9 1を用いた。

Ή-NMR (2 7 0MHz、 DMSO— d₆) ： δ 0. 74 (3H、 d、 J = 5.

9Hz) , 0. 8 0 (3H、 d、 J = 6. 5Hz) 、 0. 9 3— 1. 0 5 (1 H、 m) 、 1. 2 9 - 1. 4 1 (2H、 m) 、 1. 5 1— 1. 5 8 (2H、 m) 、 1.

6 0 - 1. 6 7 (2H、 m) 、 1. 94 (1 H、 d d、 J = 1 4. 0、 7. 3 H z) 、 2. 0 8 (1 H、 d d、 J = 14. 3、 7. 3H z) 、 2. 6 5 - 2. 7 8 ( 1 H、 m) 、 2. 9 2 - 3. 1 4 (6H、 m) 、 3. 26 (2H、 t、 J =

6. 5H z) 、 3. 3 8— 3. 48 ( 1 2H、 m) 、 4. 47 ( 1 H、 d t、 J

= 7. 8、 6. 7 H z ) 、 4. 7 6 (2H、 s ) 、 5. 0 0 (2H、 s ) 、 6.

94 (1 H、 d d、 J = 7. 6、 7. 2Hz) 、 7. 04 ( 1 H、 d d、 J - 8.

1、 7. 2Hz) 、 7. 1 2 (1 H、 s) 、 7. 22 ( 1 H、 t、 J = 5. 7 H z) , 7. 2 9 - 7. 34 ( l l H、 m) 、 7. 5 5 ( 1 H、 d、 1 = 7. 6 H z) 、 7. 7 9 (1H、 t、 J = 5. 4Hz) 、 8. 0 5 (1 H、 d、 J = 7.

8Hz) 、 1 0. 7 8 (1 H、 s ) 、 1 1. 0 1 ( 1 H、 s )

(o) (4 - (N—ヒドロキシァミノ）一（2 R) —イソプチルサクシニル）

—L一トリプトファン一 N— ( 1 3— N—ァミノ一 4， 7 , 1 0—トリオキサ一トリデカニル）アミド（化合物 9)

(4— (N—ベンジルォキシァミノ）一（2 R) —イソブチルサクシニル） ―

L—トリブトファン—N_ (1 3— N—ベンジルォキシカルボニルァミノ— 4,

7, 1 0 _トリオキサ—トリデカニル）アミド（化合物 8) (1. 9 0 g、 2.

4mmo 1 ) をメタノール 2 00m l に溶解させ、炭酸水素ナトリウム 20 0m gを加え、水素雰囲気常圧下、 1 0 %P dZC 2 0 Omgにて 3時間接触還元した。反応液をセライトろ過後、減圧濃縮したところ標題化合物 9が無色のァモルファスとして 1. 50 g (収率 9 9 %) 得られた。

Ή-NMR ( 2 7 0MHz、 CD₃OD) ： d 0. 84 (3H、 d、 J = 5. 9 Hz) , 0. 8 9 (3H、 d、 J = 6. 2Hz) 、 1. 1 7 (1 H、 d d d、 J = 1 1. 9、 7. 6、 5. 1 Ηζ) 、 1. 38— 1. 54 (2H、 m) 、 1. 5 6 - 1. 65 ( 2 H、 m) 、 1. 7 1— 1. 8 1 (2H, m) , 2. 1 5 ( 1 H、 d d、 J = 14. 9、 7. 4Hz) , 2. 28 (1H、 d d、 J = 14. 3、 7. 4Hz) , 2. 78 (1H、 t、 J = 6. 8Hz) 、 2. 80 (1H、 b r s) 、 3. 09 - 3. 32 (6H、 m) 、 3. 44— 3. 49 (2H、 m) 、 3. 52 一 3. 65 (8H、 m) 、 4. 62 (1H、 t、 J = 7. 3Hz) 、 7. 04 (1 H、 d d、 J = 7. 6、 7. 0Hz) 、 7. 1 2 ( 1 H、 d d、 J = 8. 0、 7. 0Hz) 、 7. 1 5 (1 H、 s) 、 7. 37 ( 1 H、 d、 J = 8. 0Hz) 、 7. 6 5 (1 H、 d、 J = 7. 6 H z )

MS : 578 (M + H+) 実施例 2 ：結合体の合成例 1

MM P阻害剤（化合物 2) 70mgに、 N—メチルピロリドン 0. 49m lとピリジン 0. 0 1m lを加えて溶かし、 1^塩酸0. 045m 1 と水で pHを 4. 7に調整し、全量を lm 1とした。これをヒアルロン酸ナトリウム 5 mgに加え、均一とした。再度 pH4. 7を確認し、氷冷下、 EDC 1 Omgを加え 30分間攪拌し、その後 1 5〜30でで 1 5時間攪拌した。

反応液に、 0. 1M重曹 lm 1とエタノール 6m 1を加え沈殿させ、沈殿物は、アルコール沈殿法（沈殿を 0. 2M食塩水 1 m 1に溶かし、エタノール 3m lで沈殿させ、沈殿を遠心分離する）を 3回繰り返すことにより精製し、 4. 3mg の結合体（「結合体 1」）を得た。

ィンドール環に由来する 279 nmでの UV吸収から算出された結合率は、 0. 84重量％であった。これは、 0. 76 %のカルボキシル基が反応したことに相当する。実施例 3 ：結合体の合成例 2

MM P阻害剤（化合物 3) 7 Omgに、 N—メチルピロリドン 0. 49m lとピリジン 0. 0 1m lを加えて溶かし、 1M塩酸0. 05m 1 と水で pHを 4. 7に調整し、全量を lm lとした。これをヒアルロン酸ナトリウム塩 5mgに加え、均一とした。再度 pH4. 7を確認し、氷冷下、 EDC l Omgを加え 30 分間攪拌し、さらに 1 5〜30°Cで 20時間攪拌した。

反応液に、 0. 1M重曹 lm 1とエタノール 6m 1を加え沈殿させ、沈殿物は、アルコール沈殿法（0. 2M食塩水 lm 1に溶かし、エタノール 3m lで沈殿させ、沈殿を遠心分離する）を 3回繰り返すことにより精製し、 3. 5mgの結合体（「結合体 2」 ) を得た。

ィンドール環に由来する 279 nmでの UV吸収から算出された結合率は、 1. 1重量％であった。これは、 1. 0 %の力ルポキシル基が反応しこことに相当する。実施例 4 ：結合体の合成例 3

MM P阻害剤（化合物 7) 77mgに、 N—メチルピロリドン 0. 603m l とピリジン 0. 0 12m 1を加えて溶かし、 1M塩酸0. 1 05m lと水でpH を 4. 7に調整し、全量を 1. 23m lとした。これをヒアルロン酸ナトリウム塩 6. 2mgに加え、均一とした。再度 pH4. 7を確認し、氷冷下、 EDC 2 4m gを加え 4 で 3日間攪拌した。

反応液に、 lMNaOHO. 1 23 m 1 とエタノール 0. 5m lを加え氷冷下 30分間攪拌した後、さらにエタノール 3m 1加え沈殿させ、沈殿物は、アルコール沈殿法（0. 2M食塩水 1 m 1に溶かし、エタノール 3m 1で沈殿させ、沈殿を遠心分離する）を 3回繰り返すことにより精製し、 6. Omgの結合体（「結合体 3」）を得た。

ィンドール環に由来する 279 nmでの UV吸収から算出された結合率は、 1. 7重量％であった。これは、 1. 4 %のカルボキシル基が反応したことに相当する。実施例 5 ：結合体の合成例 4

MM P阻害剤（化合物 7) 1 89mgに、 N_メチルピロリドン 1. 47m l とピリジン 0. 03m lを加えて溶かし、 11 塩酸0. 24m lと水で pHを 4. 7に調整し、全量を 3m lとした。これをヒアルロン酸ナトリウム 1 5mgに加え、均一とした。再度 pH4. 7を確認し、氷冷下、 EDC 87mgを加え 4°C で 24時間攪拌した。

反応液に、 0. 11^重曹1. 5m lとエタノール 1. 5m lを加え氷冷下 30 分間攪拌した後、さらにエタノール 9m l加え沈殿させ、沈殿物は、アルコール沈殿法（沈殿を 0. 2 M食塩水 3m 1に溶かし、エタノール 9 m 1で沈殿させ、沈殿を遠心分離する）を 3回繰り返すことにより精製し、 1 3. 9mgの結合体 ( 「結合体 4」 ) を得た。

ィンドール環に由来する 279 nmでの UV吸収から算出された結合率は、 4. 9重量％であった。これは、 3. 9 %のカルボキシル基が反応したことに相当する。実施例 6 ：結合体の合成例 5

結合体の合成例 3と同じ原料や試薬を用い、同様の操作を行ったところ、 5. 7mgの「結合体 5」を得た。

インド一ル環に由来する 279 nmでの UV吸収から算出された結合率は、結合体の合成例 3の時と再現性よく、 1. 7重量％であった。これは、 1. 4%のカルボキシル基が反応したことに相当する。実施例 7 ：結合体の合成例 6

MM P阻害剤（化合物 9) 145mgに、 N—メチルピロリドン 0. 89m l とピリジン 0. 02m lを加えて溶かし、 61^[塩酸0. 091111 と水で 1"1を4. 7に調整し、全量を 1. 82m lとした。これをヒアルロン酸ナトリウム 9. 1 mgに加え、均一とした。再度 pH4. 7を確認し、氷冷下、 EDC 35mgを加え 4°Cで 24時間攪拌した。

反応液に、 0. 11^重曹0. 375m 1とエタノール 0. 375m lを加え氷冷下 30分間攪拌した後、さらにエタノール 5m 1加え沈殿させ、沈殿物は、ァルコール沈殿法（沈殿を 0. 2 M食塩水 2m 1に溶かし、エタノール 6m lで沈殿させ、沈殿を遠心分離する）を 3回繰り返すことにより精製し、 8. 2mgの結合体（「結合体 6」）を得た。ィンドール環に由来する 279 nmでの UV吸収から算出された結合率は、 1. 0重量％であった。これは、 0. 70 %の力ルポキシル基が反応したことに相当する。実施例 8 ：結合体の合成例 7

N—ヒドロキシ _ 5—ノルポルネンー 2 , 3—ジカルボキシミド 8. 9mgを水に溶かし、ピリジン 0. 0 1m l と lM塩酸0. 07m 1と水とで pHを 4. 7に調整し、全量を lm 1とした。これをヒアルロン酸ナトリゥム 5 mgに加え、均一とした。氷冷下、 EDC 9. 6mgを加え 4°Cで 1 7時間攪拌した。氷冷下、 2%酢酸ナトリウム緩衝液（pH6) 0. 5m lを加えた後、アセトン 4m lを加え沈殿を析出させた。沈殿を遠心分離し、減圧で乾燥した。

MM P阻害剤（化合物 9) の TFA塩（化合物 1 0) 86mg [MM P阻害剤 (化合物 9) を 0. 1 %TF Aを含む蒸留水に懸濁し、凍結乾燥することにより得た] を、 N—メチルピロリドン 0. 49m lとピリジン 0. 0 1 m 1を加えて溶かし、 1M塩酸 0. 035m 1と水で pHを 8. 0に調整し、全量を 1 m 1とした。これを上述の沈殿物に加え、 4°Cで 3日間攪拌した。

反応液に、 2M食塩水 0. 2m 1とエタノール 3m 1を加え沈殿させ、沈殿物を遠心分離した。この沈殿に 0. 2M食塩水 lm 1と 1M水酸化ナトリウム水溶液 0. 06m lを加え、氷冷下 1時間攪拌し可溶化させ、エタノール 3 m lで沈殿を析出させ、沈殿を遠心分離した。再度、この沈殿に 0. 2M食塩水 lm lと 1M水酸化ナトリウム水溶液 0. 06m lを加え、氷冷下 3時間攪拌し可溶化させ、エタノール 3m 1で沈殿を析出させ、沈殿を遠心分離した。引き続き、沈殿を 0. 2M食塩水 lm 1に溶かし、エタノール 3m 1で沈殿させ、沈殿を遠心分離し、さらにこの沈殿を 90 %エタノール/水で懸濁し遠心分離した後、水に溶かして凍結乾燥することで、 6. Omgの結合体（「結合体 7」）を得た。

ィンドール環に由来する 279 nmでの UV吸収から算出された結合率は、 1. 1重量％であった。これは、 0. 78 %のカルボキシル基が反応したことに相当する。試験例 1 ：マトリックスメタ口プロテア一ゼ（MM P ) 阻害活性コラゲナーゼ _ 1、ストロメリシン— 1、ゲラチナ一ゼ Aおよびゲラチナ一ゼ Bに対する「結合体 1」、「結合体 7」および H Aの酵素阻害活性を測定した。なお、コラゲナーゼ _ 1とストロメリシン一 1に対する阻害活性は、ャガイ社製の I型コラゲナ一ゼ活性測定キットとストロメリシン— 1測定キットを、また、ゲラチナ一ゼ Aとゲラチナーゼ Bに対する阻害活性は、ロッシュ .ダイァグノスティック社製のゲラチナーゼ活性測定キットをそれぞれ用いて測定した。結果は、薬物非添加時の酵素活性を 1 0 0とした時の酵素活性の平均値として表示した (n=2)。図 1、図 2、図 8及び図 9に示したように、「結合体 1」及び「結合体 7」はこれら 4種類のいずれの酵素に対しても阻害活性を有していたが、 H Aは阻害活性を示さなかった。

これらの実験結果から、「結合体 1」及び「結合体 7」は H Aにはない、 MM P阻害活性を有していることが判明した。試験例 2 ：マトリックスメタ口プロテア一ゼ（MM P ) 阻害活性に及ぼすスぺ一サ一の影響

特許第 2 7 3 6 2 8 5号公報記載の MM P阻害剤（N— [ 2 —イソブチル— 3 一（Ν ' —ヒドロキシカルボニルアミド） —プロパノィル] —L—トリプ卜ファンメチルアミド：化合物 1 ) と Η Α間のスぺ一サ一長を C 4から C 1 0に変えた 4種類の結合体（結合体 1、結合体 3、結合体 4及び結合体 6 ) について、ゲラチナ一ゼ Αおよびゲラチナーゼ Βに対する阻害活性を比較した。結果は、薬物非添加時の酵素活性を 50%阻害するのに必要な薬物濃度（ I C _5Q値）で表した（下記の表 1 ) 。スぺーサ一長が大きくなるに従い、ゲラチナ一ゼ Aに対する阻害活性が強くなる傾向が若干見られたが、これら 4種類の結合体間で阻害活性に大きな違いは認められず、この結果から、同じ合成法（H Aと MM P阻害剤を混合した後、縮合剤を加える方法）で調製した結合体（結合体 1、結合体 3、結合体 4、結合体 6 ) の間で比較すると、阻害活性に及ぼすスぺーサ一長の影響は少ないものと考えられた。

また、「結合体 6」と、 H Aを予め活性エステルとした後、 MM P阻害剤を加えて反応させる方法で合成した「結合体 7」とを比較すると、スぺーサ一は同一かつ阻害剤の結合量はほぼ同じであるにもかかわらず、ゲラチナーゼ Aの阻害活性には約 1 0倍の差が見られた。このことから、合成法の違いによって、結合後の MM P阻害剤の阻害活性は、結合前の阻害活性から変化する可能性が示唆された。表 1 ：

MM P阻害活性に及ぼすスぺーサ一の影 S

酵素阻害活性（に so.mg/ml) 結合体スへーサ一

ゲラチナーゼ A ゲラチナーゼ B 結合体 1 C₄H_ft-NH- 0.03 結合体 3 C₈H₁₆-NH 0.7 0.04 結合体 4 C₈H₁₆-NH- 0.2 0.02 結合体 6 C_inH₂₀O。-NH- 0.2 NT 結合体 7 C₁₀H₂₀O_a-NH- 0.02 0.01

試験例 3 ：コラーゲンフィルム破壊阻害活性

Gavrilovic, Jらの方法 (Cell. Biol. Int. Reports, 9, 1097-1107 (1985)) に従つて行った。 3〜 6週齢のゥサギ膝関節からコラゲナーゼ処理により回収した関節軟骨細胞を、 0 · 2 %のラクトアルブミンを含む 5 0 0 x 1の Dulbeco' s modified eagle's medium (DMEM) に浮遊させ、浮遊液 50 0 1ずつを、 ^l4Cでラベルしたモルモット皮膚由来タイプ I型コラーゲンフィルムでプレコートされた 4 8ゥエル培養プレート上に播種した。「結合体 3」または HAをイン夕一ロイキン 1 ( lng/ml) とプラスミン（lOO ig/ml) の存在下、 37 °Cの C 0₂インキュべ —夕—内で _{7 2}時間培養した。培養終了後、培養上清と、残存するコラーゲンフイルムをコラゲナーゼ処理した消化液を回収し、それぞれの放射活性を液体シンチレーシヨンカウンターで測定した。結果は下記の式に従って、破壊されたコラ一ゲンフィルムの破壊率（％) の平均値として算出した（n=2)。コラーゲンフィルム破壊率（％) = [ (培養上清中の放射活性） Z (培養上清中の放射活性 +残存したコラーゲンフィルム中の放射活性） ] X 1 0 0 図 3に示したように、「結合体 3」はインタ一ロイキン 1とプラスミンによつて誘導された細胞性のコラーゲン破壊を抑制したが、 H Aは抑制効果を示さなかつた。

この結果から、 HAと MMP阻害剤との結合体は、 HAでは抑制しえない関節軟骨細胞によるコラーゲン破壊に対しても優れた抑制効果を持つことが明らかとなった。試験例 4 ：結合体の結合安定性 1

「結合体 5」を lmgZm 1の濃度で生理食塩水に溶解（この時点での pH = 6. 3であった）し、 37 でインキュベートし、ゲルろ過クロマトグラフィーで結合体の変化を分析した。

カラムは T SKg e 1 G 4000 PW (7. 5 mm I . D. X 30 cm, 東ソ一社製）、溶出溶媒は 20 %エタノールを含む 5 OmMリン酸緩衝液（pH 6) 、カラム温度は 40 （L一 7300、日立製）、流速は 0. 7 m 1 Z分（L— 7 1 00、日立製）、検出にはダイオードアレイ検出器（L— 7450 H、日立製）を用いた。

40 1の溶解液をインジェクションした際の、ボイドのインドール環由来の 279 nmでの吸収によるピーク面積を 0日、 2日、 5日と追跡したところ、変化は認められなかった（図 4) 。また、この 5日間で、低分子量領域への新たなピークの出現は HP L C上認められなかった。

この結果から、「結合体 5」の H Aと MM P阻害剤との間の結合の良好な結合安定性が示された。試験例 5 ：結合体の結合安定性 2

化合物 1、化合物 1と HAの混合物および「結合体 4」を、それぞれ、 Millipore 社製の膜孔直径 25 nmの半透膜（TypeHC)で区切り、等張リン酸緩衝液溶液 (PH7.4)を満たした拡散セル（ドナ一側： 1.5mしァクセプ夕一側： 8.0ml) に入れ、ドナー側からァクセプター側への漏出を測定波長 3 5 O nmの蛍光強度から算出し、透過率として表した（図 5) 。ここで、透過率 1 00 %とは、薬物全量が拡散し、セル内が均一となったときの濃度を意味する。

1 化合物 1 5 Onmol

2 化合物 1 5 Onmolと H A 0. 5mgの混合物

3 「結合体 4」 0. 5mg (化合物 1 5 Onmoけ目当が結合）

化合物 1および化合物 1と H Aの混合物の場合、化合物 1は速やかに膜を透過し、ァクセプタ一側へ拡散したが、「結合体 4」は 8時間まで透過せず、 24、

48時間で 2. 8、 3. 6%が、それぞれ透過するに止まった。

この結果から「結合体 4」の HAと MMP阻害剤との間の結合の良好な結合安定性が示された。試験例 6 ：関節内貯留性

9〜 10週齢のラット（n=4〜10) の右膝関節内に以下の薬物（1〜3) を投与後、経時的に動物を屠殺し、計 0. 5m 1の生理食塩水で関節腔内を洗浄して関節液を回収した。

1 化合物 1 3 Onmol

2 化合物 1 3 Onmol と HA 0. 3mgの混合物

3 「結合体 4」 0. 3mg (化合物 1 3 Onmoけ目当が結合）

ロッシュ ·ダイァグノスティック社製のゲラチナーゼ活性測定キッ卜を用い、下記の式より、関節液のゲラチナーゼ Bに対する阻害活性を算出した。ゲラチナーゼ B阻害活性（％) = [ (関節液非存在下の酵素活性一関節液添加時の酵素活性）関節液非存在下の酵素活性] X 1 0 0 化合物 1と「結合体 4」のゲラチナ一ゼ Bに対する用量 ·阻害曲線をもとに、化合物 1単独および化合物 1と H Aの混合物投与群では化合物 1の量そのもの、「結合体 4」投与群では「結合体 4」に結合した化合物 1相当量を薬物量として、関節液中に残存する薬物量を算出した。結果は平均値で表示した。図 6に示したように、化合物 1単独および化合物 1と H Aの混合物投与群では、関節内に残存した薬物量は、いずれも投与 2時間後には投与量（図中の 0時間目の薬物量）の約 1/3000に減少し、化合物 1単独投与群では投与 6時間、化合物 1 /H Aの混合物投与群では投与 17時間後に、それぞれ投与量の 1/300000にまで減少した。これに対して「結合体 4」投与群では、投与 2時間後では投与量の 2/5、投与 1 7時間後でも投与量の 1/10程度の薬物が残存していた。

図 7には、投与直後（図の 0時間目）、 2時間後および 17時間後に各薬物投与群より回収された関節液のゲラチナ一ゼ B阻害活性を示した。結果は平均値士標準偏差で表示した。化合物 1単独および化合物 1と H Aとの混合物投与群の関節液のゲラチナーゼ B阻害活性は、いずれも投与 2時間後には 20%、投与 Π時間後には 5 %以下にまで減少していたのに対して、「結合体 4」投与群では投与 17時間後でも、 50%程度残存していた。

これらの結果から、 H Aと MM P阻害剤との結合体は、関節腔内での MM P阻害剤の貯留性を高めるための手段として、極めて優れた手段となることが明らかとなった。また、 H Aと MM P阻害剤との結合体は、関節腔内でも長時間に渡つて MM P阻害活性を保持し、単回の関節内投与でも長期に渡って関節破壊を阻害する可能性が示唆された。

すなわち、本発明の MM P阻害剤と H Aとの結合体は、各々単独、並びに MM P阻害剤と H Aとの合剤よりも、関節疾患治療薬としての効果および貯留性が優れることが示唆された。試験例 7 ：関節軟骨コラーゲン破壊阻害活性

Saito, Sらの方法（J. Biochem, 111, 49- 54 (1997)に従って行った。 7週例のゥサギ膝関節から関節軟骨の小片（約 10mg) を調製し、 48ゥエル培養プレート上で 500 /X 1の Dulbeco's modified eagle's medium (DMEM) 中、 24時間培養した。培養液を、 500 1の 0. 2 %ラクトアルブミンを含む DMEM に交換後、「結合体 7」または HAを添加し、インターロイキン 1 (I n gZm 1 ) とプラスミノ一ゲン（1 00 i g/m l ) の存在下、 37°〇の( 〇₂ィンキュベータ一内で 1 0日間培養しだ。培養終了後、培養上清と、軟骨残査をパパイン処理した消化液を回収し、最終濃度 6 Nになるように塩酸を添加して、 1 10°C のォ一トクレーブ中で 2時間加水分解を行った。 N₂ガス噴霧によって試料を乾固後、 5mMの EDTAを含む 0. 1 Mリン酸緩衝液（ p H 6. 5) に溶解し、マィクロプレートを用いた比色定量法によって、ヒドロキシプロリン量を測定した。結果は下記の式に従って、関節軟骨小片中から培養液中へのヒドロキシプロリン量の遊離率（％) の平均値土標準偏差で表示した（n = 4) 。ヒドロキシプロリン遊離率 (%) = [培養上清中のヒドロキシプロリン量 Z (培養上清中のヒドロキシプロリン量 +軟骨残査中のヒドロキシプロリン量） ] X 1 00 図 10に示したように、「結合体 7」は、 1 mg/mlの濃度において、イン夕一口ィキン 1とプラスミノーゲンによって誘導された軟骨コラーゲンの破壊を有意に抑制したが、 H Aは有意に抑制しなかった。

この結果から、 HAと MMP Iとの結合体は、直接の標的組織である関節軟骨の破壊に対しても、明確な抑制作用を持つことが示された。なお、本出願が主張する優先権の基礎となる日本特許出願平成 1 0年第 1 38 329号、同平成 10年第 224187号および同平成 1 1年第 43064号の明細書に記載の内容は全て引用により本明細書中に取り込まれるものとする。産業上の利用の可能性

本発明の結合体は、例えば、投与された関節腔内において、通常の H A製剤と同様に長期間貯留し、かつ、分子中のヒドロキサム酸は H A又は H A誘導体又はそれらの塩に結合した状態で局所の MM Pを阻害する。そのため、既存技術では成しえなかった関節疾患治療薬（例えば、 MM P阻害剤）の投与部位（例えば、膝、肩等の関節が挙げられる）での作用の限局 '長期化および投与回数の低減が可能であり、従来の全身投与に比べて、関節疾患治療薬の副作用を大幅に軽減することが期待される。

また、投与部位において、 H A又は H A誘導体又はそれらの塩の製剤成分と関節疾患治療薬成分の両者は、解離、分解を受けずにそれぞれの薬効を発現するので、両者の相乗的な薬効が期待できる。

以上の点より、本発明の結合体は、関節疾患治療薬（例えば、ヒドロキサム酸などの MM P阻害剤）と H A又は H A誘導体又はそれらの塩の両方の薬物としての有用性が改善された薬剤、例えば、関節破壊抑制作用が強化された薬剤として、優れた変形性関節症、慢性関節リウマチ又は肩関節周囲炎の治療薬となることが期待される。

Claims

1. (1) 1種以上の関節疾患治療薬と（2) ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体又はそれらの塩との結合体。

2. 結合が共有結合である、請求項 1記載の結合体。

3. 関節疾患治療薬がマトリックスメタ口プロテア一ゼ阻害剤である、請求項 1又は 2に記載の結合体。

4. マトリックスメタ口プロテア一ゼ阻害剤がスぺーサーを介してヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体又はそれらの塩と結合している請求項 1から 3の何れか 1項記載の結合体。

の

5. マトリックスメタ口プロテアーゼ阻害剤の重量割合が、結合体全体に対して 0. 0 1〜50 %である、請求項 1から 4の囲何れか 1項記載の結合体。

6. マトリックスメタ口プロテア一ゼ阻害剤がヒドロキサム酸残基である、請求項 1から 5の何れか 1項に記載の結合体。

7. マトリックスメタ口プロテアーゼ阻害剤が、一般式（ 1) ：

[式中、 R,は、水素原子、水酸基、又は炭素数 1〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表し； R₂は、炭素数 1〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表し； R₃は、シクロアルキル基、ァリール基もしくは複素環基で置換されていてもよい炭素数 1〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表し； R₄は、水素原子、又は炭素数 1〜4の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表す。 ] で表されるヒドロキサム酸残基である、請求項 1から 6の何れか 1項に記載の結合体。

8. スぺーサ一が、一般式（2) ：

-R₅-R₆-R₇-R₈- (2)

[式中、 R₅は、炭素数 1〜8の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキレン基を表し； R ₆は、炭素数 1〜4の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基で置換されていてもよいメチレン基もしくはイミノ基、または酸素原子を表し； R ₇は、 1〜 3個の酸素原子が挿入されていてもよい炭素数 1〜 1 0の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキレン基を表し； R ₈は、酸素原子、硫黄原子、又は N R ₉ (ここで、 R ₉は、水素原子、又は炭素数 1〜4の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表す）を表す。 ] で表される、請求項 1から 7のいずれか 1項に記載の結合体。

9 . マトリックスメタ口プロテアーゼ阻害剤とスぺーサ一との結合体が、一般式（3 ) ：

[式中、 R ₁₂は、 1個のイミノ基および又は 1〜4個の酸素原子が挿入されていてもよい炭素数 2〜 2 3の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキレン基を表し； R _l3 . は、水素原子、又は炭素数 1〜4の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基を表す。 ] で表される、請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載の結合体。

1 0 . 生体内においてマトリックスメタ口プロテア一ゼ阻害剤がヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体又はそれらの塩と結合した状態でマトリックスメタロブ口テアーゼを阻害する、請求項 1から 9の何れか 1項に記載の結合体。

1 1 . 関節疾患治療薬中の活性に影響を及ぼさない部位と、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体又はそれらの塩のカルボキシル基、水酸基または還元末端の官能基とを、直接の化学反応によって又はスぺーサーを介して結合させることを含む、請求項 1から 1 0の何れか 1項に記載の結合体の製造方法。

1 2 . 請求項 1か 1 0の何れか 1項に記載の結合体を含む医薬。

1 3 . 関節疾患治療薬である、請求項 1 2に記載の医薬。

14. 関節疾患が変形性関節症、慢性関節リウマチ又は肩関節周囲炎である、請求項 1 3に記載の医薬。

1 5. 請求項 1から 10の何れか 1項に記載の結合体の、医薬を製造するための使用。

1 6. 請求項 1から 10の何れか 1項に記載の結合体の、関節疾患治療薬を製造するための使用。

1 7. 関節疾患を有する患者を治療するための方法であって、薬学的に有効量の請求項 1から 1 0の何れか 1項に記載の結合体を有効成分として含む医薬を該患者に投与することを含む方法。